DE102004055998A1

DE102004055998A1 - Niedermolekulare Inhibitoren von Guaninnucleotid-Austauschfaktoren der Cytohesin-Familie

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Publication number: DE102004055998A1
Application number: DE102004055998A
Authority: DE
Inventors: Michael Prof. Famulok; Waldemar Prof. Kolanus; Markus Dipl.-Chem. Hafner; Imke Dipl.-Chem. Grüne; Barbara Dipl.-Biol. Tappertzhofen; Mirko Dr. Theis
Original assignee: Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn
Current assignee: Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn
Priority date: 2004-11-19
Filing date: 2004-11-19
Publication date: 2006-05-24
Also published as: WO2006053903A3; EP1811997A2; US8163788B2; US20090105286A1; WO2006053903A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel und deren Verwendung, wobei die Arzneimittel Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen. Diese Arzneimittel sind geeignet zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Tumorerkrankungen und/oder zur Immunsuppression.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel. Das Arzneimittel kann zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Tumorerkrankungen und/oder zur Immunsuppression verwendet werden.
Kleine G-Proteine oder GTPasen und ihre regulatorischen Proteine wie Austauschfaktoren regulieren zentrale zelluläre Prozesse wie Zellproliferation, Zelladhäsion und Zellmigration, programmierter Zelltod oder Antworten auf Zellstress. Diese regulatorischen Proteine oder Austauschfaktoren erfüllen trotz eines teilweise sehr homologen Aufbaus die unterschiedlichen Aufgaben im Zellkontext hochspezifisch, wobei einige Proteine selektiv in die Entstehung bestimmter Krankheiten involviert sind.
Guaninnucleotid-Austauschfaktoren, die im folgenden auch als GEFs bezeichnet werden, aktivieren kleine G-Proteine durch Stimulation des GDP/GTP-Austauschs. Guaninnucleotid-Austauschfaktoren sind Regulatoren von Aktivierungssignalen.
Zu den Guaninnucleotid-Austauschfaktoren für kleine GTPasen der Familie der ADP-Ribosylierungsfaktoren (ARFs) gehören die Familie der großen Guaninnucleotid-Austauschfaktoren, wie Gea1, Gea2, BlG1, BlG2, und die Familie der kleinen Guaninnucleotid-Austauschfaktoren, die Cytohesine wie Cytohesin-1, Cytohesin-2, Cytohesin-3 und Cytohesin-4 (Julie G Donaldson and Catherine L Jackson, Regulators and effectors of the ARF GTPases, Current Opinion in Cell Biology 2000, 12: 475–482).
Ein gemeinsames Merkmal der Guaninnucleotid-Austauschfaktoren für kleine GTPasen der Familie der ADP-Ribosylierungsfaktoren ist ihre zentrale sec7-Domäne, entsprechend der Aminosäuren 62–244 in Cytohesin-1 (Ref.: Betz et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Jul 7;95(14): 7909–14), Cytohesin-2 (Chardin, P. et al., Nature 384, 481–4 (1996) oder Gea2 (Peyroche, A. et al., Mol Cell 3, 275–85 (1999)). Die sec7-Domäne ist innerhalb der Guaninnucleotid-Austauschfaktoren weitgehend ähnlich und verantwortlich für die Katalyse des Guaninnucleotid-Austausches.
Cytohesine besitzen ein Molekulargewicht von ca. 50 kDa und sind in die Regulation von Zellproliferation und Zelladhäsion/Zellmigration in Krebszellen und Immunzellen involviert.

Als Inhibitoren für GEFs bekannt sind derzeit nur Brefeldin A sowie RNA-Aptamere und Peptide, die entweder hochtoxisch oder nicht ausreichend zellgängig und daher nicht medizinisch anwendbar sind. Somit sind Austauschfaktoren der Cytohesin-Familie bisher nicht als molekulare Zielstrukturen für medizinische Anwendungen verwendbar. Weitere Verbindungen, die diese Proteine inhibieren, sind bisher im Stand der Technik nicht bekannt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die als Inhibitoren der GEFs der Cytohesin-Familie verwendbar sind, Arzneimittel, die diese Verbindungen umfassen und deren Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen mittels dieser Inhibitoren.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Arzneimittel, umfassend Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:

worin:
R ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin, C1-C10- Alkoxy und/oder ein Strukturelement (A1), (B1), (C1), (D1), (E1), (F1), (G1), (H1), (I1), (J1) wie nachstehend angegeben:

worin:
R₄ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin und/oder C1-C10-Alkoxy.

Es wurde überraschend gefunden, dass Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) die Aktivität der Guaninnucleotid-Austauschfaktoren, insbesondere der der Familie der Cytohesine modulieren können, wobei es sich bei der Modulation vorzugsweise um eine Blockierung oder Inhibierung der Funktion handelt. Dies ist insbesondere überraschend, da bislang keine niedermolekularen Inhibitoren für diese Proteinklasse bekannt sind.

Ein besonderer Vorteil der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) besteht darin, dass diese die Proteine bei Konzentrationen inhibieren können, die nicht toxisch sind. Somit sind die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) in Arzneimitteln verwendbar und/oder therapeutisch einsetzbar.

Bevorzugt sind die Verbindungen niedermolekulare Verbindungen. Unter "niedermolekularen Verbindungen" werden im Sinne dieser Erfindung Verbindungen verstanden, die bevorzugt ein Molekulargewicht im Bereich von 50 Dalton bis 800 Dalton, vorzugsweise im Bereich von 100 Dalton bis 500 Dalton, besonders bevorzugt im Bereich von 250 Dalton bis 475 Dalton aufweisen. Vorzugsweise weisen die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) ein Molekulargewicht von weniger als 500 Dalton auf.

Ein weiterer großer Vorteil der die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) umfassenden Arzneimittel wird dadurch verwirklicht, dass die Verbindungen zellgängig sind. Die Verbindungen sind vorteilhafter Weise sehr gut zellgängig, wodurch eine sehr hohe Verfügbarkeit der Verbindungen an ihrem Wirkort, insbesondere in Zellen erzielt werden kann. Unter dem Begriff "zellgängig" wird im Sinne der Erfindung verstanden, dass die Verbindungen durch die Zellmembran hindurchtreten und in Zellen gelangen können. In besonders vorteilhaften Ausführungsformen gelangen die Verbindungen vollständig oder nahezu vollständig in die Zellen und/oder sind vollständig oder nahezu vollständig in der Zelle verfügbar.

