WO1999053091A2 - Gdnf-kodierende dna, teile davon und gdnf-varianten - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten sowie gegen sie gerichtete Antikörper. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der GDNF-kodierenden DNA, Teile davon und der GDNF-Varianten.

Description

  
 



   GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten Die vorliegende Erfindung betrifft eine GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten sowie gegen sie gerichtete   Antikörper.    Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der GDNF-kodierenden DNA, Teile davon und der GDNF-Varianten.



  Neurotrophe Faktoren sind Proteine, die im Nervensystem oder in durch das Nervensystem innervierten Geweben   vorliegen.      Ihre Aufgabe liegt    in der Versorgung von Glia-und Nervenzellen. Ferner   fördern    sie die Differenzierung von Neuronen. Ein von Gliazellen stammender neurotropher Faktor ist GDNF ("glial cell line-derived neurotrophic factor"). Dieser   gehört    zur   TGF-ss    ("transforming growth   factor-ss")    Superfamilie. GDNF ist ein etwa 30 kd   grosser    Differenzierungs-Faktor   für    die verschiedensten Neuronen. Dies sind z.

   B.   dopaminerge    Neuronen des Mittelhirns, spinal-motorische, kranial-sensorische und sympathische Neuronen wie auch noradrenerge Neuronen des Hinterhirns.



  Ferner   fördert    GDNF die Aufnahme von Dopamin durch das Mittelhirn. Des weiteren haben Versuche mit Parkinson aufweisenden Rhesusaffen gezeigt, dass eine intrazerebrale Verabreichung von GDNF eine funktionelle Wiederherstellung bewirken kann.



  Dies   ässt    vermuten,   dass      über    GDNF in neurodegenerative Erkrankungen, wie Parkinson, amyotrophische   Lateralsklerose    und Alzheimer, eingegriffen werden kann. Ein   solches    Eingreifen   könnte    auf mehreren Ebenen, z. B. auf der Ebene der Expression des GDNF-Gens und der Prozessierung von GDNF, erfolgen. Bisher liegen allerdings   über    diese Ebene keine ausreichenden Erkenntnisse vor.



  Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem die Regulation von GDNF auf molekularer Ebene untersucht und  ggfs. Wege aufgezeigt werden können, mit denen in diese Regulation eingegriffen werden kann.



     Erfindungsgemäss    wird dies durch die   Gegenstände    in den Patentansprüchen erreicht.



  Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit   Mittel,    mit denen kodierende und   regulatorische    Bereiche einer genomischen GDNF-DNA und ihre gegenseitigen Einflüsse untersucht werden können. Ferner sind es Mittel, mit denen die Expression, insbesondere verschiedene Expressionsformen, einer   solchen    DNA, bestimmt werden können. Desweiteren sind es   Mittel,    die ein gezieltes Eingreifen in die Regulation dieser DNA   ermöghchen    können.



  Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders   über    die Struktur und die   transkriptionelle    Regulation einer genomischen GDNF-DNA. Der   Anmelder    hat eine solche DNA im humanen Genom am   Genlocus    5p   12-p13.1    identifiziert. Er hat diese DNA auf dem PAC Klon 24B12 isoliert und charakterisiert   (vgl.    Fig. 1). Ferner hat er die Sequenz   für    die kodierenden und   für    die transkriptionelle Regulation wichtigen Bereiche der GDNF-DNA aufgeklärt   (vgl.    Fig. 2).

   Die DNA enthält drei Exons, die   für    eine 3.6 kb   grolle      cDNA    kodieren, sowie   grosse    5'-und   3'-untranslatierte    Regionen   (UTRs).    Die 3'-UTR enthält ein polymorphes AGG-"repeat", das   allerdings    in Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen, wie Parkinson, idiopathisches Parkinson Syndrom, ALS,   Alzheimer,    spinozerebellare Ataxie oder   dopa-responsive    Dystonie, nicht in   klinisch    relevanter   Häufung      vorliegt.    Die Transkription der GDNF-DNA wird durch einen eine TATA-Box   enthaltenden    Promotor bewirkt, der vor Exon 1 liegt.

   Ein zweiter Promotor befindet sich vor Exon 2. Der erste Promotor kann durch verschiedene Substanzen in seiner Promotoraktivität verstärkt werden. Solche Substanzen sind z. B. der Entzündungsmediator   Tetradecanoyl-1 2-phorbol-acetat    (TPA), der   Fibroblasten-Wachstumsfaktor    2 (FGF2bFGFf), cAMP wie auch das Differenzierungsmittel Retinoesäure (RA).



  Diese Substanzen spielen eine wichtige Rolle in Entwicklungsprozessen der Zelle  wie auch in anti-apoptotischen, durch   Verietzungen    induzierten Signalwegen.



  Des weiteren hat der Anmelder DNAs gefunden, die   für    GDNF-Varianten kodieren. Eine dieser DNAs   umfasst    die Exons 1,2 und 3. Eine andere DNA   umfasst    die Exons 1,2 und 3, wobei Exon 2 eine 78 bp   grosse    Deletion aufweist.



