DE1467945A1 - Verfahren zur Herstellung eines gegen Wuermer und Protozoen wirksamen Antibiotikums - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung eines gegen Würmer und Protozoen wirksamen Antibiotikums.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen anthelmintisohen und antiprotozoalen, d.h. gegen Würmer und Protozoen wirksamen Antibiotikums, das im folgenden als Antiamoebin bezeichnet wird. In den vergangenen Jahren ist über verschiedene gegen Protozoen wirksame Antibiotika, wie z.B. Paramomycin, Antiprotozoin, Hamycin, Puromycin, Afzalomycin-F, berichtet worden, die gegen Entamoeba histolytica, Trypanosoma curzil, Trichomonas vacinalis und andere Protozoen benutzt wurden, die Krankheiten bei Menschen und Tieren verursachen. Man ist zur Zeit noch bemüht, ein wirksames Amoebicid gegen Bntamoeba hiatolytica, wodurch in den Tropen Amöbiasis hervorgerufen wird, zu finden, das als Mittel gegen Leber- und Darminfektionen Verwendung finden soll und gleichzeitig ungiftig i3t.

Paramomycin steuert lediglich Darminfektionen, während andere Chemikalien wie üimetinhydrochlorld, Arsen enthaltende Mittel, Gluacarubin, Camoquin, lange Behandlungszeiten erfordern und schädliche Nebeneffekte hervorrufen. Keine der oben erwähnten gegen Protozoen·wirksamen Antibiotika and Chemikalien besitzen anthelmintieche (vermifuge) Eigenschaften.

Die Zahl von Würmern, die Menschen und Tiere, insbesondere in den Tropen, befallen, ist so groß, daß sie nicht

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namentlich erwähnt werden können. Würmer in den Därmen und anderen inneren Organen rufen Unterernährung und verschiedene andere Krankheiten hervor. Spulwürmer, Madenwürmer und Bohrwürmer verringern bei schwerem Befall der Därme das Wachstum von Kindern. Bandwürmer, Hakenwürmer und andere Arten verursachen chronische Leiden, insbesondere rufen Hakenwürmer in unterernährten Bevölkerungsschichten Anämie hervor. Würmer, die bei auf Farmen gehaltenen Tieren, bei Haustieren und Geflügel auftreten, gibt es in mehreren Dutzend verschiedenen Arten und Gattungen; ihre Kontrolle ist eins der Hauptprobleme. Es gibt sehr wenige Antibiotika, wie Hygromycin und Anthelamycin, von deren bekannt ist, daß sie antheimintische Eigenschaften haben. Aus Japan wurde über Ascaricidin berichtet, daß es in begrenztem Umfang als Wurmmittel eingesetzt werden könne. Die für Menschen und Tiere zur Zeit üblichen Behandlungsarten zum läntfernen von Würmern sind sehr verschieden. Es werdenPiperazinsalze verordnet, um Spul- and Madeovürmer zu entfernen. Ferner benutzt man Bephenium- und Zinnsalze für Bandwürmer, Tetrachloräthylen und organische Phosphorverbindungen gegen Hakenwürmer usw. -Bs sind auch toxische Verbindungen bekannt, die sehr erhebliche Nachwirkungen zeigen. Da bessere und sichere Arzneimittel fehlen, müssen diese verordnet werden. Keins dieser Mittel ist methodisch wirksam, so daß zur Zeit weder Antibiotika noch Chemikalien vorhanden sind, mit denen das Mikro3tadium bei Toxocara und ausgewachsenen Würmer bei FilarLasia behandelt werden können.

Im Verlauf eines Forschungsprogrammes zur Entwicklung neuer gegen Protozoen und Würmer wirksamer Antibiotika

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beim „Research Laboratories of Hindustan Antibiotics Research Centre, Pimpri, Poona 18, wurde das neue Antibiotikum Antiamoebin von drei Arten von Pilzen in großen Mengen erhalten. Bs handelt sich um die Pilze Emericellopsis salmosynnemata Mathur und xhirumalachar, Emericellopsis poonensis Thirumalachar und Gephalosporium pimprina Thirumalachar.