Dies ist von besonderem Vorteil, da die Arzneimittel umfassend zellgängige Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) somit nach üblichen Methoden beispielsweise oral, dermal und/oder intravenös verabreichbar sind, ohne dass die Verbindungen mittels einer Transfektion in die Zelle eingebracht werden müssen.

In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), wobei die Strukturelemente R₁, R₂ und/oder R₃ vorzugsweise ausgewählt aus den schwefelhaltigen Strukturelementen (A1), (B1), (C1) und/oder (D1) sind. In vorteilhaften Ausführungsformen kann das Arzneimittel Verbindungen aufweisen, die mehrere gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A1), (B1), (C1) und/oder (D1) aufweisen. Vorzugsweise weisen die Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A1), (B1), (C1) und/oder (D1) auf.

In bevorzugten Ausführungsformen umfassen Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:

worin:
R₁ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₂, R₃ und/oder ein Strukturelement (A2), (B2), (C2), (D2) wie nachstehend angegeben:

R₂ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₃ und/oder ein Strukturelement (E2), (F2), (G2), (H2), (I2), (J2), (K2) wie nachstehend angegeben:

R₃ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₂, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C 1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin und/oder C1-C10-Alkoxy.

In weiterhin bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8), wobei die Strukturelemente R₁, R₂ und/oder R₃ vorzugsweise ausgewählt aus den schwefelhaltigen Strukturelementen (A2), (B2), (C2) und/oder (D2) sind. In vorteilhaften Ausführungsformen kann das Arzneimittel Verbindungen aufweisen, die mehrere gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A2), (B2), (C2) und/oder (D2) aufweisen. Vorzugsweise weisen die Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A2), (B2), (C2) und/oder (D2) auf.

Bevorzugt unter den C1-C10-Alkoxygruppen sind Methoxy- und/oder Ethoxygruppen.

Erfindungsgemäß besonders geeignete Arzneimittel umfassen Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:

worin:
R₁ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₂, R₃ und/oder ein Strukturelement (A3), (B3), (C3), (D3) wie nachstehend angegeben:

R₂ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₃ und/oder ein Strukturelement (E3), (F3), (G3), (H3), (I3), (J3), (K3), wie nachstehend angegeben:

R₃ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₂, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, und/oder C1-C10-Alkoxy.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8), wobei die Strukturelemente R₁, R₂ und/oder R₃ vorzugsweise ausgewählt aus den schwefelhaltigen Strukturelementen (A3), (B3), (C3) und/oder (D3) sind. In vorteilhaften Ausführungsformen kann das Arzneimittel Verbindungen aufweisen, die mehrere gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A3), (B3), (C3) und/oder (D3) aufweisen. Vorzugsweise weisen die Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A3), (B3), (C3) und/oder (D3) auf.

In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:

Ein bevorzugtes Enantiomer der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) ist die Verbindung (19) wie nachstehend angegeben:

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) als Monomere aufweisen.

Es kann auch vorgesehen sein, diese Verbindungen über geeignete Gruppen, die auch als spacer bezeichnet werden, zu mehrere solche Monomere umfassenden Einheiten zumindest teilweise miteinander zu verbinden und Dimere, Trimere und/oder Oligomere der Verbindungen zu verwenden.

In weiterhin bevorzugten Ausführungsformen weist das Arzneimittel Dimere, Trimere und/oder Oligomere auf, die wenigstens eines oder mehrere der Monomere ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8), vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12) (13) und/oder (14), aufweisen.

Die verbindenden Gruppen oder spacer können die einzelnen Einheiten und/oder Monomere starr oder flexibel verbinden. Beispielsweise können einzelne Einheiten und/oder Monomere durch Alkin-Gruppen starr verbunden werden, während eine Verbindung über eine oder mehrere Ethylenglycol-Gruppe(n) eine flexible Verbindung zur Verfügung stellen kann.

Bevorzugt sind Monomere ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) zur Bildung von Dimeren, Trimeren und/oder Oligomeren über Ether-, Ester-, Alkin-, Amid-, Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Alkoxy-, Alkylen-, Aryl-, Arylen- und/oder Ethylenglycol-Gruppen zumindest teilweise miteinander verbunden.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Arzneimittels kann dadurch verwirklicht werden, dass bereits geringe therapeutische Dosierungen des Arzneimittels verwendbar sind. Eine hohe Dosierung, die häufig zu toxischen Nebenwirkungen führen kann, kann durch die sehr gut zellgängigen und in hohem Ausmaß verfügbaren Verbindungen vermieden werden.

Vorzugsweise weisen die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) Dissoziationskonstanten im Bereich von 0,1 μM bis 30 μM, besonders bevorzugt im Bereich von 0,5 μM bis 10 μM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 1 μM bis 7 μM, auf. Vorzugsweise werden die Dissoziationskonstanten mittels Mikrokalorimetrie bestimmt.

In bevorzugten Ausführungsformen weisen die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) IC₅₀-Werte im von 0,1 μM bis 30 μM, besonders bevorzugt im Bereich von 0,5 μM bis 20 μM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 1 μM bis 15 μM, auf. Der IC₅₀-Wert der Verbindungen für die Inhibierung der Austauschaktivität der sec7-Domänen verschiedener Guaninnukleotid-Austauschfaktoren entspricht der Konzentration, die nötig ist, die Aktivität des Proteins auf die Hälfte zu reduzieren.

In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel, bezogen auf eine Tagesdosis, 10 nM bis 100 μM, vorzugsweise 100 nM bis 10 μM, bevorzugt 1 μM bis 10 μM, besonders bevorzugt 1 μM bis 3 μM Verbindung(en) ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze.

In weiterhin bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel, bezogen auf eine Tagesdosis, 500 nM bis 3 μM, vorzugsweise 500 nM bis 1 μM Verbindung(en) ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14).

Unter einer Tagesdosis wird im Sinne dieser Anmeldung die Menge des Arzneimittels verstanden, die pro Tag verabreicht wird.

