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Verfahren zur Herstellung von L (+)-Glutaminsäure Die Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von L(+) -Glutaminsäure (d-Glutaminsäure) durch Gärung.
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Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung von Glutaminsäure
bekannt. So läßt sich diese Verbindung z. B. durch Hydrierung von a-Ketoglutarsäure
in Gegenwart von Ammoniak herstellen. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil,
daß hierbei die Glutaminsäure als Racemat erhalten wird, während oft die optisch
aktive, natürlich vorkommende Form erwünscht ist. Wie im Verfahren gemäß Patentanmeldung
P 14926 IV b / 12 q beschrieben, wird Glutaminsäure auch durch einen Gärprozeß aus
a-Ketoglutarsäure hergestellt. Das erfindungsgemäße Verfahren vermeidet die Verwendung
der ziemlich teuren a-Ketoglutarsäure und ist infolgedessen Wirtschaftlicher als
die bisher üblichen Verfahren.
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Glutaminsäure wird als Geschmacksstoff oder Geschmacksverstärker bei
verschiedenen Nahrungsmitteln, insbesondere bei Fleisch oder aus Fleisch hergestellten
Produkten verwendet.
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Es wurde nun gefunden, daß mit Hilfe bestimmter Pilze, nämlich Stämmen
der- Gattung Cephalosporium, Glutaminsäure in guten Ausbeuten hergestellt werden
kann. Diese Mikroorganismen werden unter aeroben Bedingungen auf Nährmedien gezüchtet.
Dabei führt die Verwendung von Harnstoff im Nährmedium zu besonders guten Ausbeuten
an Glutaminsäure. An Stelle des Harnstoffs können jedoch auch andere mehr oder weniger
wirksame stickstoffhaltige Substanzen verwendet werden. Als Nährmedium verwendet
man Kohlehydrate, z. B. Saccharo,s,e, Glucose, Maissirup, Melasse, verschiedene
Stärkearten, nämlich Kartoffeln-, Mais-, Weizenstärke u. a. Weiterhin eignen sich
verschiedene Rohsubstanzen, z. B. Nebenprodukte, die bei der Alkoholherstellung
aus vergorenem Weizen oder Getreidemischungen, die vorwiegend Weizen enthalten,
anfallen, Maiswasser und verschiedene Proteinhydrolysate als Zusätze. Die Anwesenheit
von Protein im Nährmedium ist zwar nicht erforderlich, bewirkt jedoch häufig eine
Erhöhung der Ausbeute. In manchen Fällen ist es ratsam, Salze zuzusetzen, z. B.
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'atriumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumsulfat und Quellen für Spurenmetalle.
Dies gilt besonders dann, wenn im Gärmedium keine Rohsubstanzen, die wesentliche
Mengen Salze enthalten, verwendet werden. Der einzige Bestandteil, der stets vorhanden
sein muß, wenn maximale Ausbeuten an Glutaminsäure erzielt werden sollen, ist Harnstoff.
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Der Harnstoff kann dem Nährmedium zu Anfang zugesetzt werden, bei
manchen Organismen zieht man es jedoch vor, den Harnstoff erst dann zuzusetzen,
wenn auf dem Nährmedium bereits ein gewisses Wachstum eingetreten ist. Es ist ratsam,
im Reaktionsmedium eine Harnstoffkonzentration von .etwa 1/" bis 5 Gewichtsprozent
anzuwenden; diese Grenzwerte sind jedoch nicht als kritisch anzusehen. Harnstofflconzentrationen
von 0,519/o erwiesen sich als sehr günstig.
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Von Bedeutung ist, daß man den Harnstoff als einzige Stickstoffquelle
verwenden kann. Selbstverständlich kann er auch zusammen mit anderen einfachen Stickstoffverbindungen,
wie Nitraten oder Amlnoniumsalzen, oder zusammen mit Protein verwendet werden. Wie
oben erwähnt, steigt in manchen Fällen bei Zusatz von Protein zum Nährmedium die
Ausbeute; zur Erzielung einer guten Ausbeute muß jedoch stets auch Harnstoff vorhanden
sein. Der wirklich unerwartete und große Vorteil der Erfindung beruht darauf, daß
die verwendeten Organismen zur Bildung der Glutaminsäure keine a-Ketoglutarsäure
als Ausgangsmaterial benötigen.
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Wie bereits erwähnt, sind Organismen der Gattung Cephalosporium, die
der Ordnung l\-Toniliales und der Klasse Fungi Imperfecti angehören, für die Bildung
von Glutaminsäure durch submerse aerobe Gärung außerordentlich geeignet. Von besonderem
Wert sind bestimmte Arten dieser Gattung, nämlich Cephalosporium salmosynnematum,
Cephalosporium diospyri und Cephalosporium acremonium. Auch verschiedene andere
Stämme nicht identifizierter Cephalosporiumarten sind wertvoll. Diese Organismen
sind über verschiedene öffentliche Kulturensammlungen zugänglich oder lassen sich
nach bekannten Verfahren aus Erdproben und anderen natürlichen Materialien isolieren.
