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Verfahren zur Herstellung von in 11-Stellung durch sauerstoffhaltige
Gruppen substituierten 16-Methyl-1,4-pregnadien-17 a-ol-3,20-dion-Verbindungen Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in 11 -Stellung durch eine
sauerstoffhaltige Gruppe substituierten 16-Methyl-1,4-pregnadien-17a-ol-3,20-dion-Verbindungen,
namentlich von in 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierten
16-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion-Verbindungen aus den entsprechenden
4-Pregnen-Verbindungen. Diese neuen Steroide besitzen sehr starke entzündungshemmende
Aktivität und eignen sich vor allem für die Behandlung von Arthritis und ähnlichen
Krankheiten; sie zeigen cortisonähnliche Wirkung und können in äußerst geringer
Dosierung verabfolgt werden, so daß unerwünschte Nebenwirkungen weitestgehend vermindert
werden.
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Die neuen 16-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion-Verbindungen
können durch folgende Strukturformel dargestellt werden:
worin X Wasserstoff oder Fluor, R Wasserstoff oder eine niedere Kohlenwasserstoffcarbonylgruppe
und Z eine Ketogruppe oder die Gruppe H, O H bedeutet.
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Diese 16-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion-Verbindungen,
die in 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituiert sind, werden
dadurch hergestellt, daß die entsprechenden 4-Pregnen-Verbindungen der dehydrierenden
Aktivität von Mikroorganismen der Klasse Schizomycetes ausgesetzt werden, zu welcher
Mikroorganismen der Reihen Actinomycetales und Eubacteriales gehören. Die bevorzugten
Eubacteriales sind Mikroorganismen des Genus Acetobacter, Aerobacter und des Genus
Bacillus; die bevorzugten Actinomycetales umfassen Mikroorganismen des Genus Nocardia
und des Genus Mycobacterium. Vornehmlich werden Mikro-` organismen der Klasse Schizomycetes
verwendet, die den folgenden Spezies angehören: Acetobacter xylinum, Aerobacter
aerogenes, Bacillus sphaericus, Nocardia erythropolis, Nocardia - blackwellii, Nocardia
asteroides, Nocardia minima, Nocardia globeruala, Nocardia leishmanii, Nocardia
formica, Nocardia convoluta, Nocardia corallina und Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium
phlei, Mycobacterium lacticola und Mycobacterium tuberculosis. Die Spezies Bacillus
sphaericus umfaßt nach der Definition in »Bergey's Manual for Determinative Bacteriology«,
6. Auflage, mehrere Abarten, wie die Abart Rotans, die Abart Fusiformis usw., welche
in manchen Sammlungen mit den Speziesnamen Bacillus rotans und Bacillus fusiformis
bezeichnet werden. Diese Mikroorganismen der Klasse Schizomycetes erhält man aus
bekannten Quellen, z. B. aus der American Type Culture Collection, Washington, D.
C., V. St. A., oder sie lassen sich aus natürlichen Quellen, z. B. aus dem Boden,
isolieren.
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An Stelle der mikrobiologischen Dehydrierung wird die 16-Methyl-4-pregnen-17a-ol-3,20-dion-Verbindung
oder vorzugsweise die entsprechende gesättigte 16-Methyl-pregnan-17x-ol-3,20-dion-Verbindung
in bekannter Weise der Dehydrierung mit Selendioxyd unterworfen. Die Dehydrierung
mit Selendioxyd wird
zweckmäßig in der Weise durchgeführt, daß man
die 16-Methyl-4-pregnen-17a-ol-3,20-dion-Verbindung oder 16-Methyl-pregnan-17a-ol-3,20-dion-Verbindung
mit Selendioxyd in einem organischen Lösungsmittel, z. B. Dioxan, einem alkoholischen
Lösungsmittel, wie tert.-Butanol, auf höhere Temperatur erhitzt. Wenn tert.-Butanol
als Lösungsmittel dient, wird die Reaktion am besten bei dem Siedepunkt des Lösungsmittels
durchgeführt; die Reaktion ist dann gewöhnlich in etwa 15 Stunden beendet. Das Reaktionsgemisch
wird zur Entfernung von metallischem Selen im allgemeinen filtriert; das Filtrat
wird im Vakuum zur Trockne eingedampft; man erhält so die gewünschte 16-Methyl-1,4-pregnadien-17a-ol-3,20-dion-Verbindung.
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Es ist zwar bereits bekannt, 1-Dehydrosteroide aus den entsprechenden
44-3-Ketonen durch mikrobiologische Dehydrierung oder aber auf chemischem Wege durch
Dehydrierung der entsprechenden Ausgangsverbindung mit Selendioxyd herzustellen;
16-Methylpregnene lassen aber bei diesen Reaktionen nicht die gleiche Wirkung erwarten,
welche für die Dehydrierung anderer Verbindungen beschrieben ist. Es bestanden keine
Erfahrungen, welche zu der Voraussage berechtigten, daß Steroide mit einer 16-Methylgruppe
überhaupt den hier vorliegenden Reaktionen zugänglich sind bzw. sich hierbei wie
Steroide verhalten, die keine 16-Methylgruppe aufweisen.
