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Die Verwendung von Inhibitoren bei der Gewinnung von TetracycJin auf
biologischem Wege Bei der Erzeugung von Tetracyclin auf biologischem Wege durch
Fermentation von Stämmen von Streptomycesaureofaciens erhält man auch Chlortetracyclin,
wenn Chlorionen im Nährmedium vorhanden sind.
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Die Chlorionen gelangen in das Nährmedium durch das Wasser, falls
man dieses nicht durch entsprechende Reinigung zuvor aufbereitet hat. Die hierzu
erforderlichen Maßnahmen bedeuten einen beträchtlichen Aufwand an verfahrenstechnischen
Maßnahmen und somit erhöhte Kosten. Die Isolierung des Tetracyclins vom Chlortetracyclin
und die damit verbundene erforderliche Reinigung sind mit großen Schwierigkeiten
und damit mit erheblichen Kosten verbunden. Dies um so mehr, da in vielen Fällen
das Chlortetracyclin das vorherrschende Stoffwechselprodukt ist.
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Ziel der Erfindung ist demnach, die Bildung von Chlortetracyclin auch
bei Anwesenheit von Chlorionen so weit zurückzudrängen, daß die etwa noch gebildete
Menge an Chlortetracyclin praktisch nicht mehr stört. Mit dem Zurückdrängen bzw.
Ausschalten der Bildung des Chlortetracyclins wird zwangläufig die Ausbeute des
Tetracyclins selbst erhöht.
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Dies ist als großer Vorteil zu betrachten, da Tetracyclin sich durch
einen besseren Blutspiegel, weniger Nebenreaktionen und eine größere Stabilität
im alkalischen Medium gegenüber dem Chlortetracyclin auszeichnet.
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Es wurde nun gefunden, daß bei der Gewinnung von Tetracyclin auf biologischem
Wege die fermentative Chlorierung gehemmt wird, wenn man als Zusatz für das Nährmedium
Verbindungen verwendet, die Bromid-, Jodid- oder Rhodanidionen liefern.
Ge-
eignete Verbindungen sind z. B. die Alkali- und Erdalkalibromide, -jodide
und -rhodanide. Vorzugsweise verwendet man Bromidionen liefernde Stoffe, z. B. die
Bromide des Natriums, Kaliums, Caleiums und Ammoniums oder auch Bromwasserstoffsäure.
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Die Mengen an Natriumbromid, die zu guten Ergebnissen führen, liegen
zwischen 0,01 und 5 Gewichtsprozent, berechnet auf den Nährboden.
Vorzugsweise verwendet man 0,1 bis 2,0 Gewichtsprozent. Von den anderen Verbindungen
verwendet man etwa äquivalente Mengen.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel
1
Zur Gewinnung von Tetracyclin wird zunächst eine Nährflüssigkeit hergestellt,
die 1,0 Gewichtsprozent Maisweichwasser, 1,0 Gewichtsprozent Rohrzucker,
0,5 Gewichtsprozent Diammoniumphosphat, (NH4)2HPO4, 1,5 Gewichtsprozent
Monokahumphosphat, KH 2pol, 0,2 Gewichtsprozent Magnesiumsulfat, Mgs04
' 7 H.0, und 0,5 Gewichtsprozent Natriumbromid enthält und auf einen
pH-Wert von 6,2 bis 6,4 eingestellt ist. 2,5 1 dieser Nährflüssigkeit
werden in eine 10-1-Flasche gegeben. Das Ganze wird während einer Stunde bei
118 bis 120' C dampfsterilisiert. Nach dem Ab#Ühlen wird die Nährflüssigkeit
mit etwa 0,5 Volumprozent einer trüben wäßrigen Sporensuspension des betreffenden
Streptomyces-Stammes, die einer Agar-Schrägkultur entnommen ist, beimpft. Der Inhalt
der Flasche wird dann bei 26 bis 28' C 48 Stunden lang auf einer hin-
und hergehenden Schüttelmaschine vergoren, wobei sterile Luft über die Oberfläche
der Flüssigkeit geblasen wird. Die so erhaltene Impflösung mit dem zu züchtenden
Streptomyces-Starnm wird dann unter völlig aseptischen Be-' dingungen in einen Gärbottich
übergeführt Eine geeignete Nährlösung enthält z. B. in rund 6000 1 Flüssigkeit
56,81 Maisweichwasser, 56,8 kg Rohrzucker, 24,4 kg Diammoniumphosphat,
85,2 kg Monokaliumphosphat, 11,3 kg Magnesiu-msulfat und 28,4
kg Natriumbromid.
