NO115254B

NO115254B -

Info

Publication number: NO115254B
Application number: NO138179A
Authority: NO
Inventors: H Offe; W Kaufmann; K Bauer
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1959-12-04
Filing date: 1960-11-30
Publication date: 1968-09-09
Also published as: DK127254B; BR6024673D0; US3079306A; SE304269B; DE1151803B; GB904576A; BE597759A

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av 6-acylaminopenicillansyrer.

Alle kjente penicilliner avleder seg som acylderivater fra den første gang av F. R. Bat-chelor og medarbeidere («Nature», bind 183, 1959, side 257) isolerte 6-aminopenicilliansyre. De inntil for kort tid siden i kjemoterapien vanlige penicilliner begrenser seg hovedsakelig til penicillin G, fenylacetylderivatet av 6-aminopenicillansyre og til penicillin V, fenoksyacetyl-derivatet av 6-aminopenicillansyre. Den kon-vensjonelle tekniske fremgangsmåte til fremstilling av disse to penicilliner består i dyrk-ning av soppen Penicillium chrysogenum i mais-svellevann-næringsoppløsning, hvortil det som såkalt precursor for de nevnte penicilliner settes fenyleddiksyre resp. fenoksyeddiksyre. I slike kulturer utskilles penicillinet av de voksende soppceller i flytende kulturmedium og kan iso-leres herav med kjente kjemiske metoder. Ved tilsetning av andre syrer som precursorer var det mulig å fremstille en rekke ytterligere penicilliner (O. K. Behrens og medarbeidere, «Journal of Biological Chemistry», bind 175, 1948, sidene 771 og 798), imidlertid var ofte utbyttene mer utilfredsstillende. Dessuten er denne såkalte fermenteringsfremgangsmåte, hvor penicillinenes biosyntese er bundet til de intakte soppceller som er i stand til vekst, meget begrenset i sin generelle anvendbarhet, da det på denne måte bare kan innbygges monosubstituerte eddiksyrer i 6-aminopenicillansyren. Således utnyttes f. eks. a-fenoksypropionsyre ikke som precursor.

En fremgangsmåte til på «halvsyntetisk» måte å fremstille nye penicilliner består i å om-sette 6-aminopenicillansyrer med energirike sy-rederivater, spesielt med syreklorider (utlagte underlag for belgisk patent nr. 569 728), idet det opptrådte metodiske vanskeligheter. I norsk uti. skrift nr. 115 253 er det foreslått å fremstille 6-acylaminopenicillansyrer ved at man på 6-aminopenicillansyre lar innvirke overskudd av kar bonsyrer, salter herav eller amider herav som er substituert ved amidnitrogenatomet, ved 10 til 45° og en pH-verdi under 5,5 i nærvær av bakterier som er i stand til å spalte penicillinenes amidbinding i 6-stilling ved pH fra 6, eller herav utvunne ekstrakter eller enzymholdige preparater og utvinner de dannede 6-acylaminopenicillansyrer ifølge vanlige metoder til isolering av penicilliner. Som karbonsyreamider har bl. a. acylglykokoller eller acylglutaminsyrer vist seg egnet.

Det er nå blitt funnet at man får 6-acylaminopenicillansyrer av fenoksykarbonsyrer i vesentlig høyere utbytte ved omsetning av 6-aminopenicillansyre med derivater av fenoksykarbonsyrer i overskudd og ved 10 til 45°C i nærvær av bakterier, resp. herav utvunne ekstrakter eller enzymholdige preparater, som er i stand til å spalte penicillinenes amidbinding i 6-stilling ved pH j> 6,0 og isolering av de dannede penicilliner, idet denne fremstilling erkarakterisert vedat omsetningen med derivater av fenoksykarbonsyrer foregår ved en pH på ikke over 6,5 og at det som derivater av fenoksy-karbonsyre anvendes.deres estere av hydroksy-eller merkaptoforbindelser.

Som hydroksy- eller merkaptoforbindelser anvendes fortrinnsvis hydroksy- eller merkaptokarbonsyrer eller hydroksy- resp. merkapto-karbonsyreestere, -amider eller -salter.