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Die neuen Steroide besitzen eine ungewöhnlich hohe entzündungshemmende
Aktivität und haben nicht die unerwünschten Nebenwirkungen der bisher zur Verfügung
stehenden, entzündungshemmenden Steroide.
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Es ist besonders zu betonen, daß für jede gegebene Spezies von Schizomycetes
die zu bevorzugenden dehydrierenden Stämme nach der folgenden Prüfrnethode ausgewählt
werden können: Ein Nährmedium, welches 1 g technische Dextrose, bekannt unter dem
Handelsnamen Cerelose, 1 g technisches digeriertes Lactalbumin, bekannt unter dem
Handelsnamen Edamin, 0,25 ccm Maismaischflüssigkeit und 0,05 g Hefeextrakt enthält
und mit destilliertem Wasser auf 50 ccm aufgefüllt ist, wird auf ein p$ von 6,5
eingestellt, sterilisiert und mit einer Kultur des auf seine 41-dehydrierende Aktivität
zu prüfenden Mikroorganismenstammes beimpft. Die so erhaltene Kultur wird 24 Stunden
bei 28' C bebrütet, worauf man eine Probe der Kultur zu einer zweiten 50-ccm-Probe
des obenerwähnten Nährmediums zusetzt, die ebenfalls auf ein pa von 6,5 eingestellt
und sterilisiert ist. Die so beimpfte Kultur wird dann 24 Stunden unter Bewegung
bei 28° C bebrütet und darauf mit einer Lösung von 10 mg Hydrocortison in 0,1 ccm
Dimethylformamid versetzt. Die die Sterinverbindung enthaltende Kultur wird weitere
10 Stunden bei 28° C unter Bewegung bebrütet. Die Gärbrühe wird mehrmals mit Äthylacetat
extrahiert; die Äthylacetat extrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne
eingedampft. Ein Teil des Rückstandes wird in Aceton gelöst und zur Herstellung
eines Papierchromatogramms verwendet, welches mit Formamid als stationärer Phase
und Chloroform als beweglicher Phase entwickelt wird. Hierbei erhält man gewöhnlich
zwei getrennte Bänder, von denen das untere dem unveränderten Hydrocortison und
das obere dem 41-Dehydroderivat entspricht. Beide Bänder werden ausgeschnitten,
einzeln mit Methanol eluiert und beide Methanoleluate der ultravioletten Absorptionsanalyse
unterworfen. Die Wirksamkeit des untersuchten Mikroorganismenstammes zur 41-Dehydrierung
ergibt sich aus den bei der ultravioletten Absorptionsanalyse gemessenen relativen
Mengen an d i-Dehydroderivat und unverändertem Hydrocortison.
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Die als Ausgangsstoffe des erfindungsgemäßen Verfahrens dienenden,
in 11-Stellung durch sauerstoffhaltige Gruppen substituierten 16-Methyl-4-pregnen-17x,21-diol-3,20-dione
werden im allgemeinen in der Weise gewonnen, daß man von dem bekannten 16-Pregnen-3a-ol-11,20-dion-3-acetat
mit folgender Umsetzungsreihe ausgeht: 16-Pregnen-3x-ol-11,20-dion-3-acetat wird
mit Methylmagnesiumjodid in Gegenwart von Kupfer(1)-chlorid unter Bildung von 16x-Methylpregnan-3a-ol-11,20-dion-3-acetat
umgesetzt, welches mit wäßriger methanolischer Salzsäure in 16x-Methyl-pregnan-3a-ol-11,20-dion
übergeführt wird. Letztere Verbindung wird mit Essigsäureanhydrid in Gegenwart von
p-Toluolsulfonsäure als Katalysator umgesetzt, wobei ein Gemisch von Enolacetaten
anfällt, welches 16a-Methyl-17(20)-pregnen-3x,20-diol-11-on-3,20-diacetat enthält.
Dieses Gemisch wird nach chromatographischer Reinigung zur Entfernung von unverändertem
Ausgangsstoff mit Perbenzoesäure umgesetzt; das erhaltene 16x-Methyl-17x,20-epoxy-pregnan-3a,20-diol-11-on-3,20-diacetat
wird mit methanolischem Kaliumbicarbonat zu 16x-Methylpregnan-3a,17oc-diol-11,20-dion
hydrolysiert. Letztere Verbindung wird mit Brom in Chloroform in 21-Brom-16x-methyl-pregnan-3x,l7x-diol-11,20-dion
übergeführt, welches mit Natriumjodid in Aceton 21-Jod-16x-methyl-pregnan-3x,l7oc-diol-11,20-dion
liefert.
