DE1642738A1

DE1642738A1 - Verfahren zur Herstellung von D-Milchsaeure und ihren Salzen

Info

Publication number: DE1642738A1
Application number: DE19671642738
Authority: DE
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1966-01-17
Filing date: 1967-01-17
Publication date: 1971-05-19
Also published as: US3494832A; NL6700314A; LU52816A1; DK116933B; IT947004B; FR1473145A; BR6786158D0; GB1157213A; BE692703A; CH462135A

Description

f. Zumstein - Dr. E* Assmowt

Dr. R. Koemgsberger

Dipl. Phys. R. Holzhauer

PaienfanviäHe

2, Brauhausstraf}* 4/*

SC-2837

ISiOlIB-POtJtBKO S.A., Paris / Frankreich

Verfahren zur Herstellung von D-Milchsäure und Ihren Salzen

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von D-Milchsäure und ihren Salzen in technischem Maßstab.

Die D,L-MilchaHure und die L-Milchsäure werden teohnisoh unter sehr vorteilhaften Bedingungen hergestellt» da es möglich ist, die Fermentation ohne spezielle Vorsichtsmaßnahmen bezüglich der Sterilität in einer einfachen Anlage und mit einem wirtschaftHohen Zuchtungsmedium durchzuführen· Die diese Säuren erzeugenden Milohsäurebakterien sind sehr lebenskräftige und sehr robuste Bakterien, die eine erhöhte Fermentationstemperatur (50-55%) vertragen, die als solche zur Entfernung der meisten eventuellen Verunreinigungen ausreicht. Die Schnelligkeit der Züchtungen trägt auch zur Aufreohterhaltung der Reinheit der Bakterien bei (vgl. S. C. Presoott und

109821/0189

C. σ. Dunn» Industrial Microbiology, 3. Auflage, Seite 299, MacOraw Hill Book Co, 19391 I*. A. Uhderkofler, Industrial Fermentation, Seite 591, Chemical Publishing Co, 1954).

Die Herstellung von D-Milchsäure unter ebenso vorteilhaften Bedingungen 1st bisher nicht durchgeführt worden. Man findet in der Literatur die Beschreibung von Laboratoriumsarbeitsgängen, doch scheint ihre Übertragung auf eine Durchführung in technischem Maßstab nur möglich zu sein, wenn man keinen geringen Qestehungspreis des Säureprodukts erzielen will (V. E. Snell, Biochemical Preparations, Band 3, Seite 61, John Wiley and Sons Inc«, 1953)· Die D-Milchsäure erzeugenden Mikroorganismen, insbesondere Lactobacillus lelohmannii, sind weniger lebenskräftig und halten weniger Wärme aus als die D,L-Mllchsäure und die L-Mllohsäure erzeugenden Bakterien. Wenn man die Arbeitsgänge nicht unter vollständig sterilen Bedingungen durchführt, besteht .die Gefahr, daß zu jedem Zeltpunkt die Kulturen entweder mit anderen Milchsäurebakterien oder mit anderen Bakterienarten verunreinigt werden, deren Vorhandensein die Produktion der gewünschten Säure in nicht mehr zu behebender Welse gefährden kann.

Es wurde nun gefunden, daß man die D-Milcheäure durch Fermentation erzeugen kann, ohne kostspielige Anlagen, die die Fermentation unter vollständig sterilen Bedin-

109821/0189

gungen ermöglichen, zu verwenden.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Einbringung von einer oder mehreren Substanzen in das Züchtungsmedium, die befähigt sind, die Entwicklung von jedem anderen Mikroorganismus als dem Produktionsmikroorganismus zu inhibieren. Dieser letztere sollte zuvor an das oder die inhibierenden Substanzen akklimatisiert werden, damit sein Wachstum und die Produktion der D-Milohsäure noreal verläuft.

Die inhibierenden Substanzen, die man verwenden kann, gehören zu sehr verschiedenartigen Typen: Mineralsalzen und organischen Produkten mit antiseptischer Wirkung oder Antifungus-Wirkung, und diese Produkte können zur Erzielung eines wirksameren Schutzes kombiniert sein. Insbesondere wurde gefunden, daß die üblichsten Antibiotica eich für diesen Zweck sehr gut eignen. Andere Substanzen, wie beispielsweise Kupfer- oder Zinksalze, Formaldehyd, quatern&re Ammoniumderivate und SuIfamide, können denselben Zweck erfüllen.