Som 6-aminopenicillansyre kan det benyt-tes såvel de syntetiske eller de ved nedbygning fremstilte, krystalliserte stoffer eller eventuelt anrikede råoppløsninger, slik de fremkommer fra fermentering eller andre prosesser.

Det er kj ent at tallrike bakterietyper formår å inaktivere penicilliner. Desto mer overras-kende er det at det finnes bakterier som i leven-de eller død, enzymatisk imidlertid aktiv til-stand, er i stand til fra 6-aminopenicillansyre og karbonsyrer å danne 6-acylamino-penicillan-syrer.

Hydroksy- og merkaptoforbindelser innen oppfinnelsens ramme er alkoholer, merkaptaner, fenoler og tiofenoler. Eksempler på alkoholer er etanol, butanol, dodecylalkohol, cykloheksanol, fenylmetylkarbinol og glykolsyre. Egnede merkaptaner er merkaptobenztiozol, tioglykolsyre, 2-merkaptosmørsyre og cysteamin. Som fenoler eller tiofenoler kommer det på tale fenol, p-ok-sybenzosyre, tiofenol eller tiokresol.

Eksempler på anvendbare forbindelser er fenoksyeddiksyremetylester, a-fenoksy-propio-nyltioglykolsyre, o-klorfenoksyacetyltioglykolsy-reamid, p-klorfenoksyacetyltioglykolsurt natri-um. Spesielt egnet er fenoksykarbonsyreestere av slike alkoholer og merkaptaner som igjen har karboksylgrupper, eksempelvis av glykol- og tioglykolsyre.

Nærværet av de nevnte enzymer er nødven-dig da fenoksykarbonsyreestrene i vandig miljø ved pH ikke over 6,5 alene ikke er i stand til å acylere 6-aminopenicillansyre til de ønskede 6-acylderivater. Sammenlikningsforsøk har vist at a-fenoksypropionyltioglykolsyre, behandlet ved pH ikke over 6,5 med 6-aminopenicillansyre, ikke gir 6-a-fenoksypropionylaminopenicillansyre, mens tilsetning av en tilsvarende enzymoppløs-ning bevirker den ønskede syntese hurtig og i høyt utbytte. Det er ikke nødvendig å isolere de syntesebevirkende enzymer. Allerede bakterie-celler som inneholder disse enzymer eller deres lysater er anvendbar som reaksjonsbetingende stoffer.

En spesiell fordel med foreliggende fremgangsmåte er videre at man med høyt utbytte kan fremstille slike 6-acylaminopenicillansyrer med verdifulle antibiotiske egenskaper som ikke oppstår ved fermentering av penicillin-dannende sopper i nærvær av de tilsvarende karbonsyrer (såkalte precursorer).

Det samme enzym som er i stand til å spalte penicillin G til 6-aminopenicillansyre og fenyleddiksyre, egner seg også for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Av denne grunn utvelges egnede mikroorganismer på følgende måte: 10 cm<3>av en fosfat-pufferoppløsning med pH 7,0 og inneholdende 10.000 I.E. penicillin G pr. cm<3>tilsettes samme volum av en bakterie-suspensjon i fosfatpufferoppløsning ved pH 7,0 og oppbevares i 4 timer ved 37°C etter tilsetning av 0,2 pst. toluol.

Bakteriesuspensjonen fremstilles på følgen-de måte: 100 cm<3>næringsbuljong podes med en ren-kultur av de bakterier som skal prøves og dyrkes i 18 timer på en rystemaskin ved 28—32°C. Deretter avsentrifugeres bakteriene, de vaskes i 40 cm<3>fosfatpufferoppløsning ved pH 7,0 og igjensuspenderes i 10 cm3 fosfatpufferoppløs-ning ved pH 7,0.

Etter 5 timers innvirkning av bakteriecellene på penicillin G bestemmes det tilbakevæ-rende penicillininnhold mikrobiologisk i den cellefrie sentrifugerte oppløsning.