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Letztere Verbindung wird ohne Isolierung mittels wasserfreien Kaliumacetats
in 16x-Methyl-pregnan-3a,l7oc,21-triol-11,20-dion-21-acetat übergeführt, welches
durch Umsetzung mit Chromtrioxyd in Pyridin 16a-Methyl-pregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat
liefert. Aus dieser Verbindung erhält man mit Brom in Eisessig - Chloroform 4-Brom-
16x-methylpregnan-17oc,21-diol-3,11,20-trion, welches mit Semicarbazid 16x-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-3,20-bis-semicarbazon-21-acetat
ergibt. Letztere Verbindung läßt sich mit Natriumborhydrid in 16x-Methyl-4-pregnen-1
lß,17a,21-triol-3,20-dion-3,20-bissemicarbazon umwandeln, welches unter sauren Bedingungen
zum 16x-Methyl-4-pregnen-11ß,17x-21-triol-3,20-dion hydrolysiert wird; diese Verbindung
wird mit Veresterungsmitteln, z. B. Benzoesäureanhydrid oder niederen Alkananhydriden,
in die entsprechenden 21-Ester übergeführt.
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16x-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-3,20-bis-semicarbazon-21-acetat
ergibt mit Kaliumbicarbonat oder Kaliumhydroxyd in wäßrigem Methanol 16x-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-3,20-bis-semicarbazon,
welches unter sauren Bedingungen in das 16x-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11, 20-trion
umgewandelt wird. Diese Verbindung mit einer freien 21-OH-Gruppe wird mit den obenerwähnten
Veresterungsmitteln in die entsprechenden 21-Ester übergeführt.
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16x-Methyl-4-pregnen- l lß,17x,21- triol-3,20-dion gibt bei der Umsetzung
mit Essigsäureanhydrid in Pyridin das entsprechende 21-Acetat, welches mit Methansulfonylchlorid
und anschließend Kaliumaceta.t oder Phosphoroxychlorid 16a-Methyl-4,9(11)-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat
liefert; letztere Verbindung läßt sich mit unterbromiger Säure
in
9a-Brom-16a-methyl-4-pregnen-llß,17a,21-triol-3;20-dion-21-acetat überführen, welches
mit wasserfreiem Kaliumacetat in Äthanol 16a-Methyl-9,11-epoxy-4-pregnen-17x,21-diol-3,20-dion-21-acetat
ergibt. Dieses 9,11-Epoxyd wird durch Umsetzung mit Fluorwasserstoff in Tetrahydrofuran
in 16a-Methyl-9x-fluor-4-pregnen-l1ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat umgewandelt,
welches zu 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnenllß,17a,21-triol-3,20-dion hydrolysiert
wird.
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Die freie 21-OH-Gruppe wird mit Veresterungsmitteln wie Benzoesäureanhydrid,
niederen Alkananhydriden usw. in die entsprechenden 21-Ester übergeführt.
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16x- Methyl - 9a -fluor- 4-pregnen - l lß,17x,21 triol-3,20-dion-21-acetat
ergibt mit Chromtrioxyd in Pyridin 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,
20-trion-21-acetat, welches zu 16x-Methyl-9x-fluor-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion
hydrolysiert wird. Die freie 21-OH-Gruppe wird mit Benzoesäureanhydrid, niederen
Alkananhydriden und anderen Veresterungsmitteln zu den 21-Estern verestert. Für
die Herstellung der Ausgangsstoffe wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Schutz
nicht begehrt.
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Als in 11-Stellung durch sauerstoffhaltige Gruppen substituierte 16-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-Verbindungen,
welche als Ausgangsstoffe dienen, kommen unter anderem folgende in Betracht: 16x-Methyl-4-pregnen-17ca,21-diol-3,11,20-trion
und dessen 21-Ester, namentlich die niederen 21-Kohlenwasserstoffcarbonsäureester,
z. B. 16a-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-benzoat; die niederen 21-Alkanoate
von 16a-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion, wie 16a-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat;
16a-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11-20-trion-21-propionat; 16ca-Methyl-4-pregnenl
lß,17a,21-triol-3,20-dion und dessen 21-Ester, namentlich die niederen 21-Kohlenwasserstoffcarbonsäureester,
z. B. 16x-Methyl-4-pregnen-1 lß,17a,21-triol-3,20-dion-21-benzoat; die niederen
21-Alkanoate von 16a-Methyl-4-pregnen-1 lß,17a,21-triol-3,20-dion, wie 16a-Methyl-4-pregnen-llß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat;16a-Methyl-4-pregnen-l
1ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-propionat; 16x-Methyl-9x-fluor-4-pregnen@ 17a,21-diol-3,11,20-trion
und dessen 21-Ester, namentlich die niederen 21-Kohlenwasserstoffcarbonylester,
z. B. 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-17a,21-diol-3,11, 20-trion-21-benzoat; die niederen
21-Alkanoate des 16x-Methyl-9x-fluor-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trions, wie 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat;
16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-propionat; 16x-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-llß,17a,21-triol-3,20-dionund
dessen 21-Ester, namentlich dessen niedere 21-Kohlenwasserstoffcarbonsäureester,
z. B. 16oc-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-llß,17a,21-triol-3,20-dion-21-benzoat; die
niederen 21-Alkanoate von 16oc-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-1 lß,17a,21-triol-3,20-dion,
wie 16ca-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-1 lß,17oc,21-triol-3,20-dion-21-acetat; 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-llß,17a,21-triol-3,20-dion-21-propionat
usw.