Unter den verwendeten Antibiotica kann man die verschiedenen Penicilline, Streptomycin, Neomycin, Kanamycin, Chloramphenicol, die verschiedenen Tetracycline, Novobiocin, die verschiedenen Macrolide und unter diesen das Spiramycin und Polymycln, nennen, ohne daß diese Aufzählung jedoch eine Beschränkung darstellen würde.

109821/0189

Die Art der Durchführung dieser Ausführungsform der Erfindung besteht dari , zunächst den Produktionsmikroorganismus an den gewählten Inhibitor oder ein Gemisch von Inhibitoren zu £³ klimatisieren und dann die Produktionszüchtung in Gegenwart dieser Inhibitoren durchzuführen.

Man kann zu diesem Zweck jeden D-Milchsäure erzeugenden Mikroorganismus und Insbesondere Lactobacillus lelchmannii, Lactobacillus lactis und Lactobacillus caucaslcus verwenden. Die Adaptation des Mikroorganismus an den Inhibitor erfolgt fortschreitend« indem man ihn in einer Reihe von flüssigen oder festen Medien, die steigende Konzentrationen des Inhibitors enthalten» züchtet. Sobald sich der Mikroorganismus bei einer gegebenen Konzentration des Inhibitors in zufriedenstellender Welse entwickelt, wird er auf ein Medium versetzt, das eine höhere Konzentration enthält. Dieser Arbeltsgang wird wiederholt, bis ein Stamm erhalten ist, der den gewünschten Resistenzgrad aufweist, der im wesentlichen mit der Bakterienart und dem oder den gewählten Inhibitoren variiert. In der Praxis ermittelt man die Konzentration des Inhibitors, die einen geeigneten Schutz gegen eventuelle Verunreinigungen ohne übertriebenen Aufwand zu gewährleisten scheint„ Man kann beispielsweise für die Antibiotica Konzentrationen bis zu 100 bis 200 mg je 1 und für die Kupfersalze viel höhere Konzentrationen in der Größenordnung von mehreren Gramm je Liter verwenden.

109821/0189 BAD ORIGINAL

Für die Produktion der D-Milchsäure durch Fermentation kann nan die für die Herstellung der anderen Isomeren der Säure beschriebenen ZUchtungsmedien verwenden (vgl. S. C. Prescott und CO. Dunn, loc clt., und L.A. Underkofler, loc. clt.)· Das von V. Eo Snell (loc» clt.) empfohlene Medium eignet sich ebenfalls. Zm vorliegenden Falle 1st es besonders wirtschaftlich, als Zuckerquelle verschiedene Arten von Melassen und insbesondere Rübenmelasse zu verwenden. Die Melassen werden so verdünnt, daß in der Maische eine Zuckerkonzentration von 50 bis 200 g/l und vorzugsweise von 100 bis 130 g/l erreicht wird. Es ist zweckmäßig, das Medium mit einer Stickstoffquelle zu vervollständigen. Unter den verschiedenen möglichen mineralischen, organischen oder komplexen Quellen ist Maisquellwasser In einer Menge von 10 bis 50 g/l besonders geeignet. Da die D-Milohsäure erzeugenden Mikroorganismen gegen Aoidltät empfindlich sind, ist es erforderlich, letzteres mit Hilfe einer Lösung von Alkall- oder Erdalkallhydroxyden oder noch besser Carbonaten der gleichen Metalle zumindest teilweise zu neutralisieren. Schließlich kann es wie im Falle der Herstellung von D-Milchsäure im Laboratorium (V. E. Snell, loc. cit.) vorteilhaft sein, in das Medium Mineralsalze, schwefelhaltige Reduktionsmittel, Vitamine und oberflächenaktive Mittel einzubringen.

Die verwendete Apparatur erfordert keine spezielle Einrichtung, es ist lediglich eine Vorrichtung zum Heizen oder Abkühlen der Malsohen erforderlich. Man kann jeden üblicherweise in der

10 9 8 21/0189

Fermentationstechnik verwendeten und offenen Bottich aus Beton, Holz oder Metall verwenden.

Trotz des durch den Inhibitor gegen mikrobielle Verunreinigungen erzielten Schutzes kann es zu bevorzugen sein, eine zumindest teilweise Sterilisation des Züchtungsmediums vorzunehmen. Diese kann entweder direkt in dem Fermentationsbottich durch ein einfaches Kochen des vollständigen Mediums oder in zeitweilig betriebenen Nebenanlagen« Bottichen oder Sterilisatoren vorgenommen werden j in denen die verschiedenen Bestandteile des Mediums gleichzeitig oder getrennt auf eine geeignete Temperatur gebracht werden. In diesem letzteren Falle werden die Bestandteile nach der Sterilisation in den Fermentationsbottich überführt.

