DE10031932A1 - Calpain-Protease 12 - Google Patents

Abstract

Calpain-Protease 12 (Capn12), dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aminosäuresequenz, umfassend die Aminosäuren 1-342 der SEQ ID NO: 1 oder eine Aminosäuresequenz ausgewählt unter SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 aufweist; sowie deren funktionale Analoge; dafür kodierende Nukleinsäuren; rekombinante Vektoren, welche diese kodierenden Sequenzen enthalten; damit transfizierte Mikroorganismen; Verfahren zur rekombinanten Herstellung der Capn12; und verschiedene Anwendungen der Capn12 und dafür kodierender Nukleinsäuren.

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Calpain-Protease mit der Be­ zeichnung Calpain-Protease 12 und funktionale Analoge davon (im Folgenden bezeichnet als Capn12); dafür kodierende Nukleinsäuren; rekombinante Vektoren, welche diese kodierenden Sequenzen enthal­ ten; damit transfizierte Mikroorganismen; Verfahren zur rekombi­ nanten Herstellung der Capn12; sowie verschiedene Anwendungen der Capn12 und dafür kodierender Nukleinsäuren.

Calpaine sind eine Familie cytosolischer Cystein-Proteasen. Die klassischen Calpaine bestehen aus einer isoformspezifischen gro­ ßen Untereinheit (80 kDa) und einer unveränderlichen kleinen Un­ tereinheit (30 kDa), die Capn4 genannt wird. Die große Unterein­ heit klassischer Calpaine weist eine Vier-Domänen-Struktur auf, umfassend eine Domäne mit Proteaseaktivität und eine C-terminale, Calmodulin-ähnliche Domäne, die Calcium binden kann. Man fand je­ doch kürzlich mehrere atypische Säugetierhomologe der großen Cal­ pain-Untereinheit, denen die Kennzeichen eines aktiven Zentrums einer Protease fehlten (Capn6; Dear et al., 1997) und/oder die eine alternative C-terminale Domäne aufweisen, die möglicherweise kein Calcium bindet (Capn5, Capn6, Capn7, Capn8; Dear et al., 1997; Braun et al., 1999; Franz et al., 1999). Eine Zusammenfas­ sung der gegenwärtig bekannten Mitglieder der Genfamilie der Säu­ getier-Calpaine ist im Internet erhältlich (http:/ /Ag.Arizo­ na.Edu/calpains).

Die physiologische Rolle der Calpaine ist unklar. Calpaine spal­ ten zahlreiche Substrate (Carafoli und Molinari, 1998) und wurden mit einer Vielzahl von Prozessen in Zusammenhang gebracht, ein­ schließlich Apoptose (Wang, 2000), Zellteilung (Mellgren, 1997), Modulation der Interaktionen des Integrin-Cytoskeletts (Schoenwa­ elder et al., 1997) und synaptische Plastizität (Chan und Matt­ son, 1999). Sie wurden außerdem mit zahlreichen pathologischen Krankheitszuständen in Verbindung gebracht, wie Alzheimer, Kata­ rakt, Demyelinisierung, kardiale Ischämie, Entzündung und trauma­ tische Hirnverletzung (Übersichtsartikel: Carafoli und Molinari, 1998; Sorimachi et al., 1997; Wang und Yuen, 1997). Mutationen im Capn3-Gen sind für die Beckengürtel-Muskeldystrophie Typ 2A ver­ antwortlich (Richard et al., 1995).

Aufgrund der vielfältigen physiologischen und pathologischen Funktionen der Calpaine, stellte sich die Aufgabe, neue Homologe der Gen-Familie der großen Calpain-Untereinheit bereitzustellen. Damit ließen sich beispielsweise neue Wirkstoffe bzw. neue Wirk­ stofftargets finden oder entwickeln, die bei der Diagnose, Thera­ pie und/oder Prophylaxe von Krankheitszuständen einsetzbar sind, in die Calpaine und deren Substrate oder auf diese wirkende Stoffe involviert sind. Diese Aufgabe wurde überraschenderweise durch die Bereitstellung einer neuen Calpain-Protease, der Cal­ pain-Protease 12 (Capn12) und funktionalen Äquivalenten davon, gelöst.

Die Capn12 ist dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aminosäurese­ quenz, umfassend die Aminosäuren 1-342 der SEQ ID NO: 1 auf­ weist. Gegenstand der Erfindung sind auch funktionale Äquivalente dieser Teilsequenz.

Bevorzugte Varianten davon sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz ausgewählt unter SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 aufweisen. SEQ ID NO: 1 steht für die Aminosäuresequenz der Splice-Variante Capn12A, SEQ ID NO: 2 für die Aminosäuresequenz der Splice-Variante Capn12B, SEQ ID NO: 3 für die Aminosäuresequenz der Splice-Variante Capn12C und SEQ ID NO: 4 für die Aminosäuresequenz der Capn12 aus Klon 914413 der Maus-EST-Datenbank. Dabei sind die Aminosäuresquenzen SEQ ID NO: 1 bis 4 im N-terminalen Abschnitt der Aminosäuren 1-342 zu­ eineinander identisch. Das vorhergesagte Protein entsprechend der Splice-Variante Capn12A weist 720 Aminosäuren und ein Molekular­ gewicht von 80,5 kDa auf.

Gegenstand der Erfindung sind auch die funktionalen Äquivalente der Capn12 bzw. der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen. Funktionale Äquivalente umfassen Aminosäuresequenzen, die sich von den konkreten Sequenzen ableiten lassen und in denen im Ver­ gleich dazu eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, dele­ tiert, invertiert oder addiert sind, ohne dass die Cystein-Pro­ tease-Aktivität und/oder wenigstens ein weiteres Charakteristikum der Capn12 im Wesentlichen beeinflusst werden. Weitere Capn12-Charakteristika werden in späteren Abschnitten beschrie­ ben. Erfindungsgemäß umfasst sind auch Capn12-charakteristische Teilsequenzen oder Fragmente der Capn12, die beispielsweise durch proteolytischen Verdau, Peptidsynthese oder rekombinante DNA- Technik herstellt werden können. Diese können beispielsweise zur Herstellung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper verwendet werden.

Die konkret offenbarten Aminosäuresequenzen repräsentieren Amino­ säuresequenzen von Splice-Varianten der Capn12, die aus einer Maus-EST-Datenbank bestimmt wurden. Gegenstand der Erfindung sind jedoch auch alle Capn12-Homologe eukaryontischer Spezies, d. h. der Evertebraten und Vertebraten, insbesondere der Säugetiere, z. B. Ratte, Katze, Hund, Schwein, Schaf, Rind, Pferd, Affe und besonders bevorzugt Mensch und weitere natürlich vorkommende Va­ rianten. Erfindungsgemäß umfasst sind auch alle entwicklungs- und organ- bzw. gewebespezifisch exprimierte Capn12-Formen und künst­ lich erzeugte Homologe, die die vorgegebenen strukturellen und/­ oder funktionalen Eigenschaften aufweisen.

Die erfindungsgemäße Capn12 ist insbesondere dadurch gekennzeich­ net, dass sie Cystein-Protease-Aktivität aufweist. Sie weist in ihrer Aminosäuresequenz die Aminosäuren Cys, His und Asn auf (in den Splice-Varianten Capn12A, B und C: Cys105, His259 und Asn283), die für das aktive Zentrum von Cystein-Proteasen charak­ teristisch und für dessen Funktion wesentlich sind. Die Splice- Variante Capn12A weist darüber hinaus eine ausgeprägt saure Re­ gion und eine Calmodulin-ähnliche, vermutlich Ca²⁺-bindende Region auf.

Die erfindungsgemäße Capn12 ist außerdem dadurch gekennzeichnet, dass das sie kodierende Gen der Maus auf dem Chromosom 7 zwischen den Markern D7Mit72 (10,4 cM) und D7Mit267 (11,0 cM) lokalisiert ist.

Die erfindungsgemäße Capn12 ist außerdem dadurch gekennzeichnet, dass sie, z. B. in der Maus, im Cortex des Haarfollikels der Haut exprimiert wird.

Weiterhin ist die erfindungsgemäße Capn12 dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Anagenphase des Haarzyklus exprimiert wird.

Gegenstand der Erfindung sind auch Calpain-Proteine, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie wenigstens eine erfindungsgemäße Capn12 aufweisen. Vorzugsweise weist ein solches Calpain-Protein neben der Capn12 als große Untereinheit noch eine Capn4 als kleine Protein-Untereinheit auf. Darüber hinaus können noch wei­ tere Protein-Untereinheiten, wie beispielsweise regulatorische Untereinheiten oder Untereinheiten, die die Lokalisation des Pro­ teins in definierten Zellkompartimenten vermitteln, enthalten sein.