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Erfindungsgemäß wird die Dehydrierung von in 11-Stellung durch sauerstoffhaltige
Gruppen substituierten 16-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-Verbindungen in
der Weise bewirkt, daß das Steroid mit den Schizomyceten selbst oder vorzugsweise
mit deren Enzymsystemen in bekannter Weise in Berührung gebracht wird, wodurch der
Wasserstoff, welcher an das 1- und 2-ständige Kohlenstoffatom gebunden ist, unter
Bildung der von unerwünschten Nebenprodukten im freien, in 1-Stellung ungesättigten
SteroiJe selektiv entfernt wird. Wenn die in 11-Steilung durch sauerstoffhaltige
Gruppen substituierte 16-Methyl-4-pregnen-17x,21-diol-3,20-dion-Verbindung der dehydrierenden
Aktivität der bevorzugten dehydrierend wirkenden Stämme von Schizomyceten unterworfen
wird, erhält man die entsprechende 1,4-Pregnadien-Verbindung unmittelbar und in
hoher Ausbeute.
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Diese 21-Alkohole können in die entsprechenden 21-Ester durch Umsetzung
mit einem Acylierungsmittel, z. B. einem Phosphorylierungsmittel, einem Acylierungsmittel
einer Carbonsäure eines niederen Kohlenwasserstoffs, wie Benzoesäureanhydrid, tert.-Butylacetylchlorid,
einem niederen Alkananhydrid oder einem niederen Alkanoylhalogenid, wie Essigsäureanhydrid,
Propionsäureanhydrid, einem Anhydrid einer mehrbasischen Säure, wie ß,ß-Dimethylglutarsäureanhydrid,
Bernsteinsäureanhydrid u. dgl., übergeführt werden.
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Zur Durchführung der erfindungsgemäßen mikrobiologischen Dehydrierung
kann man das Steroid als Feststoff oder Lösung z. B. in einem Dialkylketon, wie
Aceton, oder einem Dialkylformarnid, wie Dimethylformamid, unter sterilen Bedingungen
in eine nährmediumhaltige Mikroorganismenkultur einbringen und das Gemisch rühren;
das Wachstum des Mikroorganismus und die Dehydrierung des Steroids gehen dann vor
sich. Das Steroid kann gleichzeitig mit der Beimpfung des Nährmediums mit der Schizomycetenkultur
oder auch zu einer bereits bestehenden Kultur zugesetzt werden. Auch kann man zwecks
leichterer Gewinnung der dehydrierten Verbindung die Zellen einer solchen Kultur
von der Brühe abfiltrieren, mit destilliertem Wasser waschen, dann in einer gepufferten
wäßrigen Lösung suspendieren, welche die in 11-Stellung durch- eine sauerstoffhaltige
Gruppe substituierte 16-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-Verbindung enthält,
und das Gemisch in Bewegung halten, bis die Dehydrierung des Steroids zu der entsprechenden
in 11-Stellung sauerstoffsubstituierten Pregnadienverbindung erfolgt ist. Andererseits
kann die in 11-Stellung sauerstoffhaltige 16-Methyl-4-pregnen-17x,21-diol-3,20-dion-Verbindung
mit dehydrierend wirkenden Enzympräparaten des Wachstums von Schizomycetenmikroorganismen
in Berührung gebracht werden.
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Die üblichen Nährmedien zur Zucht von Schizomyceten enthalten eine
Quelle für Stickstoff und eine Quelle für Kohlenstoff, anorganische Salze und gegebenenfalls
Wachstumfaktoren. Der Kohlenstoff kann in Form von Acetaten, Lactaten u. dgl. geliefert
werden. Der Stickstoff kann in Form von Ammoniumsalzen, Aminosäuren oder Proteinen,
wie Sojabohnen, Hafer, Hefe, Hefeextrakten, angedautem Kasein, Fleischextrakt, Blutmehl,
Protein-Fleisch- und Knochenabfall, Lachsmehl, Fischmehl, löslichen Fischbestandteilen,
löslichen Schlempebestandteilen u. dgl., vorliegen. Gegebenenfalls kann man die
Schizomycetenmikroorganismen unter Verwendung von Proteinen (oder Aminosäuren) in
Abwesenheit von Kohlehydraten züchten, in welchem Falle die Proteine oder Aminosäuren
gleichzeitig als Quelle für Kohlenstoff und für Stickstoff dienen. Vorzugsweise
arbeitet man so, daß man die in 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe
substituierte 16-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-Verbindung zu einem Nährmedium
zusetzt, welches ein 24 Stunden altes Wachstum von
Schizomycetenmikroorganismen
enthält. Die Menge der dem Medium zuzusetzenden Steroidverbindung richtet sich nach
dem jeweils zu dehydrierenden Substrat; vorzugsweise arbeitet man jedoch mit einer
Konzentration von etwa 0,005 bis 0,2 % der in 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige
Gruppe substituierten 16-Methyl-4-pregnen-17cc,21-diol-3,20-dion-Verbindung. Die
die Steroidverbindung enthaltende Kultur wird dann, vorzugsweise unter Bewegung
und Belüftung, eine weitere Zeit lang bebrütet, die gewöhnlich 10 bis 50 und vorzugsweise
10 bis 24 Stunden beträgt, je nach dem angewandten Steroidsubstrat. Bei Einhaltung
derartiger Gärzeiten gewinnt man das in 1-Stellung dehydrierte Steroid in Höchstausbeute.