Es wurde gefunden, daß geringe Mengen dieses Antibiotikums auch von Stämmen von Emericellopsis huiiicola (Gain) Gain (=E. humicola (Gain Gilman) und E. minima stolk erzeugt werden. Es ist bekannt, daß Emericellopsis das Endstadium der vorangehenden Entwicklungsstufe Gephalosporium ist. Ein Bericht über den Pilz E. Synnematicola Mathur und Thirumalachar ist von der Anmelderin in der Zeitschrift „Mycologia", Band 52, Seiten 694 bis 697, I960, veröffentlicht worden, E. poonensis unterscheidet sich von E. synnematicola dadurch, daß er das Gephalosporium-Stadium für seine Konidien erzeugt, das verscnieden ist von dem Stiibum-Typ der Konidio-Sporen in E. synneraaticola. Die Größe der Sporen ist ebenfalls leicht verschieden. Gephalosporium p^rl^iprina Thirum gehört zu der Gruppe des Gephalosporium, die von Sukapure und Thirumalachar beschrieben wurde.(Die Veröffentlichtung in„Mycologia" 13t zur Zeit in Druck). Es erzeugt nicht den Perithel-Zustand und die Kolonien sind weiß und breiten sich aus. Die Konidio-Sporen haben eine Größe von 20 bis 30 ü, die Konidien von 8 bis 10 mal 4 bis 6 u, sind elliptisch, glasklar und glatt.

Die Erfindung umfaßt einenfermentativen Prozess zur Erzeugung einer der drei oben erwähnten Pilzarcen und auch von ausgewählten Stämmen von &, humicola und JS, minina durch

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BAD

Wachstum in einem Kulturboden, der eine anpaßbare Kohlehydratquelle, Stickstoff und anorganische Salze enthält. Um in wirtschaftlicher Weise maximale Ausbeuten des Antibiotikums zu erhalten und dieses leicht abtrennen zu können werden bestimmte Kulturböden vorzugsweise verwendet. Beispielsweise sind bevorzugte Kohlehydratquellen in dem Kulturboden Glukose, Rohrzucker und Stärke. Andere Quellen können beispielsweise Dextrin, Melasse und Milchzucker sein. Als Stickstoffquellen können Getreide, Sojabohnen und Erdnußmehl, verschiedene Hülsenfrüchte, bei bestimmten Destillationen anfallende Lösungen, Kasein, aminosäure Gemische sowie pflanzliche und tierische Peptone und dergleichen verwendet werden. Anorganische Stickstoffträger bestehen aus Nitraten und Ammoniumsalzen j die anorganischen Nährsalze, die in das Medium eingebracht werden, bestehen aus üblichen Salzen, die fähig sind, Natrium,- Kalium,- Galzium,-Phosphat-, Chlorid-, und Sulfationen oder dergleichen zu erzeugen. Die wesentlichen Spurenelemente, die das Wachstum des Pilzes fördern, und höhere Ausbeuten ergeben, werden ebenfalls in den Kulturboden eingebracht. Derartige Spurenelemente sind häufig als Verunreinigungen in den Ausgangsstoffen vorhanden.

