DE1467945A1 - Verfahren zur Herstellung eines gegen Wuermer und Protozoen wirksamen Antibiotikums - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines gegen Wuermer und Protozoen wirksamen AntibiotikumsInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung eines gegen Würmer und Protozoen wirksamen Antibiotikums.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
eines neuen anthelmintisohen und antiprotozoalen, d.h. gegen Würmer und Protozoen wirksamen Antibiotikums,
das im folgenden als Antiamoebin bezeichnet wird. In den vergangenen Jahren ist über verschiedene gegen Protozoen
wirksame Antibiotika, wie z.B. Paramomycin, Antiprotozoin, Hamycin, Puromycin, Afzalomycin-F, berichtet worden, die
gegen Entamoeba histolytica, Trypanosoma curzil, Trichomonas
vacinalis und andere Protozoen benutzt wurden, die Krankheiten bei Menschen und Tieren verursachen. Man ist zur Zeit
noch bemüht, ein wirksames Amoebicid gegen Bntamoeba hiatolytica,
wodurch in den Tropen Amöbiasis hervorgerufen wird,
zu finden, das als Mittel gegen Leber- und Darminfektionen
Verwendung finden soll und gleichzeitig ungiftig i3t.
Paramomycin steuert lediglich Darminfektionen, während
andere Chemikalien wie üimetinhydrochlorld, Arsen enthaltende
Mittel, Gluacarubin, Camoquin, lange Behandlungszeiten erfordern und schädliche Nebeneffekte hervorrufen.
Keine der oben erwähnten gegen Protozoen·wirksamen Antibiotika and Chemikalien besitzen anthelmintieche (vermifuge)
Eigenschaften.
Die Zahl von Würmern, die Menschen und Tiere, insbesondere in den Tropen, befallen, ist so groß, daß sie nicht
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namentlich erwähnt werden können. Würmer in den Därmen und anderen inneren Organen rufen Unterernährung und
verschiedene andere Krankheiten hervor. Spulwürmer, Madenwürmer und Bohrwürmer verringern bei schwerem Befall
der Därme das Wachstum von Kindern. Bandwürmer, Hakenwürmer und andere Arten verursachen chronische Leiden,
insbesondere rufen Hakenwürmer in unterernährten Bevölkerungsschichten Anämie hervor. Würmer, die bei auf Farmen
gehaltenen Tieren, bei Haustieren und Geflügel auftreten, gibt es in mehreren Dutzend verschiedenen Arten
und Gattungen; ihre Kontrolle ist eins der Hauptprobleme. Es gibt sehr wenige Antibiotika, wie Hygromycin und
Anthelamycin, von deren bekannt ist, daß sie antheimintische
Eigenschaften haben. Aus Japan wurde über Ascaricidin berichtet, daß es in begrenztem Umfang als Wurmmittel
eingesetzt werden könne. Die für Menschen und Tiere zur Zeit üblichen Behandlungsarten zum läntfernen von
Würmern sind sehr verschieden. Es werdenPiperazinsalze
verordnet, um Spul- and Madeovürmer zu entfernen. Ferner
benutzt man Bephenium- und Zinnsalze für Bandwürmer, Tetrachloräthylen und organische Phosphorverbindungen
gegen Hakenwürmer usw. -Bs sind auch toxische Verbindungen bekannt, die sehr erhebliche Nachwirkungen zeigen.
Da bessere und sichere Arzneimittel fehlen, müssen diese verordnet werden. Keins dieser Mittel ist methodisch wirksam,
so daß zur Zeit weder Antibiotika noch Chemikalien vorhanden sind, mit denen das Mikro3tadium bei Toxocara
und ausgewachsenen Würmer bei FilarLasia behandelt werden
können.
Im Verlauf eines Forschungsprogrammes zur Entwicklung
neuer gegen Protozoen und Würmer wirksamer Antibiotika
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beim „Research Laboratories of Hindustan Antibiotics
Research Centre, Pimpri, Poona 18, wurde das neue Antibiotikum Antiamoebin von drei Arten von Pilzen in großen
Mengen erhalten. Bs handelt sich um die Pilze Emericellopsis salmosynnemata Mathur und xhirumalachar, Emericellopsis
poonensis Thirumalachar und Gephalosporium pimprina Thirumalachar.