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Nach Beendigung der Dehydrierung wird das Endprodukt vorteilhaft aus
der Gärbrühe durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel,
z. B. einem chlorierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, einem Keton, wie Methylisobutylketon,
einem Alkylalkanoat, wie Äthylacetat u. dgl., gewonnen. Dieser Extrakt wird chromatographisch
an Kieselsäuregel, aktiviertem Aluminiumoxyd u. dgl. oder gegebenenfalls mittels
eines Papierehromatogramms gereinigt. Nach Trennung des dehydrierten Produktes von
dem nicht umgesetzten Ausgangsstoff kann das Produkt weitergereinigt werden, gewünschtenfalls
durch Umkristallisieren aus einem Lösungsmittel wie Äthylacetat, Äthylacetat Petroläther
u. dgl.
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Geht man von den obenerwähnten 16-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-Verbindungen,
die in 11-Stellung durch sauerstoffhaltige Gruppen substituiert sind, aus, so erhält
man 16-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion-Verbindungen, die in 11-Stellung
durch sauerstoffhaltige Gruppen substituiert sind, wie 16a-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion;
16a-Methyl-1,4-pregnadien-1lß,17oc,21-triol-3,20-dion; 16a-Methyl-9x-fluor-17oc,21-diol-3,11,20-trion
und 16a-Methyl-9a-fluor-1 Iß,17a,21-triol-3,20-dion.
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Wenn das Ausgangsmaterial in Form eines 21-Esters vorliegt, wird doch
nach der mikrobiologischen Dehydrierung der entsprechende 21-Alkohol erhalten; denn
jede 21-Estergruppe wird während der mikrobiologischen Dehydrierung hydrolysiert.
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Das Rohprodukt wird zweckmäßig durch Papierstreifenchromatographie
gemäß der Arbeitsweise gereinigt, die oben für die Reinigung der durch mikrobiologische
Dehydrierung hergestellten 16-Methyl-1,4-pregnadien-17oc-ol-3,20-dion-Verbindungen
beschrieben ist.
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Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel 1 50 ccm eines Nährmediums folgender Zusammensetzung: Technische Dextrose
(bekannt unter der Handelsbezeichnung Cerelose) ..... 1 g Technisches digeriertes
Lactalbumin (bekannt unter der Handelsbezeichnung Edamin) . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 1 g Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . 0,25 ccm Mit
destilliertem Wasser aufgefüllt auf 50 ccm werden mit K O H auf ein p$ von 6,5 eingestellt,
sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ccm einer Kultur von Bacillus sphaericus (ATCC-245)
beimpft; die beimpfte Kultur wird dann bei 28'C unter Rühren 24 Stunden bebrütet.
Dann setzt man der Kultur eine Lösung von 16oc-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion
in 0,2 ccm Dimethylformamid zu. Die das Steroid enthaltende Kultur wird dann weiter
24 Stunden unter Bewegung bei 28'C bebrütet.
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Man extrahiert die Gärbrühe mit vier Anteilen von je 50 ccm Äthylacetat,
vereinigt die Äthylacetatextrakte und dampft sie im Vakuum auf etwa 5 ccm ein.
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Die konzentrierte Lösung wird dann für Streifenpapierchromatogramme
verwendet, welche mit Dimethylformamid als der stationären Phase und 50°/0 Benzol-50
°/o Chloroform als beweglicher Phase entwickelt werden. Nach 8stündiger Entwicklung
in absteigendem System werden die oberen Bänder der Chromatogramme, welche dem dI-Dehydroderivat
entsprechen, ausgeschnitten und mit Methanol extrahiert; der Methanolextrakt wird
dann der Streifenpapierchromatographie unterworfen. Das obere Band wird wieder ausgeschnitten,
gründlich getrocknet und mit Methanol extrahiert; der Methanolextrakt wird im Vakuum
zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat Petroläther umkristallisiert
und ist 16a-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion; F. 210 bis 212°C.
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Diese Verbindung liefert mit Essigsäureanhydrid und Pyridin das 21-Acetylderivat,
welches durch Umkristallisieren aus Benzol-Petroläther gereinigt wird. Man erhält
praktisch reines 16ec-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat.