Diese Organismen können dann nach den für verschiedene
Cephalosporiumarten
in der wissenschaftlichen Literatur angegebenen Methoden klassifiziert werden.
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Die Organismen können in Laboratorien auf Schrägnährböden, z. B. Emersons
Agar, gezüchtet werden. Die Mikroorganismenkultur .wird von der Oberfläche dieser
Medien entfernt und für die Züchtung von Impfstoff oder die Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens in kleinem Maßstab in sterile flüssige Nährmedien, die sich in kleinen
Glasflaschen befinden, gegeben. Diese Flaschen können mit steriler Watte verschlossen
und 1 bis 5 Tage bei geeigneter Temperatur geschüttelt werden. Der gezüchtete Organismus
kann sodann für die Impfung größerer Mengen Nährmedium in Glas- oder Metallgefäßen
verwendet werden. Nach erfolgtem Wachstum in diesen Gefäßen läßt sieh die Kultur
zur Impfung von Gärgefäßen im technischen Maßstab verwenden. Im allgemeinen verwendet
man zu Beginn der Gärung mindestens etwa 5 Volumprozent Impfstoff. Bei bestimmten
Organismen kann es vorteilhaft sein, zur Erzielung einer raschen Gärung und wirtschaftlichen
Herstellung von Glutaminsäure einen höheren Prozentsatz anzuwenden. In manchen Fällen
erwies es sich als günstig, den Organismus vor Zusatz des Harnstoffs bestimmte Zeit
wachsen zu lassen. Dies kann 10 bis 30 Stunden in Anspruch nehmen. Sobald man eine
schnell wachsende üppige Kultur erhalten hat, setzt man den Harnstoff zu, so daß
sich unter diesen Bedingungen rasch Glutaminsäure bildet. Alle diese Verfahren sollen
selbstverständlich unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, so daß der die
Glutaminsäure erzeugende Organismus nicht mit anderen nachteilig sich bemerkbar
machenden Arten verunreinigt wird.
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Im allgemeinen läßt sich das erfindungsgemäße Gärverfahren in Medien
mit einem Anfangs-pH Wert von etwa 4,0 bis etwa 8,0 durchführen. Auch etwas höhere
oder niedrigere PH-Werte können angewandt werden, obgleich hierdurch kein besonderer
Vorteil erzielt wird. Setzt man der Gärmischung entweder zu Beginn oder nach einem
gewissen Wachstum des Organismus Harnstoff zu, so kann der p11-Wert steigen. Oft
wird ein pH-Wert von 8,5 erreicht, der jedoch selten merklich überschritten wird.
Dieser pH-Wert hat keinerlei Einfluß auf die Erzeugung der Glutaminsäure.
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Das Fortschreiten des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich sehr
leicht verfolgen, indem man dem Reaktionsgemisch in gleichmäßigen Zeitabständen
Proben des Gemisches entnimmt und auf ihren Glutaminsäuregehalt untersucht, z. B.
durch papierchromatographische Analyse. Als besonderes wirksames Lösungsmittelsystem
erwies sich hierbei eine Mischung aus 1 Volumen Eisessig, 5 Volumen Butanol und
5 Volumen Wasser. Nach der Entwicklung wird das Chromatogramm getrocknet und mit
einer verdünnten Ninhydrinlösung besprüht. Nach dem Erwärmen des Papierstreifens
läßt sich die Anwesenheit von Glutaminsäure feststellen. Unter Verwendung von Standardproben.
von Glutaminsäure bekannter Konzentration ist es möglich, mit einiger Genauigkeit
die bei der Gärung erzeugte Menge Glutaminsäure zu ermitteln. Im allgemeinen können
Ausbeuten von etwa 11/2 bis etwa 2 g je Liter Medium erzielt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen bei einer Temperatur
von etwa 25 bis 32° C durchgeführt. Oft wird bereits nach einer Zeit von nur 12
Stunden etwas Glutaminsäure erhalten. Die optimale Zeit liegt jedoch etwas darüber,
und im allgemeinen benötigt man für die Erzielung einer maximalen Ausbeute nicht
mehr als 70 Stunden. Die Gärung kann in Glasgefäßen durchgeführt werden oder, bei
Durchführung in technischem Maßstab, in Metallgefäßen, die entsprechend mit Rühr-
und Belüftungsvorrichtungen ausgestattet und so beschaffen sind, daß sich die Gefäße
vor Beginn der Gärung sterilisieren lassen. Die zusätzlichen Vorrichtungen für die
Sterilisierung des Mediums oder die Vorrichtungen für die Sterilisation des Mediums
im Gärkessel sind ebenfalls wesentlich. Die Belüftung wird im allgemeinen mit einer
Geschwindigkeit von 1/2 bis 2'/2 Volumen Luft je Volumen Medium je Minute durchgeführt.
Selbstverständlich muß die Luft vor der Verwendung sorgfältig sterilisiert werden.
