DE1151803B

DE1151803B - Verfahren zur Herstellung von 6-Acylaminopenicillansaeuren

Info

Publication number: DE1151803B
Application number: DEF30003A
Authority: DE
Inventors: Dr Hans Albert Offe; Dr Wilfried Kaufmann; Dr Klaus Bauer
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1959-12-04
Filing date: 1959-12-04
Publication date: 1963-07-25
Also published as: DK127254B; US3079306A; SE304269B; BE597759A; GB904576A; BR6024673D0; NO115254B

Description

Alle bekannten Penicilline leiten sich als Acylderivate von der erstmalig von F. R. Batchelor und Mitarbeiter (»Nature«, Bd. 183, 1959, S. 257) isolierten 6-Aminopenicillansäure ab. Die bis vor kurzer Zeit in der Chemotherapie gebräuchlichen Penicilline beschränkten sich hauptsächlich auf das Penicillin G, das Phenylacetylderivat der 6-Aminopenicillansäure und auf das Penicillin V, das Phenoxyacetylderivat der 6-Aminopenicillansäure. Das konventionelle technische Verfahren zur Herstellung dieser beiden Penicilline besteht in der Züchtung des Pilzes Penicillium chrysogenum in Maisquellwassernährlösungen, denen als sogenannte Praecursoren für die genannten Penicilline Phenylessigsäure bzw. Phenoxyessigsäure zugesetzt wird. In solchen Kulturen wird das Penicillin von den atmenden und gleichzeitig wachsenden Pilzzellen in das flüssige Kulturmedium ausgeschieden und kann mit bekannten chemischen Methoden daraus isoliert werden. Durch Zusatz anderer Säuren als Praecursoren war es möglich, eine Reihe weiterer Penicilline herzustellen (O. K. Behrens, und Mitarbeiter, »Journal of Biological Chemistry«, Bd. 175, 1948, S. 771 und 798), doch waren die Ausbeuten oft recht unbefriedigend. Darüber hinaus ist dieses sogenannte Fermentationsverfahren, bei dem die Biosynthese der Penicilline an die intakte, zum Wachstum befähigte Piizzelle gebunden ist, in seiner allgemeinen Anwendbarkeit sehr beschränkt, da auf diesem Wege nur monosubstituierte Essigsäuren in die 6-Aminopenicillansäure eingebaut werden. So wird z. B. a-Phenoxypropionsäure nicht als Praecursor verwertet.

Ein Verfahren, auf »halbsynthetischem« Wege neue Penicilline herzustellen, besteht darin, 6-Aminopenicillansäure mit energiereichen Säurederivaten, insbesondere mit Säurechloriden, umzusetzen (bekanntgemachte Unterlagen des belgischen Patents 569728), wobei methodische Schwierigkeiten auftreten. In der Patentanmeldung F 29459 IVd/12p (deutsche Auslegeschrift 1 149 361) ist vorgeschlagen worden, 6-Acylaminopenicillansäure!! dadurch herzustellen, daß man auf 6-Aminopenicillansäure Carbonsäuren, deren Salze oder deren am Aminostickstoffatom substituierte Amide im Überschuß bei etwa 10 bis 45 ⁰C und einem Pir-Wert unter etwa 5,5 in Gegenwart von Bakterien oder aus diesen gewonnenen Extrakten oder enzymhaltigen Präparaten einwirken läßt, die fähig sind, die Amidbindung in 6-Stellung von Penicillinen ab etwa Ph 6,0 bevorzugt zu spalten, und daß man die erhaltenen Penicilline in üblicher Weise isoliert. Als geeignete Carbonsäureamide hatten sich unter anderem Acylglycokolle oder Acylglutaminsäuren erwiesen.

Verfahren zur Herstellung
von o-Acylaminopenicillansäuren

Anmelder:

Farbenfabriken Bayer Aktiengesellschaft,
Leverkusen

Dr. Hans Albert Offe, Wuppertal-Elberfeld,

Dr. Wilfried Kaufmann, Wuppertal-Vohwinkel,

und Dr. Klaus Bauer, Wuppertal-Elberfeld,

sind als Erfinder genannt worden

Es wurde nun gefunden, daß man manche 6-Acylaminopenicillansäuren in wesentlich höherer Ausbeute erhält, wenn man 6-Aminopenicillansäure mit Carbonsäureestern von Hydroxy- oder Mercaptoverbindungen, insbesondere von Hydroxy- und Mercaptocarbonsäuren oder Hydroxy- bzw. Mercaptocarbonsäureestern, -amiden oder -salzen bei einem pn-Wert nicht über etwa 6,5, jedoch sonst unter gleichen Bedingungen und in Gegenwart solcher Bakterien oder aus diesen gewonnenen Extrakten oder enzymhaltigen Präparaten umsetzt.

