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Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Xanthosin Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Xanthosin.
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Xanthosin wird zur Nucleinsäuresynthese benötigt. Besonders dem 5'-Phosphorsäureester
dieser Substanz wird eine bemerkenswerte geschmacksverbessernde Wirkung zugeschrieben.
Xanthosin kann nach einem chemischen Verfahren synthetisiert werden, das jedoch
derart umständlich ist und eine so geringe Ausbeute liefert, daß es für die industrielle
Herstellung nicht geeignet ist. Die Substanz ist demzufolge bisher ausschließlich
durch Desaminierung von Guanosin hergestellt worden, das durch Zersetzung von Hefenucleinsäure
erhalten wird. Wenn jedoch Xanthosin, das das Ausgangsmaterial f ür das eine gute
geschmacksverbessernde Wirkung besitzende Xanthosinphosphat ist, nach einem Fermentationsverfahren
direkt hergestellt werden könnte, würde gegenüber dem üblichen komplizierten Verfahren
ein großer Vorteil erzielt werden.
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Erfindungsgemäß ist nun gefunden worden, daß beim Züchten des Guanin
benötigenden Mutantenstammes ATCC 14 304 von Aerobacter aerogenes in einem - Kulturmedium
unter bestimmten Züchtungsbedingungen Xanthosin in einer Menge angesammelt wird,
die eine technische Herstellung ermöglicht.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
Aerobacter aerogenes ATCC 14 304 in einem Nährmedium, das neben den üblichen Bestandteilen
30 bis 100 mg/1 Guanin enthält, bei pH-Werten von 5 bis 8 züchtet. Der Bakterienstamm
Aerobacter aerogenes ATCC 14 304 wurde erhalten, indem ein wilder Stamm von Aerobacter
aerogenes in an sich bekannter Weise mit ultravioletten Strahlen oder mit y-Strahlen
von Co"" bestrahlt bzw. mit verschiedenartigen anderen mutagen wirkenden Substanzen
oder mit Penicillin behandelt wurde.
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Das erfindungsgemäß verwendete Nährmedium enthält als übliche Bestandteile
eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und andere wachstumsfördernde
Mittel, die dem Bedarf des verwendeten Stammes entsprechen. Als Kohlenstoffquelle
werden vorzugsweise Maltose, Lactose und Rohrzucker verwendet. Glucose, Fructose
und Mannit können ebenfalls zufriedenstellende Ergebnisse liefern, wobei jedoch
Glycerin, Stärke, Sorbose u. dgl. vorzugsweise nicht verwendet werden. Die Konzentration
der Kohlenstoffquelle beträgt vorzugsweise etwa 501., es können aber auch weit höhere
Konzentrationen verwendet und damit gute Ergebnisse erhalten werden.
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Als Stickstoffquelle können Ammoniak und verschiedenartige anorganische
und organische Ammoniumsalze verwendet werden, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat u. dgl. Nitrate,
Harnstoff und andere stickstoffhaltige Substanzen, Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt,
Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit und hydrolytische Zersetzungsprodukte von eiweißartigem
Material, wie Casein, Fischmehl, Bohnenmehl, Seidenraupenpuppen, Gärungsrückstände
u. dgl. können ebenfalls verwendet werden. Besonders Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat u. dgl. sind den anderen angegebenen Substanzen
als Stickstoffquelle überlegen.
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Als anorganische Salze können Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat,
Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat u. dgl. verwendet werden. Es ist bekannt, daß Mikroorganismen
für ihr Wachstum bestimmte Arten von Metallionen, besonders Kalium- und Magnesiumionen,
benötigen.
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Andere Metallionen, wie Mangan-, Nickel- und Kobaltionen und ähnliche
Ionen, die für das Wachstum in sehr geringen Mengen benötigt werden, können, falls
erforderlich, getrennt zugesetzt werden; oft reicht aber auch die in dem Leitungswasser,
das zur Herstellung des Nährmediums verwendet wird, enthaltene Menge.
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Als Guanin liefernde Substanz wird erfindungsgemäß vorzugsweise reines
Guanin, ein Guaninsalz, ein Guaninderivat oder ein als organische Stickstoffquelle
übliches
Material, wie Hefeextrakt, Hefehydrolysat, Fischmehlauszug oder Bakterienhydrolysat,
eingesetzt.
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Als Guaninderivat wird vorzugsweise Guanosin, Guanylsäure u. dgl.
verwendet, als Guaninsalz wird das Hydrochlorid bevorzugt. Bei der oben angegebenen
Guaninmenge von 30 bis 100 mg/1 handelt es sich um eine für den Mutantenstamm suboptimale
Menge.
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Die Züchtung erfolgt gewöhnlich bei einer Temperatur zwischen 20 und
40°C und unter aeroben Bedingungen, wobei eine Schüttelkultur oder eine belüftete
und gerührte Tauchkultur verwendet werden kann. Als günstig erweist sich ein Zusatz
von Calciumcarbonat in einer Menge von 0,5 bis 2,0°/o des Nährmediums, um den pH-Wert
im gewünschten Bereich zu halten.