Es wurde gefunden, daß geringe Mengen dieses Antibiotikums auch von Stämmen von Emericellopsis huiiicola (Gain)
Gain (=E. humicola (Gain Gilman) und E. minima stolk erzeugt werden. Es ist bekannt, daß Emericellopsis das Endstadium
der vorangehenden Entwicklungsstufe Gephalosporium ist. Ein Bericht über den Pilz E. Synnematicola Mathur und
Thirumalachar ist von der Anmelderin in der Zeitschrift „Mycologia", Band 52, Seiten 694 bis 697, I960, veröffentlicht
worden, E. poonensis unterscheidet sich von E. synnematicola dadurch, daß er das Gephalosporium-Stadium für
seine Konidien erzeugt, das verscnieden ist von dem Stiibum-Typ der Konidio-Sporen in E. synneraaticola. Die Größe der
Sporen ist ebenfalls leicht verschieden. Gephalosporium p^rl^iprina Thirum gehört zu der Gruppe des Gephalosporium,
die von Sukapure und Thirumalachar beschrieben wurde.(Die Veröffentlichtung in„Mycologia" 13t zur Zeit in Druck).
Es erzeugt nicht den Perithel-Zustand und die Kolonien
sind weiß und breiten sich aus. Die Konidio-Sporen haben eine Größe von 20 bis 30 ü, die Konidien von 8 bis 10 mal
4 bis 6 u, sind elliptisch, glasklar und glatt.
Die Erfindung umfaßt einenfermentativen Prozess zur Erzeugung
einer der drei oben erwähnten Pilzarcen und auch von ausgewählten Stämmen von &, humicola und JS, minina durch
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BAD
Wachstum in einem Kulturboden, der eine anpaßbare Kohlehydratquelle,
Stickstoff und anorganische Salze enthält. Um in wirtschaftlicher Weise maximale Ausbeuten des Antibiotikums
zu erhalten und dieses leicht abtrennen zu können werden bestimmte Kulturböden vorzugsweise verwendet.
Beispielsweise sind bevorzugte Kohlehydratquellen in dem Kulturboden Glukose, Rohrzucker und Stärke. Andere Quellen
können beispielsweise Dextrin, Melasse und Milchzucker sein. Als Stickstoffquellen können Getreide, Sojabohnen und Erdnußmehl,
verschiedene Hülsenfrüchte, bei bestimmten Destillationen anfallende Lösungen, Kasein, aminosäure Gemische
sowie pflanzliche und tierische Peptone und dergleichen verwendet werden. Anorganische Stickstoffträger bestehen
aus Nitraten und Ammoniumsalzen j die anorganischen Nährsalze, die in das Medium eingebracht werden, bestehen aus
üblichen Salzen, die fähig sind, Natrium,- Kalium,- Galzium,-Phosphat-,
Chlorid-, und Sulfationen oder dergleichen zu erzeugen. Die wesentlichen Spurenelemente, die das Wachstum
des Pilzes fördern, und höhere Ausbeuten ergeben, werden ebenfalls in den Kulturboden eingebracht. Derartige
Spurenelemente sind häufig als Verunreinigungen in den Ausgangsstoffen vorhanden.
Zur Erläuterung des Verfahrens zur Herstellung von Antiamoebin
wird die Behandlung eines Stammes von Emericellopsis poonensis beschrieben. Die gleichen Resultate erhält man
auch mit den anderen oben erwähnten Arten und Stemmen. Der E. poonensis SLA-I kann auf einem Kulturboden bei
Temperaturen von etwa 24 bis 37° C gezüchtet werden, der verschiedene Nährstoffe enthält; die optimale Temperatur
liegt bei 28° C. Geeignete Kulturböden sind solche aus Kartoffelstärke,
aus Glukose-Peptonen sowie die sogenannten
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Sabouraud- oder Czapeks-Böden. -Der Pilz wächst als weiße Kolonie, die einen Luftpilz entwickelt,und eine
große Anzahl sphärischer Konidium-Massen entsteht auf
Konidiumsporen, was typisch für Gephalosporium ist. Nach
einer Inkubationszeit von ungefähr 10 bis 15 Tagen erscheinen schwarze Punkte, die über die Kolonie verteilt
sind. Hierbei handelt es sich um das Endstadium des Pilzes, das dem Emericellopsis-Stadium entspricht. Zur Herstellung
des Antibiotikums sind 6 bis 8 Tage alte Kolonien geeignet, die eine Vielzahl von Konidien besitzen.