Weiterhin umfasst die Erfindung auch Polynukleotide, die für eine erfindungsgemäße Capn12 kodieren, sowie deren funktionale Äquiva­ lente und damit hybridisierbare oder dazu komplementäre Polynu­ kleotide, umfassend einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Se­ quenzen. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Bibliotheken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschlie­ ßend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermeh­ rung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.

Gegenstand der Erfindung sind auch Polynukleotide mit einer Nu­ kleinsäuresequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, Seq ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 5 steht für die Nu­ kleinsäuresequenz der cDNA der Splice-Variante Capn12A, SEQ ID NO: 6 für die Nukleinsäuresequenz der cDNA der Capn12B, SEQ ID NO: 7 für die Nukleinsäuresequenz der cDNA der Capn12C und SEQ ID NO: 8 für die genomische Nukleinsäuresequenz der Capn12 der Maus, umfassend alle Exon- und Intron-Sequenzen. Die vorhergesagte ge­ nomische Sequenz der Capn12 der Maus umfasst 21 Exons und einen genomischen Abschnitt von 13116 Basenpaaren.

Funktionale Äquivalente erfindungsgemäßer Polynukleotide umfassen durch Degeneration des genetischen Codes abgeleitete Sequenzen und damit stumme Nukleotidsubstutionen (d. h. ohne Veränderungen der resultierenden Aminosäuresequenz) und konservative Nukleotid­ substutionen (d. h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt). Funktionale Äquivalente erfindungsgemäßer Polynukleo­ tide weisen somit eine durch Nukleotidsubstitution, -deletion, -inversion oder -addition veränderte Sequenz auf, kodieren jedoch ebenfalls für eine funktional äquvalente Capn12, wie z. B. mit gleicher oder vergleichbarer Cystein-Protease-Aktivität. Insbe­ sondere umfassen erfindungsgemäß geeignete Polynukleotide wenig­ stens eine der Teilsequenzen, welche für charakteristische Amino­ säuresequenzen der Capn12 kodieren.

Gegenstand der Erfindung sind auch die Primersequenzen SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18, die an erfin­ dungsgemäße Polynukleotide hybridisieren können bzw. komplementär dazu sind und beispielsweise zu deren Amplifikation durch RT-PCR oder PCR eingesetzt werden können.

Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide hybridisieren zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu müssen die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch anein­ ander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonu­ kleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Nort­ hern-Blot-Technik die Verwendung einer 50-70°C, vorzugsweise 60-65°C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1x SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspe­ zifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nu­ kleinsäuren aneinander gebunden.

Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, die we­ nigstens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfassen, das mit wenigstens einer regulatorischen Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft ist. Vorzugsweise liegt 5'-strangaufwärts vom erfin­ dungsgemäßen Polynukleotid eine Promotorsequenz und ermöglicht auf diese Weise eine kontrollierte Expression der Capn12. Beson­ ders bevorzugt liegen 3'-strangabwärts vom erfindungsgemäßen Po­ lynukleotid eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulatorische Elemente, und zwar jeweils operativ ver­ knüpft mit der die Capn12 kodierenden Sequenz.

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung regulatorischer und kodierender Sequenzen, wie z. B. von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls wei­ terer regulatorischer Elemente derart, sodass jedes der regulato­ rischen Elemente seine Funktion vor, während oder nach Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für weitere operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Se­ quenzen, Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylierungssi­ gnale und dergleichen. Brauchbare regulatorische Elemente umfas­ sen auch selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikati­ onsursprünge und dergleichen.

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die na­ türliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürli­ che Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Die Expressionskassette kann aber auch einfacher aufgebaut sein, d. h. es werden keine zu­ sätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht ent­ fernt. Stattdessen kann beispielsweise die natürliche Regulati­ onssequenz so mutiert werden, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nu­ kleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette enthalten sein.

Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder im 1-PL-Promotor, die vorteilhafter­ weise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung indu­ zierbarer Promotoren, wie z. B. licht- und insbesondere temperatu­ rinduzierbarer Promotoren, wie der P_rP_l-Promotor.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula­ tionssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch syn­ thetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Ex­ pression der Nukleinsäuresequenzen und die Proteinexpression er­ möglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus be­ deuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überex­ primiert wird, oder dass es sofort exprimiert oder überexprimiert wird. Die Expression kann durch diese regulatorischen Elemente auch gewebe-, zell- oder entwicklungsspezifisch erfolgen, wenn der Vektor in einen höheren Organismus, wie in ein Tier oder eine Pflanze, eingebracht wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs­ weise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf Transkriptivnsebene erfolgen, in­ dem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhan­ cer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöht wird. Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken.

Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette er­ folgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einem geeigne­ ten die Capn12 kodierenden Polynukleotid, sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekom­ binations- und Klonierungstechniken, wie beispielsweise die In­ sertion über Restriktionsenzymschnittstellen, oder wie sie bei­ spielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecu­ lar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Har­ bor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pu­ blishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Gegenstand der Erfindung sind auch rekombinante Vektoren zur Transformation von eukaryontischen oder prokaryontischen Wirten, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid oder eine erfindungsge­ mäße Expressionskassette tragen. Diese Vektoren erlauben die Ex­ pression der Capn12 in einem geeigneten Wirtsorganismus. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Hrsg, Elsevier, Amster­ dam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind neben Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vekto­ ren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Plasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus oder chromosomal repliziert werden.

Gegenstand der Erfindung sind auch Mikroorganismen, die einen er­ findungsgemäßen Vektor enthalten oder solche, die die Capn12 en­ dogen exprimieren. Diese können zur Produktion rekombinanter Capn12 eingesetzt werden. Vorteilhafterweise werden die oben be­ schriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionskassetten als Teil eines Expressionsvektors in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fach­ mann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden verwendet, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfu­ sion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispiels­ weise in Current Protocols in Molecular Biology, F, Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997 und in J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Ma­ nual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY (1980), beschrieben.

Als Wirtsorganismen zur Transformation mit erfindungsgemäßen Vek­ toren sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expres­ sion der erfindungsgemäßen Polynukleotide, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Orga­ nismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, insbesondere Hefen wie Saccharomy­ ces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryontische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen. Ge­ wünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen wie transgenen Tieren, wie insbesondere Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knock-Out- Tiere oder -Pflanzen handeln, in denen das korrespondierende en­ dogene Gen ausgeschaltet wurde, wie z. B. durch Mutation oder par­ tielle oder vollständige Deletion.

Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expres­ sionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farb­ gebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformier­ ten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zell­ sortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor trans­ formierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikare­ sistenzgen (z. B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden se­ lektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.

Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie bei­ spielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter-System, die Phagen X, µ oder andere temperente Phagen oder Transposons und/ oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bildet ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff "Expres­ sionssystem" die Kombination aus Säugetierzellen, wie CHO-Zellen, und Vektoren, wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geei­ gnet sind, zu verstehen.

Wie oben beschrieben, kann das Genprodukt vorteilhaft auch in transgenen Tieren, z. B. Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden. Ebenso ist es möglich, zellfreie 1 Translationssysteme mit der von der Nukleinsäure abgeleiteten RNA zu programmieren.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Capn12, wobei man einen Capn12-produzie­ renden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Capn12 induziert und die Capn12 aus der Kultur isoliert. Die Capn12 kann so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Der Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 400C und einem pH- Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) be­ schrieben.

Die Zellen werden dann, falls Capn12 nicht in das Kulturmedium sezerniert wird, aufgeschlossen und die Capn12 nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination meh­ rerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Capn12 kann mit bekannten, chromatographi­ schen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie, Ionenaustausch- Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussal­ zen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsme­ thoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Sco­ pes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidel­ berg, Berlin beschrieben.

Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z. B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epi­ tope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (be­ schrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibo­ dies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem üb­ liche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer erfin­ dungsgemäßen Capn12 oder eines erfindungsgemäßen Calpain-Proteins als Cystein-Protease. Bevorzugt ist die Verwendung in Verbindung mit natürlichen Substraten der Capn12, es können jedoch alle Sub­ strate verwendet werden, die an das aktive Zentrum der Capn12 binden und dort gespalten werden. Die Capn12 kann so beispiels­ weise als Cystein-Protease in molekularbiologischen und chemi­ schen Verfahren eingesetzt werden.

Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus pharmazeutische Mit­ tel, die eine erfindungsgemäße Capn12, ein erfindungsgemäßes Cal­ pain-Protein oder einen erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor, sowie wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthalten. Die erfindungsgemäße Capn12, das erfindungsgemäße Calpain-Protein oder der Vektor können als sol­ che, vorzugsweise jedoch zusammen mit einem Träger oder Verdün­ nungsmittel verabreicht werden. Dieser Träger kann abhängig von der gewünschten Dosierungsform in fester oder flüssiger Form vor­ liegen. Geeignete pharmazeutische Mittel können außerdem neben einer erfindungsgemäßen Capn12, einem erfindungsgemäßem Calpain- Protein oder einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor ge­ wünschtenfalls noch weitere pharmazeutische Wirkstoffe im Gemisch oder getrennt in einem Kombinationspräparat enthalten. Bespiels­ weise können solche Wirkstoffe die Wirkung der enthaltenen Capn12, des Calpain-Proteins oder des Vektors verstärken, einen anderen Wirkmechanismus aufweisen und damit additiv wirken oder die Gesamtkonstitution des Patienten verbessern.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer er­ findungsgemäßen Capn12, eines erfindungsgemäßen Caplain-Proteins oder eines erfindungsgemäßen Vektors zur Herstellung eines Medi­ kaments zur Behandlung von Krankheiten oder Krankheitszuständen, die in Zusammenhang mit einer unzureichenden Expression der Capn12 stehen. Dabei umfasst eine erfindungsgemäße Behandlung die Verhinderung der Ausbildung der Erkrankung bei einem Patienten mit einer entsprechenden Prädisposition oder die Therapie einer bereits bestehenden Erkrankung durch verlangsamtes Fortschreiten oder sogar durch Verbesserung des Zustandes des Patienten, mögli­ cherweise bis zum völligen Ausheilen.

In Situationen, in denen ein Mangel an Capn12 herrscht, können mehrere Verfahren zur Substituierung eingesetzt werden. Zum einen kann in einem erfindungsgemäßen Medikament eine Capn12 oder ein erfindungsgemäßes Calpain-Protein direkt oder gentherapeutisch in Form ihrer kodierenden Nukleinsäuren (DNA oder RNA) appliziert werden. Zur gentherapeutischen Anwendung können beliebige Vehi­ kel, beispielsweise sowohl virale (retrovirale Transfektion), als auch nicht-virale Vehikel (z. B. Liposomen-Transfektion) zum Ein­ satz kommen. Geeignete Vehikel können über geeignete Rezeptormo­ leküle oder dergleichen spezifisch an genau definierte Zielzellen binden und diese gezielt transformieren. Die Transfektion kann im Körper des Patienten erfolgen oder es werden entnommene Zellen in-vitro transfektiert und nachfolgend wieder dem Patienten ap­ pliziert. Geeignete Verfahren werden beispielsweise von Strauss und Barranger in Concepts in Gene Therapy (1997), Walter de Gruy­ ter, Hrsg., beschrieben. Ein weiteres Verfahren zur Capn12-Sub­ stitution stellt die Stimulation des endogenen, körpereigenen Gens dar. Auch der turn-over oder die Inaktivierung erfindungsge­ mäßer Capn12, z. B. durch Proteasen, können blockiert werden, um eine erhöhte Zahl aktiver Capn12-Moleküle zu erreichen. Schließ­ lich können Agonisten der Capn12 zum Einsatz gelangen, um die Ak­ tivität vorhandener Capn12-Moleküle zu steigern. Bei verminderter Capn12-Expression kann dies nur ein die Therapie unterstützendes Verfahren sein.

Erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel oder Medikamente können in Form von Tabletten, Granulaten, Pulver, Dragees, Pastillen, Pellets, Kapseln, Zäpfchen, Lösungen, Emulsionen und Suspensionen zur enteralen und parenteralen Verabreichung vorliegen. Vorzugs­ weise können erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel in Gelen, Lotionen und Cremes zur kutanen Applikation enthalten sein.

Die jeweilige Dosierung erfindungsgemäßer pharmazeutischer Mittel oder Medikamente und der jeweilige Dosierungsplan obliegen der Entscheidung des behandelnden Arztes. Dieser wird in Abhängigkeit vom gewählten Verabreichungsweg, von der Wirksamkeit des jeweili­ gen Medikaments, von der Art und Schwere der zu behandelnden Er­ krankung, von dem Befinden des Patienten und dessen Ansprechen auf die Therapie eine geeignete Dosis und einen geeigneten Dosie­ rungsplan auswählen. So können z. B. die pharmakologisch wirksamen Substanzen an ein Säugetier (Mensch und Tier) in Dosen von etwa 0,5 mg bis 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht wer­ den. Sie können in Einzeldosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden.

Die Anwendungsgebiete umfassen Krankheiten und Krankheitszustände die im Zusammenhang mit einer unzureichenden Capn12-Expression stehen.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung einer erfin­ dungsgemäßen Capn12 oder eines erfindungsgemäßen Calpain-Proteins zum Screening auf Calpain-Protease-Effektoren. Unter Calpain-Pro­ tease-Effektoren sind beispielsweise Substanzen zu verstehen, die die Aktivität der Capn12 und/oder anderer Calpaine beeinflussen können, wie Aktivatoren oder Inhibitoren, oder solche, die auf die Substrate der Capn12 während der enzymatischen Katalyse wir­ ken können oder Capn12-bindende Moleküle, wie Immunglobuline oder niedermolekulare Capn12-bindende Moleküle, die ebenfalls die bio­ logische Funktion der Capn12 modulieren können. Unter Capn12-bin­ denden Molekülen versteht man alle natürlichen und synthetischen Liganden und Interaktionspartner der Capn12.

In einem geeigneten Screening-Verfahren wird beispielsweise die Capn12 oder ein erfindungsgemäßes Calpain-Protein mit einem Ana­ lyten inkubiert, welcher einen Effektor einer physiologischen oder pathologischen Capn12-Aktivität enthält, beispielsweise der Cystein-Protease-Aktivität, und die Aktivität der Capn12, gegebe­ nenfalls durch Zugabe von Substraten und Cosubstraten bestimmt.

Den folgenden Verfahren liegt dagegen die Eigenschaft vieler Ef­ fektoren zugrunde, an das Zielprotein zu binden. So kann die Capn12 oder das erfindungsgemäße Calpain-Protein, gegebenenfalls nach entsprechender Derivatisierung, an einem Träger immobili­ siert und mit einem Analyten in Kontakt gebracht werden, in wel­ chem wenigstens ein Capn12-Bindungspartner vermutet wird. Die an die immobilisierte Capn12 oder das immobilisierte, erfindungsge­ mäße Calpain-Protein gebundenen Bestandteile des Analyten können dann gegebenfalls nach einer Inkubationsphase eluiert, bestimmt und charakterisiert werden. Entsprechend kann aber auch der Ana­ lyt immobilisiert werden und anschließend auf Bindung von Capn12-Molekülen oder bindungsfähigen Capn12-Fragmenten an Be­ standteile des Analyten hin untersucht werden.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Immunglobuline mit Spezi­ fität für eine erfindungsgemäße Capn12. Solche Immunglobuline um­ fassen mono- oder polyklonale Antikörper, die an charakteristi­ sche Epitope der Capn12 binden können, sowie deren Fragmente. Die Herstellung von Anti-Capn12-Immunglobulinen erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Mit Immunglobulinen sind sowohl poly­ klonale, monoklonale, gegebenenfalls humane oder humanisierte An­ tikörper oder Fragmente davon, single-chain-Antikörper oder auch synthetische Antikörper gemeint, sowie Antikörperfragmente, wie Fv, Fab und F(ab)_'2. Geeignete Herstellungsverfahren sind z. B. in Campbell, A.M., Monoclonal Antibody Technology, (1987) Elsevier Verlag, Amsterdam, New York, Oxford und in Breitling, F. und Dü­ bel, S., Rekombinante Antikörper (1997), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg beschrieben. So können beispielsweise ausge­ hend von den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen Peptide syn­ thetisiert werden, die einzeln oder in Kombination als Antigene zur Herstellung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper einge­ setzt werden können.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung erfindungsgemä­ ßer Immunglobuline oder erfindungsgemäßer Polynukleotide zur Dia­ gnose von Krankheiten oder Krankheitszuständen, die im Zusammen­ hang mit der Capn12-Expression stehen. Dabei kann die Menge, Ak­ tivität und Verteilung der Capn12 oder ihrer zugrunde liegenden mRNA im menschlichen Körper bestimmt werden. Mit Hilfe von Immun­ globulinen oder Capn12-bindenden Molekülen läßt sich beispiels­ weise die Capn12-Konzentration in biologischen Proben, z. B. Zel­ len oder Körperflüssigkeiten, bestimmen. Mit Hilfe erfindungsge­ mäßer Polynukleotide läßt sich beispielsweise mittels Northern- Blot-Technik oder RT-PCR die Expression auf mRNA-Ebene beurteilen und beispielsweise eine Minderexpression nachweisen und eine da­ mit verbundene Krankheit diagnostizieren. Außerdem lassen sich mit Hilfe erfindungsgemäßer Polynukleotide in Form geeigneter Sonden Gendefekte oder Mutationen bezüglich des Capn12-Gens und damit die Prädisposition eines Patienten für bestimmte Krankhei­ ten nachweisen. Weiterhin lassen sich aus der Untersuchung einer großen Anzahl von Patienten im klinischen Monitoring Aussagen über genetische Ursachen und Prädispositionen bestimmter Erkran­ kungen machen.