Zur Erläuterung des Verfahrens zur Herstellung von Antiamoebin wird die Behandlung eines Stammes von Emericellopsis poonensis beschrieben. Die gleichen Resultate erhält man auch mit den anderen oben erwähnten Arten und Stemmen. Der E. poonensis SLA-I kann auf einem Kulturboden bei Temperaturen von etwa 24 bis 37° C gezüchtet werden, der verschiedene Nährstoffe enthält; die optimale Temperatur liegt bei 28° C. Geeignete Kulturböden sind solche aus Kartoffelstärke, aus Glukose-Peptonen sowie die sogenannten

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Sabouraud- oder Czapeks-Böden. -Der Pilz wächst als weiße Kolonie, die einen Luftpilz entwickelt,und eine große Anzahl sphärischer Konidium-Massen entsteht auf Konidiumsporen, was typisch für Gephalosporium ist. Nach einer Inkubationszeit von ungefähr 10 bis 15 Tagen erscheinen schwarze Punkte, die über die Kolonie verteilt sind. Hierbei handelt es sich um das Endstadium des Pilzes, das dem Emericellopsis-Stadium entspricht. Zur Herstellung des Antibiotikums sind 6 bis 8 Tage alte Kolonien geeignet, die eine Vielzahl von Konidien besitzen.

Zur Herstellung begrenzter Mengen des Antibiotikums können Schüttelflaschen und Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden. Zur Herstellung größerer Mengen benutzt man Fermentations-Gefäße aus rostfreiem Stahl, mit Einrichtungen zum Belüften und Umrühren. Ferner ist eine Temperaturkontrolle und die Möglichkeit erforderlich, sterile Bedingungen zu schaffen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform läßt man da8 vegetative Inokulum des Pilzes in einem Zuchtgefäß wachsen und inokuliert mit einem reinen Kulturboden mit Konidien, Askosporen, Pilzen oder Mischungen hiervon. Wenn das vegetative' Wachstum mit dem jungen und schnell wachsenden Pilz stattgefunden hat, wird das Inoculum aseptisch in große Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum entwickelt wird, kann dasselbe oder ein anderes sein, wie das, das man für die Herstellung des Antibiotikums benutzt.

Wie es bei der Herstellung von Antibiotika durch Züchtung üblich ist, wird sterile luft durch den Kulturboden geleitet, die durch Umrühren verteilt wird. Die Luftmenge ändert sich von 0,1 bis 1 Volumen Luft in der Minute pro Volumen

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Kulturboden. Der anfängliche pH-Wert des Mediums kann zwischen 4 und 7*5 liegen, obschon der bevorzugte Wert 6,5 ist. Die Temperatur liegt zwischen 24 und 28°, die Fermentation wird 72 bis 120 Stunden lang durchgeführt, wobei der pH-Wert sich am Ende der Fermentation zur alkalischen Seite verschiebt. Im Anschluß daran erfolgt die Herstellung des Antibiotikums, indem man periodisch eine bestimmte Menge des Bodens abzieht, die halbe Menge n-Butanol zusetzt, das ganze zur Extraktion durchrührt und das Butanol durch Zentrifugieren abtrennt, worauf man das Butanol unter Vakuum verdampft. Der Rest wird mit Methanol extrahiert und gefiltert. Die Lösung wird bis zum Eintrocknen verdampft und die Menge des Antibiotikums, die zurückbleibt, bestimmt. Diese gravimetrische Bestimmung gibt zufriedenstellende Resultate und Ausbeuten von 85 bis 90 $> von in dem Kulturboden enthaltenen Antibiotikum. Im allgemeinen findet die maximale Produktion des Antibiotikums nach der Inoculierung des Kulturbodens in 3 bis 5 Tagen statt, wenn ein untergetauchter Boden verwendet wird, und in 8 bis 15 Tagen, wenn eine Oberflächenkultur benutzt wird. Das gemäß der Erfindung hergestellte Antibiotikum kann von dem Kulturboden durch Extraktion und Absorption gewonnen werden. Die erstgenannte Methode wird zur Herstellung größerer Mengen bevorzugt, da die Ausbeute hierbei besser ist. Zur Extraktion des Antibiotikums von dem FiItrat des Kulturbodens werden wasserunlösliche polare, organische Lösungsmittel bevorzugt, zur Extraktion von dem Pilz kann man aliphatische Alkohole wie Methanol, Äthanol, Butanol, Propanol, Isopropanol, Methyl- und Äthyl-Cellosolve (Äthylenglukose-monomethyl-(bzv;. äthyl)äther), wässriges Azeton und dergleichen benutzen. Bevorzugt erfolgt die Extraktion durch Filtrieren des Bodens und ge-

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trennte Extraktion des Filtrates und des Pilzes. Von dem Mycelium oder Pilz kann das Antibiotikum mit allen niedrigen Alkoholen, wie Methanol und Äthanol, Isopropanol, wässrigem Azeton, Methyl- und Äthyl-Oellosolve, Pyridin , Dimethyl-Formamid, extrahiert werden.