Die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) und/oder (19) können die Aktivität von Guaninnucleotid-Austauschfaktoren, die eine sec7-Domäne aufweisen, modulieren, wobei es sich bei der Modulation um eine Blockierung oder Inhibierung handelt.

Vorteilhafter Weise sind Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) und/oder (19) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze als Inhibitoren für wenigstens eine sec7-Domäne aufweisende Proteine verwendbar.

Diese Verbindungen sind als Inhibitoren für eine sec7-Domäne aufweisende Proteine verwendbar, wobei die Proteine bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Guaninnukleotid-Austauschfaktoren, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guaninnukleotid-Austauschfaktoren für humane ADP-Ribosylierungsfaktoren, wie Gea1, Gea2, BlG1, BlG2 und/oder Cytohesine wie Cytohesin-1, Cytohesin-2, Cytohesin-3 und/oder Cytohesin-4.

Überraschender Weise wurde gefunden, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) und/oder (19) insbesondere für die Inhibition der Cytohesine verwendbar sind.

Ein Vorteil der Verbindungen liegt in bevorzugten Ausführungsformen darin, dass diese Verbindungen spezifisch an Cytohesine binden können. Insbesondere bei niedrigen Konzentrationen der Verbindungen, vorzugsweise im Bereich von 10 nM bis 10 μM, bevorzugt im Bereich von 500 nM bis 1 μM, können die Verbindungen an Cytohesine binden, während die Verbindungen an höhermolekulare Guaninnukleotid-Austauschfaktoren wie Gea1, Gea2, BlG1, BlG2 bei diesen Konzentrationen nicht oder nur in geringerem Umfang binden.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen können die Verbindungen, eine Spezifität für bestimmte Cytohesine aufweisen, beispielsweise kann Verbindung (12) vorteilhafter Weise bevorzugt an Cytohesin-1 gegenüber Cytohesin-2 binden.

Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (15), (16), (17), (18) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:

sind vorteilhafter Weise zur Herstellung von Inhibitoren, die zur Blockierung von wenigstens eine sec7-Domäne aufweisenden Proteinen geeignet.

Unter dem Begriff "Blockierung" wird in Sinne dieser Erfindung eine Bindung der Verbindungen (15), (16), (17), (18) an die sec7-Domäne der Proteine verstanden, die vorzugsweise zu einer Inhibition der eine sec7-Domäne aufweisenden Proteine, insbesondere der Cytohesine, führt.

Hierbei können die Strukturelemente, die die Verbindungen aufweisen, ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend R, R₁, R₂ R₃, und/oder R₄, Strukturelemente (A1), (B1), (C1), (D1), (E1), (F1), (G1), (H1), (I1), (J1), (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2), (H2), (I2), (J2), (K2), (A3), (B3), (C3), (D3), (E3), (F3), (G3), (H3), (I3), (J3), (K3), Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin, C1-C10-Alkoxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy, Aryl, Alkylen, Arylen, Amine, Halogen, Carboxylatderivate, Cycloalkyl, Carbonylderivate, Heterocycloalkyl, Heteroaryl, Heteroarylen, Sulphonat, Sulphat, Phosphonat, Phosphat, Phosphin und/oder Phosphinoxid, wobei wenn nicht anders angegeben, für:
Alkyl = lineares oder verzweigtes C₁-C₂₀-Alkyl, vorzugsweise Ethyl, Propyl, iso-Propyl, tert-Butyl, Butyl, Pentan.

Alkenyl = C₂-C₂₀-Alkenyl.

Alkinyl = C₂-C₂₀-Alkinyl.

Cycloalkyl = C₃-C₁₀-Cycloalkyl.

Alkoxy = C₁-C₆-Alkoxy.

Alkylen = Methylen; 1,1-Ethylen; 1,2-Ethylen; 1,1-Propyliden; 1,2-Propylen; 1,3-Propylen; 2,2-Propyliden; Butan-2-ol-1,4-diyl; Propan-2-ol-1,3-diyl; 1,4-Butylen; Cyclohexan-1,1-diyl; Cyclohexan-1,2-diyl; Cyclohexan-1,3-diyl; Cyclohexan-1,4-diyl; Cyclopentan-1,1-diyl; Cyclopentan-1,2-diyl; und/oder Cyclopentan-1,3-diyl.

Aryl = homo- oder hetero-Aromaten mit einem Molekulargewicht von ≤ 300.

Arylen = 1,2-Phenylen; 1,3-Phenylen; 1,4-Phenylen; 1,2-Naphtalenylen; 1,3-Naphtalenylen; 1,4-Naphtalenylen; 2,3-Naphtalenylen; 1-Hydroxy-2,3-phenylen; 1-Hydroxy-2,4-phenylen; 1-Hydroxy-2,5-phenylen; und/oder/oder 1-Hydroxy-2,6-phenylen.

Heteroaryl = Pyridinyl; Pyrimidinyl; Pyrazinyl; Triazolyl; Pyridazinyl; 1,3,5-Triazinyl; Quinolinyl. Isoquinolinyl; Quinoxalinyl; Imidazolyl; Pyrazolyl; Benzimidazolyl; Thiazolyl; Oxazolidinyl; Pyrrolyl; Carbazolyl; Indolyl; und/oder Isoindolyl.

Heteroarylen = Pyridindiyl; Quinolindiyl; Pyrazodiyl; Pyrazoldiyl; Triazolediyl; Pyrazindiyl; und/oder Imidazolediyl; insbesondere Pyridin-2,3-diyl; Pyridin-2,4-diyl; Pyridin-2,5-diyl; Pyridin-2,6-diyl; Pyridin-3,4-diyl; Pyridin-3,5-diyl; Quinolin-2,3-diyl; Quinolin-2,4-diyl; Quinolin-2,8-diyl; Isoquinolin-1,3-diyl; Isoquinolin-1,4-diyl; Pyrazol-1,3-diyl; Pyrazol-3,5-diyl; Triazole-3,5-diyl; Triazole-1,3-diyl; Pyrazin-2,5-diyl; und/oder Imidazole-2,4-diyl.

