DE1442046A1

DE1442046A1 - Verfahren zur Herstellung von Orotidin

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Publication number: DE1442046A1
Application number: DE19631442046
Authority: DE
Inventors: Shimpachi Konishi; Shinji Okumura; Teruo Shiro; Masahiro Takahashi
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1962-11-20
Filing date: 1963-11-19
Publication date: 1968-11-21
Also published as: GB1006732A; US3275526A

Description

Verfahren znr H«rs+;ellung von Orotidin«

Die "Srfinrhinp betrefft ein Terf^hren zur herstellung von Orotidin durch bakterielle Fermentation unter aeroben Bedingungen·

Orotidin (^Cö^C^rboxy-uracil-N-ribosid) ist eine Substanz, die durch Kombination von Orotinsäure (orotic acid) und Ribose erhalten wird und eine Hrmptkomponente der Orotidylsäure (orotidylic acid) darstellt« Die ürdrt idyl satire wird im Verlauf der Pyrimidinnucleofcidsynthese als Precursor des Pyrimidinnucleosids, einem wichtigen Element der Nncleinsäure, erhalten.

(Es ist bekannt, dass Orotidinsäure ein nützliches^ Pharmazeutikum darstellt. Es hat aber nicht die Aufmerksamkeit auf Orotidin gezogen, da es wegen de"^ Schwierigkeiten der chemischen Synthese nicht in grosser Menge billig zur Verfügung steht und kaum in in der Natur vorkommenden Materialien unter freien Bedingungen zu finden ist.

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BAD

Orotidin si'eht dem Pyriffiidinnuoleotid strukturell näher als Orotinsäure. "Jenri ep. daher itiglglich sein sollte, es billig; in industriellem Masstab horzustelTei, wäre eine zunehmende Verwendung auf den G^bi^ten der Medizin und der Chemie zu erwarten, Das umso mehr, als sich der Prozess zur -^ildunp: von Nur leinsäure und deren verwandten Verbindungen in industriellem Easstab eignet und einen grossen Beitrag auf diesem Gebiet darstellt. Infolgedessen

er; ·
stellt der aerobe jaafetfxelle Fermentationsprozess eremäss Erfindung eine Pioniererfindung dar.

Ein Charakteristikum der Erfindung besteht in der Kultivierung von künstlich induzierten biochemischen Mutanten von Bakterien, die die ■Fähigkeit haben, Orotidin extracellular in einem Kulturmedium,das Lieferanten für assimilierbaren Kohlenstoff, für assimilierbaren Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen zu produzieren und c"as in den ^?-'T^d.ium angereicherte Or|)tid.in zu isolieren.

Es gelang, künstlich induzierte biochemische Mutanten des Bacillus subtilis zu erhalten, die sich für die Produktion von Orotidin in industriellem Masstab eignen. Da die Fähigkeit der Mutanten, Orotidin zu bilden, sehr stark ausgeprägt ist, gelang es, eine Methode zur ferment*>tiven Produktion von Orotidin zu entwickeln« .

Die geiaäss Erfindung benutzten Stämme sind künstlich induaierte biochemische Mutanten, die Orotidin extrazellular produzieren.und anreichern können und ihre·Ausgangsstämme (parent str^ainV) irr Abhängigkeit von Bac&llus subtilis« Diese Ausgangsstamme können gewöhnlich nicht grössere Orötidinmengen produzieren. Nach folgenden Methoden werden die biochemischen Mutanten von Bakterien, die gemäss Erfindung verwendet werden, induziert«

BAD ORIGINAL-809809/0704

Werden die vegetativen Zellen oder Sporen der -^tvusF^w-ngsstämine von Bacillus subtilis UV-Licht, Röntgen« oder γ-Strahlen ausgesetzt oder mit einer Netriumnitritlösung in Berührung gebracht, dann werden die biochemischen Mutanten, die extrazellular Orotidin in einem aeroben Kulturmedium zu bilden vermögen, induziert.