F. 208 bis 212° C. Beispiel 2 50 ccm eines Nährmediums folgender Zusammensetzung:
Technische Dextrose (»Cerelose«) ..... 1 g Technisches digeriertes Lactalbumin
(»Edamin«) . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g Maismaischflüssigkeit
. . . . . . . . . . . . . . 0,25 ccm Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 50
ccm werden mit K O H auf ein pg von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5
bis 5 ccm einer Kultur von Nocardia asteroides (ATCC-9970) beimpft; die beimpfte
Kultur wird dann bei 28'C unter Bewegung 24 Stunden bebrütet. Dann setzt man der
Kultur 10 mg 16a-Methyl-4-pregnen-llß,17oc,21-triol-3,20-dion in 0,2 ccm Dimethylformamid
zu. Die das Steroid enthaltende Kultur wird dann weitere 24 Stunden unter Bewegung
bei 28'C bebrütet. Man extrahiert die Gärbrühe mit vier Anteilen von je 50 ccm Äthylacetat,
vereinigt die Äthylacetatextrakte und dampft sie im Vakuum auf etwa 5 ccm ein. Die
konzentrierte Lösung wird dann auf Papierchromatogramme ausgestrichen, welche mit
Dimethylformamid als stationärer Phase und 5001, Benzol-50 °/o Chloroform
als beweglicher Phase entwickelt werden. Die oberen Bänder der Chromatogramme, welche
der d i-Dehydroverbindung entsprechen, werden ausgeschnitten, mit Methanol extrahiert;
der Methanolextrakt wird wiederum der Streifenpapierchromatographie unterworfen.
Das obere Band wird wiederum ausgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol
extrahiert; der Methanolextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand
wird aus Äthylacetat Petroläther zu 16a-Methyl-
1,4-pregnadien-llß,l7oc,21-triol-3,20-dion
umkristallisiert; F. 199 bis 203°C.
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Diese Verbindung liefert bei der Behandlung mit Essigsäureanhydrid
und Pyridin das acetylierte Derivat, welches aus Benzol-Petroleum umkristallisiert
wird. Man erhält praktisch reines 16a-Methyl-1,4-pregnadien-l1ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat;
F. 145 bis 149' C.
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Beispiel 3 50 ccm eines Nährmediums folgender Zusammensetzung: Technische
Dextrose (»Cerelose«) ..... 1 g Technisches digeriertes Lactalbumin (»Edamin«)
. . . . .. . . ... . .. . . . . . . . . 1 g Maismaischflüssigkeit . . . . . . .
. . . . . . . 0,25 ccm Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 50 ccm werden mit
K O H auf ein pu von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ccm einer
Kultur von Mycobacterium smegmatis (NRRL B-1667) beimpft; die beimpfte Kultur wird
dann bei 28'C unter Bewegung 24 Stunden lang bebrütet. Dann setzt man der Kultur
eine Lösung von 10 mg 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnenl1ß,17a,21-triol-3,20-dion in
0,2 ccm Dimethylformamid zu. Die das Steroid enthaltende Kultur wird dann weitere
24 Stunden unter Bewegung bei 28'C bebrütet.
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Man extrahiert die Gärbrühe mit vier Anteilen von je 50 ccm Äthylacetat,
vereinigt die Äthylacetatextrakte und dampft sie im Vakuum auf etwa 5 ccm ein. Die
konzentrierte Lösung wird dann für Streifenpapierchromatogramme verwendet, welche
mit Dimethylf ormamid als der stationären flüssigen Phase und 50 °/o Benzol-5001,
Chloroform als beweglicher flüssiger Phase entwickelt werden. Das eine von zwei
Bändern, welches der beweglicheren Komponente entspricht, zeigt das charakteristische
Ultraviolettadsorptionsmaximum der als Ausgangsmaterial benutzten 16oc-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-llß,17a,21-triol-3,20-dion-Verbindung;
das andere Band (die weniger bewegliche Komponente) zeigt ein Ultraviolettadsorptionsmaximum
bei etwa 245 my. Das Papierchromatogramm wird getrocknet; das Band, welches der
245-mM-Adsorption entspricht, wird ausgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Der
Methanolextrakt wird wiederum der Streifenpapierchromatographie unterworfen; hierfür
verwendet man Papier, welches 48 Stunden unter Verwendung des oben benutzten Chloroformformamidsystems
mit Methanol extrahiert war. Das erhaltene Chromatogramm zeigt nur noch die Andeutung
eines dem Ausgangsmaterial entsprechenden Bandes und das Hauptband mit einem Ultraviolettadsorptionsmaximum
von 245 mß. Das Papierchromatogramm wird gründlich getrocknet; das Band, welches
dem 245-m,A-Adsorptionsmaximum entspricht, wird ausgeschnitten und mit Methanol
extrahiert. Der Methanolextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft; es verbleibt
16a-Methyle9x-fluor-1,4-pregnadien-1 lß,17a,21-triol-3,20-dion; F. 268 bis
271' C.