Das in dem organischen Lösungsmittel enthaltene Antibiotikum kann durch Eindampfen im Vakuum gewonnen werden, wobei es als !Rohprodukt anfällt. Man kann das Antibiotikum auch mittels Aktivkohle, Magnesium-Aluminium-Silikat und dergleichen adsorbieren. Eluieren des Antibiotikums ist nur teilweise mittels organischer Lösungsmittel möglich, in denen es löslich ist.

Wenn nur das bevorzugte Extraktionsverfahren angewandt wird, wird der Kulturboden gefiltert und das FiItrat mit 1/3 Volumen n-Butanol extrahiert. Das Butanol wird abgetrennt, im Vakuum auf 1/20 des Volumens konzentriert und das Antibiotikum durch Benutzen eines damit mischbaren Lösungsmittel wie Azeton ausgefällt; man kann statt Azeton auch eine Mischung von miteinander mischbaren Lösungsmitteln wie Azeton und Benzin benutzen. Das rohe Antibiotikum wird einer weiteren Reinigung unterworfen. Der Pilz kann zweimal mit n-Butanol extrahiert werden, und man kann den für die Filtration beschriebenen Prozess ausführen. Vorzugsweise extrahiert man das Mycelium mit Methanol oder Äthanol und filtriert dann. Der Methanol- oder Äthanolextrakt wird mit entfärbender Kohle behandelt, und verdampft bis zur Entfernung des Alkohols. Das Antibiotikum bleibt gewöhnlich als weißer Rückstand, meist in kristalliner Form zurück. Die erhaltenen Kristalle werden durch Filtration abgetrennt und zwecks weiterer Reinigung rekristallisiert.

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Zur Reinigung des rohen oder gegebenenfalls schon vorgereinigten Produktes wird dieses in 30 bis 45 Ί» warmem Äthanol oder Methanol gelöst, mit entfärbender Aktivkohle behandelt, in warmem Zustand gefiltert, auf Raumtemperatur gekühlt und auf dieser Temperatur 4 bis 6 Stunden gehalten, worauf man das Produkt über Nacht in einen Kaltraum mit einer Temperatur von 5 C überführt. Große Mengen nagelscharfer, weißer Kristalle werden gebildet, die gefiltert, dann mit Wasser gewaschen und getrocknet werden. Das Antibiotikum "Antiamoebin" hat folgende Eigenschaften:

Neutrales Polypeptid,

Form und Farbe» Weiße, buscheiförmige Nadeln, leicht,

bitter und geruchlos.

Schmelzpunkt« 219 bis 220° C (d)

Optische Aktivität

U.V. Absorptionamaximai

löslichkeit«

(et) D²⁵+ 10 (C, 1.02 # in Methanol) (a) D²⁵+ 10 (C, 1.03 °h in DMF)

Bndabsorption

3320-3290 (gebundenes NH). 1650, 1530 (CO und NH-Deformation), 1078, 695 CM

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Löslich in Methanol, Äthanol, Butanol, n-Propanol, Isopropanol, Pyridin, Eisessig, Dimethylformamid, wässrigem Azeton, feuchtem Methyläthylketon und Methyl- und Äthyl-CellOBOlve. Unlöslich in Wasser, ChIo-

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roform, Äther, Benzin, Äthylazetat, Butylazetat, Azeton, Toluol , Tetrachlorkohlenstoff, Dioxan, Benzol, Schwefelkohlenstoff, Methylchiorid und Äthylenglykol.