Eine solche Nährflüssigkeit wird zweckmäßig
in einem mit Glas ausgekleideten Gärbottich von 8000 1 Inhalt, der einen
Wassermantel zur Temperaturregelung, eine geeignete Rührvorrichtung aus rostfreiem
Stahl und eine geeignete Zerstäubungsanlage zur Belüftung aufweist, hergestellt.
Die Nährlösung wird darin durch Erhitzen mit Dampf unter Druck sterilisiert und
dann abgekühlt. Nach der Sterilisierung soll die Wasserstoffionenkonzentration der
Nährlösung etwa 6,2 betragen. Der so erhaltene sterile Nährboden wird dann
mit 15 Volumprozent einer vegetativen Kultur, die in einem ähnlichen Gärbottich
gewonnen war, der zuvor mit einer Impflösung, wie sie weiter oben beschrieben worden
ist, beimpft worden war, oder mit einer im Laboratorium gewonnenen Impflösung beimpft.
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Die beimpfte Nährlösung im 8000-1-Gärbottich wird dann bei etwa
28' C 44 Stunden lang vergoren. Während der Gärung wird die Rührvorrichtung
mit einer Geschwindigkeit von 90 Umdrehungen pro Minute in Gang gehalten
und gleichzeitig sterile Luft in einer Menge von etwa 2,8 m-»3 pro Minute
in die Nährlösung durch den Sprühverteiler eingeleitet. Gegen Ende der Gärung enthält
die Nährlösung gewöhnlich beträchtliche Mengen an Tetracyclin, die die gleichzeitig
erzeugte Menge an Chlortetracyclin übersteigen. Tetracyclin wird aus der Nährlösung,
wie im nachstehenden näher beschrieben, isoliert. Das so gewonnene feste Rohprodukt
enthält vor dem Umkristallisieren mindestens 19 Teile Tetracyclin auf
je 1 Teil Chlortetracyclin.
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Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel) Es wird in gleicher Weise, unter gleichen
Bedingungen und mit der gleichen Nährflüssigkeit wie im Beispiel 1 gearbeitet.
In einem Ansatz werden ihr 0,51,10 Natriumbromid zugesetzt. In einem anderen vergleichbaren
Ansatz wird dagegen das Natriumbromid weggelassen. Als Tetracyclin erzeugender Stamm
wird der Stamm Streptomyces BL-567201 verwendet.
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Die in den dabei gewonnenen Nährflüssigkeiten enthaltenden Mengen
an Tetracyclin und Chlortetracyclin werden mit dem Verfahren der Papierstreifenchromatographie
bestimmt. Dabei verwendet man als Lösungsmittelsystem z. B. mit Wasser gesättigtes
Butandl. Man kann sich aber auch der biologischen Unterscheidungsmethode bedienen,
wobei auf verschiedene pH-Werte, nämlich auf pH 6,2 und auf pH
8,0 eingestellte Agar-Nährböden Verwendung finden. Die Gärflüssigkeit aus
einem 500-1-Gärbottich mit etwa 320 1 Nährflüssigkeit, zu der 0,5
11/o Natriumbromid hinzugesetzt waren, enthielt nach 20- bzw. 44stündiger Gärdauer
mindestens 19Teile Tetracyclin auf 1 Teil Chlortetracyclin. Der biologische
Test ergab, daß die Gärflüssigkeit nach 20stündiger Gärdauer 85 ", Tetracyclin
und 3 ", Chlortetracyclin pro Kubikzentimeter enthielt.
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Die gleiche Gärflüssigkeit ohne Zusatz von Natriumbromid lieferte
nach 44ständiger Gärdauer nicht mehr als 1 bis 2 Teile Tetracyclin auf
8 Teile Chlortetracyclin.
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Die Gärflüssigkeit aus einem mit 1400 1 Nährlösung gefüllten
2400-1-Gärbottich, zu der kein Natriumbromid hinzugesetzt war, enthielt nach 45stündiger
Gärdauer ebenfalls nicht mehr als 1 bis 2 Teile Tetracyclin auf
8 Teile Chlortetracyclin und ein entsprechender Ansatz mit 1200
1 Nährlösung , im 2400-1-Gärbottich ohne Bromidzusatz nach 30stündiger
Gärdauer nicht mehr als 1 Teil Tetracyclin auf 9 Teile Chlortetracyclin.
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Die hemmende Wirkung der Bromidionen auf die chlorierende Fermentation
ist aus diesen Vergleichsversuchen eindeutig ersichtlich. Beispiel 3
In der
nachstehenden Tabelle werden eine Reihe von verschiedenen Nährflüssigkeiten angegeben.