Die Erfindung wird nun in den folgenden nichtlimitierenden Bei­ spielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher be­ schrieben. Dabei zeigt:

Fig. 1 einen Sequenzvergleich der vorhergesagten Aminosäurese­ quenz der Capn12 mit repräsentativen Mitgliedern der Wirbeltier- Genfamilie der großen Calpain-Untereinheit:
Die vorhergesagte Aminosäuresequenz (hier dargestellt im Ein- Buchstaben-Code) der Splice-Variante Capn12A wurde mit Mitglie­ dern der wichtigsten Klassen der großen Calpain-Untereinheit verglichen, die sich durch verschiedene C-terminale Domänen un­ terscheiden. Capn1 besitzt eine klassische Calmodulin-ähnliche, C-terminale Domäne, während Capn5, Capn7 und Capn10 C-terminale Domänen aufweisen, die mit N, T bzw. X bezeichnet sind. Aminosäu­ ren anderer Proteine, die zu denen der Capn12 identisch sind, sind schwarz hinterlegt. Bindestriche kennzeichnen Lücken, die zur Gegenüberstellung und damit zum bestmöglichen Vergleich der Sequenzen eingefügt wurden. Die drei konservierten Aminosäuren, die Teil des aktiven Zentrums der Calpaine sind, sind mit Pfeilen markiert. Die Calcium-bindenden EF-Hand-Domänen von Capn1 (Lin et al., 1997; Blanchard et al., 1997) sind durch einen Balken über der jeweiligen Sequenz hervorgehoben und abschnittsweise numme­ riert. Die aus der Kristallstruktur vorhergesagten (Hosfield et al., 1999) Calpain-Domänen sind ebenfalls gekennzeichnet. Zur besseren Übersichtlichkeit wurden die ersten 122 Aminosäuren des vorhergesagten Capn7-Proteins, die nur dieses Protein aufweist, nicht angegeben und durch ein "Gleichheitszeichen" (=) ersetzt. Die ausgesprochen saure Region in Domäne III, die mit Calcium in­ teragieren kann und möglicherweise als "elektrostatischer Schal­ ter" der Protease-Aktivität wirkt, ist durch Kreise über der re­ levanten Sequenz kenntlich gemacht. Die von der Splice-Variante A abweichenden C-terminalen Enden der aus der 914413-cDNA vorherge­ sagten Proteinsequenz und der vorhergesagten Proteinsequenzen der Splice-Varianten B und C sind von dem Punkt an gezeigt, an dem sie sich von der Proteinsequenz der Splice-Variante Capn12A un­ terscheiden. Die EMBL/Genbank-Zugangsnuxnmern der Calpain-Sequen­ zen sind in der Legende zu Fig. 3 angegeben.

Fig. 2 die genomische Struktur des Capn12-Gens:
A. Schematisches Diagramm der Intron/Exon Struktur des Capn12-Gens. Die schwarzen Rechtecke stehen für Exons der Capn12. Diese sind fortlaufend nummeriert. Das karierte Rechteck kenn­ zeichnet das am äußersten 3'-Ende gelegene Exon von Actn4. Das gepunktete Rechteck kennzeichnet die Exonsequenz, die sich Capn12 und Actn4 teilen. Die Pfeile geben die Transkriptionsrichtung beider Gene an. Die Lage der Sequenzwiederholungen, die man in der Sequenz entdeckte, sind oben angegeben. Das Splice-Ereignis zwischen den Exons 9 und 20, aus dem das mRNA-Transkript des Klons 914413 resultierte und die Teilsequenzen, die Splice-Donor- und Splice-Akzeptorstelle der Exons 9 und 20 der Capn12 umgeben, sind ebenfalls angegeben. Große Buchstaben kennzeichnen jeweils die kodierende Sequenz und kleine Buchstaben die Intronsequenz. Die Sequenz CACTG, die der anomalen Splice-Donor- und der Splice- Akzeptorstelle gemeinsam ist und in der das anomale Splice-Ereig­ nis auftrat, ist unterstrichen. Die sich daran anschließende Se­ quenz der 914413-cDNA, die diese zwei Exons miteinander verbin­ det, ist ebenfalls angegeben.
B. Ein schematisches Diagramm der Exons 11, 12 und 13 zeigt die alternativen Splice-Varianten A, B und C. Die Sequenz des gemein­ samen Exons 11 ist auf der linken Seite gezeigt und das damit verbundene Exon, das in der jeweiligen Splice-Variante verwendet wird, auf der rechten Seite. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist unter der entsprechenden Nukleotidsequenz angegeben. Die letzten zwei Nukleotide des Splice-Akzeptors in Exon 12, AG, die in Splice-Variante B verwendet werden, sind fettgedruckt darge­ stellt.
C. Die Tabelle zeigt die Splice-Ereignisse der einzelnen Exons mit der den jeweiligen Splice-Donor und Splice-Akzeptor umgeben­ den Nukleotidsequenz. Splice-Donor und Splice-Akzeptor sind fett­ gedruckt dargestellt. Die Größe der jeweiligen Exons und Introns ist angegeben.

Fig. 3 den phylogenetischen Stammbaum der Säugetier-Genfamilie der großen Calpain-Untereinheit:
Die Analyse wurde mit Hilfe des Programms CLUSTAL durchgeführt, der Stammbaum wurde mit CLUSTREE erstellt. Die jeweilige Länge der horizontalen Linien ist proportional zum vermuteten phyloge­ netischen Abstand; die vertikalen Abstände haben keine Bedeutung. Es wurden 1000 Bandwiederholungen durchgeführt und die Werte sind in den inneren Knotenpunkten angegeben. Es wurden vorzugsweise Sequenzen der Maus verwendet. Da diese nicht für Capn8, Capn9 und Capn1l verfügbar sind, wurden ersatzweise die orthologen Sequen­ zen der Ratte und des Menschen verwendet. Die EMBL/Genbank-Zug­ angsnummern der Sequenzen sind: Capn1 (AF021847), Capn2 (X10139), Capn3 (X92523), Capn5 (Y10656), Capn6 (Y12582), Capn7 (AJ012475), Ratte Capn8 (D14480), Mensch CAPN9 (AF022799), Capn10 (AF126867) und Mensch CAPN11 (AJ242832).

Fig. 4 eine mRNA-Expressionsanalyse von Actn4 und Capn12:
A. Expression von Actn4 in verschiedenen Mausgeweben. Eine 32P­ markierte Probe, die dem 3'-Ende der Actn4-cDNA der Maus ent­ sprach, wurde an einen Clontech Mouse-Master-Blot hybridisiert. Die Lokalisation der RNAs auf den Filtern ist auf der rechten Seite angegeben. Der Blot wurde gestrippt und mit einer Maus Hprt-Probe hybridisiert (in der Mitte), um die RNA-Beladung zu überprüfen. Die Expositionszeit betrug 48 Stunden.
B. Eine ³²P-markierte Probe wurde an einen Northern-Filter, der RNAs aus der Haut von Mäusen angegebenen Alters trug, hybridi­ siert. Der Blot wurde zur Überprüfung der aufgetragenen RNA-Level anschließend ein weiteres Mal mit einer β-Actin-cDNA-Probe hybri­ disiert. Die Positionen der 28S- und 18S-rRNAs sind gekennzeich­ net und die spezifische Capn12-RNA-Bande mit einem Pfeil mar­ kiert. Die Expositionszeit bei der Capn12 betrug 144 Stunden und 2 Stunden bei β-Actin.
C. Capn12-RT-PCR von RNAs der Haut verschiedenen postnatalen Al­ ters. M, pSM verdaut mit Hindlil als Molekulargewichtsmarker. Die Größe der Banden ist in Basenpaaren angegeben. Neg, negative Kon­ trolle ohne eingesetzte DNA. Die Sequenzierung der hervorgeho­ benen PCR-Produkte bestätigte, dass die verstärkte Bande der Capn12-cDNA entspricht.

Fig. 5 eine in-situ-Hybridisierung an Hautgewebeschnitten aus Mausembryonen:
Auf der linken Seite sind lichtmikroskopische Aufnahmen der Gewe­ benschnitte dargestellt. Rechts daneben ist das entsprechende Bild der in-situ-Hybridisierung zu sehen. Die Capn12 wird selek­ tiv im Cortex des Haarfollikels exprimiert (irs: inner root sheet; ors: outer root sheet; co: cortex).