Weitere Reaktionen: Negativ: Fehlingsche Perri-Ghloridlöaung,

Benedict-, Nolisch-, Sokaguchi-Test, sowie Reaktion mit Ninhydrin, Biuret und Anthron. Positive Xanthoproteinreaktion.Nach einstündiger Alkalihydrolyse positive Biuret-Reaktion, Hydrolyse mit 6 η-Salzsäure in einem verschlossenem Rohr während 16 Stunden ergibt 11 positive NinhydrIn-Ii¹Iecken bei zweidimensionaler Papierchromatographie. Die folgenden Aminosäuren werden bestimmt durch ein- und zweidimensionale Papierchromatographien mit Hilfe von Standard-Aminosäuren. Prolin, ct-Aniinoisobuttersäure, Phenylalanin, Valin, Leucin, Hydroxyprolin, Lysin und Glutaminsäure.

Analyse: G, 56.11, H, 7.56, N, 15.56 #. Halogen- und Schwefelreaktionen sind negativ.

Die U.V.- und I.R.-Spektren von Antiamoebin in Nujol sind auf den Zeichnungen dargestellt; Figur 1 zeigt das UV-Spektrum und die Figuren 2 und 3 das IR-Spektrum für zwei verschiedene Bereiche.

Beispiel 1

Herstellung von Antiamoebin
Zunächst wird airk Inoiruljam-iRoden folgender Zusammensetzung

- 10 hergestellt»

pH 6,5 bis 7	2,0
Sojabohnenmehl	2,0
Glukose	0,3
Aminoniumsulfat	0,25
Natriumchlorid	0,6
Galziumkarbonat

Das Medium von 50 Litern wird bei 15 lbs. 30 Minuten lang sterilisiert und bei Kühlung auf 28° G mit 48 Stunden vegetativ gewachsenen Emericelopsis synnematicola oder E. poonensis inokuliert (geimpft). Das Inokulum, das man vorzugsweise benutzt, erzeugt man vorher in Schüttelflaschen; es wird unter dem Mikroskop für starkes Wachstum berechnet. Während der Wachstumsperiode in den 50 Litern Boden wird belüftet und umgerührt. Dies erfolgt unter sterilen Bedingungen. Es werden 0,5 Vol. Luft pro Vol. Kulturboden und Min. benutzt.

Das Inokulum wird nach 58-stündigem Wachstum in einen Fermentationstank überführt, der 100 1 eines Mediums mit folgender Zusammensetzung enthält»

So j ab ohnenmehl	2,5 %
Glukose	3,0 i»
Ammoniumsulfat	0,5 5*
Natriumchlorid	0,25 :
Galziumkarbonat	0,5 °/o