Zur Herstellung begrenzter Mengen des Antibiotikums können Schüttelflaschen und Oberflächenkulturen in Flaschen
verwendet werden. Zur Herstellung größerer Mengen benutzt man Fermentations-Gefäße aus rostfreiem Stahl, mit Einrichtungen
zum Belüften und Umrühren. Ferner ist eine Temperaturkontrolle und die Möglichkeit erforderlich, sterile
Bedingungen zu schaffen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
läßt man da8 vegetative Inokulum des Pilzes in einem
Zuchtgefäß wachsen und inokuliert mit einem reinen Kulturboden mit Konidien, Askosporen, Pilzen oder Mischungen hiervon.
Wenn das vegetative' Wachstum mit dem jungen und schnell
wachsenden Pilz stattgefunden hat, wird das Inoculum aseptisch in große Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative
Inoculum entwickelt wird, kann dasselbe oder ein anderes sein, wie das, das man für die Herstellung des
Antibiotikums benutzt.
Wie es bei der Herstellung von Antibiotika durch Züchtung üblich ist, wird sterile luft durch den Kulturboden geleitet,
die durch Umrühren verteilt wird. Die Luftmenge ändert sich von 0,1 bis 1 Volumen Luft in der Minute pro Volumen
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Kulturboden. Der anfängliche pH-Wert des Mediums kann
zwischen 4 und 7*5 liegen, obschon der bevorzugte Wert 6,5 ist. Die Temperatur liegt zwischen 24 und 28°, die
Fermentation wird 72 bis 120 Stunden lang durchgeführt, wobei der pH-Wert sich am Ende der Fermentation zur alkalischen
Seite verschiebt. Im Anschluß daran erfolgt die Herstellung des Antibiotikums, indem man periodisch eine
bestimmte Menge des Bodens abzieht, die halbe Menge n-Butanol zusetzt, das ganze zur Extraktion durchrührt und
das Butanol durch Zentrifugieren abtrennt, worauf man
das Butanol unter Vakuum verdampft. Der Rest wird mit Methanol extrahiert und gefiltert. Die Lösung wird bis zum
Eintrocknen verdampft und die Menge des Antibiotikums,
die zurückbleibt, bestimmt. Diese gravimetrische Bestimmung gibt zufriedenstellende Resultate und Ausbeuten von
85 bis 90 $> von in dem Kulturboden enthaltenen Antibiotikum.
Im allgemeinen findet die maximale Produktion des Antibiotikums
nach der Inoculierung des Kulturbodens in 3 bis 5 Tagen statt, wenn ein untergetauchter Boden verwendet
wird, und in 8 bis 15 Tagen, wenn eine Oberflächenkultur benutzt wird. Das gemäß der Erfindung hergestellte Antibiotikum
kann von dem Kulturboden durch Extraktion und Absorption gewonnen werden. Die erstgenannte Methode wird
zur Herstellung größerer Mengen bevorzugt, da die Ausbeute hierbei besser ist. Zur Extraktion des Antibiotikums
von dem FiItrat des Kulturbodens werden wasserunlösliche
polare, organische Lösungsmittel bevorzugt, zur Extraktion von dem Pilz kann man aliphatische Alkohole wie Methanol,
Äthanol, Butanol, Propanol, Isopropanol, Methyl- und Äthyl-Cellosolve
(Äthylenglukose-monomethyl-(bzv;. äthyl)äther), wässriges Azeton und dergleichen benutzen. Bevorzugt erfolgt
die Extraktion durch Filtrieren des Bodens und ge-
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trennte Extraktion des Filtrates und des Pilzes. Von dem Mycelium oder Pilz kann das Antibiotikum mit allen
niedrigen Alkoholen, wie Methanol und Äthanol, Isopropanol,
wässrigem Azeton, Methyl- und Äthyl-Oellosolve,
Pyridin , Dimethyl-Formamid, extrahiert werden.