C1-C6-Heterocycloalkyl = Piperidinyl; Piperidine; 1,4-Piperazine, Tetrahydrothiophene; Tetrahydrofuran; 1,4,7-Triazacyclononan; 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan; 1,4,7,10,13-Pentaazacyclopentadecan; 1,4-Diaza-7-thiacyclononan; 1,4-Diaza-7-oxa-cyclononan; 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan; 1,4-Dioxane; 1,4,7-Trithiacyclononan; Pyrrolidin; und/oder Tetrahydropyran.

Heterocycloalkylen = Piperidin-1,2-ylen; Piperidin-2,6-ylen; Piperidin-4,4-yliden; 1,4-Piperazin-1,4-ylen; 1,4-Piperazin-2,3-ylen; 1,4-Piperazin-2,5-ylen; 1,4-Piperazin-2,6-ylen; 1,4-Piperazin-1,2-ylen; 1,4-Piperazin-1,3-ylen; 1,4-Piperazin-1,4-ylen; Tetrahydrothiophen-2,5-ylen; Tetrahydrothiophen-3,4-ylen; Tetrahydrothiophen-2,3-ylen; Tetrahydrofuran-2,5-ylen; Tetrahydrofuran-3,4-ylen; Tetrahydrofuran-2,3-ylen; Pyrrolidin-2,5-ylen; Pyrrolidin-3,4-ylen; Pyrrolidin-2,3-ylen; Pyrrolidin-1,2-ylen; Pyrrolidin-1,3-ylen; Pyrrolidin-2,2-yliden; 1,4,7-Triazacyclonon-1,4-ylen; 1,4,7-Triazacyclonon-2,3-ylen; 1,4,7-Triazacyclonon-2,9-ylen; 1,4,7-Triazacyclonon-3,8-ylen; 1,4,7-Triazacyclonon-2,2-yliden; 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradec-1,4-ylen; 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradec-1,8-ylen; 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradec-2,3-ylen; 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradec-2,5-ylen; 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradec-1,2-ylen; 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradec-2,2-yliden; 1,4,7,10-Tetraazacyclododec-1,4-ylen; 1,4,7,10-Tetraazacyclododec-1,7-ylen; 1,4,7,10-Tetraazacyclododec-1,2-ylen; 1,4,7,10-Tetraazacyclododec-2,3-ylen; 1,4,7,10-Tetraazacyclododec-2,2-yliden; 1,4,7,10,13-Pentaazacyclopentadec-1,4-ylen; 1,4,7,10,13-Pentaazacyclopentadec-1,7-ylen; 1,4,7,10,13-Pentaazacyclopentadec-2,3-ylen; 1,4,7,10,13-Pentaazacyclopentadec-1,2-ylen; 1,4,7,10,13-Pentaazacyclopentadec-2,2-yliden; 1,4-Diaza-7-thia-cyclonon-1,4-ylen; 1,4-Diaza-7-thia-cyclonon-1,2-ylen; 1,4-Diaza-7-thia-cyclonon-2,3-ylen; 1,4-Diaza-7-thia-cyclonon-6,8-ylen; 1,4-Diaza-7-thia-cyclonon-2,2-yliden; 1,4-Diaza-7-oxa-cyclonon-1,4-ylen; 1,4-Diaza-7-oxa-cyclonon-1,2-ylen; 1,4-Diaza-7-oxa-cyclonon-2,3-ylen; 1,4-Diaza-7-oxa-cyclonon-6,8-ylen; 1,4-Diaza-7-oxa-cyclonon-2,2-yliden; 1,4-Dioxan-2,3-ylen; 1,4-Dioxan-2,6-ylen; 1,4-Dioxan-2,2-yliden; Tetrahydropyran-2,3-ylen; Tetrahydropyran-2,6-ylen; Tetrahydropyran-2,5-ylen; Tetrahydropyran-2,2-yliden; 1,4,7-Trithia-cyclonon-2,3-ylen; 1,4,7-Trithia-cyclonon-2,9-ylen; und/oder 1,4,7-Trithia-cyclonon-2,2-yliden.

Heterocycloalkyl = Pyrrolinyl; Pyrrolidinyl; Morpholinyl; Piperidinyl; Piperazinyl; Hexamethylenimine; 1,4-Piperazinyl; Tetrahydrothiophenyl; Tetrahydrofuranyl; 1,4,7- Triazacyclononanyl; 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecanyl; 1,4,7,10,13-Pentaazacyclopentadecanyl; 1,4-Diaza-7-thiacyclononanyl; 1,4-Diaza-7-oxa-cyclononanyl; 1,4,7,10-Tetraazacyclododecanyl; 1,4-Dioxanyl; 1,4,7-Trithiacyclononanyl; Tetrahydropyranyl; und/oder Oxazolidinyl.

Amine = -N(R)2 worin jedes R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C6-Alkyl; C1-C6-Alkyl-C6H5; und/oder Phenyl, wobei beide R einen -NC3 bis -NC5 heterocyclischen Ringschluß ausbilden können.

Halogen = F; Cl; Br und/oder I, besonders bevorzugt F.

Sulphonat = -S(O)2OR, worin R = H; C1-C6-Alkyl; Phenyl; C1-C6-Alkyl-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; und/oder Ca ist.

Sulphat = -OS(O)2OR, worin R = H; C1-C6-Alkyl; Phenyl; C1-C6-Alkyl-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; und/oder Ca ist.

Sulphon: -S(O)2R, worin R = H; C1-C6-Alkyl; Phenyl; C1-C6-Alkyl-C6H5 und/oder Amine (zur Bildung von Sulphonamid) ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: -NR'2, worin jedes R' unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C6-Alkyl; C1-C6-Alkyl-C6H5; und/oder Phenyl, worin wenn beide R' = C1-C6-Alkyl die R' gemeinsam einen -NC3 bis -NC5 heterocyclischen Ringschluss ausbilden können.

Carboxylatderivate = -C(O)OR, worin R ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C20-Alkyl; Phenyl; C1-C6-Alkyl-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; und/oder Ca.

Carbonylderivate = -C(O)R, worin R ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C6-Alkyl; Phenyl; C1-C6-Alkyl-C6H5 und/oder Amin (zur Ausbildung von Amid) ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: -NR'2, worin R' unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C6-Alkyl; C1-C6-Alkyl-C6H5; und/oder Phenyl, worin wenn beide R' = C1-C6-Alkyl die R' gemeinsam einen -NC3 bis -NC5 heterocyclischen Ringschluss ausbilden können.