Gie werden aus den unveränderten Btämmen mittels den konventionellen Siebtechniken und unter Nutzung der Tatsache ausgewählt, dass die Mutanten auxotroph sind,(vgl. Werner Brown "Bacterial Geneties"

<ist> W.B.öaundere Company (1953))· Das Minimalmedium,/das für die Siebung der biochemischen Mutanten (Nährstoff benötigende Mutanten) benutzt wurde,/aas in Tabelle I erläuterte Gray-Tatum-Medium. Die ^usgangsstämai· des Bacillus subtilis können gewöhnlich auf diesem Gray-Tatua-Mediuin wachetn. Wenn die ^uegamrsstämme schon einige Materialien für dae Wachstum· brauchten, wurde» das modifizierte Gray-Tatum-Mediun (gewöhnlich mit d«n für die ^Ausgangsstamme benöt^gten Materialien versetzt) benutzt. Jedoch die gemäss Erfindung benutzten biochemischen Mutanten wachsen nicht auf derartigeu%

Tabelle I

Gr ay-T al"^? ι m-M <= dium

Arr.iaoniumchlorid . ^ ff

Amsoniumnitrlit 1 et

Natriumsulfat 2 g

f at o,1

Tihosphat 3 g

K^liumdihydroctenrihosphat 1 g

Calciumchlorid 1 si»

Zinksulfat P,P

o,^Q m^ o," m-3 o,o7 mn·

_n BAD ORIGiNAU

Iticose o,^ 3·

η η r\ f\ r* ** t — m· — ·

Die Orotidinbildungsgeschwindigkeit in dem Siebmedium für die Orotidinproduktion sowie die maximale Orotidinkonzentration, die erreicht wurde, wurde bestimmt,und die künstlich induzierten biochemischen Mutanten, die am besten Orotidin produzieren und anreichern könnten,wurden ausgewählt, üie Zusammensetzung des Siebmediums ist in Tabelle II angegeben.

Tabelle II Siebmedium für die Orotidinprodulction

Glucose 5 %

Kaliumdihydrogenphosphat ο,2 %

Magnesiumsulfat-Heptahydrat o,o4 %

Ferrosulfat 0,0005 %

Mangansulfat o,ooo5 %

Hefeextrakt 0,5 %

Ammoniumchlorid o,4- %

Harnstoff 0,6 %

Pepton o,5 %

Zur Bestimmung der ^rotidinkonzentration in dem Fermentationsmedium wurden verschiedene Analysenmethoden angewandte Hiervon haben sich die Papierchromatographie, die Filterpapierelelttrophorese, die Oroinolreaktion für Ribose und das UV-Absorptionsspektrum als die zweckmässigsten, zur Bestimmung der verschiedenen Komponenten in dem analysierten Medium erwiesen. Die Identifizierung der isolierten Kristalle wurde mit den konventionellen Vergleichstesten, wie UV-Absorptionsspektrum, Infrarotspektrum, Schmelzpunkt, H^-Wert der-Papierchromatographie, Wanderung bei der Filterpapierelektrophorese, Elementaranalyse wowie die Orcinolreaktion mit authentischen Orotidinproben durchgeführt»

BAD ORfGfNAL

"Die kpnstlich induzierten biochemischen Mutanten, die Orotidin produzieren und anreichern können, benötigen gewöhnlich Uracil, Uridin oder Uridylsäure für ihr Wachstum* E¹Ur den Verlauf der biologischen Synthese von Pyrimidinnucleo^Lden (in ^ig.i gezeigt) kann gesatrt werden, dass die genannten Mutanten der geduldete» (suffered) genetische Block zwischen der Orotidylsäure und der Uridylsäure bei den Mutationstechniken sind, so dass sie Uracil, Uridin oder Uridylsäure für das Wachstum brauchen, ebenso wie die Bildung und Anreicherung von Orotidin·

■^ig.i Biologische Synthese von PyrimidinnucleofcLd und

Mechanismus der Abscheidung von Orotidin durch Mutanten

Lieferant für Genetischer Block

assimilierbaren—τ

Kohlenstoff

f-^Orot insäur β —> Orotidylsäure Lieferant für

Uridindiphosphat

Orotidin φ

U.!Γ.P.: (iml Medium) U.T.P.

uridin- » ι

^riphosphat Orttinsäure ^

Typische künstlich induzierte biochemische Mutanten der weiter oben erwähnten Mikroorganismen, die Orotidin im Kulturmedium bilden und anreichern konnen,sind Bacillus subtilis Stamm No.167 (ATCC 15181), No.217 (ATCC 15182), No.3o9 (ATCC 15183) und No.2-317 (ATCC 15184)· i