Ved de forskjellige bakteriestammer finnes derved: 1. Oppløsningen har den fulle begynnelsesaktivi-tet. I dette tilfelle har bakteriecellene ikke ut-viklet noen enzymatisk virkning overfor penicillin G. Bakteriene er således uegnet til fremstilling av penicillinspaltende enzymer. 2. Oppløsningen er inaktiv eller har en sterkt nedsatt aktivitet. I dette tilfelle lar man under isavkjøling og samtidig tilsetning av natrium-bikarbonat 500 mg fenylacetylklorid innvirke på oppløsningen.

Denne prøves deretter på ny.Når det ved denne prøve a. ikke finnes noen økning av aktiviteten overfor den ikke-acylerte oppløsning kan det herav sluttes at penicillinet nedbrytes irreversibelt av penicillinase eller liknende enzymer,

b. finnes en fullstendig reaktivering av peni-. cillinvirkningen på 10.000 I.E. pr. cm3 oppløsning fremgår av forsøket at penicillin G er spaltet således ved enzymvirkning at det er fremkom-met 6-aminopencillansyre og fenyleddiksyre. De ved dette forsøk funne bakterier er meget godt egnet til enzymatisk spaltning av penicillin G til 6-aminopenicillansyre.

c. finnes en kun delvis reaktivering av den opp-rinnelige penicillinaktivitet på 10.000 I.E. pr. cm<3>oppløsning, fremgår av, forsøket at det for-uten det fenyleddiksyreavspaltende enzym var penicillinase tilstede i bakteriene. Slike bakterier er kun egnet til fremstilling av 6-aminopenicillansyre når den foreliggende penicillinase kun inaktiverer en liten del av penicillinet eller når det lykkes å holde penicillinaktiviteten selektivt nede i stor utstrekning.

Den ovenfor omtalte prøve kan også gjen-nomføres modifisert, idet den enzymatiske aktivitet overfor penicillin G undersøkes i cellefrie kulturfiltrater.

Fremstillingen av de enzymatisk aktive taak-teriesuspensjoner resp. bakterieekstrakter og de som utgangsstoffer anvendte fenoksykarbonsy-rederivater er ikke gjenstand for foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1.

160 liter 2 volumprosentig maissvellevann-oppløsning inneholdende 0,2 pst. kaliumfenyl-acetat, innstilles med kalilut på pH 7,0 og oppvarmes i 30 min. ved 120°C. Etter avkjøling kla-res oppløsningen ved sentrifugering og steriliseres i 40 min ved 110°C i gjæringskar. Denne næringsoppløsning podes etter avkjøling med 400 cm<3>av en 18 timers rystekultur av E. coli ATCC 11105. Blandingen luftes deretter med 150 liter luft pr. min. ved 150 omdreininger av røreverket pr. min. og dyrkes i 17 timer ved 31°C uten overtrykk. Under den samlede veksttid inn-føres gjennom en fra gjæringskarets luftledning adskilt ledning 5 liter karbondioksyd pr. min. i kulturen. Bakteriecellene frasentrifugeres kul-turoppløsningen, vaskes i 16 liter 1/15 molar fosfatpufferoppløsning av pH 6,0 og resuspenderes etter fra-sentrifugering til en tett suspensjon i 1/15 molar fosfatpufferoppløsning av pH 6,0.

Til denne suspensjon setter man 0,125 pst. 6-aminopenicillansyre, 0,5 pst. a-fenoksypropionyltioglykolsyre og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter med konsentrert so-daoppløsning til pH 6,5 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder blandingen 884 enheter penicillinaktivitet pr. cm<;1>, målt på en penicillin-G-standard i plateprøve med Bae. subtilis ATCC 6633. Denne penicillinaktivitet bevirkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede 6- (a-f enoksypropionyl) -aminopenicillansyre.

Fremstillingen av a-f enoksypropionyl tioglykolsyre.