Das Züchtungsmedium wird anschließend auf die Fermentationstemperatur gebracht. Man setzt den gewählten Inhibitor zu und beimpft mit einer zuvor in Gegenwart des gleichen Inhibitors durchgeführten Impfkultur» Wenn der gewählte Inhibitor in Lösung bei der Temperatur and dem pH-Wert der Fermentation nicht sehr stabil 1st, kann es vorteilhaft sein, eine zusätzliche Zugabe vorzunehmen, um eine ausreichende Inhibitorkonzent ratlon aufreoht zuerhalten.

Man 188t die Fermentation bis zum praktisch vollständigen Verbrauch des Zuckers fortschreiten, wobei man alle zusatz-

109821/0189

lichen Arbeitsgänge, die für eine gute Entwicklung der Züchtungerforderlich sind« wie beispielsweise die Korrektur des pH-Werts, die Ergänzung an zuckerhaltigen und stickstoffhaltigen Elementen und die Zugabe von Antischaununitteln, vornimmt.

Man führt die Fermentation im allgemeinen bei der für den Produktion ^mikroorganismus als optimal angesehenen Temperatur durch. Zur Verstärkung des durch die zuvor genannten ■Verunreinigungsinhibitoren verliehenen Schutzes kann es jedoch von Interesse sein* bei einer höheren Temperatur als dieser optimalen Temperatur zu arbeiten. In gewissen Fällen ist es bevorzugt, den Produktionsmikroorganismus an diese neue Temperatur zu akklimatisieren, um seine Wachstumsgeschwindigkeit und seine Fermentationskapazität zu verbessern. So kann teäl~ spielsweise Lactobacillus leichmannil, dessen Entwicklung bei 36⁰C optimal ist (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, 1957, Seite 548, Ed. Williams and Wilkins Company, Baltimore), bei einer Temperatur von 47¹C und mehr verwendet werden.

Nach beendeter Fermentation kann die D-Milchsäure aus den Fermentationsmaischen nach einer üblichen Methode extrahiert werden. Man kann beispielsweise die Maische bei einem pH-Wert von etwa 6 filtrieren und dieses FiItrat gewinnen und eindampfen. Man erhält dann ein Salz der D-Milchsäure in kristallisierter Form. Dieses Salz wird nach üblichen Methoden gereinigt.

109821/0189

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel

a) Akklimatisierung des D-Milchsäure erzeugenden Mikroorganismus

Man stellt ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung hen

Glucose

Bacto-trypton Hefeextrakt Polyoxyäthylenanhydrosorbitmonooleat Kristallisiertes Natriumacetat Nat riufflthioglykolat Hydratisiertes Ferrosulfat Hydratisiertes Nangansülfat

85^-ige Orthophosphorsäure

Destilliertes Wasser

30 g 5 g 5 g 2 com 10 g 0,05 g 0,01 g 0,01 g 0,46 com ad 950 com

Man stellt den pH-Wert mit 0,9 ecm Natronlauge (d « 1,3?) auf

6,8 ein und sterilisiert 25 Minuten bei 120¹C. Dann setzt man 50 com

einer wäßrigen Lösung, die 0,1 g L(-i-)-Cystein-hydroohlorld und 10 ug Vitamin B12 enthält und durch Filtrieren sterilisiert ist, zu. Man verteilt das Medium in sterilen Rohren mit einer Länge von 200 mm und einem Durohmesser von 25 mm in einer Menge von 20 com Je Rohr und bringt in jedes Rohr 0,3 g