Das in dem organischen Lösungsmittel enthaltene Antibiotikum kann durch Eindampfen im Vakuum gewonnen werden,
wobei es als !Rohprodukt anfällt. Man kann das Antibiotikum
auch mittels Aktivkohle, Magnesium-Aluminium-Silikat und dergleichen adsorbieren. Eluieren des Antibiotikums
ist nur teilweise mittels organischer Lösungsmittel möglich, in denen es löslich ist.
Wenn nur das bevorzugte Extraktionsverfahren angewandt wird, wird der Kulturboden gefiltert und das FiItrat mit
1/3 Volumen n-Butanol extrahiert. Das Butanol wird abgetrennt, im Vakuum auf 1/20 des Volumens konzentriert und
das Antibiotikum durch Benutzen eines damit mischbaren Lösungsmittel wie Azeton ausgefällt; man kann statt Azeton
auch eine Mischung von miteinander mischbaren Lösungsmitteln wie Azeton und Benzin benutzen. Das rohe Antibiotikum
wird einer weiteren Reinigung unterworfen. Der Pilz kann zweimal mit n-Butanol extrahiert werden, und man kann
den für die Filtration beschriebenen Prozess ausführen. Vorzugsweise extrahiert man das Mycelium mit Methanol oder
Äthanol und filtriert dann. Der Methanol- oder Äthanolextrakt
wird mit entfärbender Kohle behandelt, und verdampft bis zur Entfernung des Alkohols. Das Antibiotikum bleibt
gewöhnlich als weißer Rückstand, meist in kristalliner Form zurück. Die erhaltenen Kristalle werden durch Filtration
abgetrennt und zwecks weiterer Reinigung rekristallisiert.
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Zur Reinigung des rohen oder gegebenenfalls schon vorgereinigten
Produktes wird dieses in 30 bis 45 Ί» warmem
Äthanol oder Methanol gelöst, mit entfärbender Aktivkohle behandelt, in warmem Zustand gefiltert, auf Raumtemperatur
gekühlt und auf dieser Temperatur 4 bis 6 Stunden gehalten, worauf man das Produkt über Nacht in einen Kaltraum
mit einer Temperatur von 5 C überführt. Große Mengen nagelscharfer, weißer Kristalle werden gebildet, die
gefiltert, dann mit Wasser gewaschen und getrocknet werden. Das Antibiotikum "Antiamoebin" hat folgende Eigenschaften:
Neutrales Polypeptid,
Form und Farbe» Weiße, buscheiförmige Nadeln, leicht,
bitter und geruchlos.
Schmelzpunkt« 219 bis 220° C (d)
Optische Aktivität
U.V. Absorptionamaximai
löslichkeit«
(et) D25+ 10 (C, 1.02 # in Methanol)
(a) D25+ 10 (C, 1.03 °h in DMF)
Bndabsorption
3320-3290 (gebundenes NH). 1650, 1530 (CO und NH-Deformation), 1078, 695 CM
-1
Löslich in Methanol, Äthanol, Butanol, n-Propanol, Isopropanol, Pyridin, Eisessig,
Dimethylformamid, wässrigem Azeton, feuchtem Methyläthylketon und Methyl- und
Äthyl-CellOBOlve. Unlöslich in Wasser, ChIo-
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roform, Äther, Benzin, Äthylazetat, Butylazetat, Azeton, Toluol , Tetrachlorkohlenstoff,
Dioxan, Benzol, Schwefelkohlenstoff, Methylchiorid und Äthylenglykol.