BAD ORIGINAL 809809/0704

—ο—

Stamm Nr. 2-217 ist dadurch, gekennzeichnet, dass er für das Wachstum Adenin, Adenosin oder Adenylsäure und Uracil, Uridin oder Uridylsäure braucht, während die anderen/Stamme nur Uracil, Uridin oder Uridylsäure benötigen. Namentlich der Stamm Nr.2-217 wurde von der Adenin benötigenden Mutanten des Bacillus subtilis induziert, der auf dem modifizierten Gray-Tatum-Medium,. das 1 mg% Adenin enthält, wachsen kann· Die Stämme Nr·167» 217 und 3o9 können nicht auf dem Gray-Tatum-Medium wachsen, es sei denn, ihm wird Uracil, Uridin oder Uridylsäure zugesetzt· Ferner,wird Adenin, Adenosin oder Adenylsäure einem Uraejlderivate enthaltenden Gray-Tatum-Medium zugesetzt! dann kann Stamm Nr. 2-217 auf dem Medium wachsen. Dieser Stamm Nr«2—217 kann eine geringe Menge Orotinsäure neben einer grosen Orfctidinmenge in dem Eermentationsmedium produzieren und anreichern·

Das Medium, auf dem die Mutantenstämme der Erfindung kultiviert werden, sollte assimilierbare Kohlenst.efflieferanten, assimilierbare Stickstofflieferanten, gewisse anorganische Salze und Nährstoffe, die von den Mikroorganismen benötigt werden j enthalten· Ausserdem sollte das Medium #o hergestellt werden, dass es sowohl für das Bakterienwachstum als auch für den ^ortgahgider Orotidinfermentation brauchbar ist#

Lieferanten für assimilierbare Kohlenstoffverbindungen stellen Kohlenhydrate dar, wie lösliche Stärke, Stärkehydrolysat» Glucose» Saccharose und zuckerreiche industrielle Produkte. Tabelle III. veranschaulicht die Aenderungen in der Orotidinbildung in Abhängigkeit von den verschiedenen zugesetzten Kohlenetoff lief ereilten· Orotidinwerte in g/l wurden mit Bacillus eubtilis No, 167

BAD

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Νο·2-217 unter aeroben Bedingungen (2o ecm Medium in 5oo ccm Sehüttelkolben) bei 31,5°C nach 72 Stunden erhalten ,

Tabelle III

Zugesetzter Kohlenstoff- lieferant 5 %	No.167	Kaliumdihydrogenphosphat MagnesiumsulfatHeptahydrat	No.	2-217	0	,o4
Glucose	2,72	Ferrosulfat	2	,53	0	,ooo5
Saccharose	2,1o	Mangansulfat	2	,06	0	,ooo5
Melassen	1,84	Ammoniumehlorid	1	,37	1	,5
Lösliche Stärke 2,44	Ammoniumnitrat	2	,41	O	,2
Stärkehydrolysat 2,95	Harnstoff	2	,?8	O	,3
Grundmediumt (pH 7,o)	Gaseinhydrolysat		O	,2
	Ribonuc1einsäure		O
	OaIciumcarbonat		5

Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff, die für die Oritidin- Bildung notwendig sind, sind beispielsweise Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoff und Ammoniak» das in wässriger Lösung zugeführt oder als Gas der Duft für die Belüftung in bekannter Weise zugemischt werden kann· Auch der Stickstoff von Proteinen oder Aminosäuren wird von den Mikroorganismen assimiliert·

Gewiss· anorganische Salze sind für die Fermentation notwendig« Sie sollten "Phosphat«-» Sulfat-, Chlorid- und viele Arten von Metall*

BAD

-F-

, wie Kalium—, Natrium-, Magnesium-, Ferro— oder Ferri- und M^.nganionen, bilden.