Beispiel 1 Screening einer genomischen Bibliothek

Eine Cosmid-Bibliothek, erstellt durch Klonierung von partiell durch Sau3A verdauter Maus-129/Sv-DNA in den Cosmidvektor pSuper- Cos (Stratagene), wurde durch PCR-Analyse unter Verwendung der Capn12-spezifischen Primer 5'-gaatggcgagtggcaacaggaag-3' (SEQ ID NO: 9) und 5'-tggggctcagcacaaaactcat-3' (SEQ ID NO: 10) ges­ creent. Die Cosmid-DNA wurde mit Hilfe des Qiagen Plasmid Midi Kits gemäß den Herstellerangaben aufgereinigt.

Beispiel 2 cDNA-Amplifikation durch PCR

Fünf Mikrogramm Gesamt-RNA wurden mit AMV Reverse Transkriptase unter Verwendung des Promega Reverse Transkription Systems in cDNA transkribiert. Die PCRs wurden in 50 µl Reaktionsvolumen, die 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9, 0,1% Triton X-100, 2 Units Taq DNA-Polymerase, 50 µmol sowohl der Vorwärts- als auch der Rück­ wärtsprimer und 0,1 ng cDNA enthielten, mit einem Thermocycling- Protokoll von 35 Zyklen, umfassend 15 s bei 94°C, 30 s bei 55°C und 1 min bei 72°C, durchgeführt. Die Capn12 Vorwärts- und Rück­ wärtsprimersequenzen zur RT-PCR waren 5'-ttcaagactttctcacg-3' (SEQ ID NO: 11) und 5'-tcgcccccttgagtttattctga-3' (SEQ ID NO: 12). Die Hprt Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen waren 5'-atgccgacccgcagtcccagcg-3' (SEQ ID NO: 13) und 5'-ggctttgtatttggcttttcc-3' (SEQ ID NO: 14).

Beispiel 3 DNA-Sequenzierung

Ein 20 µl-Reaktionsgemisch, das 8 µl BigDye Reaktion Mix (Perkin- Elmer Biosystems), 500 ng gereinigte DNA und 10 µmol Primer ent­ hielt, wurde 30 Zyklen, umfassend 15 s bei 94°C, 15 s bei 50°C und 2 min bei 60°C, inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch Po­ lyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung eines ABI 377 DNA- Sequencers aufgetrennt und die Sequenz durch Dye-Terminator-Flu­ oreszenz mit Hilfe der Perkin-Elmer Biosystems Sequenzanalyse Software Version 3,3 sequenziert. Weitere Sequenzierung mit syn­ thetisierten Oligonukleotiden erweiterte die DNA-Sequenzen. Die Sequenzen wurden mit Hilfe des SeqMan der Programmreihe DNASTAR zu einem Contig zusammengesetzt.

Beispiel 4 Sequenzanalysen

DNA- und Aminosäuresequenzen wurden bezüglich ihrer Homologie mit den nicht-redundanten Nukleotid-, Protein- und EST-Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov) mit Hilfe der Programmreihe-BLAST (Altschul et al., 1990) untersucht. Der Sequenzvergleich und die Gegenüberstellung Von Aminosäuresequenzen wurde mit CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) durchgeführt. Die Vorhersage der Exons war mit Hilfe des FGNENESH-Programms möglich, das über den Sanger Center Web-Server (www.sanger.ac.uk) erhältlich ist. Repetitive Sequenzen wurden unter Verwendung des "RepeatMasker" (http:/ /re­ peatmasker.genome.washington.edu) identifiziert. Die phylogeneti­ sche Analyse wurde mit dem Programm CLUSTREE, erhältlich vom HU- SAR-Server des Deutschen Krebsforschungszentrums, Heidelberg (WWW.dkfz-heidelberg.de) durchgeführt.

Beispiel 5 Northern-Blot-Hybridisierung

Die Gesamt-RNA aus Mausgeweben wurde mit Hilfe der Guanidin-ISO- thiocyanat-Methode (Chomzynski und Sacchi, 1987) isoliert. 10 µg Gesamt-RNA wurden durch Elektrophorese in einem 1,4% (w/v) Agaro­ segel, das wie bereits beschrieben 2,2 M Formaldehyd enthielt (Sambrook et al., 1989), aufgetrennt und gemäß den Herstelleran­ gaben auf eine Hybond-N-Nylonmembran (Amersham) geblotted. Der Blot wurde mit einem ³²P-markierten cDNA-Fragment, das den Nukleo­ tiden 33-852 cDNA-Sequenz der Capn12 entsprach in Expresshyb Hy­ bridisierungslösung (Clontech) hybridisiert. Die Bedingungen der Hybridisierung und des hochstringenten Waschens wurden gemäß den Herstellerangaben gewählt. Der Blot wurde in einem zweiten Schritt mit einer cDNA-Probe des β-Actins hybridisiert, um die RNA-Beladung zu überprüfen.

Beispiel 6 In-situ-RNA-Hybridisierung an Gewebeschnitten

Die Capn12-cDNA, die als Template zur Synthese von RNAS, entspre­ chend den Nukleotiden 33-852 der beschriebenen Sequenz, verwendet wurde, wurde in die EcoRV-Stelle des pBluescripts kloniert. Die­ ses cDNA-Fragment überlappt nicht mit dem Actn4-Gen. ³³P-markierte Sense- und Antisense-RNAs wurden durch in-vitro-Transkription von Restriktionsenzym-linearisierter Plasmid-DNA in einem Reaktions­ volumen von 12,5 µl, das 1 × Transkriptionspuffer (Puffer für T7- und T3-RNA Polymerasen, von Statagene), 200 µM ATP, CTP, GTP, 40 µCi α-³³P-UTP (Amersham), 10 mM DTT, 1 µg linearisierte Plasmid- DNA, 40 Units RNAsin (Promega) und 10 Units RNA-Polymerase ent­ hielt, hergestellt. Nach 2-stündiger Inkubation bei 370C wurde die Template-DNA durch Zugabe von 2 Units DNAaseI (Boehringer Mann­ heim) gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 37°C entfernt. Die Reaktion wurde extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in 26 µl DEPC-behandeltem dH₂O resuspendiert. Die Embryos wurden in 4% (w/v) Paraformaldehyd in PBS fixiert und daraus erhaltene 5 µm- Gewebeschnitte wurden auf vorgereinigte SuperFrost Plus-Objekt­ träger (Menzel-Glaeser) überführt. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren wie bereits beschrieben (Dressler und Gruss, 1989). Es wurde eine Hybridisierungstemperatur von 55°C ge­ wählt.

Beispiel 7 Bestrahlungshybridkartierung

Die DNAs der T31-Bestrahlungshybridkartierungsplatte (Research Genetics) wurden durch PCR mit Hilfe zweier, der Capn12 [Set 1: 5'-gggagggccaggacaaggact-3' (SEQ ID NO: 15), 5'-agggaaggctggaacaatggagaa-3' (SEQ ID NO: 16), Set 2: 5'-gaatggcgagtggcaacaggaag-3' (SEQ ID NO: 17), 5'-ctggggctcagcacaaaactcat-3' (SEQ ID NO: 18)] und der Capn5 (Set 1: 5'-cggtgacactggactgggccttgc-3' SEQ ID NO: 19), 5'-aagccgcctgcagagcactgtgg-3' (SEQ ID NO: 20); Set 2: 5'-cgggagtggacgggcccctg-3' (SEQ ID NO: 21), 5'-etcactttctgccattecte-3' (SEQ ID NO: 22)) entsprechenden Prim­ ersets, analysiert. Die PCRs wurden in einem Reaktionsvolumen von 20 µl, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9, 1,5 mM MgCl₂, 1 Unit Taq DNA-Polymerase, 25 ng DNA mit einem Thermocycling-Protokoll von 35 Zyklen, umfassend 15 s bei 94°C, 30 s bei 60°C und 1 min bei 72°C, durchgeführt. Die Rohdaten wurden zur Analyse bei der Maus-Bestrahlungshybrid-Datenbank, im Jackson Laboratory (www.jax.org/resources/documents/cmdata/rhmap/) eingereicht.

Beispiel 8 Identifizierung der Capn12

Zur Identifizierung neuer Calpaingene durchsuchte man die öffent­ lich zugänglichen EST-Datenbanken. Unter Verwendung der vorläufig erhaltenen Daten, wurde ein neues Mitglied der Säugetier-Genfami­ lie der großen Calpain-Untereinheit, die durch ein zellspezifi­ sches Expressionsmuster charakterisiert ist, gefunden und charak­ terisiert.