I 200 cm<3>4,4 pst.-ig natronlut oppløses 9,2 g tioglykolsyre. Til denne oppløsningen setter man under innføring av nitrogen og god omrø-ring ved 0 til 5°C 18,4 g a-fenoksypropionsyre-klorid i løpet av 30 min. Etter 2 timers etterom-røring ved 20°C surgjøres med saltsyre. Den utskilte olje opptas med eter. Etter tørkning og fordampning av eteren blir det tilbake 22,9 g a-fenoksypropionyltioglykolsyre som viskos olje, som krystalliserer etter lengere henstand.

Sm.p. 52°C

Eksempel 2.

Til en som i eksempel 1 fremstilt bakterié-suspensjon settes 0,025 pst. 6-aminopenicillansyre, 0,5 pst. o-klorfenoksyacetyltioglykolsyre og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter med saltsyre til pH 5,0 og oppbevares i

1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder

blandingen 324 enheter penicillinaktivitet pr. cm<:1>, målt på en penicillin-G-standard i plate-prøve med Bacsubtilis ATCC 6633. Denne penicillinaktivitet bevirkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede 6-(o-klorfenoksyacetyl)-aminopenicillansyre.

Den anvendte o-klorfenoksyacetyltioglykolsyre fremstilles av b-klorfenoksyacetylklorid med tioglykolsyre på samme måte som fenoksypropionyltioglykolsyre (se eksempel 1). Den danner fargeløse krystaller med sm.p. 120°C.

Eksempel 3.

Til en som i eksempel 1 fremstilt bakterie-suspensjon settes 0,125 pst. 6-aminopenicillansyre, 0,5 pst. p-metoksy-fenoksyacetyltioglykol-syre og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter med konsentrert sodaoppløsnirig til pH 6,5 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder blandingen 744 enheter penicillinaktivitet pr. cm<3>, målt på en penicillin-G-standard i plateprøve med Bacsubtilis ATCC 6633. Denne penicillinaktivitet bevirkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede 6-(p-metoksyfenoksyacetyl)-aminopenicillansyre.

Den anvendte p-metoksyfenoksyacetyltio-glykolsyre fremstilles av p-metoksyfenoksyace-tylklorid med tioglykolsyre (se eksempel 1). Far-geløse krystaller. Sm.p. 85°C.

Eksempel 4.

Til en som i eksempel 1 fremstilt bakterie-suspensjon settes 0,125 pst. 6-aminopenicillansyre, 1,0 pst. 2,6-diklorfenoksyacetyltioglykolsyre og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter med saltsyre til pH 5,0 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder blandingen 247 enheter penicillinaktivitet pr. cm<3>, målt på en penicillin-G-standard i plate-prøve med Bacsubtilis ATCC 6633. Denne penicillinaktivitet bevirkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede 6-(2,6-diklorfenoksyace-tyl) -aminopenicillansyre.

Den anvendte 2,6-diklorfenoksyacetyltioglykolsyre fremstilles av 2,6-diklorfenoksyacetylklo-rid med tioglykolsyre (se eksempel 1). Den danner fargeløse krystaller med sm.p. 60°C.

Eksempel 5.

Til en som i eksempel 1 fremstilt bakterie-suspensjon settes 0,125 pst. 6-aminopenicillansyre, 1,0 pst. p-nitrofenoksyacetyltioglykolsyre og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter med saltsyre til pH 5,0 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder blandingen 256 enheter penicillinaktivitet pr. cm<3>, målt på en penicillin-G-standard i plateprøve med Bacsubtilis ATCC 6633. Denne penicillinaktivitet bevirkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede 6-(p-nitrofenoksyacetyl)-aminopenicillansyre. p-nitrofenoksyacetyltioglykol-syren fremstilles av p-nitrofenoksyacetylklorid med tioglykolsyre (se eksempel 1). Den danner et lysebrunt pulver. Sm.p. 101° C.

Eksempel 6.

Til en som i eksempel 1 fremstilt bakterie-suspensjon settes 0,025 pst. 6-aminopenicillansyre, 0,5 pst. o-klorfenoksyeddiksyrefenylester og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter til pH 5,5 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder blandingen 5,9 enheter peinicillinaktivitet pr. cm<3>målt på en penicillin-G-standard i plateprøve med Bacsubtilis ATCC 6633. Denne penicillinaktivitet bevirkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede 6- (o-klorfenoksyacetyl) -aminopenicillansyre.