Weitere Reaktionen: Negativ: Fehlingsche Perri-Ghloridlöaung,
Benedict-, Nolisch-, Sokaguchi-Test, sowie
Reaktion mit Ninhydrin, Biuret und Anthron. Positive Xanthoproteinreaktion.Nach einstündiger
Alkalihydrolyse positive Biuret-Reaktion, Hydrolyse mit 6 η-Salzsäure in einem verschlossenem Rohr während 16 Stunden
ergibt 11 positive NinhydrIn-Ii1Iecken bei
zweidimensionaler Papierchromatographie. Die folgenden Aminosäuren werden bestimmt durch
ein- und zweidimensionale Papierchromatographien mit Hilfe von Standard-Aminosäuren.
Prolin, ct-Aniinoisobuttersäure, Phenylalanin,
Valin, Leucin, Hydroxyprolin, Lysin und Glutaminsäure.
Analyse: G, 56.11, H, 7.56, N, 15.56 #.
Halogen- und Schwefelreaktionen sind negativ.
Die U.V.- und I.R.-Spektren von Antiamoebin in Nujol sind
auf den Zeichnungen dargestellt; Figur 1 zeigt das UV-Spektrum und die Figuren 2 und 3 das IR-Spektrum für zwei verschiedene
Bereiche.
Herstellung von Antiamoebin
Zunächst wird airk Inoiruljam-iRoden folgender Zusammensetzung
Zunächst wird airk Inoiruljam-iRoden folgender Zusammensetzung
- 10 hergestellt»
pH 6,5 bis 7 | 2,0 |
Sojabohnenmehl | 2,0 |
Glukose | 0,3 |
Aminoniumsulfat | 0,25 |
Natriumchlorid | 0,6 |
Galziumkarbonat | |
Das Medium von 50 Litern wird bei 15 lbs. 30 Minuten
lang sterilisiert und bei Kühlung auf 28° G mit 48 Stunden vegetativ gewachsenen Emericelopsis synnematicola
oder E. poonensis inokuliert (geimpft). Das Inokulum, das man vorzugsweise benutzt, erzeugt man vorher in Schüttelflaschen;
es wird unter dem Mikroskop für starkes Wachstum berechnet. Während der Wachstumsperiode in den 50 Litern
Boden wird belüftet und umgerührt. Dies erfolgt unter sterilen Bedingungen. Es werden 0,5 Vol. Luft pro Vol. Kulturboden
und Min. benutzt.
Das Inokulum wird nach 58-stündigem Wachstum in einen Fermentationstank
überführt, der 100 1 eines Mediums mit folgender Zusammensetzung enthält»
So j ab ohnenmehl | 2,5 % |
Glukose | 3,0 i» |
Ammoniumsulfat | 0,5 5* |
Natriumchlorid | 0,25 : |
Galziumkarbonat | 0,5 °/o |
ph 6,5 bis 6,8
Das Medium wird durch Erhitzen unter Druck bei ungefähr "
909822/1160 -H-
110° C 30 Minuten lang sterilisiert. Die Temperatur wird auf 28° C gesenkt, und das Inokulum von 50 1 aseptisch in
dieses Gefäß eingebracht. Während der Wachstumsperiode wird der Boden gerührt, und sterile Luft in einer Menge
von 0,5 bis 1 Vol. pro Vol. Boden und Min. eingeblasen. Das Wachstum dee Myceliums und die Antibiotikumproduktion
wird von Zeit zu Zeit gravimetrisch bestimmt. Nach 96 bis 120 Stunden, die üblicherweise benötigt werden, wird der
pH-Wert des Bodene auf 5 eingestellt und eine Filtration vorgenommen. Das FiItrat wird gesammelt und mit 1/3 Vol.
n-Butanol extrahiert, wobei ein Extraktor zum Durchmischen und Überführen des Antibiotikums vom Boden in das Lösungsmittel
benutzt wird. Das Mycelium wird in ähnlicher Weise zunächst mit 1,5 VoI Butanol pro kg. Mycelium extrahiert,
worauf eine zweite Extraktion erfolgt, bei der man 1 Liter Butanol pro kg. Mycelium benutzt. Nach gründlicher Extraktion
unter Umrühren wird das Butanol abfiltriert und stehengelassen.
