DE1075524B

DE1075524B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von a-Aminocarboxylaten

Info

Publication number: DE1075524B
Application number: DENDAT1075524D
Authority: DE
Inventors: Evanston HL und Irwin C. Gunsalus Urbana 111. Robert C Good (V. St. A.)
Original assignee: International Minerals S- Chemical Corporation, Chicago, 111. (V. St. A.)
Publication date: 1960-02-18

Description

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von a-Aminocarboxylaten Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von a-Aminocarboxylaten aus a-Ketocarboxylaten oder deren Vorstufen durch Fermentieren mittels Hefe und ist dadurch gekennzeichnet, daß man diese Fermentierung mit Hefezellen in Gegenwart eines Lipoidlösungsmittels durchführt.
Die als wichtiger Bestandteil von Proteinen bekannte Glutaminsäure wird vielfach als geruchverbesserndes Mittel in Form des Natriumsalzes ihres 1-Enantiomorphen benutzt. Für die Herstellung von Mononatrium-l-Glutamat wird 1-Glutaminsäure vorwiegend aus natürlichen Quellen, wie z. B. Weizengluten und Zuckerrübenmelasse, z. B. Steffens-Filtrat, gewonnen. Die bei der Synthese von Glutaminsäure als racemisches Gemisch gebildete dl-Glutaminsäure muß zwecks Gewinnung von 1-Glutaminsäure weiterhin einer Spaltung unterworfen werden, deren Durchführung bisher sich nicht als wirtschaftlich erwies.
Bekanntlich oxydiert glutaminsaure Dehydrogenase aus Leber, der Niere und aus Herzgeweben 1-Glutaminsäure reversibel zu a-Ketoglutarsäure und Ammoniak in Gegenwart von Coenzym I und Coenzym Il; anfänglich bildet sich wahrscheinlich Iminoglutarsäure, die dann spontan zu a-Ketoglutarsäure und Ammoniak hydrolysiert (Sumner und Somers, »Chemistry and Methods of Enzymes«, New York, Academic Press, Inc. III: Edit. [1953], S. 269). Auf diese Weise kann man 1-Glutaminsäure aus a-Ketoglutarsäure und Ammoniak durch Wirkung solcher glutaminsauren Dehydrogenase herstellen (Hunter und H i x o n , Journ. Biolog. Chem., 181 [1949], S.67, zitiert von S u m n e r und M y r b a c k, »The Enzymes, New York, Academic Press, Inc. [1953], Bd. II, Teil 1, S. 308). Glutaminsaure Dehydrogenase aus Hefe zeigt eine ähnliche Funktion (S u m n e r und S o m e r s, a. a. O., S.268).
Auch ist es bekannt, auf biochemischem Wege 1-Glutaminsäure durch enzymatische Reduktion und Aminierung von a-Ketoglutarsäure dadurch zu gewinnen, daß bei diesem Verfahren laufend eine Rückbildung von Cozymase zu ihrer Dihydroform durch die Anwesenheit geeigneter Oxydo-Reduktions-Fermentsysteme bewirkt wird. Weiterhin wurde vorgeschlagen, 1-Glutaminsäure durch Behandlung einer wäßrigen, a-Ketoglutarationen und Ammoniumionen enthaltenden Lösung, deren pg 6,0 bis 8,5 betrug, mit einem biologischen Katalytsystem aus Extrakten von Herz, Leber und Nieren, Bakterien der Gattung Xanthomonas, Pseudomonas u. dgl. und mit einem wasserlöslichen, wasserstoffabgebenden Reaktionsteilnehmer, wie z: B. Zitronen-, Maleinsäure usw., und einem geeigneten Dehydrogenasesystem zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung bringt eine Verbesserung in der Herstellung von 1-a-Aminocarbonsäuren aus den entsprechenden a-Ketocarbonsäuren oder deren Vorstufen durch Hefefermentierung bzw. von 1-a-Aminocarboxylaten aus den entsprechenden a-Ketocarboxylaten.