109821 /0189

in trockenem Zustand bei l8o°C während 1 1/2 Stunden sterilisiertes Calciunicarbonat ein. Der pH-Wert des Gemische beträgt 6,3. Man beimpft mit 0,8 ecm einer in einem Identischen Medium bei 37% Ir. einem Rohr in der Ruhe entwickelten Kultur von Lactobacillus leiohmannii (ATCC 4797). Nach 24-sttindiger Inkubation bei ebenfalls 37% in der Buhe 1st die Kultur gut entwickelt« und man versetzt sie im Rohr in ein identisches Medium, von dem die jeweils 20 ecm mit 0,5 com einer wäßrigen, 200 mg/1 Spiramycinadlpat enthaltenden Lösung (entsprechend 173 mg/1 Spiramyoin), die durch Filtrieren sterilisiert wurde, versetzt wurden. Das ZUohtungsmedium enthält somit 0,43 mg Spiramyoin je Liter, Nach 24-stfindiger Inkubation bei 37% in der Ruhe ist die Kultur gut entwickelt, und man versetzt sie in ein Medium der gleichen Zusammensetzung, das jedoch 1,73 mg Spiramycin je Liter anstelle von 0,43 mg/1 enthält. Man inkubiert bei 37% in der Ruhe. Eine Folge von Versetzungen wird unter den gleichen Bedingungen auf Medien, die immer reicher an Spiramycin sind und 4,3, dann 8,6, 13, 21,5, 30, 43, 60,5, 78, 104, 138, 173, 216 und i

schließlich 269 mg des Antibiotikums je Liter enthalten, durchgeführt.

b) Herstellung der Impfkultur

Ein 2-1-Erlenmeyer-Kolben wird mit dem folgenden Nährmedium

gefüllt und verschlossen:

109821/0189

Pepton

Hefeaminextrakt PoIyoxyathylenanhydrosorbitmolooleat Kristallisiertes Natriumacetat Nat riutnt hioglykolat Hydratisiertes Magnesiumsulfat Natriumchlorid Hydratlslertes Ferrosulfat Hydratisiertes Mangansulfat

8556-ige Orthophosphorsäure

Destilliertes Wasser

7,5 g 7,5 g 3 ecm 15 g
0,075 g 0,3 g 0,015 g 0,015 g 0,015 g 0,69 com ad 1275 com,

Man stellt den pH-Wert mit 0,5 com Natronlauge (d « 1,33) auf 6,1 ein und sterilisiert 45 Minuten bei 120¹C. Nach Abkühlen setzt man 150 ecm einer SO Minuten bei 12OT sterilisierten, 75 g Glucose enthaltenden wäßrigen Lösung und 75 com einer durch Filtrieren sterilisierten Lösung, die 15 mg L(+)-Cystein-HCl, 15 μg Vitamin B12 und 450 mg Spiramycin-adipat (entsprechend 388 mg Spiramycin) enthält, zu. Schließlich vervollständigt man mit 45 g zuvor in trockenem Zustand 1 1/2 Stunden bei 18O<C sterilisiertem Calciumcarbonat. Der pH-Wert des Gemische beträgt 6,2. Man beimpft mit 40 oom der Rohrkultur des gegen 269 mg Spiramycin je Liter resistenten Stamms und verschließt den Kolben mit einem Kautsohukstopfen, durch den ein feines Rohr zur Abführung des Kohlendloxydgases geht. Man inkubiert 30 Stunden auf einem Schütteltisch (Qeaohwlnd'.g-

109821 /0189

keit 180 UpN, Gang 10 cm) bei

c) Produktionskultur

Ein zylindrisch-konisch geformter Bottich aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 8o 1* der mit einem abnehmbaren Deckel verschlossen 1st, wird mit folgendem Medium gefttlltt

RUbenmelasse 10 kg Polyoxyäthylenanhydrosorbit-

monooleat 50 ecm

Leitungswasser ad 45 1 Man stellt den pH-Wert mit 2,5 ecm Schwefelsäure (d » 1,83)

auf 7,0 ein und erhitzt 15 Minuten bei 10O⁴C. Nach Abkühlen auf 45«C setzt man 300 com einer nicht-sterilen wäßrigen Lösung, die 5 g Spiramycin-adipat (entsprechend 4,3 g Spiramycin) enthält, und dann 4 1 einer zuvor mit 172 com Natronlauge (d m 1,33) auf pH 6,8 eingestellten und 60 Minuten bei 122⁰C sterilisierten wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 1,750 kg

Maiequellwasser (mit 50$ Trockenextrakt) zu. Schließlich

vervollständigt man mit 3,250 kg nicht-sterilisiertem

Caloiumoarbonat. Das Gemisch(50 1) hat einen pH-Wert von

7,1. Die Temperatur wird durch Zirkulation von warmem Wasser in einer in die Brühe eingetauchten Schlange aus rostfreiem

Stahl auf 44ΐ eingestellt. Das Medium wird mit einem Rührer

mit vertikalen Schaufeln, der bei 100 UpM betrieben wird.