Es wird mit dem Butanolextrakt des Bodenfiltrates
gemischt. Die Butanolextrakte unterwirft man zur Entfernung
der Salze und dergleichen einer Wäsche mit Wasser, worauf man sie im Vakuum auf ungefähr 30 Liter konzentriert. Die
Butanollösung hat zu Beginn ein Volumen von ungefähr 600
Große Mengen von Schlamm, die aus dem rohen Antibiotikum bestehen, fallen an. Der Schlamm wird gefiltert, mit Azeton
gewaschen und getrocknet. Zu der Butanollösung wird nach
Abfiltrieren des Schlammes die dreifache Menge Azeton gegeben und die Lösung 24 Stunden lang bei 10° G gehalten·
Der cremige gelbe Niederschlag wird gefiltert, mit Azeton gewaschen und getrocknet.
Das so erhaltene rohe Antiamoebin wird mehrfach mit Wasser gewaschen bis kein gelblich gefärbter Stoff mehr abgegeben
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wird und in warmem, 45#igen Methanol aufgelöst und bei
50° 0 auf dem Wasserbad gehalten. Man gibt einen Überschuß von Antiamoebin hinzu, bis es sich nicht mehr auflöst.
Anschließend wird Aktivkohle (1$ des Methanolextraktes)
zugefügt und in warmem Zustand filtriert. Die Lösung wird dann 3 bis 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten
und dann in einen kalten Raum gebracht und dort über Nacht bei 5° stehen gelassen. Große Mengen von nadelscharfen
Kristallen fallen in Bündeln aus; sie werden gefiltert, mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.
Eine zweite Kristallisation kann in der gleichen Weise ausgeführt werden.
Der ffermentationsprozess wird in derselben Weise ausgeführt
wie in Beispiel 1 beschrieben. Der Pilz, der den Hauptteil des Antibiotikums enthält, wird gefiltert, während
der pH-Wert des Nährbodens auf 5 eingestellt wird. Der Pilz wird gewaschen und mit Methanol extrahiert, wobei
für die erste Extraktion 1,5 1 Methanol pro kg Pilz und für die zweite Extraktion 1 Liter Methanol pro kg
Pilz benutzt werden. Das Methanol wird gefiltert und das Extrakt mit Aktivkohle zum Entfärben behandelt und gefiltert,
wobei 0,5 1» Aktivkohle benutzt werden. Dae Extrakt
wird im Vakuum bei einer Temperatur von 45 bis 50° verdampft. Dies ist wegen des in dem Methanolextrakt enthaltenen
Wassers möglich. 600 Liter des Methanolextraktes werden auf 30 Liter eingedampft; dabei scheidet sich Antiamoebin
als weißer Schlamm aus, der größtenteils kristallisiert ist. Die rohen Kristalle werden gefiltert, mit
Wasser gewaschen und getrocknet. Anschließend werden sie
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- 13 -
H679A5
in 45 i» Methanol enthaltendem Äthanol aufgelöst, mit
Aktivkohle behandelt, gefiltert und in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, rekriatallisiert.
Das Nährbodenfiltrat wird mit Aktivkohle behandelt, wobei
2 g pro Liter Nährboden benutzt werden. Die Aktivkohle wird mit Butanol, Methanol oder Äthanol herausgelöst
und die so erhaltene Lösung eingedampft. Auf diese Weise wird Antiamoebin durch Rekristallisation von dem
so erhaltenen Stoff gereinigt.
Der Fermentationsprozess wird, wie bei Beispiel 1 und 2 beschrieben, durchgeführt und der Pilz mit Äthyl- oder
Methyl cellosolve extrahiert, das Jäxtrakt konzentriert,
um das rohe Antibiotikum zu erhalten. Das Rohprodukt wird, wie vorstehend beschrieben, weiter behandelt.
Die Fermentation erfolgt wieder in der in den Beispielen
1 und 2 beschriebenen Weise und der Pilz wird mit wässrigem Azeton oder Dimethylformamid extrahiert, das Extrakt
konzentriert und das rohe Antibiotikum gereinigt und kristallisiert.
Die Fermentation erfolgt wie gemäß Beispiel 1 und 2. Der Pilz wird mit heißem Amylalkohol oder ZyKbhexanol
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extrahiert und das Extrakt konzentriert, um rohes Antibiotikum
zu erhalten.