Die Maus-EST-Datenbank wurde mit Proteinsequenzen von bekannten Wirbeltier-Calpainen unter Verwendung des TBLAST-Algorithmus (Altschul et al., 1990) durchsucht. Das translatierte Protein ei­ nes 3'-EST, AA1314413, war für die Familie der großen Calpain-Un­ tereinheit typisch. Aus diesem Grund wurde der cDNA-Klon, 914413, der diesem EST-Klon entspricht, in seiner Gesamtheit sequenziert. Die cDNA weist einen PolyA-Schwanz auf und enthält ein offenes Leseraster, dessen vorhergesagtes Protein Homologie zu den Domä­ nen I und II der großen Untereinheit der klassischen Calpain zeigt. Die vorhergesagte Sequenz weicht allerdings von der klas­ sischer Calpaine im Anschluß an die Domäne II ab und endet kurz darauf (Fig. 1).

Drei Beobachtungen deuten an, dass dieser cDNA-Klon von einem anomalen Transkript stammt. Erstens, weist das offene Leseraster keine Homologie zu den Domänen III oder IV anderer Calpaine auf, während alle bisher identifizierten Calpaine eine typische Vier- Domänen-Struktur aufweisen. Zweitens, war es nicht möglich, mit Primern, die aus den beiden Enden der erhaltenen Sequenz kon­ struiert wurden, aus einer großen Zahl von Gewebe-cDNAs ein Transkript dieser Länge zu amplifizieren. Drittens, wurden zum 3'-Ende von AA1314413 homologe, humane ESTs identifiziert, von denen manche Homologie zu der Calmodulin-ähnlichen Domäne IV der Calpaine zeigten. Daher scheint der cDNA-Klon 914413 das Ergebnis eines atypischen oder fehlerhaften RNA-Splicing-Ereignisses zu sein, das die für die Domänen III und IV kodierenden Exons dieses Calpain-Gens deletiert hat.

Um dies zu überprüfen wurde ein genomischer DNA-Cosmidklon iso­ liert und sequenziert. Man erhielt eine fortlaufende Sequenz (SEQ ID NO: 8) von insgesamt 13116 bp. Die Genvorhersagesoftware (FGE- NESH) identifizierte ein potentielles Gen mit 21 Exons, mit einer Exon/Intron-Struktur, die typisch für die Genfamilie der Calpaine ist. Darunter sind Exons mit ausgeprägter Homologie zu den Domä­ nen III und IV der klassischen Calpaine. Zur Bestimmung der ge­ nauen Exon/Intron-Struktur analysierte man aus der Haut isolierte mRNA mittels RT-PCR. Die Software sagte 20 der 21 Exons vorher, wobei sie einige Fehler in der Position der Donor- oder der Ak­ zeptor-Splice-Stelle erlaubt. Die Intron/Exon-Grenzen des voll­ ständigen Gens sind in Fig. 2A gezeigt und in Tabelle 1 zusam­ mengefaßt. Das Nomenklatur-Kommittee des Maus-Genoms gab diesem Gen den Namen Capn12. Man fand in der Capn12-Intronsequenz vier einfache Sequenzwiederholungen und 16 SINES (short interspersed repeats; 4 B1, 1 B2, 3 B4 und 8 ID; Fig. 2A). Im Vergleich zu der aus der genomischen Sequenz vorhergesagten mRNA-Sequenz scheint der cDNA-Klon 914413 das Ergebnis eines fehlerhaften Splice-Erei­ gnisses zu sein, denn sowohl die Donor- als auch die Splice-Ak­ zeptorstelle sind atypisch und der größte Teil der Exons der Do­ mänen III und IV wird dadurch deletiert. Der Splice findet zwi­ schen den Exons 9 und 20 innerhalb einer 5-Basenpaarregion, CACTG, statt, die diesen beiden Exons gemeinsam ist (Fig. 2A).

Mittels RT-PCR wurden drei alternative Splice-Varianten der Capn12-mRNA identifiziert (hier Capn12A, Capn12B und Capn12C ge­ nannt). Die Splice-Variante A weist ein offenes Leseraster auf, das vermutlich ein Protein aus 720 Aminosäuren (M_r 80,5 kDa) ko­ diert. Das vorgeschlagene Start-Methionin (cgaATGg) entspricht der minimalen Konsensussequenz der Translationsstartstelle (Ko­ zak, 1996). Weitere 5'-Startstellen werden durch ein TAA-Stopco­ don im Leseraster ausgeschlossen, das 39 Nukleotide strangauf­ wärts dieses ATG lokalisiert ist. Die vorhergesagte Aminosäurese­ quenz zeigt Ähnlichkeiten zu Mitgliedern der Familie der großen Calpain-Untereinheit und kann in die für Calgaine typischen vier Domänen I bis IV unterteilt werden (Fig. 1). Die Domäne II der erfindungsgemäßen Capn12 weist die drei Aminosäurereste (Cys105, His259 und Asn283) auf, die für das aktive Zentrum von Cystein- Proteasen wesentlich sind (Berti und Storer, 1995). Demgemäß weist die erfindungsgemäße Capn12, wie die meisten klassischen Calpaine, Cystein-Protease-Aktivität auf.

Jede der fünf, der bei der Capn2 beschriebenen Ca²⁺-bindenden Se­ quenzen (Blanchard et al., 1997; Lin et al., 1997) ist in gewis­ sem Ausmaß in der Aminosäuresequenz der Capn12 konserviert (Fig. 1). Die Kristallstruktur der Capn2 brachte eine extrem saure Re­ gion in der Domäne III zum Vorschein, die mit Ca2+ interagieren und als "elektrostatischer Schalter" der Protease-Aktivität wir­ ken könnte (Strobl et al., 2000). Die Autoren vermuten, dass die große Zahl saurer Reste in dieser Region die für die Aktivierung notwendige Ca²⁺-Konzentration reduzieren könnte. Die entsprechende Region der Capn12 ist ebenso ausgeprägt sauer (DEEEDDDDEE; Fig. 1). Insgesamt legt die primäre Aminosäuresequenz somit nahe, dass dieses Protein Cystein-Protease-Aktivität aufweist und Calcium bindet. Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz mit anderen Vertebraten- und Invertebraten-Calpainen zeigte starke Sequenzhomologie zur Capn1 des Menschen und der Maus (39,9% bzw. 39,75%).

Die Transkripte der Splice-Varianten A und B unterscheiden sich im Splice-Akzeptor des Exons 12, während der Variante C das Exon 12 ganz fehlt. Die vorhergesagten Proteine der alternativen Splice-Varianten B und C zeigen dadurch eine in der Domäne III abweichende Aminosäuresequenz und aufgrund eines Shifts im Lese­ raster endet die Translation innerhalb dieser Domäne (Fig. 2B). Folglich fehlt ihnen vermutlich auch die Calmodulin-ähnliche, Ca²⁺-bindende Domäne, C-terminale Domäne. Analog dazu wurde be­ reits gezeigt, dass auch die Capn8 der Ratte und die Capn5 der Maus alternativ gesplicete Transkripte bilden, die Proteine ko­ dieren, denen die C-terminale Domäne fehlt (Sorimachi et al., 1993; Dear et al., 1997). Überraschenderweise war das RT-PCR-Pro­ dukt der Splice-Variante B abundanter als das der Sglice-Variante A. Somit stellt vermutlich ein Capn12-Protein, dem eine Ca2+-bin­ dende Domäne fehlt einen beträchtlichen Teil des Capn12-Protein­ pools dar. Das RT-PCR-Produkt der Splice-Variante C war dagegen das am wenigsten abundante.

Beispiel 9 Phylogenetische Analyse der großen Calpain-Untereinheit der Säu­ getiere

Die jeweils vollständigen Aminosäuresequenzen repräsentativer Mitgliedern aller bekannten großen Calpain-Untereinheiten der Säugetiere wurden einer phylogenetischen Analyse unterzogen. Da­ durch konnte man die Calpaine in drei Hauptgruppen einteilen (Fig. 3). Die erste Gruppe (A) wird durch Capn1, Capn2, Capn3, Capn8 und Capn9 repräsentiert und die zweite Gruppe (B) durch Capn5, Capn6, Capn7, Capn10 und Capn12. Capn11, ein stark abwei­ chendes Calpain (Dear et al., 1999), passt in keine der Gruppen. Gruppe (A) enthält alle Calpaine mit einer Calmodulin-ähnlichen, C-terminalen Domäne, während Gruppe (B) all jene "atypischen" Calpaine enthält, denen vermutlich die Fähigkeit zur Ca²⁺-Bindung fehlt. Eine Ausnahme stellt die Capn12 dar, die im Allgemeinen der Gruppe (B) ähnlicher ist, abgesehen davon, dass sie eine Cal­ modulin-ähnliche, C-terminale Domäne aufweist. Darüberhinaus legt die phylogenetische Analyse die Vermutung nahe, dass die Capn12 das älteste Mitglied dieser Gruppe ist. Folglich könnte ein Vor­ läufer des Capn12-Gens der Begründer der Gene der atypischen gro­ ßen Calpain-Untereinheit sein, wobei die Capn12 über alternatives Splicing möglicherweise als Quelle sowohl klassischer als auch atypischer Proteine gedient hat.