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Diese Verbindung wird mit überschüssigem Essigsäureanhydrid in Pyridin
umgesetzt und ergibt das 21-Acetylderivat, welches aus Benzol-Petroläther zu praktisch
reinem 16a-Methyl-9a-fluor-1,4-pregnadienllß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat umkristallisiert
wird; F. 238 bis 240° C.
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Beispiel 4 Die Gärprozesse der Beispiele 1, 2 und 3 werden wiederholt;
jedoch werden, an Stelle der dort benutzten Mikroorganismen und des in 11-Stellung
durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierten 16x-Methyl-4-pregnen-17oc,21-diol-3,20-dions
als Ausgangsstoff, die Mikroorganismenstämme und Steroide als Ausgangsverbindungen
benutzt, welche in der folgenden Tabelle aufgeführt sind. Die erhaltenen Gärbrühen
werden nach Maßgabe der in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Isolierungsverfahren
behandelt und liefern für die besonderen Mikroorganismenstämme und Steroidsubstrate
das jeweilige, in 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierte
16a-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,20-diongemäß folgender Tabelle.
| Ver- Bacillus In 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe |
| bindung Substrat Spaericus substituiertes 16-Methyl-1,4-pregnadien- |
| Nr. Mikroorganismen 17o;,21-diol-3,20-dion |
| 1 16a-Methyl-4-pregnen-17x,21-diol- ATCC-7054 16x-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol- |
| 3,11,20-trion 3,11,20-trion |
| 2 16a-Methyl-4-pregnen-1 Iß,17a,21-triol- ATCC-245 16x-Methyl-1,4-pregnadien-llß,l7a,21-tri- |
| 3,20-dion ol-3,20-dion |
| 3 16a-Methyl-4-pregnen-1 Iß,17a-21-triol- ATCC-4525 16x-Methyl-1,4-pregnadien-11ß,17a,21-tri- |
| 3,20-dion-21-acetat ol-3,20-dion |
| 4 16a-Methyl-4-pregnen-17x,21-diol- ATCC-7055 16a-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol- |
| 3,11,20-trion 3,11,20-trion |
| 5 16a-Methyl-9ca-fluor-4-pregnen-17a,21-di- ATCC-7055 16a-Methyl-9a-fluor-1,4-pregnadien- |
| ol-3,11,20-trion-21-acetat 17x,21-diol-3,11,20-trion |
| 6 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen- ATCC-245 16rx-Methyl-9a-fluor-1,4-pregnadien- |
| l l ß,17a,21-triol-3,20-dion l lß,17a,21-triol-3,20-dion |
| 7 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen- ATCC-7063 16a-Methyl-9@x-fluor-1,4-pregnadien- |
| I lß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat 1 lß,17a,21-triol-3,20-dion |
| Ver- Nocardia In 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe |
| bindung Substrat Mikroorganismen substituiertes 16-Methyl-1,4-pregnadien- |
| Nr. 17x,21-diol-3,20-dion |
| 8 16x-Methyl-4-pregnen-llß,17x,21-triol- N. blackwellii 16x-Methyl-1,4-pregnadien-llß,17x,21-tri- |
| 3,20-dion ATCC-6846 ol-3,20-dion |
| 9 16x-Methyl-4-pregnen-17x,21-diol- N. globerula 16x-Methyl-1,4-pregnadien-17x,21-diol- |
| 3,11,20-dion ATCC-9356 3,11,20-trion |
| 10 16x-Methyl-9x-fluor-4-pregnen-17x,21-di- N.leishmanii 16x-Methyl-9x-fluor-1,4-pregnadien- |
| ol-3,11,20-trion 17x,21-diol-3,11,20-trion |
| 11 16x-Methyi-9x-fluor-4-pregnen- N. formica 16x-Methyl-9x-fluor-1,4-pregnadien- |
| l lß,17x,21-triol 3,20-dion NRRL-2470 l lß,17cc,21-triol-3,20-dion |
| 12 16x-Methyl-4-pregnen-1 1ß,17x,21-triol- M. phlei 16x-Methyl-1,4-pregnadien-llß,17x,21-tri- |
| 3,20-dion - - ATCC-12,298 ol-3,20-dion |
| 13 16x-Methyl-4-pregnen-17x,21-diol- M.lacticola 16x-Methyl-1,4-pregnadien-17x,21-diol- |
| 3,11,20-trion ATCC-12,297 3,11,20-trion |
| 14 16x-Methyl-9x-fluor-4-pregnen-17x,21-di- M. tuberculosis
16x-Methyl-9x-fluor-1,4-pregnadien- |
| ol-3,11,20-trion ATCC-12,296 17x,21-diol-3,11,20-trion |
Beispiel 5 In eine Lösung von 110 mg 16x-Methyl-4-pregnen-17x,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat
in 6 ccm tert.-Butanol, 0,01 ccm Eisessig und 0,03 ccm Essigsäureanhydrid werden
70 mg selenige Säure (HZSe03) eingetragen. Das Gemisch wird über Nacht auf Siedetemperatur
erwärmt, mit weiteren 50 mg seleniger Säure versetzt und weitere 24 Stunden erwärmt.