Es wurde festgestellt, daß die enzymatische Überführung von a-Ketocarbonsäuren in die entsprechenden 1-a-Aminocarbonsäuren mit unversehrten Hefezellen in Gegenwart eines Lipoidlösungsmittels in einem Reaktionsmedium gegebenenfalls gebräuchlicher Zusammensetzung zum Erfolg führt. Die Lipoide werden aus den Hefezellen herausgelöst und deren Durchdringlichkeit dadurch erheblich verbessert und die Wechselwirkung der Enzyme und Reaktionsteilnehmer zwischen den Hefezellen und dem Reaktionsmedium stark begünstigt. Auf jeden Fall ist die Ausbeute am gewollten Produkt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wesentlich größer als nach den bisher bekannten Methoden.
Weiterhin hat sich ergeben, daß die Ausbeute beträchtlich erhöht wird, wenn das Fermentierungsmedium vor Einführung der a-Ketocarbonsäure 1 bis 10 Stunden lang einer Vorinkubation, vorzugsweise etwa 2 Stunden lang, unter den im nachstehenden noch angegebenen Fermentierungsbedingungen unterworfen wird. Anscheinend ergibt sich die beobachtete Verbesserung aus einer Bildung von Diphosphorpyridinnucleotid (DPN) während der Vorinkubationsperiode. Ferner läßt sich die Fermentierung vorteilhaft in Abwesenheit von freiem Sauerstoff und vorzugsweise unter einer Kohlendioxydatmosphäre durchführen.
Die Bezeichnung »a-Aminocarboxylat« bezieht sich auf a-Aminocarbonsäure, a-Aminodicarbonsäure und auf die Alkali- und Erdalkalimetallsalze dieser Stoffe, »a-Ketocarboxylat« auf eine a-Ketocarbonsäure, a-Ketodicarbonsäure und auf die Alkali- und Erdalkalimetallsalze dieser Säuren, und unter die Bezeichnung »Fermentierung« fällt jeder Prozeß, bei dem Organismen angewendet werden, die die Umwandlung eines Substrates in ein oder mehrere erwünschte Produkte katalysieren sollen.
Zwar ist a-Ketoglutarat in den erfindungsgemäßen Verfahren das bevorzugte a-Ketocarboxylat; es können aber für die Synthese anderer a-Aminocarboxylate vorteilhaft auch andere u-Ketocarboxylate zwecks Gewinnung von 1-Glutaminsäure verwendet werden, z. B. Oxalacetat für diejenige von Asparaginsäure, Pyruvat für die Herstellung von Alanin, Methyl-a-Ketobuttersäure für die Gewinnung von Valin usw. Auch cc-Ketocarboxylat-Vorläuferverbindungen, wie Citrat, Isocitrat oder Aconitat für u-Ketoglutarat, Fumarat oder Malat für Oxalacetat oder fermentierbare Kohlehydrate als Vorläufer von a-Ketoglutarat oder Oxalacetat, können dazu dienen, das a-Ketocarboxylat ganz oder teilweise bei der Durchführung des neuartigen erfindungsgemäßen Verfahrens zu ersetzen. Die Verwendung von Fumarsäuresalzen und Maleinsäuresalzen beschränkt sich nicht allein auf die Herstellung von Oxalacetat; nur in einigen Fällen werden diese Substanzen in Asparaginsäure ohne vorherige Bildung von Oxalacetat übergeführt.