Den anvendte o-klorfenoksyeddiksyre-fen-ylester fremstilles av o-klorfenoksyeddiksyreklorid og fenolnatrium ved 0 til 5°C i tetrahydrofuran. Etter omkrystallisering fra ligroin viser den et smeltepunkt på 54 til 56°C.

Eksempel 7.

Til en som i eksempel 1 fremstilt bakterie-suspensjon settes 0,025 pst. 6-aminopenicillansyre, 0,5 pst. o-klorfenoksyacetylglykolsyre og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter på pH 6,5 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder blandingen 368 enheter penicillinaktivitet pr. cm<3>, målt på en penicillin-G-standard i plateprøve med Bacsubtilis ATCC 6633. Denne penicillinaktivitet bevirkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede 6- (o-klorfenoksyacetyl) -aminopenicillansyre.

Den anvendte o-klorfenoksyacetylglykolsyre med formel

ble fremstilt idet man blandet en vandig opp-løsning av triethylaminsalt av glykolsyre med overskytende trietylamin og det samme volum tetrahydrofuran og ved 0 til 5°C tildryppet o-klorfenoksyeddiksyreklorid. En annen fremgangsmåte består i omsetningen av glykolsyre-tert.-butylester med o-klorfenoksyacetylklorid i alkalisk medium og etterfølgende termisk spaltning av 2-klorfenoksyacetylglykolsyretert.-bu-tylester i isobutylen og 2-klorfenoksyacetylglykolsyre. Syren smelter etter omkrystallisering fra benzol uskarpt ved 107°C.

Eksempel 8.

Til en som i eksempel 1 fremstilt bakterie-suspensjon settes 0,025 pst. 6-aminopenicillansyre, 0,5 pst. o-klorfenoksyacetyltioglykolsyre-amidog 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter til pH 5,5 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder blandingen 53 enheter penicillinaktivitet pr, cm<3>, målt på

en penicillin-G-standard i plateprøve med Bae. subtilis ATCC 6633. Denne penicillinaktivitet be-

virkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede o-klorfenoksyacetyl-6-aminopenicillansyre.

Den anvendte o-klorfenoksyacetyltioglykol-syreamid fremstilles idet man blander tiogly-kolsyreamid i vandig alkalisk oppløsning ved 0 til 5°C med o-klorfenoksyeddiksyreklorid. Dets smeltepunkt ligger ved 180°C.

Eksempel 9.

Til en som i eksempel 1 fremstilt bakterie-suspensjon settes 0,025 pst. 6-aminopenicillansyre, 0,5 pst. a-fenoksypropionyl-(3-tiopropionsy-re og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter til pH 6,5 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder blandingen 246 enheter penicillinaktivitet pr. cm<3>målt på en penicillin-G-standard i plateprøve med Bae subtilis ATCC 6633. Denne penicillinaktivitet bevirkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede 6- (a-fenoksypropionyl) -aminopenicillansyre.

Den som utgangsmateriale benyttede a-fenoksypropionyl-p-tiopropionsyre med formel

fremstilles av dinatriumsaltet av |3-merkapto-propionsyre i vandig oppløsning med a-fenoksy-propionylklorid ved 0 til 5°C. Etter surgjøring og ekstrahering med eter er den en svakt gulaktig harpiks.

Eksempel 10.

Til en som i eksempel 1 fremstilt bakterie-suspensjon settes 0,025 pst. 6-aminopenicillansyre, 0,5 pst. difenoksyacetyltioglykolsyre og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter til pH 5,0 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder blandingen 122 enheter penicillinaktivitet pr. cm<3>, målt på en penicillin-G-standard i plateprøve med Bacsubtilis ATCC 6633. Denne penicillinaktivitet bevirkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede 6-(difenoksyacetyl)-aminopenicillansyre.