Phosphonat = -P(O)(OR)2, worin jedes R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C6-Alkyl; Phenyl; C1-C6-Alkyl-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; und/oder Ca.

Phosphat = -OP(O)(OR)2, worin jedes R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C6-Alkyl; Phenyl; C1-C6-Alkyl-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; und/oder Ca.

Phosphin = -P(R)2, worin jedes R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C6-Alkyl; Phenyl; C1-C6-Alkyl-C6H5.

Phosphinoxid = -P(O)R2, worin jedes R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C6-Alkyl; Phenyl; C1-C6-Alkyl-C6H5 und/oder Amin (zur Ausbildung von Phosphonamidat) ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: -NR'2, worin R' unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C6-Alkyl; C1-C6-Alkyl-C6H5; und/oder Phenyl, worin wenn beide R' = C1-C6-Alkyl, die R' gemeinsam einen -NC3 bis -NC5 heterocyclischen Ringschluss ausbilden können; steht.

Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin gelöst durch Verbindungen, die an wenigstens eine sec7-Domäne aufweisende Proteine binden, wobei die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze.

Cytohesine sind beispielsweise beteiligt an der Aktivierung von Integrinen. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass insbesondere durch die Inhibition der Cytohesine durch Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) und/oder (19) beispielsweise über eine Wechselwirkung der Cytohesine mit Integrinen, der Inhibition der Adhäsion von Leukozyten an Zelloberflächen und/oder einer Beeinflussung inflammatorischer Prozesse eine Verwendung dieser Verbindungen im Bereich der Medizin bei einer Vielzahl an Krankheitsbildern ermöglicht wird.

Ein großer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12) (13), (14) und/oder (19) zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen geeignet sind, die durch die Aktivität der Guaninnukleotid-Austauschfaktoren insbesondere der Cytohesine beinflußbar sind.

Zu diesen Erkrankungen zählen beispielsweise Krankheiten, bei welchen inflammatorische Prozesse eine Rolle spielen, Krebs- bzw. Tumorerkrankungen, allergische Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und/oder Erkrankungen bei welchen die Immunsuppression eine Rolle spielt.

Besonders vorteilhaft sind Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12) (13), (14) und/oder (19) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoide Arthritiden, Multiple Sklerose, Diabetes mellitus (Typ1), Psoriasis, Morbus Crohn, Allergien, Tumorerkrankungen, wie Lungen- oder Bronchialkrebs, Dick- oder Mastdarmkrebs, Prostatakrebs, Lymph- oder Blutkrebs, Harnblasenkrebs, Brustkrebs und/oder Gebärmutterkrebs und/oder Immunsuppression, beispielsweise in der Organtransplantation verwendbar.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an vorzugsweise wenigstens eine sec7-Domäne aufweisende Proteine binden, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst:

a) Herstellen einer vorzugsweise mit Fluorescein markierten RNA, umfassend die Schritte:
aa) optional Amplifizieren einer DNA-Sequenz
bb) optional Reinigung der amplifizierten DNA-Sequenz
cc) optional Transkription der DNA-Sequenz in eine RNA-Sequenz
dd) Markierung der RNA, vorzugsweise Markierung mit Fluorescein
ee) Reinigung der markierten RNA
b) Bestimmung der Polarisation der markierten RNA
c) Zugabe eines vorzugsweise wenigstens eine sec7-Domäne aufweisenden Proteins
d) Bestimmung der Polarisation des Komplexes aus Protein und markierter RNA
e) Zugabe der zu untersuchenden Verbindung
f) Bestimmung der Polarisation nach Zugabe der zu untersuchenden Verbindung.

Das Verfahren beruht vorzugsweise auf der Methode der Fluoreszenzpolarisation, wobei ein RNA-Molekül bevorzugt mit einem Fluoreszenzmarker wie Fluorescein markiert wird.

Zur Herstellung einer ausreichenden Menge verwendbarer RNA kann zunächst das der RNA-Sequenz entsprechende DNA-Molekül vervielfältigt werden. Das Amplifizieren einer DNA- Sequenz erfolgt vorzugsweise durch PCR-Reaktion. Die DNA kann in einem nächsten Schritt aufgearbeitet und/oder gereinigt werden, bevorzugt durch Phenol/Chloroform-Extraktion und/oder Ethanolfällung. Die DNA-Sequenz kann dann in eine RNA-Sequenz transkribiert werden.

In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens erfolgt die Markierung der RNA mit einem Fluorophor.

Bevorzugt wird die RNA in vitro in Anwesenheit der RNA-Polymerase aus Phage T7 transkribiert. In bevorzugten Ausführungsformen wird diese Transkription in Anwesenheit von Guanosin-5'-monophosphothioat, ausgeführt. Die Transkription führt zu einer Einführung einer Thiophosphatgruppe am 5'-Ende des RNA-Moleküls. Diese Thiolgruppe kann dann mit einem aktivierten Fluorophorreagenz, beispielsweise Fluorescein oder einem Fluorescein-Derivat wie 5-Iodoacetyl-Fluorescein reagieren.

In bevorzugten Ausführungsformen zeigen Fluorescein-markierte RNA-Moleküle eine geringe Polarisation. Unter dem Begriff "Polarisation" wird insbesondere eine Fluoreszenzpolarisation verstanden. Die Bestimmung der Polarisation der markierten RNA kann in einem Fluoreszenzpolarimeter erfolgen.

In einem nächsten Schritt wird ein vorzugsweise eine sec7-Domäne aufweisendes Protein zugegeben. Bevorzugte Proteine sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cytohesine wie Cytohesin-1, Cytohesin-2, Cytohesin-3 und/oder Cytohesin-4, bevorzugt Cytohesin-1. Das Protein kann ein natives Cytohesin-Protein sein, wie auch ein in vitro exprimiertes und aufgereinigten eine sec7-Domäne aufweisendes Protein und/oder Peptid.