Beispiel 10 Chromosomen-Lokalisation

Die Lokalisation des Capn12-Gens auf Chromosomen der Maus wurde durch PCR-Analyse der T31-Bestrahlungshybridkartierungsplatte mit Hilfe von Primern bestimmt, die innerhalb des Introns 1 des Capn12-Gens binden. Die Rohdaten wurden unter Verwendung der Be­ strahlungshybridkarte des Maus-Genoms (Van Etten et al., 1999) und dem dazugehörenden World Wide Web Server analysiert. Der höchste LOD-Wert lag bei 16, in Verbindung mit dem Marker D7Mit72. Andere hohe LODs lagen bei 14,4 in Verbindung mit D7Mit116, 14,4 in Verbindung mit D7Mit77, und 13,9 in Verbindung mit D7Mit267. Diese Marker wurden auf Chromosom 7 bei 9,4 (D7Mit77), 10,7 (D7Mit116), 10,4 (D7Mit72), und 11,0 cM (D7Mit267) lokalisiert. Die schlüssigste Reihenfolge ist: proxi­ mal - D7Mit77 - D7Mit116 - D7Mit72 - Capn12 - D7Mit267 - distal. Die Region ist ortholog zum humanen Chromosom 19q13. Das Capn5-Gen der Maus wurde kürzlich ebenfalls mit Hilfe einer Be­ strahlungshybridkartierungsplatte der Chromosomen somatischer Zellen der Maus auf dem Maus-Chromosom 7 lokalisiert (Matena et al., 1998). Um den genauen Abstand zwischen Capn5 und Capn12 auf dem Chromosom 7 zu bestimmen, wurde die T31-Platte mit Maus-Capn5-spezifischen PCR-Primern ausgewertet. Der höchste LOD- Wert lag bei 13,4 in Verbindung mit D7Mit321. Andere hohe LODs lagen bei 10,9, 8,5 und 6,9 in Verbindung mit D7Mit184, D7Mit171 bzw. D7Mit39. Die schlüssigste Reihenfolge dieses Locus ist: pro­ ximal - D7Mit321 - 7cR - Capn5 - 42cR - D7Mit149 - distal. Der D7Mit321-Marker wurde bei 48,5 cM auf Chromosom 7 lokalisiert. Somit sind Capn5 und Capn12 syntenisch, liegen aber in deutlichem Abstand voneinander auf Chromosom 7. Da die Gene Actn4 und Capn12, wie nachfolgend beschrieben, überlappen, muß Actn4 eben­ falls auf dem Maus-Chromosom 7 liegen. Da das humane Actn4-Gen auf dem Chromosom 19q13 lokalisiert wurde (Kaplan et al., 2000), liegt das humane Capn12-Ortholog sehr wahrscheinlich ebenfalls in dieser Region.

Beispiel 11 Expressionsanalyse

Eine erste in-situ-Hybridisierungsanalyse an Gewebeschnitten aus Maulembryonen, die mit Hilfe der 914413-cDNA zur Herstellung strangspezifischer RNA-Proben durchgeführt wurde, führte dadurch zu verwirrenden Ergebnissen, da die als Kontrolle eingesetzte Sense-RNA, die an den Nonsense-Strang von Capn12 hybridisieren sollte, in jedem Experiment ein Hybridisierungssignal lieferte. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen ist, dass der Non­ sense-DNA-Strang ebenfalls eine RNA kodiert. Untersuchungen der DNA-Gendatenbank identifizierte über 200 ESTs, die dem 3'-Ende des Capn12-Gens entsprechen. Jedoch entsprechen alle ESTs, mit Ausnahme von AA914413, dem nicht-kodierenden Strang. Die Abfolge überlappender ESTs bildete eine Sequenz mit einem offenen Lesera­ ster, die für das Maus-Ortholog von α-Actinin-4 (ACtn4) kodiert. Die RT-PCR verschiedener Maulgewebe-RNAs bestätigte die Sequenz. Das vorhergesagte Mausprotein ist mit dem humanen Actn4 zu 98,9% identisch. Das letzte Exon überlappt mit dem letzten Exon des Capn12-Gens um 330 bp, allerdings in entgegengesetzter Orientie­ rung (Fig. 2). Man konnte kürzlich zeigen, dass Mutationen im hu­ manen Actn4-Gen familiäre segmentale Herdnephretitis verursachen kann (Kaplan et al., 2000).

Eine RNA-Dot-Blot-Analyse und in-situ-Hybridisierung unter Ver­ wendung einer spezifischen Probe zeigte, dass das Actn4-Gen ubi­ quitär exprimiert wird (Fig. 4). Im Gegensatz dazu war es nicht möglich, in einer von über 30 verschiedenen getestete Poly(A+)-RNA-Isolierungen aus adultem oder embryonalem Gewebe mit Capn12-spezifischen cDNA-Proben ein Hybridisierungssignal zu er­ halten. Obwohl der 914413-cDNA-Klon aus einer Brustdrüsen-cDNA- Bibliothek isoliert wurde, zeigten Northern-Blot- und RT-PCR-Ana­ lyse in diesem Gewebe keine signifikanten Expressionslevel. Erst eine genauere RT-PCT-Analyse in Verbindung mit einer in-situ-Hy­ bridisierung an Mausembryonen der Stadien dE10,5 bis dE18,5 und verschiedenen adulten Geweben zeigten, dass Capn12 ausschließlich in der Haut exprimiert wird. Hier wird Capn12 im Cortex des Haar- follikels exprimiert (Fig. 5).

Haare unterliegen einem Zyklus, der bei der Maus ungefähr 25 Tage dauert (Chase, 1965). Der Zyklus ist grob in drei Phasen unter­ teilt: Die Anagen- (Proliferations-), die Katagen- (Rückbin­ dungs-) und die Telogen-Phase (Ruhephase). Die Rückenhaut der adulten Maus enthält Haarfollikel aller Phasen des Haarzyklus. Um genauer zu ermitteln, in welchen Phasen des Zyklus die Capn12-mRNA exprimiert wird, wurden von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Geburt Proben aus der Rückenhaut entnommen und die extrahierten RNAs durch Northern-Blot-Hybridisierung un­ tersucht. Der erste Haarzyklus der Maus verläuft synchron (Chase, 1965) und somit können relativ reine Haarfollikeln-Populationen einer spezifischen Zyklus-Phase untersucht werden. Eine Capn12-mRNA von ungefähr 3,5 kb kann in der Anagenphase (ungefähr P1-P16), aber nicht in der Telogenphase (P19-P25) (Fig. 4B) nach­ gewiesen werden. Die mRNA erreicht ihr höchstes Expressionslevel ungefähr am Tag P12, in der Mitte der Anagenphase. Eine RT-PCR- Analyse derselben Hautproben bestätigte dieses Ergebnis (Fig. 4C). Somit zeigt Capn12 ein hochspezifisches mRNA-Expressionsmu­ ster.

Die Genfamilie der großen Calpain-Untereinheit kann aufgrund ver­ schiedener Kriterien unterteilt werden, wie oben erwähnt z. B. aufgrund der Proteinstruktur. Ein weiteres Klassifizierungskrite­ rium ist die ubiquitäre gegenüber der gewebespezifischen Expres­ sion. Capn1, Capn2, Capn7 und Capn10 scheinen ubiquitär expri­ miert zu werden, während die anderen Calpaine durch unterschied­ lich stark ausgeprägte gewebsspezifische Expression charakteri­ siert sind. Beispielsweise wird Capn9 vorwiegend im Darm und Ma­ gen exprimiert, ist aber auch in anderen Geweben nachweisbar (Li et al., 1998). Dagegen wird Capn1l offenbar ausschließlich in be­ stimmten Zellen der Testis exprimiert wird (Dear und Boehm, 1999). Darüber hinaus werden manche Calpain-Gene entwicklungsspe­ zifisch exprimiert. Capn5 wird beispielsweise im embryonalen Thy­ mus in den T-Zell-Vorläufern exprimiert, während nach der Geburt die Expression im Thymus herunterreguliert wird (Dear und Boehm, 1999).