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird ein a-Ketocarboxylat mit unversehrten Hefezellen in einem geeigneten Lipoidlösungsmittel behandelt, bis es praktisch in das entsprechende a-Aminocarboxylat übergeführt wurde. Als Lipoidlösungsmittel wird Tetrachlorkohlenstoff bevorzugt. Geeignet sind unter anderem noch Äthylendichlorid, Trichloräthylen, Benzol, Toluol, Äthyläther, Äthylacetat u. dgl. Die L ösungsmittelmengen sollen so hinreichend sein, daß freie Lipoide von den Zellen praktisch völlig weggelöst werden. Für diesen Zweck genügen gewöhnlich 50 Gewichtsprozent an Lösungsmittel, bezögen auf trockene Hefezellen, für ein gut bewegtes System; bevorzugt werden etwa 100 bis etwa 500 Gewichtsprozent.
Das Fermentierungsmedium enthält in geeigneter Weise Ammoniumionen, Phosphationen, ein fermentierbares Kohlehydrat, unversehrte, ganze Hefezellen, Wasser und fakultativ einen Metallionenzymaktivator.
Die Ammonium- und Phosphationen brauchen nicht in Form eines Ammoniumphosphates eingeführt zu werden, wenn auch diese Verbindung ein bequemes Verfahren für die Einführung dieser Ionen gewährleistet. Diese Phosphationen können fakultativ in Form von Phosphorsäure oder von Phosphaten, die Ammoniumionen in Form von Ammoniak oder eines einfachen Ammoniumsalzes zugesetzt werden, wie z. B. eines Alkalimetallphosphates bzw. in Form von Ammoniumchlorid, Ammoniumhydroxyd od. dgl.
Das wäßrige Medium soll während der Fermentierung möglichst einen p$ Wert zwischen etwa 6 und etwa 8 aufweisen. Für höhere Ergebnisse läßt sich das pH durch Einstellung des Ammoniakgehaltes des Mediums regeln. Vorzugsweise soll jedoch das Medium zwischen etwa 30 und etwa 750 Mikromol an Ammoniak pro Milliliter enthalten,. ohne Rücksicht darauf, in welcher Form das Ammoniak zugegeben wird; die erforderliche Einstellung des pH des Substrates für seinen Wert im Bereich von etwa 6 bis 8 kann durch Zugabe eines Alkalimetallhydroxydes, wie Natriumhydroxyd, zum Gemisch erfolgen, um eine Störung der Ammoniakkonzentration zu vermeiden. Nach Feststellung beeinflußt eine Zugabe von mehr als 400 Mikromol an Ammoniak pro Milliliter des Substrates die Ausbeute an a-Aminocarboxylat nicht günstig. Liegen aber im Substrat zwischen etwa 30 und etwa 400 Mikromol an Ammoniak pro Milliliter vor und wird der p11-Wert der Reaktionslösung vor der Incubation auf zwischen etwa 6 und etwa 8 durch Zugabe eines Alkalimetallhydroxydes eingestellt, erhöht sich die Ausbeute an a-Aminocarboxylat um etwa 15 bis 20% des Ergebnisses, das man bei Einstellung des PH mit Ammoniak allein erzielen kann.
Die a-Ketocarboxylat-Konzentration im Fermentierungsmedium kann zwischen etwa 0,2 und etwa 10 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 1 und etwa 4%, liegen.
Vorzugsweise erfolgt die Fermentationsreaktion in Gegenwart von Saccharose; es eignet sich jedoch auch jegliches gärfähige Kohlehydrat einschließlich Fruktose, Glukose, Maltose, Mannose und Invertzucker (Glukose plus Fruktose). Ergänzend zu diesen Zukkerarten können Pentosen durch Torulopsis-Hefe fermentiert und dann angewendet werden, wenn diese Art benutzt wird.