Als 6-Aminopenicillansäure können sowohl die synthetische oder die durch Abbau gewonnene, kristallisierte Substanz oder gegebenenfalls angereicherte rohe Lösungen, wie sie aus Fermentationen oder anderen Prozessen anfallen, benutzt werden.

Von zahlreichen Bakterienarten ist es bekannt, daß sie Penicilline allenfalls zu inaktivieren vermögen. Um so überraschender ist es, daß es Bakterien gibt, die im lebenden oder abgetöteten, enzymatisch jedoch aktiven Zustand befähigt sind, aus 6-Aminopenicillansäure und Carbonsäuren 6-Acylaminopenicillansäuren zu bilden.

Hydroxy- und Mercaptoverbindungen im Sinne der Erfindung sind Alkohole, Mercaptane, Phenole und Thiophenole. Beispiele für Alkohole sind Äthanol, Butanol, Dodecylalkohol, Cyclohexanol, Phenylmethylcarbinol und Glykolsäure. Geeignete Mercaptane sind Mercaptobenzthiazol, Thioglykolsäure, 2-Mercaptobuttersäure und Cysteamin. Als Phenole oder Thiophenole kommen Phenol, p-Oxybenzoesäure, Thiophenol oder Thiokresol in Frage.

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Beispiele brauchbarer Verbindungen sind Phenyl- Herstellung der

essigsäurethiophenolester, Phenoxyessigsäuremethyl- Ä-Phenoxypropionylthioglykolsäure

ester, a-PhenoxypropionylthioglykoIsäure, o-Chlor- I_n 200 ecm 4,4%iger Natronlauge werden 9,2 g

phenoxyacetylthioglykolsäureamid, p-chlorphenoxy- Thioglykolsäure gelöst. Zu dieser Lösung gibt man acetylthioglykolsaures Natrium. Besonders geeignet 5 unter Einleiten von Stickstoff und gutem Rühren bei sind Carbonsäureester von solchen Alkoholen und 0 bis 5° C 18,4 g a-Phenoxypropionsäurechlorid Mercaptanen, die wiederum Carboxylgruppen tragen, innerhalb von 30 Minuten. Nach 2stündigem Nachbeispielsweise Carbonsäureester von Glykol- und rühren bei 20° C wird mit Salzsäure angesäuert. Das Thioglykolsäure. abgeschiedene Öl wird mit Äther aufgenommen.

Die Gegenwart der genannten Enzyme ist erforder- io Nach dem Trocknen und Verdampfen des Äthers lieh, da die Carbonsäureester in wäßrigem Milieu bei hinterbleiben 22,9 g a-Phenoxypropionylthioglykol-Ph 4 bis 8 allein nicht in der Lage sind, 6-Aminopeni- säure als viskoses Öl, das nach längerem Stehen cillansäure zu den erwünschten 6-Acylderivaten zu kristallisiert. F. i>2° C. acylieren. Vergleichsversuche haben ergeben, daß .

«-Phenoxypropionylthioglykolsäure, bei ph 4 bis 8 mit 15 Beispiel 2

6-Aminopenicillansäure behandelt, keine 6-a-Phenoxy- Einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Bakterien-

propionyl-aminopenicillansäure liefert, während der suspension werden 0,025% 6-Aminopenicillansäure, Zusatz einer entsprechenden Enzymlösung die ge- 0,5% o-Chlorphenoxyacetylthioglykolsäure und 0,1% wünschte Synthese schnell und in hoher Ausbeute be- Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann wirkt. Es ist nicht erforderlich, die synthesebewirken- 20 mit Salzsäure auf ph 5,0 eingestellt und 1 Stunde bei den Enzyme zu isolieren. Vielmehr sind bereits Bak- 37° C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der terienzellen, die diese Enzyme enthalten, oder ihre Ansatz 324 Einheiten Penicillinaktivität pro Kubik-Lysate als reaktionsbedingende Agenzien verwendbar. Zentimeter, gemessen an einem Penicillin-G-Standard Ein besonderer Vorteil des vorliegenden Verfahrens im Plattentest mit Bac.subtilis ATCC 6633. Diese ist es ferner, solche ö-Acylaminopenicillansäuren mit 25 Penicillinaktivität wird von der bei der enzymatischen den wertvollen antibiotischen Eigenschaften der Peni- Reaktion entstandenen 6-(o-Chlorphenoxyacetyl)-cilline in hoher Ausbeute darzustellen, die durch aminopenicillansäure bewirkt.