REFERENCES

Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. und Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment sequencing tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410
Berti, P.J. und Storer, A.C. (1995). Alignment/Phylogeny of the papain superfamily of cysteine proteases. J. Mol. Biol. 246: 273-283
Blanchard, H., Grochulski, P., Li, Y., Arthur, J.S.C., Davies, P.L., Elce, J. S. & Cygler, M. (1997). Structure of a Ca²⁺

-binding domain reveals a novel EF-hand and Ca²⁺

-induced conformational 1 changes. Nature Struct. Biol. 4: 532-538
Braun, C., Engel, M., Theisinger, B., Welter, C. und Seifert, M. (1999). CAPN 8: isolation of a new mouse calpain-isoenzyme. Bio­ chem. Biophys. Res. Commun. 260: 671-675
Carafoli, E. und Molinari, M. (1998). Calpain: a protease in search of a function? Biochem. Biophys. Res. Commun. 247: 193-203
Chan, S.L. und Mattson, M.P. (1999). Caspase and calpain substra­ tes: roles in synaptic plasticity and cell death. J. Neurosci. Res. 58: 167-190
Chase, H.B. (1965). Cycles and waves of hair growth. In: Lyne, A.B., Short, B.F. (Eds.). Biology of the Skin and Hair Growth. Angus und Robertson, Sydney, pp. 462-465
Chomczynski, P. und Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ex­ traction. Anal. Biochem. 162: 156-159
Dear, T.N. und Boehm, T. (1999). Diverse mRNA expression patterns of the mouse calpain genes Capn5, Capn6 and Capn11 during deve­ lopment. Mech. Dev. 89: 201-209
Dear, N., Matena, K., Vingron, M. und Boehm, T. (1997). A new subfamily of vertebrate calpains lacking a calmodulin-like do­ main: Implications for calpain regulation and evolution. Genomics 45: 175-184
Dear, T.N., Moller, A. und Boehm, T. (1999). CAPN11: A calpain with high mRNA levels in testis and located on chromosome 6. Ge­ nomics 59: 243-247
Dressler, G.R., Gruss, P., 1989. Anterior boundaries of Hox gene expression in mesoderm-derived structures correlate with the li­ near gene order along the chromosome. Differentiation 41, 193-201 Franz, T., Vingron, M., Boehm, T. und Dear, T.N. (1999). Capn7: A highly divergent vertebrate calpain with a novel C-terminal do­ main. Mamm. Genome 10: 318-321
Hardman, M.J., Sisi, P., Banbury, D.N. und Byrne, C. (1998). Pat­ terned acquisition of skin barrier function during development. Development 125, 1541-1552
Hosfield, C.M., Elce, J. S., Davies, P.L. und Jia, Z. (1999). Cry­ stal structure of calpain reveals the structural basis for Ca²⁺

dependent protease activity and a novel mode of enzyme activa­ tion. EMBO J. 18: 6880-6889
Kaplan, J.M., Kim, S., North, K.N., Rennke, IL, Correia, L., Tong, H.Q., Mathis, B.J., Rodfiguez-Perez, J.C., Allen, P.G., Beggs, A.H. und Pollak, M.R. (2000). Mutations in ACTN4, encoding alpha-actinin-4, cause familial focal segmental glomerulosclero­ sis. Nat. Genet. 24, 251-256
Kozak, M. (1996). Interpreting cDNA sequences: some insights from studies on translation. Mamm. Genome 7: 563-574
Lee, HA., Sorimachi, H., Jeong, S-Y., Ishiura, S. und Suzuki, K. (1998). Molecular cloning and characterization of a novel tissue­ specific calpain predominantly expressed in the digestive tract. Biol. Chem. 379, 175-183
Lin, G.D., Chattopadhyay, D., Maki, M., Wang, K.K., Carson, M., Jin, L., Yuen, P.W., Takano, E., Hatanaka, M., DeLucas, L.J. und Narayana, S. V. (1997). Crystal structure of calcium bound domain VI of calpain at 1.9 A resolution and its role in enzyme assem­ bly, regulation, and inhibitor binding. Nat. Struct. Biol. 4: 539-547
Matena, K., Boehm, T. und Dear, T.N. (1998). Genomic organization of mouse Capn5 and Capn6 genes confirms that they are a distinct calpain subfamily. Genomics 48: 117-120
Mellgren, R.L. (1997). Evidence for participation of a calpain­ like cysteine protease in cell cycle progression through late G1 phase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 236: 555-558
Richard, I., Broux, O., Allamand, V., Fougerousse, F., Chiannil­ kulchai, N., Bourg, N., Brenguier, L., Devaud, C., Pasturaud, P., Roudaut, C., Hillaire, D., Passos-Bueno, M., zatz, M., Tisch­ field, J.A., Fardeau, M., Jackson, C. E., Cohen, D. und Beckmann, J. S. (1995). Mutations in the proteolytic enzyme calpain 3 cause Limb-Girdle Muscular Dystrophy Type 2A. Cell 81: 27-40
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. 1989. Molecular Clo­ ning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, pp. 7.43-7.45
Schoenwaelder, S. M., Yuan, Y., Cooray, P., Salem, H.H. und Jack­ son, S. P. (1997). Calpain cleavage of focal adhesion proteins re­ gulates the cytoskeletal attachment of integrin alphallbbeta3 (platelet glycoprotein IIb/IIIa) and the cellular retraction of fibrin clots. J Biol. Chem. 272: 1694-1702
Sorimachi, H., Ishiura, S. und Suzuki, K. (1993). A novel tissue­ specific calpain species expressed predominantly in the stomach comprises two alternative splicing products with and without Ca²⁺

binding domain. J. Biol. Chem. 268: 19476-19482
Sorimachi, H., Ishiura, S. und Suzuki, K. (1997). Structure and physiological function of calpains. Biochem. J. 328: 721-732.
Strobl, S., Fernandez-Catalan, C., Braun, M., Huber, R., Masu­ moto, H., Nakagawa, K., Ine, A, Sorimachi, H., Bourenkow, G., Bartunik, H., Suzuki, K. und Bode, W. (2000). The crystal struc­ ture of calcium-free human m-calpain suggests an electrostatic switch mechanism for activation by calcium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 588-592
Thompson, J.D., Higgins, D.G. und Gibson, T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence align­ ment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl. Acids Res. 22: 4673-4680
Van Etten, W.J., Steen, R.G., Nguyen, H., Castle, A.B., Slonim, D.K., Ge, B., Nusbaum, C, Schuler, G.D., Lander, Es. und Hudson, T.J. (1999). Radiation hybrid map of the mouse genome. Nat. Ge­ net. 22: 384-387
Wang, K.K. (2000). Calpain and caspase: can you tell the diffe­ rence? Trends Neurosci. 23: 20-26
Wang, K.K. und Yuen, P.W. (1997). Development and therapeutic po­ tential of calpain inhibitors. Adv. Pharmacol. 37: 117-152

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (17)

1. Calpain-Protease 12 (Capn12), dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aminosäuresequenz, umfassend die Aminosäuren 1-342 der SEQ ID NO: 1 aufweist, sowie deren funktionale Äquivalente.

2. Capn12 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 aufweist, sowie deren funktionale Äquivalente.

3. Capn12 gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekenn­ zeichnet, dass sie Cystein-Protease-Aktivität aufweist.

4. Calpain-Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eine Capn12 gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche auf­ weist.

5. Polynukleotid, das für eine Capn12 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert, sowie deren funktionale Äquivalente und da­ mit hybridisierbare oder dazu komplementäre Polynukleotide.

6. Polynukleotid gemäß Anspruch 5 mit einer Nukleinsäuresequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8.

7. Expressionskassette, umfassend wenigstens eine regulatorische Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft mit einem Polynukleo­ tid gemäß einem der Ansprüche 5 und 6.

8. Rekombinanter Vektor, der ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 oder eine Expressionskassette gemäß An­ spruch 7 trägt.

9. Mikroorganismus, enthaltend wenigstens einen rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 8.

10. Verfahren zur Herstellung einer Capn12 gemäß einem der An­ sprüche 1 bis 3, wobei man einen Mikroorganismus, welcher die Capn12 produziert, kultiviert und die Capn12 aus der Kultur isoliert.

11. Verwendung einer Capn12 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines Calpain-Proteins gemäß Anspruch 4 als Cystein-Pro­ tease.

12. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine Capn12 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, ein Calpain-Protein gemäß Anspruch 4 oder einen rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 8.

13. Verwendung einer Capn12 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, eines Calpain-Proteins gemäß Anspruch 4 oder eines rekombi­ nanten Vektors gemäß Anspruch 8 zur Herstellung eines Medika­ ments zur Behandlung von Krankheiten oder Krankheitszustän­ den, die im Zusammenhang mit einer unzureichenden Expression der Capn12 stehen.

14. Verwendung einer Capn12 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines Calpain-Proteins gemäß Anspruch 4 zum Screening auf Calpain-Protease-Effektoren.

15. Immunglobulin mit Spezifität für eine Capn12 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.

16. Verwendung von Immunglobulinen gemäß Anspruch 15 oder Capn12-bindender Moleküle zur Diagnose von Krankheiten oder Krankheitszuständen, die im Zusammenhang mit einer Capn12-Ex­ pression stehen.

17. Verwendung von Polynukleotiden gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 zur Diagnose von Krankheiten oder Krankheitszuständen, die im Zusammenhang mit einer Capn12-Expression stehen.