Das Fermentierungsmedium kann wahlweise und vorteilhaft einen Metallionen-Enzym-Aktivator enthalten, auch können verschiedene Salze bivalenter Metalle, wie z. B. die einfachen Salze von Kobalt, Zink und Ferroeisen, verwendet werden. Als Aktivator wird Mangansulfat, gegebenenfalls auch Magnesiumsulfat benutzt. Allgemein ist jedes Metallsalz brauchbar, das zur Katalysierung der Hefeumwandlung eines a-Ketocarboxylats in das entsprechende a-Aminocarboxylat fähig ist, wie vorzugsweise Mangansulfat. Ein solcher Aktivator muß möglichst in einer Menge zwischen etwa l0-0 und etwa 10-2 Molkonzentration, vorzugsweise zwischen 10-4 und etwa 10-2, bezogen auf das gesamte Fermentationsreaktionsgemisch, zugegen sein.
Erfindungsgemäß können unversehrte Hefezellen jeder Art verwendet werden, vorzugsweise Bäckerhefe und T orulopsis utilis, gegebenenfalls auch Bierhefe (Saccharo,myces cerevisiae) und andere Spezies von Rhodotorula und Picchia. Die Hefe muß frisch hergestellt oder in einem äquivalenten Zustand sein.
Die Fermentierung erfolgt möglichst bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 50° C, gegebenenfalls auch bei niedrigeren oder etwas höheren Temperaturen. Sie benötigt im allgemeinen mindestens 15 Minuten für eine weitgehende Umwandlung des als Ausgangsmaterial benutzten a-Ketocarboxylats; für eine praktisch vollkommene Reaktion genügt allgemein eine Gärungsperiode von etwa 10 bis 20 Stunden. Gewöhnlich bringt eine Reaktionszeit über 48 Stunden keinen Vorteil. Die für eine vollständige Fermentation erforderliche Zeitlänge hängt von der benutzten Menge an Hefe ab; größere Mengen verkürzen die Fermentationszeit. Aber, bezogen auf das Gärungsmedium, führen auch 1 bis 10 Gewichtsprozent oder mehr, vorzugsweise 2 bis 4%, an Hefe (auf Trockenbasis) zum Erfolg.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man alle Bestandteile in das wäßrige Medium gleichzeitig oder etwa zur gleichen Zeit einbringen; jedoch ergeben sich Höchstausbeuten an a-Aminocarboxylat mit einem zweistufigen Verfahren, hierbei werden alle Teile des Mediums., mit Ausnahme des a-Ketocarbo-xylats,, in den Reaktionskessel eingebracht und die entstandene Lösung kurzzeitig, z. B. zwischen etwa 15 Minuten und etwa 2 Stünden, einer Bebrütung bei einer besonderen Temperatur, z. B. zwischen etwa 20 und etwa 50' C, vorzugsweise 35 bis 40' C, ausgesetzt. Nach diesem Vorbrüten wird das auf ein p$ zwischen 6 und 8 mit Alkali, vorzugsweise mit Kaliumhydroxyd, eingestellte a-Ketocarboxylat hinzugegeben und die entstandene Lösung auf ein pA zwischen etwa 6 und 8 rnit Alkali, wieder vorzugsweise mit Kaliumhydroxyd, gebracht. DieseEndmischungwirdbei einer Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 50' C, vorzugsweise 35 bis 40' C, so lange bebrütet, bis die Überführungsreaktion praktisch vollständig ist. Hierfür sind etwa 15 Minuten bis etwa 20 Stunden erforderlich. Nach diesem zweistufigen Verfahren, das eine Vorbebrütungsperiode einschließt, wird das a-Aminocarboxylat mit etwa 15 % höheren Ausbeuten als bei Weglassung einer Vorbebrütungszeit erhalten.