Bindet das Protein an die markierte RNA steigt die Polarisation des gebildeten Komplexes aus Protein und markierter RNA gegenüber der der freien RNA. Die Polarisation des Komplexes aus Protein und markierter RNA kann in einem weiteren Schritt des Verfahrens bestimmt werden.

Anschließend wird die zu untersuchende Verbindung zugegeben. Ein Vorteil des Verfahrens wird dadurch verwirklicht, dass Verbindungen, die mit der RNA/Proteinbindung interferieren, die RNA von dem Protein verdrängen können und somit wieder ein geringeres Polarisationssignal erzeugen können.

Die Polarisation nach Zugabe der zu untersuchenden Verbindung kann gemessen werden. Vorteilhafter Weise kann eine Verbindung, die an das Protein bindet, durch ein Absinken des Polarisationssignals, insbesondere auf den Wert der Polarisation der freien RNA, detektiert werden.

In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens werden Reaktionsbedingungen gewählt, die RNA im Bereich von 1 nM bis 10 μM, vorzugsweise im Bereich von 10 nM bis 1 μM, Protein im Bereich von 10 nM bis 100 μM, vorzugsweise im Bereich von 100 nM bis 10 μM, und/oder zu untersuchende Verbindung im Bereich von 1 μM bis 10 mM, vorzugsweise im Bereich von 10 μM bis 1 mM, umfassen. Besonders bevorzugt sind Reaktionsbedingungen umfassend 100 nM RNA, 1 μM Protein und/oder 100 μM der zu untersuchenden Verbindung.

Das Verfahren ist in vorteilhaften Ausgestaltungen als Screening Assay mit einem hohen Durchsatz verwendbar. Dies ermöglicht die Untersuchung einer hohen Zahl an Verbindungen. In besonders vorteilhaften Ausgestaltungen weist das Verfahren einen z-Faktor, welcher einen Qualitätsfaktor für die Durchführbarkeit von Screening Verfahren darstellt, von 0,81 auf.

In bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA- und/oder RNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend M69-Aptamere, K61-Aptamere und/oder natürliche DNA und/oder RNA. Ein besonders bevorzugt verwendbares M69-Aptamer, welches die sec7-Domäne von Cytohesin-1 und Cytohesin-2 bindet ist beispielsweise in Mayer, G. et al., Proc Natl Acad Sci USA 98, 4961–5 (2001) beschrieben. Ein besonders bevorzugt verwendbares K61-Aptamer, welches spezifisch die sec7-Domäne von Cytohesin-2 bindet ist in Theis, M. G. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101, 11221–26 (2004) beschrieben.

Unter dem Begriff "Aptamere" werden im Sinne der Erfindung Peptide und/oder Oligonukleotide verstanden, die spezifisch mit zellulären Proteinen interagieren.