Die Aktivität dea Produktes wird durch eine biologische Versuchsmethode zur Bestimmung der antiprotozoalen Aktivität
bestimmt, wobei Tetrahymena pyriformis und Bntamoeba
histolytica benutzt werden. Bei den Versuchen wurde Tetrahymena
pyriformis benutzt.
Es wurden Kulturen verwendet, die auf einem Sojabohnenextrakt und Erdnußmehl-Sud erhalten wurden.
Antiamoebin-Standardmaterial wurde verwendet und eine wässrige Lösung von 1 mg pro ml hergestellt. DaB Antibiotikum
muß vorher in einigen Tropfen Äthanol aufgelöst werden. Gleiche Mengen einer flüssigen Tetrahymena-Kultur,
die 2 x 10 Zellen pro ml enthielten, wurden in Röhrchen gefüllt. Durch übliche Auflösung wurde eine
Konzentration des Antibiotikums von 1 bis IGDu g pro ml
in der Abstufung 1-1O-2O-3O-4-O u g/ml usw. erhalten. Nach
der 'Durchmischung und einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 24° wurde die Lösung in Jedem Rohr unter dem
Mikroskop untersucht. Die Konzentration, bei der ein lOO^iges Absterben der Zellen vorlag, wurde bestimmt.
In den nächsten Untersuchungsreihen wurden Lösungen zwischen der Konzentration, bei der lOO^iges Absterben vorhanden
war, und der nächstniedrigen Konzentration untersucht, und die Konzentration bestimmt, bei der ein
lOO^iges Absterben in 60 Minuten auftritt, für reines
Antiamoebin lag die Konzentration für das Absterben bei 46 bis 48 u g pro ml.
iäin im Laboratorium gezüchteter Stamm von Ja. histolytica
909822/1160 I5
wurde ebenfalls untersucht. Die Amoeben waren in flüssigem
Balamuth-Boden gezüchtet worden,und die 48 Stunden
alten Kulturen, die bei einer Inkubationstemperatur von
37° 0 erhalten wurden, sind untersucht worden. Die Amoeben wurden mit frischem Baliamuth-Boden, der Reismehl enthielt,
gemischt, -^ie Anzahl der Amoeben wurde so verteilt,
daß ungefähr 5 bewegungsiähige Amoeben pro 0,05 ml Lösung
vorhanden waren. Es wurde eine Lösung von Antiamoebin mit
demselben Lösungsmittel hergestellt und zunächst in einigen
Tropfen Äthanol gelöst; das Balamuth-Medium, das die
Trophoziten enthielt, wurde in Röhrchen verteilt und das Antibiotikum zugegeben, um die gewünschte Endkonzentration
zu erhalten. Die Inkubationszeit betrug 48 Stunden bei 37° G, nach der Proben genommen wurden, die unter dem Mikroskop
auf aktive Trophoziten untersucht wurden. Die Beobachtung nach 48-stündiger Inkubationszeit bei 37° C gaben folgendes
Bildi
Kontrolle: .
(kein Zusatz von Antibiotikum)
1/100 mg/ml,
1/200 mg/ml. 1/300 mg/ml. 1/400 rag/ml. 1/500 mg/ml. 1/600 to 1/900 mg/ml,
l/lOOO mg/ml
Mehr als 45 bewegungsfähige Trophoziten pro Feld.
Vollständiges Absterben, keine Amoeben. das gleiche
Il I«
das gleiche. fiine oder höchstens zwei Amoeben bei 1/900 mg/ml.
Eine oder zwei aktive, bewegliche Amoeben in 0,05 ml.
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1/2000 mg/ml. langsames Wachstum; ein bis zwei Amoe-
ben pro 0,05 ml.
1/2500 mg/ml. mehr als zwei Amoeben pro 0,05 ml. 1/5000 mg/ml. mehr als 10 Amoeben pro 0,05 ml.
1/LO.OOO mg/ml. mehr als 10 Amoeben pro 0,05 ml.