Die Lösung wird von dem metallischen Selen abgegossen und zu einem Öl eingedampft,
welches in Äthylacetat gelöst wird. Die Äthylacetatlösung wird mit wäBrigem Natriumbicarboa
nat und dann mit Wasser bis zur Erreichung des Neutralisationspunktes gewaschen
und getrocknet. Das Lösungsmittel wird aus der getrockneten Lösung zu einem Produkt
öliger Konsistenz eingedampft, welches in Benzol gelöst und aus diesem Lösungsmittel
an säuregewaschenem Aluminiumoxyd adsorbiert. Das Adsorbat wird mit Äther-Petroläther
und sodann mit Gemischen aus Äther und Chloroform mit zunehmendem Chloroformgehalt
eluiert. Die Äther-Chloroformeluate (4: 6) werden vereinigt, zur Trockne eingedampft;
der Rückstand ergibt nach dem Umkristallisieren aus Äthylacetat-Äther 16x-Methyl-1,4-pregnadien-17x,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat;
F. 208 bis 212' C. Beispiel 6 In eine Lösung von 10 mg 16x-Methyl-4-pregnenllß,17x,21-triol-3,20-dion-21-acetat
in 6 ccm tert.-Butanol,
0,01 ccm Eisessig und 0,03 ccm Essigsäureanhydrid
werden 70 mg selenige Säure eingetragen. Das Gemisch wird über Nacht auf Siedetemperatur
erwärmt, mit weiteren 50 mg seleniger Säure versetzt und weitere 24 Stunden erwärmt.
Die von dem metallischen Selen abgegossene Lösung wird zu einem Öl eingedampft,
welches in Äthylacetat gelöst wird. Diese Lösung wird mit wäBrigem Natriumbicarbonat
und dann mit Wasser neutral gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wird aus
der getrockneten Lösung verdampft; das verbleibende Öl wird in Benzol gelöst und
aus diesem Lösungsmittel an säuregewaschenem Aluminiumoxyd adsorbiert. Das Adsorbat
wird mit Äther-Petroläther und darauf mit Gemischen aus Äther und Chloroform mit
zunehmendem Chloroformgehalt eluiert. Die Äther-Chloroformeluate (4:6) werden vereinigt
und zur Trockne eingedampft; der Rückstand ergibt nach dem Umkristallisieren aus
Äthylacetat-Äther 16x-Methyl-1,4-pregnadien-llß, 17x,21-triol-3,20-dion-21-acetat;
F. 145 bis 149°C. Beispiel 7 Das Beispiel 6 für die Dehydrierung mit seleniger Säure
wird wiederholt, jedoch mit der Abweichung, daB 9x-Fluor-16x-methyl-4-pregnen-17x,21-diol-3,11,
20-trion-21-acetat als Ausgangsstoff an Stelle von 16ä-Methyl-4-pregnen- l lß,17x,21-triol-3,20-dion-21-acetat
im Beispiel 6 benutzt wird. Es fällt 9x-Fluor-16x-methyl-1,4-pregnadien-17x,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat
an; F. 208 bis 210° C. Beispiel 8 Das Beispiel 6 für die Dehydrierung mit seleniger
Säure wird wiederholt, jedoch 9x-Fluor-16x-methyl-4-pregnen-11ß,17x,20-triol-3,20-dion-21-acetatals
Ausgangsstoff benutzt. Man erhält 9x-Fluor-16x-methyl 1,4-pregnadien-l lß,17x,21-triol-3,20-dion-21-acetat;
F. 238 bis 240' C. Beispiel 9 In eine Lösung aus 110 mg 16x-Methyl-pregnan-17x,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat
in 6 ccm tert.-Butanol,
0,01 ccm Eisessig und 0,03 ccm Essigsäureanhydrid
werden 70 mg selenige Säure eingetragen. Das Gemisch wird über Nacht auf Siedetemperatur
erwärmt, mit weiteren 50 mg seleniger Säure versetzt und weitere 24 Stunden erwärmt.
Die von dem metallischen Selen abgegebene Lösung wird zu einem Öl eingedampft, welches
in Äthylacetat gelöst wird. Diese Lösung wird mit wäBrigem Natriumbicarbonat und
dann mit Wasser neutral gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wird aus der
getrockneten Lösung verdampft; das verbleibende Öl wird in Benzol gelöst und aus
diesem Lösungsmittel an säuregewaschenes Aluminiumoxyd adsorbiert. Das Adsorbat
wird mit
Äther-Petroläther und darauf mit Gemischen aus Äther und
Chloroform mit zunehmendem Chloroformgehalt eluiert. Die Äther-Chloroformeluate
(4: 6) werden vereinigt und zur Trockne eingedampft; der Rückstand erjibt nach dem
Umkristallisieren aus Äthylacetat-Äther 16a-Methyl-1,4-pregnadien-17a, 21-diol-3,11,20-trion-21-acetat;
F. 208 bis 212°C.