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Die Isolierung der Glutaminsäure kann nach zahlreichen Verfahren erfolgen.
In vorteilhafter Weise filtriert man die Gärlösung und führt die Lösung über eine
Säule von mit Säure gewaschener Tonerde. Die Glutaminsäure wird von der Tonerde
adsorbiert, während das übrige Material die Säule wieder verläßt. Die adsorbierte
Substanz kann mit einem kleinen Volumen Wasser gewaschen werden. Die Aminosäure
wird sodann in reiner Form mit einer verdünnten Lösung einer Mineralsäure, vorzugsweise
Salzsäure, eluiert. Der p11-Wert des Eluats wird dann mit Alkali; z. B. Natriumhydroxyd,
auf etwa 3,2 eingestellt. Anschließend konzentriert man das Gemisch auf ein kleines
Volumen. Während der Konzentrierung neigen die in der Lösung enthaltenen Salze dazu,
auszufallen; d. h., bei Verwendung von Salzsäure für die Eluierung und Verwendung
von Natriumhydroxyd für die Einstellung des p11-Wertes auf 3,2 kann während der
Konzentrierung Natriumchlorid ausfallen. Das Salz wird abfiltriert, und nach weiterer
Konzentrierung fällt kristalline Glutaminsäure aus der Lösung aus: Diese läßt sich
filtrieren und trocknen. Zur Gewinnung der Glutaminsäure können auch verschiedene
andere Verfahren angewendet werden. So kann man sie z. B. durch Extraktion mit einem
polaren Lösungsmittel, wie Butanol, am isoelektrischen Punkt der Glutaminsäure,
d. h. bei etwa PH 3,2, gewinnen: Beispiel I Es wurde ein Gärmedium hergestellt,
das 4 Gewichtsprozent Nebenprodukte aus der Alkoholherstellung und 0,2 Gewichtsprozent
Maiswasser enthielt. Mit Kaliumhydroxyd brachte man den PH-Wert des Mediums auf
7. Nach der Sterilisierung wurde es mit einem Stamm Cephalosporium acremonium geimpft.
Das Gemisch wurde gerührt und 24 Stunden bei 28° C belüftet. Danach setzte man dem
Gemisch unter sterilen Bedingungen 0,5°/o Harnstoff zu. Die Gärung wurde weitere
30 Stunden fortgesetzt. Danach wurde das Gemisch filtriert und die filtrierte Lösung
über eine Säule aus mit Säure gewaschener Tonerde geleitet. Die Glutaminsäure wurde
mit 1 n-Salzsäure aus der Tonerde eluiert. Der pH-Wert der salzsauren Lösung wurde
mit 20°/oiger Natriumhydroxydlösung auf 3,2 eingestellt. Die auf diese Weise erhaltene
Lösung wurde im Vakuum konzentriert und das während der Konzentrierung der Lösung
auskristallisierende Natriumchlorid abfiltriert. Nach weiterer Konzentrierung kristallisierte
die Glutaminsäure aus. je Liter filtrierter Gärlösung wurden etwa 2 g Glutaminsäure
gewonnen.
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Beispiel II Das im Beispiel I beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung
eines Stamms Cephalosporium salmosynnematum wiederholt. Man erzielte ähnliche Ergebnisse,
d.
h., Glutaminsäure wurde in einer Konzentration von etwa 1,5 g je Liter Nährmedium
erzeugt. Beispiel III Das im BeispielI beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung
eines Stamms Cephalosporium diospyri wiederholt. Die hierbei erzeugte Glutaminsäure
wurde isoliert und gereinigt. Je Liter Medium erhielt man etwa 1 g Glutaminsäure.
Beispiel IV Das im Beispiel I beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung des
gleichen Organismus und eines Mediums, das an Stelle von Nebenprodukten aus der
Alkoholherstellung 4 Gewichtsprozent Weizenglutin enthielt, wiederholt. Der PH-Wert
des Gemisches betrug etwa 5,0. Die erhaltene Gärmischung enthielt je Liter 3 g Glutaminsäure.
Beispiel V Das im Beispiel I beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung von 4
Gewichtsprozent Maisglutin an Stelle von Nebenprodukten aus der Alkoholherstellung
und 0,2 Gewichtsprozent Maiswasser wiederholt. Nach 24 Stunden setzte man dem Gemisch
0,5 Gewichtsprozent Harnstoff zu. Kurz danach stieg der pH Wert auf etwa 8,0. Nach
Beendigung der Gärung enthielt die Lösung je Liter etwa 3 g Glutaminsäure.
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Beispiel VI Das im Beispiel I beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung
von 4 Gewichtsprozent Sojamehl und 0,2 Gewichtsprozent Maiswasser wiederholt. Der
PH-Wert der Mischung betrug 5,0. Nach 24 Stunden fügte man 0,5 Gewichtsprozent Harnstoff
zu und setzte die Gärung fort. Man erzielte eine Ausbeute von 31/z g Glutaminsäure
je Liter Lösung.