Fermentation mit penicillinbildenden Pilzen in Gegen- Die verwendete o-Chlorphenoxyacetylthioglykol-

wart der entsprechenden Carbonsäuren (sogenannten säure wird aus o-Chlorphenoxyacetylchlorid mit Praecursoren) nicht entstehen. 30 Thioglykolsäure nach Art der Phenoxypropionylthio-

Die Verfahren zur Herstellung der enzymatisch ak- glykolsäure (s. Beispiel 1) hergestellt. Sie bildet tiven Bakteriensuspensionen bzw. Bakterienextrakte farblose Kristalle. F. 120° C. und der als Ausgangsstoffe verwendeten Carbonsäure- .

derivate sind nicht Gegenstand der vorliegenden Er- Beispiel

findung. 35 Einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Bakterien-

Beisoiel 1 suspension werden 0,125% 6-Aminopenicillansäure,

0,5% p-Methoxyphenoxyacetylthioglykolsäure und

160 1 2 volumprozentige Maisquellwasserlösung, 0,1 % Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird enthaltend 0,2% Kaliumphenylacetat, werden mit dann mit konzentrierter Sodalösung auf pH 6,5 einKalilauge auf pn 7,0 eingestellt und 30 Minuten auf 40 gestellt und 1 Stunde bei 37° C aufbewahrt. Nach 120° C erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung dieser Zeit enthält der Ansatz 744 Einheiten Penicillindurch Zentrifugieren geklärt und 40 Minuten bei aktivität pro Kubikzentimeter, gemessen an einem 110° C im Fermenter sterilisiert. Diese Nährlösung Penicillin-G-Standard im Plattentest mit Bac.subtilis wird nach Abkühlung mit 400 ecm einer 18stündigen ATCC 6633. Diese Penicillinaktivität wird von der bei Schüttelkultur von E.coli ATCC 11105 beimpft. Der 45 der enzymatischen Reaktion entstandenen 6-(p-Meth-Ansatz wird dann mit 150 1 Luft pro Minute bei oxyphenoxyacetyl)-aminopenicillansäure bewirkt. 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüf- Die verwendete p-Methoxyphenoxyacetylthio-

tet und 17 Stunden bei 31° C ohne Überdruck kulti- glykolsäure wird aus p-Methoxyphenoxyacetylchlorid viert. Während der gesamten Wachstumszeit werden mit Thioglykolsäure dargestellt (s. Beispiel 1). Farbdurch eine von der Luftleitung des Fermenters 50 lose Kristalle. F. 85° C. getrennte Leitung 5 1 Kohlendioxyd pro Minute in .

die Kultur eingeleitet. Die Bakterienzellen werden aus Beispiel 4

der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 1 V₁₅molarer Einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Bakterien-

Phosphatpufferlösung von pn 6,0 gewaschen und suspension werden 0,125% 6-Aminopenicillansäure, nach dem Abzentrifugieren zu einer dichten Suspension 55 1,0% 2,6-Dichlorphenoxyacetylthioglykolsäure und in Visinolarer Phosphatpufferlösung von Ph 6,0 0,1 % Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird resuspendiert. dann mit Salzsäure auf ph 5,0 eingestellt und 1 Stunde

Dieser Suspension setzt man 0.125% 6-Amino- bei 37° C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der penicillansäure, 0,5 % «-Phenoxypropionylthioglykol- Ansatz 247 Einheiten Penicillinaktivität pro Kubiksäure und 0,1% Toluol zu. Das Reaktionsgemisch ⁶° Zentimeter, gemessen an einem Penicillin-G-Standard wird dann mit konzentrierter Sodalösung auf pn 6,5 im Plattentest mit Bac.subtilis ATCC 6633. Diese eingestellt und 1 Stunde bei 37° C aufbewahrt. Nach Penicillinaktivität wird von der bei der enzymatischen dieser Zeit enthält der Ansatz 884 Einheiten Penicillin- Reaktion entstandenen 6-(2,6-Dichlorphenoxyacetyl)-aktivität pro Kubikzentimeter, gemessen an einem aminopenicillansäure bewirkt.