Die Wirksamkeit des Antiamoebins gegen Amoeben liegt zwischen 0,5 bis 1,25 Jü. g/ml. Die Aktivität für nicht bekannte
Anwendungsfälle kann nach derselben Methode bestimmt werden. Das Antibiotikum ist oral nicht giftig; 10 g pro kg
Körpergewicht wurden gut von Mäusen, Ratten, Mehrschweinchen,
Hunden usw. vertragen. Die therapeutische Dosis zum Heilen von durch Protozoen oder Würmer hervorgerufenen Infekten
bei Menschen und Tieren liegt bei nur 5 mg pro kg Körpergewicht, die oral eingenommen werden. Die Behandlungszeit ist weniger als 5 Tage für die vollständige Heilung;
der therapeutische Effekt dieses Antibiotikums ist gut nachweisbar.
Patentansprüche
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Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums durch Züchten von Pilzstämmen in einem Kulturboden und Ab-taennen
des erzeugten Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet , daß Stämme von Emericellopsis
oder Cephalosporium, insbesondere: Emericellopsis synnematicola,
Bmericellopsis poonensis, Oephalosporium pimprina und Stämme anderer Emerioellopsis-Arten wie Emericellopsis minima
und Emerioellopsis humicola und ihre Konidienstufen in
einem Kulturboden, der assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, gezüchtet werden,
bis eine beträchtliche Menge des Antibiotikums in dem Kulturboden produziert ist und das Antibiotikum dann aus dem
Kulttirboden gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, daduroh gekennzeichnet, daß
die in dem assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenen Kulturboden vorhandenen Organismen unter aeroben Bedingungen in einer Tauchkultur, d.h.
in einer unter einer Flüssigkeits-Oberflache befindlichen
Kultur gezüchtet werden. "
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Organismen Bmericellopsis synnematicola,
Emericellopais poonensis, Bmericellopsis humicola, Bmericellopsis
minima und ihre Konidienstufen und Cephalosporium
pimprina sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der Kulturboden auf einer Temperatur zwischen etwa 20 und 37° G gehalten wird.
- 18 -
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5. Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß
man die Organismen während eines Zeitraumes von 2 bis θ Tagen wachsen läßt.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung des Antibiotikums durch Extraktion
des Kulturbodens bei einem beliebigen pH-Wert mit mit Wasser nicht mischbaren, polaren, organischen Lösungsmitteln
und aliphatischen Alkoholen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen erfolgt.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung des Antibiotikums durch Extraktion
des Kulturbodens bei einem beliebigen pH-Wert mit aliphatischen Monoalkyläthern von Glykolen mit 3 bis 6
Kohlenstoffatomen durchgeführt wird.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion des Kulturbodens bei einem beliebigen
pH-Wert und bei niedriger oder höherer Temperatur mit aliphatischen Ketonen mit 3 bis IO Kohlenstoffatomen
erfolgt.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Mycelium (die Pilzkultur) mit Dimethylformamid
extrahiert wird.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,
daß das abgeschiedene Antibiotikum, bei dem es aich um ein Polypeptid handelt, einer Reinigung unterworfen
wird, einen Schmelzpunkt von 219 bis 220° C hat und die folgenden unterscheidbaren Bänder in einem Infrarot-Spektral-
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■bereich aufweist, 3320 bis 3290 (gebundenes NH), 1650,
1530 (GO und NH-Deformation), 1078, 695 cm"1.
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Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DEH0057665 | 1965-11-12 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1467945A1 true DE1467945A1 (de) | 1969-05-29 |
DE1467945B2 DE1467945B2 (de) | 1974-01-03 |
DE1467945C3 DE1467945C3 (de) | 1974-07-25 |
Family
ID=7159844
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1467945A Expired DE1467945C3 (de) | 1965-11-12 | 1965-11-12 | Verfahren zur Herstellung eines gegen Würmer und Protozoen wirksamen Antibiotikums |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE1467945C3 (de) |
-
1965
- 1965-11-12 DE DE1467945A patent/DE1467945C3/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE1467945B2 (de) | 1974-01-03 |
DE1467945C3 (de) | 1974-07-25 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
EHJ | Ceased/non-payment of the annual fee |