Die mehr komplexen organischer Stoffe, die das Wachstum der Mikroorganismen erhöhen, und die Orotidinbildung beschleunigen, sind für ^ie "''.rtschaftlichkeit dps Verfahrens ^.'ichti.p. Durch ihre Anwesenheit 'WiTd die Orotidinausbeute, die maximale Orotidinknnzentration in dem Medium und die Gescn^'ar^agkeit der Orotidinbildung beeinflusst. Zu den Nährstoffen oder W^chstumsbeschleunigern dieser Gruppe erehören Nucleoside, Nucleotide, deren Basen, Aminosäuren, verschiedene Vitamine und Materialien, die diese Substanzen enthalten oder in sie unter Fermentationsbedingungen übe-cp-eführt werden. Zu diesen Materialien gehören Ribonucleinsäuren, die pur Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen erhalten wird, Proteinhjdrolysat, Maisquel!wasser, Extrakt aus Mikroorganismen und Trockenzollen von Mikroorganismen. Die mit der Zugabe der Nährstoffe erzielte Wirkung ist in TabellelV veranschaulicht. Die Orotidinwerte in p/1 wurden.mit Bacillus subtilis No.217 unter aeroben Bedingungen (2o ecm Medium in ^oo com-Schüttelko Ib en ö hei 5o°C nach 64 Stunden erhalten.

Tabelle IV

racil^

Ss atz "ürotidin"

fljbonucle in» äur e Hefeextrakt 5^2ckenhefe

Zusatz" Orotidin Zusatz Orotidin Zusatz" "Or otiiin

mg/1 mg/1

• O

2,2
2,8
3,7

1,o 1,2 1,5 1,8 290

2,9 2,1

o,9

2
4-6
8

1o
12

0	0
ok7	5
1,1	8
1,8	1o
2,2	12
1,3	15
o,7	?o

1,8 3,o 3*9 3,5 2,8

2,7

	Glu.ose	O₁	5	1442046
	Kai iumdihyd ^oprenphorrili at		o4
^rundmedium:	H-umesiumsulfat-He^tahydrat	o,	ooo4
(pH η,ο)	Perrochlorid	o,	ooo4	%
	iianpranch lor id	1,		%
	Arcmon iumc h 1 ο r i d	O,		%
	Aruiooniumsulfat	o,		%
	DiammoniumhydroRjenphosphat	o,	5	%
	Pepton	2.	5	%
	Calciumcarbonat		⁰A
			%
			%

Der ΌΗ-Vert des Ferment ation sioediums muss kontrolliert werden, damit er 'vähreni der Fermentation weder zu saner noch zu alkalisch wird« Aus diesem Grunde hat es sich als zweokmässi^ erwiesen,, Oalciumcarbonat, fällbares Calciumphosphat, wässriges Ammoniak, gasförmiges Ammoniak, Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Phosphorsäure unri Salzsäure dem Fermentationnmedium zuzusetzen. Der b^ste pH-Wert für die Produktion und Anreicherung von Orotidin lie^t bei etwa 7ίθ. ¥ä Qfiite Erirebnisse werden im allgemeinen zwischen pH 5_to und 8,5 erhalten. Der ^influss des pH-Bereiche auf die Orotidinbildung bei Kulturen von Bacillus subtilis Nr.217 wird in Tabelle V veranschaulicht, in der die mit 64-Stu*nden-Kulturen erzielten "Resultate zusammonpres^ellt sind. Die angegebenen pH-Werte wurden durch Zusatz dfer weiter oben angegebenen Reagenzien während der Fermentation aufrecht erhalten. Die Orotidinwerte in g/l wurden unter aeroben Bedingungen (2o ecm Medium in 9o ecm .-.chüttelkolben) erhalten#

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	25°	-To-	)	4o°	5
	ο	Tabelle Y	O	o,5
pH	ο ,6	Tftmpera^ur der Kultur (⁰^	o, ?>	O,o4
	1*9	27° 3o° 37°	o,7	o,ooo5
O	ο,⁹	o.Q 1,ο 1 ,ο	o,7	ο,οοο5
So-6,5	ο	2,3 2,8 2,6	O
^-7,5	Grundmedium:	2,9 3,1 3*o	o,3
ΓΠ £~ Q C 7 * *		1,8. 2,3 2,2	o,8
8,5<		9?4 o_s7 o,5
		Glucose
		Kaliumd ihydrogenpho sphat
		Magnesiumsulf^t-Heptahydrat
	Ferrosulfet
	Mangansulfat
	Ammoniumchlorid
	Pepton
	Ribonucleinsäure