Penicillin-G-Standard im Plattentest mit Bac.subtilis 65 Die verwendete2,6-Dichlorphenoxyacetylthioglykol-ATCC 6633. Diese Penicillinaktivität wird von der bei säure wird aus 2,6-Dichlorphenoxyacetylchlorid mit der enzymatischen Reaktion entstandenen 6-(a-Phen- Thioglykolsäure hergestellt (s. Beispiel 1). Sie bildet oxypropionyO-aminopenicillansäure bewirkt. farblose Kristalle, F. 60° C.

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Beispiel 5 phenoxyacetylglykolsäure. Die Säure schmilzt nach

Einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Bakterien- dem Umlösen aus Benzol unscharf bei 107° C. Suspension werden 0,125% 6-Aminopenicillansäure, .

1,0% p-Nitrophenoxyacetylthioglykolsäure und Beispiel 8

0,1% Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 5 Einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Bakteriendann mit Salzsäure auf pjr 5,0 eingestellt und 1 Stunde suspension werden 0,025 % 6-Aminopenicillansäure, bei 37" C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der 0,5% o-Chlorphenoxyacetylthioglykolsäureamid und Ansatz 256 Einheiten Penicillinaktivität pro Kubik- 0,1 % Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird Zentimeter, gemessen an einem Penicillin-G-Standard dann auf Ph 5,5 eingestellt und 1 Stunde bei 37° C im Plattentest mit Bac.subtilis ATCC 6633. Diese io aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz Penicillinaktivität wird von der bei der enzymatischen 53 Einheiten Penicillinaktivität pro Kubikzentimeter, Reaktion entstandenen 6-(p-Nitrophenoxyacetyl)- gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattenaminopenicillansäure bewirkt. Die p-Nitrophenoxy- test mit Bac.subtilis ATCC 6633. Diese Penicillinacetylthioglykolsäure wird aus p-Nitrophenoxyacetyl- aktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion Chlorid mit Thioglykolsäure hergestellt (s. Beispiel 1). 15 entstandenen o-Chlorphenoxyacetyl-ö-aminopenicil-Sie bildet ein hellbraunes Pulver. F. 101° C. lansäure bewirkt.

Das verwendete o-Chlorphenoxyacetylthioglykol-

Beisniel 6 säureamid wird hergestellt, indem man Thioglykol-

säureamid in wäßrig-alkalischer Lösung bei 0 bis 5° C

Einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Bakterien- 20 mit o-Chlorphenoxyessigsäurechlorid versetzt. Sein Suspension werden 0,025% 6-Aminopenicillansäure, Schmelzpunkt liegt bei 180⁰C. 0,5 % o-Chlorphenoxyessigsäure-phenylester und

0,1% Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird Beisoiel 9

dann auf pn 5,5 eingestellt und 1 Stunde bei 37° C

aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 25 Einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Bakterien-5,9 Einheiten Penicillinaktivität pro Kubikzentimeter, suspension werden 0,025% 6-Aminopenicillansäure, gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Platten- 0,5% «-Phenoxypropionyl-ß-thiopropionsäure und test mit Bac.subtilis ATCC 6633. Diese Penicillin- 0,1 % Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird aktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion dann auf ph 6,5 eingestellt und 1 Stunde bei 37° C entstandenen 6-(o-Chlorphenoxyacetyl)-aminopenicil- 30 aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz lansäure bewirkt. 246 Einheiten Penicillinaktivität pro Kubikzentimeter,

Der verwendete o-Chlorphenoxyessigsäure-phenyl- gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattenester wird aus o-Chlorphenoxyessigsäurechlorid und test mit Bac.subtilis ATCC 6633. Diese Penicillin-Phenolnatrium bei 0 bis 5⁰C in Tetrahydrofuran aktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion hergestellt. Nach dem Umlösen aus Ligroin zeigt er 35 entstandenen 6-(«-Phenoxypropionyl)-aminopenicileinen Schmelzpunkt von 54 bis 56° C. lansäure bewirkt.

Die als Ausgangsmaterial benutzte «-Phenoxy-

Beismel 7 propionyl-ß-thiopropionsäure der Formel

Einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Bakterien- 40 C₆H₅-O-CH-(CH₃)-CO-S-CH₂-CH₂-COOH Suspension werden 0,025% 6-Aminopenicillansäure,

0,5% o-Chlorphenoxyacetylglykolsäure und 0,1% wird aus dem Dinatriumsalz der/S-Mercaptopropion-Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann säure in wäßriger Lösung mit «-Phenoxypropionylauf pn 6,5 eingestellt und 1 Stunde bei 37° C auf- chlorid bei 0 bis 5° C dargestellt. Nach dem Ansäuern bewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 368 Ein- 45 und Extrahieren mit Äther stellt sie ein Schwachheiten Penicillinaktivität pro Kubikzentimeter, gemes- gelbliches Harz dar. sen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest mit .