Zwar kann die Fermentation erfolgreich im Kontakt mit Luft durchgeführt werden, jedoch wird ein Arbeiten in Abwesenheit von freiem Sauerstoff bevorzugt. Beste Ergebnisse erzielt man anscheinend dann, wenn die Luft aus dem Kulturapparat mit Kohlendioxyd herausgestrichen und dessen Atmosphäre während der ganzen Fermentation aufrechterhalten wird.

Tabelle II
a-Ketoglutarat 1-Glutaminsäure
Lipoidlösungsmittel Zeit hinzugefügt Gefunden Synthese Umwandlung
Stunden M/MI M/ml I M/MI I °/o
C C14 ............................. 0 82 21,9
3,5 35,6 13,7 16,7
9,5 56,2 34,3 41,8
24 68,5 46,6 56,7
Benzol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 82 16,4
3,5 31,5 15,1 18,4
9,5 34,2 17,8 21,7
24 46,6 30;2 36,8
Trichloräthylen ................... 0 82 9,6
3,5 35,6 26,0 31,7
9,5 45,2 35,6 43,3
24,0 54,8 45,2 55,0

Beispiel 2 Das vorhergehende Beispiel gibt erfolgreiche Fermentationen wieder, bei denen das Gärungsmittel unversehrte Hefezellen und Lipoldlösungsmittel umfaßt. Beispiel 2 erläutert dazu die im Vergleich nur geringen Ergebnisse, wenn die Fermentation in. Gegenwart eines mit Lipoidlösungsmittel (Tetrachlorkohlenstoff) hergestellten Hefezellenextrakts, jedoch in- Abwesenheit der Hefezellen selbst, durchgeführt wurde.

Ein wäßriges Gärungsmedium, das wie nach Bei-

Tabelle III

a-Ketoglutarat 1-Glutaminsäure

Lipoidlösungsmittel Zeit hinzugefügt Gefunden Synthese Umwandlung

Stunden M/MI M/MI I M/MI I °/o

C C14 ............................. 0 82 6,8

3,5 16,4 9,6 11,7

9,5 19,2 12,4 15,1

24 19,2 12,4 15,1

Die folgenden Beispiele erläutern besondere Ausführungsformen der Erfindung. Alle Teile und Prozentangaben beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, auf Gewicht.

Beispiel 1 Die folgenden Versuche erläutern die Verwendung verschiedener Lipoidlösungsmittel. Es wurde ein wäßriges Gärungsmedium folgender Zusammensetzung hergestellt

Tabelle I

(M = Mikromol)

0,2 M zweibasisches Ammonium-

phosphat (pg 7,6 mit H Cl) . . . . . . . . . 30,0 ml

Mn S 04 (0,003 M) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 ml

Wasser ............................. 9,8m1

Trockene Bäckerhefe, Type 1821 ...... 6,0 g

Saccharose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g

Lipoidlösungsmittel (unten bezeichnet) 10,0 ml

Das Medium wurde 2 Stunden lang bei 37' C bebrütet; dann wurden 60 ml einer Lösung von 2 % a-Ketoglutarsäure (eingestellt auf ein pg 7,6 mit NaOH) hinzugegeben. Das gesamte Gemisch wurde mit Na O H auf ein pH von 7,6 eingestellt und in den Brutofen mit einer Temperatur von 37' C zurückgebracht. Von Zeit zu Zeit wurden zwecks Analysierung Proben abgezogen. Die Ergebnisse sind folgende: spiel 1 zusammengesetzt war und als Lipoidlösungsmittel Tetrachlorkohlenstoff enthielt, wurde 2 Stunden lang bei 37' C bebrütet, dann zentrifugiert, um die Hefezellen zu entfernen. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde gesammelt, mit 60 ml einer wäßrigen 21/o a-Ketoglutarsäurelösung (mit NaOH auf ein pg von 7,6 eingestellt) vermischt und in den Brutapparat von 37' C wieder eingebracht. Zwecks Vornahme einer Analyse wurden von Zeit zu Zeit Proben abgezogen. Die Ergebnisse sind folgende: Beispiel 3 Der folgende Versuch zeigt den Vorteil der Vorbebrütung des Fermentationsmediums vor der Zugabe von a-Ketoglutarat. Es wurden 2 Portionen eines Mediums nach Beispiel 1 hergestellt und mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellt. Ein Teil wurde

Tabelle IV
a-Ketoglutarat 1-Glutaminsäure
Behandlung Zeit hinzugefügt Gefunden I Synthese Umwandlung
Stunden M/ml M/ml M/ml , °/a
Vorbebrütet ...................... 0 82 23,1
5 48,8 25,7 31,3
10 63,8 40,7 49,6
24 73,4 50,3 61,3
Keine Vorbebrütung .............. 0 82 21,7
5 28,5 6,8 8,3
10 51,7 30,0 36,6
24 62,6 40,9 49,9