ph 6,5 bis 6,8

Das Medium wird durch Erhitzen unter Druck bei ungefähr " 909822/1160 -H-

110° C 30 Minuten lang sterilisiert. Die Temperatur wird auf 28° C gesenkt, und das Inokulum von 50 1 aseptisch in dieses Gefäß eingebracht. Während der Wachstumsperiode wird der Boden gerührt, und sterile Luft in einer Menge von 0,5 bis 1 Vol. pro Vol. Boden und Min. eingeblasen. Das Wachstum dee Myceliums und die Antibiotikumproduktion wird von Zeit zu Zeit gravimetrisch bestimmt. Nach 96 bis 120 Stunden, die üblicherweise benötigt werden, wird der pH-Wert des Bodene auf 5 eingestellt und eine Filtration vorgenommen. Das FiItrat wird gesammelt und mit 1/3 Vol. n-Butanol extrahiert, wobei ein Extraktor zum Durchmischen und Überführen des Antibiotikums vom Boden in das Lösungsmittel benutzt wird. Das Mycelium wird in ähnlicher Weise zunächst mit 1,5 VoI Butanol pro kg. Mycelium extrahiert, worauf eine zweite Extraktion erfolgt, bei der man 1 Liter Butanol pro kg. Mycelium benutzt. Nach gründlicher Extraktion unter Umrühren wird das Butanol abfiltriert und stehengelassen. Es wird mit dem Butanolextrakt des Bodenfiltrates gemischt. Die Butanolextrakte unterwirft man zur Entfernung der Salze und dergleichen einer Wäsche mit Wasser, worauf man sie im Vakuum auf ungefähr 30 Liter konzentriert. Die Butanollösung hat zu Beginn ein Volumen von ungefähr 600 Große Mengen von Schlamm, die aus dem rohen Antibiotikum bestehen, fallen an. Der Schlamm wird gefiltert, mit Azeton gewaschen und getrocknet. Zu der Butanollösung wird nach Abfiltrieren des Schlammes die dreifache Menge Azeton gegeben und die Lösung 24 Stunden lang bei 10° G gehalten· Der cremige gelbe Niederschlag wird gefiltert, mit Azeton gewaschen und getrocknet.

Das so erhaltene rohe Antiamoebin wird mehrfach mit Wasser gewaschen bis kein gelblich gefärbter Stoff mehr abgegeben

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wird und in warmem, 45#igen Methanol aufgelöst und bei 50° 0 auf dem Wasserbad gehalten. Man gibt einen Überschuß von Antiamoebin hinzu, bis es sich nicht mehr auflöst. Anschließend wird Aktivkohle (1$ des Methanolextraktes) zugefügt und in warmem Zustand filtriert. Die Lösung wird dann 3 bis 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten und dann in einen kalten Raum gebracht und dort über Nacht bei 5° stehen gelassen. Große Mengen von nadelscharfen Kristallen fallen in Bündeln aus; sie werden gefiltert, mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet. Eine zweite Kristallisation kann in der gleichen Weise ausgeführt werden.

Beispiel 2

Der ffermentationsprozess wird in derselben Weise ausgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben. Der Pilz, der den Hauptteil des Antibiotikums enthält, wird gefiltert, während der pH-Wert des Nährbodens auf 5 eingestellt wird. Der Pilz wird gewaschen und mit Methanol extrahiert, wobei für die erste Extraktion 1,5 1 Methanol pro kg Pilz und für die zweite Extraktion 1 Liter Methanol pro kg Pilz benutzt werden. Das Methanol wird gefiltert und das Extrakt mit Aktivkohle zum Entfärben behandelt und gefiltert, wobei 0,5 1» Aktivkohle benutzt werden. Dae Extrakt wird im Vakuum bei einer Temperatur von 45 bis 50° verdampft. Dies ist wegen des in dem Methanolextrakt enthaltenen Wassers möglich. 600 Liter des Methanolextraktes werden auf 30 Liter eingedampft; dabei scheidet sich Antiamoebin als weißer Schlamm aus, der größtenteils kristallisiert ist. Die rohen Kristalle werden gefiltert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Anschließend werden sie

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in 45 i» Methanol enthaltendem Äthanol aufgelöst, mit Aktivkohle behandelt, gefiltert und in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, rekriatallisiert.

Das Nährbodenfiltrat wird mit Aktivkohle behandelt, wobei 2 g pro Liter Nährboden benutzt werden. Die Aktivkohle wird mit Butanol, Methanol oder Äthanol herausgelöst und die so erhaltene Lösung eingedampft. Auf diese Weise wird Antiamoebin durch Rekristallisation von dem so erhaltenen Stoff gereinigt.

Beispiel 3

Der Fermentationsprozess wird, wie bei Beispiel 1 und 2 beschrieben, durchgeführt und der Pilz mit Äthyl- oder Methyl cellosolve extrahiert, das Jäxtrakt konzentriert, um das rohe Antibiotikum zu erhalten. Das Rohprodukt wird, wie vorstehend beschrieben, weiter behandelt.