109821/0189

gerührt. Man beimpft alt 3 1 Impfkultur, die aue zwei Erlenmeyer-Kolben stammt. Haoh 6O-etündiger Inkubation beträgt der pH-Wert 5,5. Die Haleohe enthält 113 g D-ffilohsKure 4« Liter, und der restliche Zucker entspricht 5 g Olucöse Je Liter· Durch Einwirkung von L-Milohsäuredehydrogenase stellt nan fest, daß die Brühe nicht mehr als 3 g L-Hilchstlure Je Liter enthKlt.

d) Extraktion des .Calcium-D-lactats

Der pH-Wert der 17»* 1 Fermentationsmaisohe, die unter den obigen Bedingungen hergestellt ist, wird mit Hilfe einer das Äquivalent von 5 g Kt«kalk enthaltenden Kalkmilch auf 6 eingestellt. Das Medium wird unter Bewegen 30 Minuten auf erhitzt. Man setzt dann 700 g Filterhilfe zu und filtriert. Der Filterkuchen wird «it 5 1 auf ΒθΌ erhitzten Wasser gewaschen.

heK

Man erhitlt so 20 1 FlItrat, das 9**2 g D-MilcheKure des CalolunsalzM enthKlt. Das FlIt rat wird in einem Schnellverdampfer im Vakuum bei HCK auf ein Volumen von 8 1 eingeengt. Das Konzentrat wird unter Bewegen auf 2ζΧ abgekühlt.

Wach 24 Stunden wird das kristallisierte Calolum-D-lactat abgesaugt und dann unter vermindertem Druck (β mm Hg) bei 6(K 48 Stunden getrocknet. Man erhält so 2822 g rohes Caloium-D-laotat mit folgender Zusammensetzung:

BAD ORIGINAL 109821/0189

Milchsäure: 54*
Calciums 14*

Nach einer spezifischen enzymatischen Bestimmung enthält das Produkt weniger als 1,6* L-Milchsäure. Die Ausbeute beträgt 77*.

Das rohe Caloiumsalz wird umkristallisiert, indem es in 11,25 auf 8o°C erhitztem Wasser gelöst wird. Man setzt 14O g Entfärbungskohle zu und hält dann die Suspension 10 Minuten in Bewegung. Nach dieser Zeltspanne setzt man J54o g Filterhilfe zu und filtriert. Das Piltrat wird bei kOPC unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 6,25 1 eingeengt. Das Konzentrat wird unter Bewegen auf 25⁰C abgekühlt. Nach zwei Stunden wird das CaIcium-D-lactat abgesaugt und dann mit 0,85 1 Wasser von 4· 5"C gewaschen. Das Produkt wird 48 Stunden unter vermindertem Druck (8 mm Hg) bei 60⁰C getrocknet. Man erhält so 1500 g wasserfreies Calcium-D-lactat mit folgender Zusammen-Setzung:

Milchsäure: 78,5* (theoretisch für 81, Calciums 17,8* ( ⁰⁴¹C⁰¹^⁰¹¹⁰H-COO)_{2 l8<}

Eine enzymatlsche Bestimmung der L-Milchsäure mit Hilfe einer spezifischen Dehydrogenase zeigt, daß das Produkt weniger als 1,6* L-Milchsäure enthält.

109821/0189

Das Drehvermögen wird an durch Umsetzung von Zinkcarbonat mit dem Caleium-D-laotat in wäßrigem Medium und Kristallisation

!stellten! Zink-D-laetat bestimmt:

Cot]²² « 4> 6,34° φ 0,20° (c = 7*502 # in Wasser)

Purdie und Walker, Soc. 61, Seite 762 (1892), zitiert in Beilstein (Auflage 1921, Band III, Seite 267) geben für dieses ™ Salz an:

- * 6,32°(c . 6,751# in Wasser).

109821/0189

Claims

P at ent ansprUche

1. Verfahren zur Herstellung von D-Milohsäure durch Fermentation eines zumindest einen assimilierbaren Zucker und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthaltenden Hährmediums, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Medium zumindest einen Inhibitor für Paraeitenmikroorganiemen zusetzt und einen gegenüber diesem Inhibitor indifferenten Mikroorganismus· der als D-Milchsäure erzeugend bekannt ist, verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« daß man den D-Milchsäure erzeugenden Organismus an den Inhibitor durch vorhergehende Züchtung in Gegenwart einer wachsenden Konzentration an dieses* gewöhnt.

109821/0189