Beispiel 4 Der folgende Versuch zeigt den Vorteil der Durchführung der Fermentation unter einer Atmosphäre von Kohlendioxyd. Das wäßrige Gärungsmedium wurde doppelt hergestellt und hatte folgende Zuca.mmensetzun@

" "Tabelle V

0,2 M zweibasisches Ammonium-

phosphat (pH 7,6 mit H Cl) . . . . . . . . . 15,0 ml

Mn S 04 (0,1 M) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 ml

Saccharose .......................... 1,09

Wasser ............... . ............ « 4,5 ml

Tetrachlorkohlenstoff ................ 5,0 ml

Trockene Bäckerhefe, Type 1821 ...... 1,5 g

Tabelle VI

a-Ketoglutarat 1-Glutaminsäure

Atmosphäre Zeit hinzugefügt Gefunden Synthese Umwandlung

Stunden M/MI M/ml I M/ml l °/a

N2 ............................... 0 82 5,6

10 19,7 141 17,3

c02 ............................. 0 82 6,3

10 59,8 83,5

65;3

Beispiel 5 Bei diesen Versuchen ergaben sich die Einflüsse der verschiedenen Konzentrationen des Metallionen-Enzym-Aktivators. Es wurde ein Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

Tabelle VII

0;2 M zweibasisches Ammonium-

phosphat (pH 7,6 mit H Cl) . . . . . . . . . 15,0 ml

Saccharose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g

Wasser ............................. 4,5 ml

Tetrachlorkohlenstoff ................ 5,0 ml

Trockene Bäckerhefe, Type 1821 ...... 3,0 g

Es wurden 5 Teile des Mediums angesetzt und zu ihnen Manganion in dem Bereich von 0- bis 0,01molar zusammen mit 80 hl/ml a-Ketoglutarat hinzugegeben. Die Mischung wurde 17 Stunden lang bei 37° C in einer Stickstoffatmosphäre unter wechselweisem 2 Stunden lang vorbebrütet; der andere Teil wurde nicht vorbebrütet. Zu jedem Teil wurden 82 M/ml eines a-Ketoglutarats hinzugefügt und die erste Bebrütung bei 37' C durchgeführt. Zwecks Vornahme einer Analyse wurden bei 0, nach 5, 10 und 24 Stunden Proben entnommen. D ie Ergebnisse waren folg ende Der obere Raum in einer der Gärgefäße wurde mit Stickstoff, der andere mit Kohlendioxyd angefüllt-Beide Gefäße wurden bei 37' C bebrütet, und zwar in einem Wasserbad unter Schütteln. Danach wurde jede Flasche mit wäßrigem Natriumhydroxyd auf einen pH Wert von 7,6 eingestellt; zu jeder Flasche wurden 30 ml einer wäßrigen 2°/aigen a-Ketoglutarsäure-Lösung, die gleichfalls unter Verwendung von wäßrigem Natriumhydroxyd auf pH von 7,6 eingestellt wurde, hinzugefügt. Dann wurde wie vorher die Fermentation unter Stickstoff und Kohlendioxyd wieder vorgenommen. Nach 10 Stunden zeigten sich folgende Ergebnisse: Schütteln bebrütet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:

Tabelle VIII
Mn-Ion- a-Keto- 1-Glutaminsäure
Konzentration glutarat
hinzugefügt Synthese Umwandlung
molar M/ml M/ml
0 82 21,3 26,0
5 10-4 78,8 30,8 39,1
10-3 78,8 32,5 41,2
5 10-3 80,4 38,1 47,4
10-2 78,8 26,8 34,0

Beispiel Die folgende Prüfung gibt die Ergebnisse bei Verwendung verschiedener Alkalimetallmaterialien zur Einstellung des p$ wieder. Es wurde ein wäßriges Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung hereestellt