Mnisuuellwasser o,1 °t>

Au^serhalb des Temperaturbereichs zwischen 25 nnd 4o°6 werden gewöhnlich keitie brauchbaren Ergebnisse erhalten und Temperaturen zwischen 27 umd 37°G werden bevorzugt» Der Einfluss_s den die Temperatur auf die Orotidinausbeute bei Bacillus subtilis Nr.217 hat, ist auch in Tabelle V gezeigt»

Die ^Mutantenstamme der Erfindung iverden unter aeroben Bedingungen kultiviert, wobei die Luft dem Medium entweder durch Schütteln oder durch Belüftung und'Rühren zugemischt wird, Die Fermentation wurde 2-3 Tage durchgeführt»jDie Isolierung des Orotidins aus dem Kulturmedium nach der Entfernung der Mikroorganismen erfolgte nach übli-.

BAD

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cbr»η Tetroden. So kann m->n beispielsweise eine ν ■^eine Or-otidinlösunr erhal+"pn, wenn rrn das indium roit Aktivkohle und Ä_ni_onenauf?taushherharzen behandelt und reines Oro+'i^in bei wiederholter IJmkrlstallisation aus Wasser abscheidet^,

"Die Identifizierung der isolierten Kristalle erfolfrt« nach den üblichen V^rgrl ei eistest en , wie R^-'Yert der PapierchroTn°tccrraOhip, Wa.nderunr bei der ^il^er^aPierelektrorhoBese, UV-Absorptionsspektrum, P^hmelzpunkt, Tn^rarotabsorntionsspektrum, Orcinolr^airion, Elem^ntararalyse etc., mil. authentischen Orotidint>roben.

Mit den folgenden Beispielen soll das Verfahren der Erfindung näher erläutert, nicht aber beschränkt werden.

■Beispiel 1

Es wurde ein wässriges Kulturmedium folgender Zusammensetzung; in ετ/Kfcm hergestellt:

Glucose ^

KaliuradihydroF;enphosphat o,?

Magnesiumsulfat-Heptahydrat	o,o4
Ferroeulfat	o,ooo5
Man~ansulfat	o,ooo5
Ammoniumchlorid	0,6
Harnstoff	0,4
Trockenhefe	1,o
Pepton	0,4
Calciumcarbonat	2,ο

Das **β<31ιΐΜ wurde bei I'WC 5 Minuten sterilisiert und der pH-Wert auf etwa 7»o eingestellt,

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Djeses Medium,v3 ecm, wurde in p3 1 e Testrohre ^in^ef^llt und nan^v Bt<rrili antion iron S Minuten bei 11S⁰C r¹!⁴" ''acrliup: subtili^ Mutant en-StamTn TTr,?17 b^im-oft. $pr bei den weiter oben erwähnten, zu künstlich induzierten bioch■-»irischen Mutanten führenden und ^iebmethoden erhalten worden war.

Testrohre wurden nach der Inkubation b^i ^0⁰C Po stunden unter Schütteln ÜsteiJ als Saraenkulturmedien benutzt.

?.o con-A^sätze dieses Mediums wurden in ^00 r.rm-Kolb^n bei 115°C 1o Minuten sterilisiert, sodann dip bedien in den Kolben F¹It o,1ccm der SusOer-sion der genannten °amenkultur beimpft und die Inkubation bei $o°G 64 -Stunden in einer Schüttelkul+-ur durchgeführt. Des fer~ montierte Medium enthielt rian^ri o,^¹ ff/1 Orotidin»

P 1 der vereinigten Medien wurden mit 9o r Aktivkohle (^0-60 Sieböffnungen/? ,4-5 cm) versetzt, ~'jo I'inuten frerührt, Verunreinifnanpren, wie BaktTi^nzellen, Calciumcarbonat etc. d^rch Waschen mit Wasser entfernt und die Kolonne mit dieser Aktivkohle gefüllt. Das ^rotidin wu""de mit Aethanol - konz.Ammoniumhydroxyd — Wasser (Vol.verh.altn. 1:1:?) eluiert, das -^luat im Vakuum verdampft und der pH-Wert der Lösung nach Wasser -m£ 1 1 auf 7,o eingestellt. Diese Lösuni? liess man dann durch eine Dowex-1 (^endelsbezeichnung für Anionen-'ustausöherharz mit 8% V^rnetzunpO-^'ormatkolonne hindurch laufen, ^achdem man die Kolonne mit genügend Wasser gewaschen hatte, eluierte man das Orotidin mit o,1n wässriger Ratriumformiatlösun^· .Das iiluat vnirde zu ,je 2o ccm-Frotionen in Eestrohren aufgefangen und die Fraktionen, die im UV-Absor-Dtionsspek^rum I-Iaxima im Bereich von