Bac.subtilis ATCC 6633. Diese Penicillinaktivität wird Beispiel 10

von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen Einer wie im Beispiel 1 gewonnenen Bakterien-

6-(o-Chlorphenoxyacetyl)-aminopenicillansäure be- 5° suspension werden 0,025% 6-Aminopenicillansäure, wirkt. 0,5% Diphenoxyacetylthioglykolsäure und 0,1%

Die verwendete o-Chlorphenoxyacetylglykolsäure Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann der Formel auf pn 5,0 eingestellt und 1 Stunde bei 37° C auf-

Qy bewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 122 Ein-

55 heiten Penicillinaktivität pro Kubikzentimeter, gemes-

.; sen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest mit

— O — CH₂ — CO — O — CH₂ — COOH Bac.subtilis ATCC 6633. Diese Penicillinaktivität wird

von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen

wurde gewonnen, indem man eine wäßrige Lösung 6-(Diphenoxyacetyl)-aminopenicillansäure bewirkt, des Triäthylaminsalzes der Glykolsäure mit über- 60 Diphenoxyacetylthioglykolsäure der Formel schüssigem Triäthylamin und dem gleichen Volumen

Tetrahydrofuran versetzte und bei 0 bis 5° C o-Chlor- (C₆H₅ — O)₂ — CH — CO — S — CH₂ — COOH

phenoxyessigsäurechlorid zutropfte. Eine andere Darstellungsweise besteht in der Umsetzung von Glykol- wurde aus Diphenoxyessigsäurechlorid mit einer säure-tert.-butylester mit o-Chlorphenoxyacetyl- 65 wäßrigen Lösung des Dinatriumsalzes der Thioglykolchlorid in alkalischem Medium und anschließender säure gewonnen. Sie ist aus Essigester—Petroläther thermischer Zersetzung des 2-Chlorphenoxyacetyl- kristallisierbar und hat dann einen Schmelzpunkt glykolsäure-tert.-butylesters in Isobutylen und 2-Chlcr- von 85° C.

Beispiel 11

1601 einer 1,0% Kaseinhydrolysat, 0,1% Dikaliumphosphat, 0,03 % Magnesiumsulfat und 0,20 % Kaliumphenylacetat enthaltenden Nährlösung werden 40 Minuten bei 110° C im Fermentor sterilisiert und nach Abkühlung mit 400 ecm einer 18stündigen Schüttelkultur von Proteus rettgeri beimpft. Der Ansatz wird dann mit 150 l/Min. Luft bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 20 Stunden bei 25° C kultiviert. Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 1 0,9%iger Natriumchloridlösung gewaschen und nach erneutem Abzentrifugieren in Vismolarer Phosphatpufferlösung von pH 6,0 resuspendiert.

Dieser Suspension setzt man 0,125% 6-Aminopenicillansäure, 0,5 % «-Phenoxypropionylthioglykolsäure und 0,1% Toluol zu. Das Reaktionsgemisch wird dann mit Natriumhydroxyd auf ph 6,5 eingestellt und 1 Stunde bei 37° C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 760 Einheiten Penicillinaktivität pro Kubikzentimeter, gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest mit Bac.subtilis ATCC6633.

Diese Penicillinaktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen 6-(«-Phenoxypropionyl)-aminopenicillansäure bewirkt.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung von 6-Acylaminopenicillansäuren durch Umsetzung von 6-Aminopenicillansäure mit Derivaten von Carbonsäuren im Überschuß und bei 10 bis 45° C und einem PH-Wert nicht über etwa 6,5 in Gegenwart von Bakterien bzw. aus diesen gewonnenen Extrakten oder enzymhaltigen Präparaten, die fähig sind, die Amidbindung in 6-Stellung von Penicillinen ab etwa pH 6,0 bevorzugt zu spalten, und Isolierung der entstandenen Penicilline, dadurch gekenn zeichnet, daß als Derivate der Carbonsäuren deren Ester von Hydroxy- oder Mercaptoverbindungen verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydroxy- oder Mercaptoverbindungen Hydroxy- oder Mercaptocarbonsäuren oder Hydroxy- bzw. Mercaptocarbonsäureester, -amide oder -salze verwendet.