1 aoene 1X

0,2 M zweibasisches Ammonium-

phosphat (pg 7,6 mit H Cl) . . ....... 30,0 ml

Mn S 04 (0,003 M) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 ml

Wasser ............................. 9,8 ml

Trockene Bäckerhefe, Type 1821 ...... 6,0 g

Saccharose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g

Tetrachlorkohlenstoff ................ 10,0 ml

Tabelle X
a-getoglutarat 1-Glutaminsäure
Neutralisierende Base Zeit hinzugefügt Gefunden Synthese Umwandlung
Stunden M/ml M/ml I M/Illl I °/o
N H4 O H ......................... 0 82 13,7
24 41,1 27,4 33,4
48 65,7 52,0 63,4
NaOH .......................... 0 82 9,5
24 52,1 42,6 52,0
48 68,5 59,0 72,0
NaOH .......................... 0 82 27,2
24 67,6 40,4 49,3
48 73,3 46,1 56,2
K O H ............................ 0 82 23,1
24 78,8 55,7 67,9
48 81,6 58,5 71,3
Ca (O 12) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 56,2 17,67
24 48,80 31,1 55,4
48 40,70 23,0 40,9
Ba (O H2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 60;5 21,80
24 51,70 30,0 49,4
48 46,20 24,4 40,3

Aus diesen Ergebnissen ist zu ersehen, daß Kaliumhydroxyd eine besonders geeignete Base für die Einstellung des pH-Wertes ist. Beispiel 8 Diese Versuche geben die Herstellung von Asparaginsäure nach der Erfindung wieder. Nach Beispiel 1 wurden 3 Teile des Fermentationsmediums hergestellt, mit Na O H ihr pH-Wert auf 7,6 eingestellt; dann wurden sie 2 Stunden lang bei 37' C unter einer Stickstoffatmosphäre vorbebrütet. Zu den entsprechenden Medien wurden dann 2o/oige wäßrige Lösungen von Oxalessigsäure; Fumarsäure und Maleinsäure, mit Na O H bis zu einem pH von 7,6 neutralisiert, gegeben und die Fermentation dann fortgesetzt. Hierbei wurden die Proben unter Stickstoff wechselweise geschüttelt.

Bei 0 und 24 Stunden vorgenommene Analysen zeigten, daß sich die Ausbeute an Asparaginsäure verdoppelte, wenn Oxalacetat, daß sie auf das Zehnfache erhöht wurde, wenn Fumarat oder Malat das Substrat war.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von a-Aminocarboxylaten aus a-Ketocarboxylaten oder deren Vorstufen durch Fermentieren mittels Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Fermentierung mit Hefezellen in Gegenwart eines Lipoidlösungsmittels durchführt. Das Medium wurde 2 Stunden bei 37' C bebrütet und zu ihm 60m1 einer wäßrigen 2o/oigen a-Ketogiutarsäure, deren pg mit einer ausgewählten Base auf 7,6 eingestellt wurde; gegeben. Das gesamte Gemisch wurde mit der ausgewählten Base auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellt und dann in den Brutapparat mit 37' C wieder eingebracht. Bei 0, nach 24 und 48 Stunden wurden Proben zwecks Analysierung entnommen. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: 2. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 50' C, vorzugsweise zwischen etwa 35 und 40' C, durchgeführt wird. 3. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung in Abwesenheit von freiem Sauerstoff durchgeführt wird. 4. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation unter einer Atmosphäre von Kohlendioxyd durchgeführt wird. 5. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daB man das Fermentationsmedium vor Einführung des a-Ketocarboxylates etwa 1 bis etwa 10 Stunden lang einer Vorbebrütüng aussetzt. 6. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurchgekennzeichnet, daßalsLipoidlösungsmittel Tetrachlorkohlenstofff verwendet wird. 7. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurchgekennzeichnet, daß äls a-Ketocarboxylat a-Ketoglutarat verwende: wird. In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Patentschrift Nr. 931582; USA.-Patentschrift Nr. 2 749 279.