Beispiel 4

Die Fermentation erfolgt wieder in der in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Weise und der Pilz wird mit wässrigem Azeton oder Dimethylformamid extrahiert, das Extrakt konzentriert und das rohe Antibiotikum gereinigt und kristallisiert.

Beispiel 5

Die Fermentation erfolgt wie gemäß Beispiel 1 und 2. Der Pilz wird mit heißem Amylalkohol oder ZyKbhexanol

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extrahiert und das Extrakt konzentriert, um rohes Antibiotikum zu erhalten.

Die Aktivität dea Produktes wird durch eine biologische Versuchsmethode zur Bestimmung der antiprotozoalen Aktivität bestimmt, wobei Tetrahymena pyriformis und Bntamoeba histolytica benutzt werden. Bei den Versuchen wurde Tetrahymena pyriformis benutzt.

Es wurden Kulturen verwendet, die auf einem Sojabohnenextrakt und Erdnußmehl-Sud erhalten wurden.

Antiamoebin-Standardmaterial wurde verwendet und eine wässrige Lösung von 1 mg pro ml hergestellt. DaB Antibiotikum muß vorher in einigen Tropfen Äthanol aufgelöst werden. Gleiche Mengen einer flüssigen Tetrahymena-Kultur, die 2 x 10 Zellen pro ml enthielten, wurden in Röhrchen gefüllt. Durch übliche Auflösung wurde eine Konzentration des Antibiotikums von 1 bis IGDu g pro ml in der Abstufung 1-1O-2O-3O-4-O u g/ml usw. erhalten. Nach der 'Durchmischung und einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 24° wurde die Lösung in Jedem Rohr unter dem Mikroskop untersucht. Die Konzentration, bei der ein lOO^iges Absterben der Zellen vorlag, wurde bestimmt. In den nächsten Untersuchungsreihen wurden Lösungen zwischen der Konzentration, bei der lOO^iges Absterben vorhanden war, und der nächstniedrigen Konzentration untersucht, und die Konzentration bestimmt, bei der ein lOO^iges Absterben in 60 Minuten auftritt, für reines Antiamoebin lag die Konzentration für das Absterben bei 46 bis 48 u g pro ml.

iäin im Laboratorium gezüchteter Stamm von Ja. histolytica 909822/1160 I₅

wurde ebenfalls untersucht. Die Amoeben waren in flüssigem Balamuth-Boden gezüchtet worden,und die 48 Stunden alten Kulturen, die bei einer Inkubationstemperatur von 37° 0 erhalten wurden, sind untersucht worden. Die Amoeben wurden mit frischem Baliamuth-Boden, der Reismehl enthielt, gemischt, -^ie Anzahl der Amoeben wurde so verteilt, daß ungefähr 5 bewegungsiähige Amoeben pro 0,05 ml Lösung vorhanden waren. Es wurde eine Lösung von Antiamoebin mit demselben Lösungsmittel hergestellt und zunächst in einigen Tropfen Äthanol gelöst; das Balamuth-Medium, das die Trophoziten enthielt, wurde in Röhrchen verteilt und das Antibiotikum zugegeben, um die gewünschte Endkonzentration zu erhalten. Die Inkubationszeit betrug 48 Stunden bei 37° G, nach der Proben genommen wurden, die unter dem Mikroskop auf aktive Trophoziten untersucht wurden. Die Beobachtung nach 48-stündiger Inkubationszeit bei 37° C gaben folgendes Bildi

Kontrolle: .

(kein Zusatz von Antibiotikum)

1/100 mg/ml,

1/200 mg/ml. 1/300 mg/ml. 1/400 rag/ml. 1/500 mg/ml. 1/600 to 1/900 mg/ml,

l/lOOO mg/ml

Mehr als 45 bewegungsfähige Trophoziten pro Feld.