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26o-?7o rau aufwiesen, gesammelt. Diese Fraktionen schickte man durch eine Kolonne mit Oowex-^o (Handelsbezeichnung für Kationenaustau.scherharz), um die Natrrnmionen zu entfernen, konzentrierte sodann die erhaltene Lönunp im V^kmim zu einem OeI, das rn-^n in der minimalen Wassermenge löste« Beim Kühlen bildete sich kristallines Orotidin. -^urch Umkristalli sation in V/asser erhielt man ieine Kristalle, "Rs wurden 2,3 g erhaltene

Beispiel 2

Es wurde ein wässriges Kulturmedium folgender Zusammensetzung in g/loo ecm hergestellt»

Glucose 6

Kaliumdihydrogenphosphat o_t1

Magnesiumsulfat-Heptahydrat o,o&

Ferrochlorid o,ooo4

Manganchlorid ο,ooo4

Ammoniumrhlorid 1

Uracil o,oo5

Natriumglutamat o,1

Calciumcarbonat 2

Bacillus subtilis Mutante Stamm No.21? wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren kultiviert«
I
Nach 72-stündiger Fermentation bei 34-⁰C hatten sich 2,6 g Orotidin pro 1 Fermentationsmedium gebildet und 2,8 g reines Orotidin wurden aus 2 1 dieses Mediums nach der in Beispiel 1 beschriebenen Aufarbeitungsmethode gewonnen.

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Beispiel 5

Bacillus subtilis Mutante Stamm Nr_ö167, die nach den weiter oben erwähnten, zu künstlich induzierten biochemischen Miatanten füh-

in renden und Siebmethoden erhalten worden war, wurde auf einem/der in Beispiel 1 angegebenen Weise sterilisierten Medium folgender Zusammensetzung (in g/1oo ecm) kultiviert:

Glucose 6

Kaliumdihydrogenphosphat o_t1

Magnesiumsulf at-Heptahyd#»sat oko4

Ferrosulfat o,ooo5

Mangansulfat o,ooo5

Ammoniumchlorid 1

Hefeextrakt ο,7

PeptOEt ο, 2

Galciumcarbonat . 2

Nach 64-stündiger fermentation bei 3o°C enthielt das Medium, wie gefunden wurde₅ 2,7 g/1 Orotidin, und nach der in Beispiel 1 beschriebenen ^w/eise wurden 1,2 g Orotidin aus 1 1 Medium isoliert»

Beispiel 4-

Bacillus subtilis Mutante Stamm No_e5o9, erhalten nach den weiter oben erwähnten^ zu künstlich induzierten biochemischen Mutanten führenden und Sxebmethoden.wurde auf einem in der in Beispiel 1 angegebenen. Weise stelilisierten Medium folgender Zusammensetzung (in g/1oo ecm) kultiviertϊ

Glucose '. 6

KaliiunalLhyärogenphosphat ο ,1-5

Magnesiumsulf at -H ept ahydr at ο,ο^- ■

_> Ferrosulfat o,ooo5

JjJ ■"' Mangansulfat o,ooo5 BADORIGiNAL

σ> Ammoniumchlorid i '

oo Eibonucleinsäure (Reinheitsgrad 75 %) o,1

Pepton , ,

Oalciumcarbonat 2

Nach 54sti"ndiger Fermentation bei 5o°C enthielt das Medium, «de gefunden wurde, ?,o n;/l Orotidin imd nach der in Beispiel 1 beschriebenen V/eise wurden ο,8 π- Orotidin aus 1 1 Medium is

Bacillus Rubtilis Mut^n^e Statin No.P-^17» erhalten nach den weiter oben erwähnten, zu künstlich irduziert-er "biochemischen Mutanten führenden und Biebriethor>r! ,'''urdesf auf einem Medium, d^s wie in Beispiel 1 angegeben, steiilisiert worden ^^rar, folgender Zusammensetzung (in -r/ioo ecm) kultiviert:

Glucose 6

Kaliumdihydropenrhosphat o,1

MaPTiesiumsulf at-Hept^hydrat o,o4-

Ferrosulfat o,ooo5

Maneransulf at ο,οοο^

Ammoniumehlorid 1

Adenin ' o,oj

Uracil . ο,οο^

Calciumcarbonat 2

Nnch 72 Sbunden Fermentation bei 3o°C enthielt das Medium, wie gefunden wurde, 1_t8 ρ Orotidin und o,^ g Ort>tinsäure / 1,

5 1 dieses fermentierten Mediums liess man nach der Behandlung mit Aktivkohle wie in Beispiel 1 durch eine Kolonne mit Dowex-1 hindurch laufen, wuech die Kolonne mit genügend "asser und 4-n Ameisensäure und schickte dann eine LöeungsmifiChung von ο\1^ M Ammoriumformiat und 4n Ameisensäure durch die Kolonne. Das Eluat unterteilte man in "Ό ccm-Fraktion^n und sammelte die Fraktionen, die im UV-Absorp«· tionsSpektrum Maxima im Bereich von 26o - 27o mu hatten,

T»ie vereinigte Lösung verdampfte man im Vakuum,und löste den Rückstand in minimaler Waseermenge. Be> Kühlen bildeten pich rohe

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Orotidinkristalle. Reine Kristalle, 5»"f 6» erhielt man bei Umkristallisation aus Wasser.

Die Orotinsäure, die neben dem Orotidin in dem Fermentationsmedium vorhanden war, wurde in den Fraktionen des Eluats gefunden, die auf die mit Orotidin folgte^und im UV-Absorptionsspektrum Maxima im Bereich von 275 - 28ο my seilten. Die Konzentration und Umkristallisation wurden nach den gleichen Methoden wie bei. Orotidin durchgeführt.

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Claims

Pat ent anwprüc.he

1)yVerfahren zur Herstellung von Orotidin (4(6)-Carboxyuracil-N-ribosid), dadurch gekennzeichnet, dass künstlich induzierte biochemische Mutanten von Bakterien, die die Fähigkeit haben, Orotidin extrazellular in einem aeroben Kulturmedium zu produzieren und mindestens Uracil, Uridin oder Uridylsäure für ihr Wachstum^in einem wässrigen Kulturmedium^benötigen), das Lieferanten für assimilierbaren Kohlenstoff, Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff, anorganische Salze und organische,Wachstumsfördernde Mittel enthält, im Temperaturbereich zwischen etwa 27 und 37°C und bei pH-Werten zwischen etwa 5»o und 8,0 aerob kultiviert werden, bis sich Orotidin in dem Medium angereichert hat,

2) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Bakterien die des Genus Bacillus angewandt werden·

3) Verfahren nach Anspruch 1 odejj 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Bakterien die des Bacillus subtilis verwendet werden.

4) Verfahren nach Anspruch 1-3» dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Mutanten aus Stämmen von Bacillus subtilis No,167 (jATCC I5I8I), Bacillus subtilis No,217 (ATCC 15182), Bacillus subtilis N0.309 (ATCC 15183) und Bacillus subtilis No.2-217 (A^CC 15154) ausgewählt werden·

5) Verfahren nach Anspruch 1', dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenstoff lief eranten für das Medium Glucose, Saccharose, Melassen, lösliche Stärke und Stärkehydrolysat verwendet werden»

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6) Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daas als Stickstof f lief eranten für das Medium'Ammoniumchloria, Ammoniumnitrat, Ammoftiumsulfat, Ammoniumphosphat, Harnstoff, Ammoniak, Protein, Proteinhydrolysat und Verbindungen, die Aminosäureniachungen enthalten, verwendet werden»

7) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als anorganische Salze für das Medium mindestens ein anorganisches Salz verwendet wird, das Natrium-, Kalium-, Mangan-, Magnesium-, Eisen-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-,und/oder ßarbonationen enthält»

8) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als wachstumsfördernde Substanzen Basen der ETucleinsäuren, Nucleoside, Nucleo— tide, Ribonucleinsäuren, Hefeextrakt, Trockenhefe, Pepton, Caseinhydro lysat, Maisquellwasser, Aminosäuren und/oder Vitamine verwendet werden.

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