Difenoksyacetyltioglykolsyre med formel (C0<H>5-O)2-CH-CO-S-CH2-COOH

ble fremstilt av difenoksyeddiksyreklorid med en vandig oppløsning av dinatriumsaltet av tioglykolsyre. Den er krystalliserbar av eddikester-pe-troleter og har da et smeltepunkt på 85°C.

Eksempel 11.

160 liter av et 1,0 pst. kaseinhydrolysat, 0,1 pst. dikaliumfosfat, 0,03 pst. magnesiumsulfat og 0,20 pst. kaliumfenylacetatholdig nærings-oppløsning steriliseres i 40 min. ved 110° C i gjæringskar og podes etter avkjøling med 400 cm<3>av en 18 timers rystekultur av Proteus rett-geri ATCC 9918. Blandingen luftes deretter med

150 1 luft pr. min. ved 150 omdreininger av røre-verket pr. min. og dyrkes i 20 timer ved 25°C. Bakteriecellene frasentrifugeres fra kulturopp-løsningen, vaskes i 16 liter 0,9 pst.-ig natrium-

kloridoppløsning og resuspenderes etter fornyet frasentrifugering i 1/15 molar fosfatpufferopp-løsning av pH 6,0.

Til denne suspensjon setter man 0,125 pst. 6-aminopenicillansyre, 0,5 pst. a-fenoksypropionyltioglykolsyre og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter med natriumhy-droksyd til pH 6,5 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Etter denne tid inneholder blandingen 760 enheter penicillinaktivitet pr. cm<3>, målt på en penicillin-G-standard i plateprøve med Bacsubtilis ATCC 6633.

Denne penicillinaktivitet bevirkes av den ved den enzymatiske reaksjon dannede 6-(a-fenoksypropionyl)-aminopenicillansyre.

Eksempel 12.

160 liter 2 volumprosentig maissvellevann-oppløsning får en tilsetning av 0,3 pst. fenyl-acetylglutaminsyre, innstilles med KOH på pH 7,0 og oppvarmes deretter i 30 min. ved 120°C.

Etter avkjøling klargjøres oppløsningen ved sentrifugering og steriliseres i 40 min. ved 110°C i gjæringskar. Denne næringsoppløsning podes etter avkjøling med 400 cm<3>av en 24 timers rystekultur av Arthrobacterstammen NRRL B-2743. Blandingen luftes deretter med 150 liter luft pr. min. ved 150 omdreininger av rørever-ket pr. min og dyrkes i 22 timer ved 25°C.

Bakteriecellene frasentrifugeres fra kultur-oppløsningen, vaskes i 16 liter 0,9 pst.-ig NaCl-oppløsning og resuspenderes etter fornyet fra-sentrifugering i 1/15 molar fosfatpufferoppløs-ning av pH 6,0..

Til denne suspensjon setter man 0,125 pst. 6-aminopenicillansyre, 0,5 pst. a fenoksypropio-nylglykolsyre og 0,1 pst. toluol. Reaksjonsblandingen innstilles deretter med NaOH på pH 6,5 og oppbevares i 1 time ved 37°C. Ved den enzymatiske reaksjon oppstår a-metylfenoksyacetyl-6-aminopenicillansyre i et utbytte på 13.550 enheter penicillinaktivitet pr. cm3.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av 6-acylaminopenicillansyrer ved omsetning av 6-aminopenicillansyre med derivater av fenoksykarbonsyrer i overskudd og ved 10 til 45°C i nærvær av bakterier, resp. herav utvunne ekstrakter eller enzymholdige preparater, som er i stand til å spalte penicillinenes amidbinding i 6-stilling ved pH ;> 6,0, og isolering av de dannede penicilliner, karakterisert ved at omsetningen foregår ved en pH-verdi ikke over 6,5 og at det som derivater av fenoksykarbonsyrer anvendes deres estere av hydroksy- eller merkaptoforbindelser.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som hydroksy- eller merkaptoforbindelser anvender hydroksy- eller merkaptokarbonsyrer eller hydroksy- resp. mer-kaptokarbonsyreestere, -amider eller -salter.