Vollständiges Absterben, keine Amoeben. das gleiche

Il I«

das gleiche. fiine oder höchstens zwei Amoeben bei 1/900 mg/ml. Eine oder zwei aktive, bewegliche Amoeben in 0,05 ml.

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1/2000 mg/ml. langsames Wachstum; ein bis zwei Amoe-

ben pro 0,05 ml.

1/2500 mg/ml. mehr als zwei Amoeben pro 0,05 ml. 1/5000 mg/ml. mehr als 10 Amoeben pro 0,05 ml. 1/LO.OOO mg/ml. mehr als 10 Amoeben pro 0,05 ml.

Die Wirksamkeit des Antiamoebins gegen Amoeben liegt zwischen 0,5 bis 1,25 Jü. g/ml. Die Aktivität für nicht bekannte Anwendungsfälle kann nach derselben Methode bestimmt werden. Das Antibiotikum ist oral nicht giftig; 10 g pro kg Körpergewicht wurden gut von Mäusen, Ratten, Mehrschweinchen, Hunden usw. vertragen. Die therapeutische Dosis zum Heilen von durch Protozoen oder Würmer hervorgerufenen Infekten bei Menschen und Tieren liegt bei nur 5 mg pro kg Körpergewicht, die oral eingenommen werden. Die Behandlungszeit ist weniger als 5 Tage für die vollständige Heilung; der therapeutische Effekt dieses Antibiotikums ist gut nachweisbar.

Patentansprüche

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Claims (10)

H67945 - 17 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums durch Züchten von Pilzstämmen in einem Kulturboden und Ab-taennen des erzeugten Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet , daß Stämme von Emericellopsis oder Cephalosporium, insbesondere: Emericellopsis synnematicola, Bmericellopsis poonensis, Oephalosporium pimprina und Stämme anderer Emerioellopsis-Arten wie Emericellopsis minima und Emerioellopsis humicola und ihre Konidienstufen in einem Kulturboden, der assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, gezüchtet werden, bis eine beträchtliche Menge des Antibiotikums in dem Kulturboden produziert ist und das Antibiotikum dann aus dem Kulttirboden gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, daduroh gekennzeichnet, daß die in dem assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenen Kulturboden vorhandenen Organismen unter aeroben Bedingungen in einer Tauchkultur, d.h. in einer unter einer Flüssigkeits-Oberflache befindlichen Kultur gezüchtet werden. "

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Organismen Bmericellopsis synnematicola, Emericellopais poonensis, Bmericellopsis humicola, Bmericellopsis minima und ihre Konidienstufen und Cephalosporium pimprina sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Kulturboden auf einer Temperatur zwischen etwa 20 und 37° G gehalten wird.

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5. Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß man die Organismen während eines Zeitraumes von 2 bis θ Tagen wachsen läßt.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung des Antibiotikums durch Extraktion des Kulturbodens bei einem beliebigen pH-Wert mit mit Wasser nicht mischbaren, polaren, organischen Lösungsmitteln und aliphatischen Alkoholen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen erfolgt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung des Antibiotikums durch Extraktion des Kulturbodens bei einem beliebigen pH-Wert mit aliphatischen Monoalkyläthern von Glykolen mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen durchgeführt wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion des Kulturbodens bei einem beliebigen pH-Wert und bei niedriger oder höherer Temperatur mit aliphatischen Ketonen mit 3 bis IO Kohlenstoffatomen erfolgt.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Mycelium (die Pilzkultur) mit Dimethylformamid extrahiert wird.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das abgeschiedene Antibiotikum, bei dem es aich um ein Polypeptid handelt, einer Reinigung unterworfen wird, einen Schmelzpunkt von 219 bis 220° C hat und die folgenden unterscheidbaren Bänder in einem Infrarot-Spektral-

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■bereich aufweist, 3320 bis 3290 (gebundenes NH), 1650, 1530 (GO und NH-Deformation), 1078, 695 cm"¹.

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