Je 200cm3 derselben wurden in 1-1-Erlenmeyerkolben a -
gegeben, und zwar wurden
für jeden Nährlösungs versuch zwei Kolben verwendet. Die Kolben mit ihrem Inhalt
wurden dann 15 Minuten unter einem Dampfdruck von etwa 1,05 at sterilisiert,
abgekühlt und mit einer vegetativen 24-Stunden-Kultur ' von Streptomyces
BL-567 201, die in einer Maisweichwasser enthaltenden Nährlösung gezüchtet war,
beimpft. Je 1 cm3 der 24-Stunden-Kultur wurde zu je
200 cm3 Kulturflüssigkeit
gegeben. Die beimpften Kolben wurden auf einer sich hin- und herbewegenden Schüttelmaschine
48 Stunden lang geschüttelt, wonach die Gärlösung zwecks Bestimmung 'des Tetracyclin-
und Chlortetracyclingehaltes vom Pilzmyzel abgetrennt wurde.
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Die abgetrennten Gärlösungen wurden zentrifugiert und nach der Methode
der Papierstreifenchromatographie analysiert. Als Lösungsmittelsystem wird mit Wasser
gesättigtes Butanol verwendet. Die nachstehende Tabelle zeigt die Mengen an Chlortetracyclin
und Tetracyclin, die bei der Fermentation in verschiedenen Nährlösungen mit und
ohne Zusatz von Natriumbromid erhalten werden.
| Versuch |
| 1 2 3 4 5 |
| % Rohrzucker .................................. 1,o
1,0 1,0 1,0 1,0 |
| '/0 M9S04 ......................................
0,2 0,2 02 0,2 0,2 |
| 11/o KHPO4 .....................................
1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 |
| 01/0 (NH4 )HP04 .................................
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 |
| % Maisweichwasser ............................. 1,0 1,0
1,0 1,0 1,0 |
| 0i0 NaBr ........... . ...........................
0 0,5 0 0,5 1,0 |
| pH der erhaltenen Gärlösung ......... . ...........
5,4 5,3 - - |
| 1/o Chlortetracyclin .............................. 100
10 95 < 5 <5 |
| % Tetracyclin ................ ................. 0 90
5 > 95 > 95 |
| Versuch 2 enthielt etwa 100 y Tetracyclin pro Kubikzentimeter. |
Beispiel 4 Ersetzt man im Beispiel
3 das Natriumbromid durch
Kaliumbromid, Caleiumbromid, Ammoniumbromid, Kaliumjodid, von dem weniger als
0,5 % verwendet wird, oder Natriumrhodanid, so wird die Tetracyclinmenge
auf Kosten des Chlortetracyclins in etwa gleichem Verhältnis erhöht.
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Beispiel 5
Verwendet man im Beispiel 10 Streptomyces
aureofaeiens (NRRL-2209) an Stelle von Streptomyces BL-567 201, so bewirkt Zusatz
von Bromid-, Jodid- oder Rhodanidionen zur Nährlösungebenfalls eine Erhöhung der
Tetracyclinausbeute auf Kosten der Bildung von Chlortetracyclin. Dies ist besonders
dann der Fall, wenn die Nährlösung diesem Streptomyces-Stamm besonders angepaßt,
d. h. so verändert wird, daß maximale Erzeugung des Antibiotikums gewährleistet
ist.
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Nach beendeter Gärung wird Tetracyclin aus der Gärflüssigkeit z. B.
in der Weise gewonnen, daß man zunächst das Myzel abfiltriert. Darauf wird die Gärflüssigkeit,
vorzugsweise nach Einstellung auf einen pH-Wert von 8,5, mit geeigneten Lösungsmitteln,
wie Butanol oder Methylisobutylketon, innig verrührt. Nach dem Absetzen und Abtrennen
der wäßrigen Schicht wird die Lösungsmittelschicht, die das Tetracyclin enthält,
durch Destillation auf ein kleines Volumen eingedampft und mit einem niedrigsiedenden
Kohlenwasserstoff, z. B. Skellysolve C, einer bei 85 bis
100' C siedenden Ligroinfraktion, sofern die extrahierte Gärflüssigkeit auf
einen alkalischen pH-Wert eingestellt war, oder als Hydrochlorid, wenn die Gärflüssigkeit
vor der Extraktion mit Salzsäure angesäuert worden war. Das so gewonnene feste Tetracyclin
kann gereinigt werden, indem man es mit Ammoniak anteigt oder auch indem man die
freie Base aus ihrer Lösung an ein chromatographisches Adsorptionsmittel, z. B.
an Kieselsäure, adsorbiert, die chromatographische Säule zwecks Entfernung der Verunreinigungen
mit geeigneten Lösungsmitteln, z. B. mit Aceton oder Methanol, wäscht und aus dem
Adsorptionsmittel durch Behandlung mit einer Säure das entsprechende Salz eluiert.
Das gereinigte Tetracyclinsalz wird aus dem Eluat durch Kristallisation, Fällung,
Tiefgefriertrocknung od. dgl. gewonnen.