Beispiele und Figuren, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.
In den Figuren zeigt:
1 den spezifischen inhibitorischen Effekt der Verbindung (9) auf Cytohesin-abhängige Adhäsionsmechanismen in primären humanen Lymphozyten nach Stimulation mit dem monoklonalen Antikörper OKT3 und Phorbolester (PMA)
2 einen Kontrollversuch mit einer nicht inhibitorisch wirkenden Verbindung (Kontrolle 2) in primären humanen Lymphozyten nach Stimulation mit dem monoklonalen Antikörper OKT3
3 die DNA-Sequenz des M69-Aptamers, das als Template verwendbar ist, sowie die Sequenz der zur Amplifikation einsetzbaren Primer
Beispiel 1
Ermittelt wurde der IC₅₀-Wert für die Inhibierung der Austauschaktivität der sec7-Domänen verschiedener Guaninnukleotid-Austauschfaktoren der Verbindungen (9), (10), (11), (12), (14) und (19).
Hierzu wurden die sec7-Domänen von Cytohesin 1, Cytohesin 2 und Gea2 und das NΔ 17-ARF1, eine Mutante des ARF-Proteins, rekombinant in E. coli BL21DE3 exprimiert, nach Standardverfahren aufgereinigt und als Katalysatoren für den Austausch von GDP zu GTP bei GTPasen der Familie der ADP-Ribosylierungsfaktoren benutzt. Der Austausch von GDP zu GTP induziert einen Konformationswechsel des Ribosylierungsfaktors, wodurch die Fluoreszenz eines Tryptophan-Restes des Proteins erhöht wird.
In 50 mM HEPES, pH 7,4, 120 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 45 μM GTP S, wurden zu 1 μM NΔ 17-ARF1 und jeweils 1 μM der aufgereinigten sec7-Domäne von Cytohesin-1, Cytohesin-2 und Gea2 die Verbindungen (9), (10), (11), (12), (14) und (19) jeweils in Konzentrationen von 1 μM bis 30 μM zugegeben und die Fluoreszenz wurde in einem Varioskan, Thermo LifeSciences Inc., bei folgenden Wellenlängen gemessen: Anregung: 275 nm, Emission 340 nm.
Aus der Auftragung der Anfangssteigung des Fluoreszenzsignals gegen die zugebenen Konzentrationen der Verbindungen lässt sich der IC₅₀-Wert ermitteln. Der IC₅₀-Wert entspricht der Konzentration der Verbindungen bei der die Aktivität des Proteins auf die Hälfte reduziert ist. Je niedriger der IC₅₀-Wert ist, je stärker inhibiert die Verbindung die sec7-Domäne. Brefeldin A, ein spezifischer Inhibitor des hochmolekularen ADP-Ribosylierungsfaktors Gea2 diente als Kontrolle.
Wie aus der Tabelle 1 hervorgeht, zeigen die Verbindungen (9), (10), (11), (12), (14) und (19) insbesondere (9), (10), (11) und (12) eine spezifische Inhibition der sec7-Domänen der Cytohesine gegenüber der sec7-Domäne von Gea2, während die Referenzverbindung Brefeldin A eine spezifische Inhibition der sec7-Domäne von Gea2 zeigt.
Beispiel 2
Bestimmt wurde der IC₅₀-Wert gegenüber dem LC₅₀-Wert in einem Luciferase-Assay in HeLa-Zellen, entsprechend den in Theis, M. G. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101, 11221–26 (2004) beschriebenen Versuchsbedingungen. Die Stimulation von Rezeptortyrosinkinasen durch in fetalen Kälberserum enthaltenen Wachstumsfaktoren aktiviert den MAPK-Weg über Cytohesin 2 und resultiert in einer Aktivierung des Serum Response Elements. Diese Aktivierung zeigt sich in der Menge der in den Zellen produzierten Luciferase.
Verbindungen (9), (10), (11), (12), (14) und (19) wurden jeweils in Konzentrationen von 1 μM bis 50 μM zu 6,5 × 10⁴ HeLa-Zellen gegeben.
Die Tabelle 2 zeigt eine Gegenüberstellung der IC₅₀-Werte gegenüber den LC₅₀-Werten nach 24 Stunden. Die LC₅₀-Werte wurden durch einen MTT-Assay nach Standardverfahren bestimmt.
Der LC₅₀-Wert beschreibt hierbei die letale Konzentration, bei der nach einmaliger Zugabe innerhalb von 24 Stunden 50% der Zellen starben.
Der IC₅₀-Wert wurde aus der Auftragung der Konzentration der Verbindung gegen die Intensität des Luciferasesignals bestimmt.
Als negative Kontrolle diente die folgende Verbindung (Kontrolle 1):
(Kontrolle 1)
Wie aus der Tabelle 2 hervorgeht, zeigten die Verbindungen (9), (10), (11), (12), (14) und (19) insbesondere (9), (10), (11) und (12) eine sehr gute Inhibition von Cytohesin 2 bei geringen Konzentrationen, während eine Toxizität nach 24 Stunden erst bei sehr hohen Konzentrationen auftrat.
Beispiel 3
Humane periphere Blutzellen (PBL) wurden mit Agonisten stimuliert, die eine beta-2 Integrin-abhängige Adhäsion aktivieren. In diesen primären humanen Lymphozyten kann die beta-2 Integrin-abhängige Adhäsion an seinen spezifischen Liganden ICAM-1 durch Cytohesine aktiviert werden.
Als Agonisten dienten der monoklonale Antikörper OKT3 (Hybridom von ATCC, mAb OKT3 gereinigt an Protein A, nach Standardmethoden aus Current Protocols in Immunology, 5th Ed., Coligan et al., Edts, Wiley 2004) gegen den CD3-Komplex, einen T-Zell Rezeptor, und Phorbolester (PMA), der intrazelluläre Signalkaskaden in humanen PBL unter Einbezug von Integrin-abhängiger Adhäsion unter Umgehung von Cytohesinen unphysiologisch aktiviert.
Zellen aus humanem Blut wurden nach Standard-Methoden (Current Protocols in Immunology, Sth Ed., 2004, Coligan et al., Edts, Wiley) isoliert. Mit ICAM-1 beschichtete Zellkulturschalen wurden mittels rekombinantem ICAM-1-Fc Fusionsprotein hergestellt (Kolanus, W. et al., Cell 86, 233–42 (1996), Geiger, C. et al., EMBO J., 19, 2525–2536 (2000)). 300.000 humane periphere Blutzellen (PBL) wurden für 30 Minuten mit 2 μg/ml OKT3 oder 40 ng/ml Phorbolester (PMA) in Hank's BSS, (Gibco; Zusammensetzung (g/l): CaCl₂ × 2H₂O (0,185), KCl (0,4), KH₂PO₄ (0,06), MgCl₂ × 6H₂O (0,1), MgSO₄ × 7H₂O (0,1), NaCl (8,0), NaHCO₃ (0,35), Na₂HPO₄ (0,048), D-Glucose (1,0)), stimuliert, und für eine Stunde in Hank's BSS auf die ICAM-1 beschichteten Zellkulturschalen gegeben, wobei die Agonist nicht entfernt wurden. Nichtgebundene Zellen wurden durch Waschen mit Hank's BSS entfernt. Der Prozentanteil gebundener Zellen wurde durch Auszählen unter dem Mikroskop mittels eines Standardzählrasters ermittelt.
Wie aus 1 zu entnehmen ist, inhibierte die Verbindung (9) die Adhäsion der humanen peripheren Blutzellen (PBL) an ICAM-1 in einer konzentrationsabhängigen Weise. Der IC₅₀-Wert lag bei ca. 500 nM bis 1 μM. Wie aus der 1 weiterhin ersichtlich ist, zeigte sich der inhibitorische Effekt nur bei mit OKT3 stimulierten Zellen, während durch Phorbolester (PMA) aktivierte Zellen nicht durch die Verbindung (9) beeinflusst wurden. Dies zeigt die hohe Spezifität der Verbindung (9) gegenüber Cytohesin-abhängigen Adhäsionsmechanismen.
Die Spezifität der Inhibition der OKT3-vermittelten Adhäsion in primären humanen Lymphozyten durch Verbindung (9) zeigt ebenfalls die 2. 2 zeigt, dass eine Kontrollverbindung (Kontrolle 2) keinen Effekt auf dieses System ausübte.
(Kontrolle 2)
Beispiel 4
Fuoreszenzpolarisations-Assay
Die in 3 gezeigte DNA-Sequenz des M69-Aptamers wurde unter Verwendung der ebenfalls abgebildeten Primer mittels PCR amplifiziert. Hierbei wurden 0,01 μM, DNA- Template, jeweils 1 μM 3'- und 5'-Primer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP-Mix, und Taq-Polymerase verwendet.
Das verwendete PCR-Programm umfasste die folgenden Schritte
Die DNA wurde einer Phenol/Chloroform-Extraktion nach Standardmethoden unterzogen und in Ethanol gefällt, bevor diese für 4 Stunden bei 37°C in Anwesenheit von 20 mM Guanosin-5'-monophosphothioat, T7-RNA-Polymerase transkribiert wurde. Die RNA wurde anschließend mittels Ethanol ausgefällt, in DEPC-Wasser gelöst und über eine G25-Säule (Amersham Biosciences) gereinigt.
10 μM RNA wurde mit 1 × labelling-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA), 2 M Urea und Wasser für 3 min auf 95°C erhitzt, anschließend für 10 Minuten abkühlen gelassen. 2,5 mg aktiviertes 5-Iodoacetyl-Fluorescein wurden in 500 μM DMF gelöst, und zu den Ansätzen gegeben. Die Mischung wies eine Konzentration von 2 mM 5-Jodoacetyl-Fluorescein auf. Diese Mischung wurde 2 Stunden bei 37°C unter leichtem Schütteln unter Alufolie inkubiert. Anschließend wurden 3 Volumen 100% Ethanol zugefügt, 1/10 Volumen 3 M NaOAc, pH 5,4 und 1 μl Glykogen zugegeben und für 20 Minuten bei –80°C inkubiert, bevor für 20 Minuten bei 14000 rpm bei 4°C zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde mit 100 μl 70% Ethanol gewaschen und in 20 μl DEPC-Wasser gelöst.
Anschließend wurde die RNA in einem 8%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, die RNA aus dem Gel in 500 μl 0,3 M NaOAc-Lösung für 1,5 Stunden bei 65°C eluiert, durch eine mit Glaswolle gefüllte Spritze filtriert, mit Ethanol gefällt und in DEPC-Wasser gelöst.
Das Reaktionsvolumen der Fluoreszenzpolarisationsmessungen betrug 50 μl PBS, pH 7,4, 3 mM MgCl₂. Die Messungen wurden in 384-well-Platten (Greiner BioOne) in einem Polarimeter Typ Ultra, TECAN, bestimmt, Anregung: 485 nm, Emission: 535 nm. Der z-Faktor betrug 0,81. Bestimmt wurde die Fluoreszenzpolarisation der Fluorescein-markierten RNA, die Fluoreszenzpolarisation nach Zugabe aufgereinigten sec7-Domäne von Cytohesin-1, Cytohesin 1-sec7, (vgl. Beispiel 1), und die Fluoreszenzpolarisation nach Zugabe der jeweiligen zu untersuchenden Verbindung.
Die Konzentrationen der einzelnen Messungen betrugen:

M69 100 nM

Cytohesin 1-sec7 1 μM

Verbindung 100 μM.
Alle Messungen wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.

Claims

Arzneimittel umfassend Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
worin: R ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin, C1-C10-Alkoxy und/oder ein Strukturelement (A1), (B1), (C1), (D1), (E1), (F1), (G1), (H1), (I1), (J1) wie nachstehend angegeben:

worin: R₄ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin und/oder C1-C10-Alkoxy.
Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
worin: R₁ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₂, R₃ und/oder ein Strukturelement (A2), (B2), (C2), (D2) wie nachstehend angegeben:
R₂ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₃ und/oder ein Strukturelement (E2), (F2), (G2), (H2), (I2), (J2), (K2) wie nachstehend angegeben:
R₃ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₂, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin und/oder C1-C10-Alkoxy.
Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
worin: R₁ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₂, R₃ und/oder ein Strukturelement (A3), (B3), (C3), (D3) wie nachstehend angegeben:
R₂ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₃ und/oder ein Strukturelement (E3), (F3), (G3), (H3), (I3), (J3), (K3) wie nachstehend angegeben:
R₃ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R₁, R₂, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(C1-C10-Alkyl), CONH₂, CONH(C1-C10-Alkyl), CON(C1-C10-Alkyl)₂, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, und/oder C1-C10-Alkoxy.
Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel Dimere, Trimere und/oder Oligomere aufweist, die wenigstens eines oder mehrere der Monomere ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12) (13) und/oder (14) aufweisen.
Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Monomere ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) zur Bildung von Dimeren, Trimeren und/oder Oligomeren über Ether-, Ester-, Alkin-, Amid-, Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Alkoxy-, Alkylen-, Aryl-, Arylen- und/oder Ethylenglycol-Gruppen zumindest teilweise miteinander verbunden sind.
Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel, bezogen auf eine Tagesdosis, 10 nM bis 100 μM, vorzugsweise 100 nM bis 10 μM, bevorzugt 1 μM bis 10 μM, besonders bevorzugt 1 μM bis 3 μM Verbindung(en) ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze umfasst.
Verwendung von Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze als Inhibitoren für wenigstens eine sec7-Domäne aufweisende Proteine.
Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Guaninnukleotid-Austauschfaktoren, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guaninnukleotid-Austauschfaktoren für humane ADP-Ribosylierungsfaktoren, wie Gea1, Gea2, BlG1, BlG2 und/oder Cytohesine wie Cytohesin-1, Cytohesin-2, Cytohesin-3 und/oder Cytohesin-4.
Verwendung von Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (15), (16), (17), (18) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
zur Herstellung von Inhibitoren, die zur Blockierung von wenigstens eine sec 7-Domäne aufweisenden Proteinen geeignet sind.
Verbindungen, die an wenigstens eine sec 7-Domäne aufweisende Proteine binden, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze.
Verwendung von Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12) (13) und/oder (14) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoide Arthritiden, Multiple Sklerose, Diabetes mellitus (Typ1), Psoriasis, Morbus Crohn, Allergien, Tumorerkrankungen, wie Lungen- oder Bronchialkrebs, Dick- oder Mastdarmkrebs, Prostatakrebs, Lymph- oder Blutkrebs, Harnblasenkrebs, Brustkrebs und/oder Gebärmutterkrebs und/oder Immunsuppression, beispielsweise in der Organtransplantation.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an vorzugsweise wenigstens eine sec 7-Domäne aufweisende Proteine binden, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst: a) Herstellen einer vorzugsweise mit Fluorescin markierten RNA, umfassend die Schritte: aa) optional Amplifizieren einer DNA-Sequenz bb) optional Reinigung der amplifizierten DNA-Sequenz cc) optional Transkription der DNA-Sequenz in eine RNA-Sequenz dd) Markierung der RNA, vorzugsweise Markierung mit Fluorescin ee) Reinigung der markierten RNA b) Bestimmung der Polarisation der markierten RNA c) Zugabe eines vorzugsweise wenigstens eine sec 7-Domäne aufweisenden Proteins d) Bestimmung der Polarisation des Komplexes aus Protein und markierter RNA e) Zugabe der zu untersuchenden Verbindung f) Bestimmung der Polarisation nach Zugabe der zu untersuchenden Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA- und/oder RNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend M69-Aptamere, K61-Aptamere und/oder natürliche DNA und/oder RNA ist.