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Der Fortschritt der Fermentation kann leicht verfolgt werden, indem
von der Gärungsflüssigkeit in regelmäßigen Abständen Proben abgenommen und auf ihr
UV-Absorptionsspektrum untersucht werden. Will man genauer arbeiten, wird eine Probe
papierchromatographiert, worauf der Xanthosinfleck ausgeschnitten und das UV-Absorptionsspektrum
bestimmt wird. Die größte Ansammlung von Xanthosin kann gewöhnlich nach etwa 48
bis 96 Stunden erreicht werden. Bei einer Änderung der Züchtungsbedingungen können
in dem Nährmedium neben Xanthosin gegebenenfalls verwandte Verbindungen, wie Xanthylsäure,
Adenylsäure und Inosinsäure, gefunden werden. Nach beendetem Züchten wird die Kulturbrühe
abfiltriert, worauf das Filtrat eingedampft, allmählich Alkohol zugesetzt, die dabei
gebildete Abscheidung von Verunreinigungen abfiltriert, das Filtrat mit Alkohol
versetzt, abgekühlt und zwecks Abscheidung von kristallinem Xanthosin stehengelassen
wird. Bei einem anderen Verfahren wird das Filtrat des Kulturmediums mit Aktivkohle
versetzt, wobei das Xanthosin absorbiert wird. Die Aktivkohle wird mit einer ammoniakalischen
wäßrigen Alkohollösung behandelt, der Auszug eingedampft, mit Alkohol versetzt,
abgekühlt, die gebildete Abscheidung abfiltriert und das erhaltene Xanthosin getrocknet.
Das erhaltene Xanthosin kann gegebenenfalls nochmals umkristallisiert werden.
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Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen
Verfahrens. Beispiel 1 Ein 2 °/a Glucose, 10/, Pepton, 0,5 °/o Fleischextrakt und
0,25 % Tafelsalz enthaltendes Nährmedium wurde mit Aerobacter aerogenes Nr. 5301
(ATCC Nr.14304) beimpft und dann 24 Stunden bei einer Temperatur von 28°C zur Erzeugung
einer Impfkultur bebrütet.
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Das Fermentationsmedium wurde wie folgt hergestellt: 50 g Lactose,
10 g (NH4)2S0" 0,5 g KHZP04, 0,5 g K,HP04, 0,25 g M9S04. 7 H20 und 74 mg Guanin
wurden in Leitungswasser gelöst, worauf die Lösung auf ein Volumen von 11 aufgefüllt
wurde. Nach Einstellen der Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 wurden Anteile von je
30 ccm der Lösung in 250 ccm fassende konische Kolben gebracht. Es wurde sterilisiert
und dann mit sterilisiertem CaCO3 in einer Menge von 10 g je Liter der Lösung versetzt.
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Das auf diese Weise hergestellte Fermentationsmedium wurde mit einer
Menge von 100/, der Impfkultur angeimpft und dann unter Schütteln bei einer
Temperatur von 28°C bebrütet. Nach 96 Stunden betrug die Menge des in dem Nährmedium
angesammelten Xanthosins 4,7 mg/ccm. Neben dem Xanthosin wurden auch geringe Mengen
von Xanthylsäure, Adenylsäure und Inosinsäure gefunden.
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Nach beendetem Züchten wurde das Nährmedium zur Entfernung der Zellen
und restlichen Calciumcarbonats filtriert, worauf die erhaltenen 450 ccm Filtrat
im Vakuum auf 70 ccm eingedampft, das abgeschiedene Calciumsulfat abfiltriert, das
Filtrat mit der dreifachen Volumenmenge Alkohol versetzt, die Abscheidung abfiltriert
und die überstehende Lösung in einem Kühlschrank mehrere Tage lang stehengelassen
wurde. Die sich dabei abscheidenden Xanthosinkristalle wurden abfiltriert und getrocknet,
wobei 610 mg weißer nadelförmiger Kristalle erhalten wurden.
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Auf Grund der Ergebnisse der Elementaranalyse, der UV-Absorptionskurven
von sauren, neutralen und alkalischen wäßrigen Lösungen, der quantitativen Analyse
von Ribose und Base und der papierchromatographischen Untersuchung wurden diese
Kristalle als Xanthosin identifiziert. Beispiel 2 Es wurde ein Nährmedium mit der
folgenden Zusammensetzung hergestellt: 50 g Glucose, 10 g (NHIS04, 1 g K,HP04, 1
g KHZP04, 0,25 g M9S04 7 H20 und 5 g Hefeextrakt wurden in Leitungswasser gelöst,
worauf auf 11 aufgefüllt wurde. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt,
worauf sterilisiertes CaCO3 in einer Menge von 10 g je Liter der Lösung zugesetzt
wurde. Das Züchten erfolgte nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren.
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Nach einer Züchtungsdauer von 72 Stunden betrug der Xanthosingehalt
des Nährmediums 4,0 mg/ccm.