  Eine weitere DNA   umfasst    die Exons 1 und 3. Die Sequenzen dieser DNAs und der entsprechenden GDNF-Varianten sind in Fig. 3 angegeben. Der Anmelder hat erkannt,   dass    Exon 2   für    eine sekretierbare Form von GDNF notwendig ist, während Exon 3   für    eine intrazelluläre Form ausreicht. Auch hat er erkannt,   dass    Exon 1 nicht   translatiert    wird.



     Erfindungsgemäss    werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, eine GDNFkodierende DNA   bereitzustellen,    umfassend die Sequenz von Fig. 2 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare   unterschiedliche    Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der DNA von Fig. 2 hybridisiert und keine   GDNF-cDNA    ist.



  Die DNA von Fig. 2 wurde als E.   coli 24B12    bei der DSMZ (Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und   Zellkulturen)    am 20.   März    1998 unter DSM 12063 hinterlegt.



  Der Ausdruck"eine durch ein oder mehrere Basenpaare   unterschiedliche    Sequenz"umfasst jegliche   für    GDNF-kodierende Sequenz, die mit der DNA von Fig.



  2 hybridisiert und keine   GDNF-cDNA    ist. Die Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 2 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Der Ausdruck   "Hybridisierung"weist    auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20 C unter dem Schmeizpunkt der Sequenz hin. Der Ausdruck "keine   GDNF-cDNA"weist    darauf hin, dass die Sequenz Elemente   umfasst,    die in einer   cDNA      fehlen.    Solche   Elemente    sind z. B. Intron-oder   transkriptionelle    Regulations-Sequenzen.



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA mit Promotor  Aktivität,    umfassend die in Fig. 2 als Promotorfragment 1 angegebene Sequenz oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz,  wobei letztere Sequenz mit der ersteren hybridisiert.



  Der Ausdruck"eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz"umfasst   jegliche    Sequenz, die mit der in Fig. 2 als Promotorfragment angegebenen Sequenz hybridisiert und eine Promotor-Aktivität aufweist. Die Sequenz kann sich von der in Fig. 2 als Promotorfragment angegebenen Sequenz durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks   "Hybridisierung"wird    auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.



  Der   Ausdruck"Promotor-Aktivität"weist    darauf hin,   dass      übliche    Verfahren zum Nachweis einer Promotor-Aktivität verwendet werden   können.    Beispielsweise kann ein Reporter-Gen, z. B. ein Luciferase-Gen, an das 3'-Ende der auf ihre Promotor-Aktivität hin zu testenden Sequenz ligiert werden. Das erhaltene DNA  Molekül    kann in   Zellen    transfiziert und die Expression des Luciferase-Gens bestimmt werden, wodurch die Promotor-Aktivität nachgewiesen wird.



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, die sich zum Nachweis von GDNF-Sequenzen eignet.   Insbesondere    eignet sich die DNA als Primer bzw.   Primer-Paar für    ein PCR-Verfahren. Eine solche DNA   umfasst    eine der in Fig. 4 angegebenen Sequenzen oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basen unterschiedliche Sequenz, wobei letztere mit der komplementären Sequenz der in Fig. 4 angegebenen DNA hybridisiert.



  Der Ausdruck"eine durch ein oder mehrere Basen   unterschiedliche    Sequenz"   umfasst    jegliche Sequenz, die mit der komplementären Sequenz der in Fig. 4 angegebenen DNA hybridisiert. Die Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 4 durch Additionen,   Deletionen,    Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basen unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks"Hybridisierung"wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die   für    eine GDNF-Variante kodiert. Die Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA,  z. B. eine   cDNA,    sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfasst :   (a)    Die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare    unterschiedliche    DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und Exon-1 und/oder Exon 2-Sequenzen von GDNF aufweist, oder (b) eine mit der DNA von (a)   über    den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.



  Der Ausdruck"eine durch ein oder mehrere Basenpaare   unterschiedliche    DNA"   umfasst    jegliche   für    GDNF-kodierende DNA, die mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und Exon-1 und/oder Exon 2-Sequenzen von GDNF aufweist. Die DNA kann sich von der DNA von Fig. 3 durch Additionen,   Deletionen,    Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Hinsichtlich des   Ausdrucks"Hybridisierung"wird    auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine GDNF-Variante. Eine   solche umfasst    durch Exon 2 und Exon 3 kodierte   Aminosäuren.      Insbesondere      umfasst    eine   erfindungsgemässe    GDNF-Variante die Aminosäuresequenz von Fig.



  3 (a) bzw. (b) oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren   unterschiedliche    Aminosäuresequenz, wobei die DNA-Sequenz der   letzteren    Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 3 (a) bzw. (b) hybridisiert und Exon 2und Exon 3-Sequenzen aufweist.



  Der Ausdruck"eine durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz"umfasst jegliche   GDNF-Aminosäuresequenz,    deren DNA Sequenz mit der DNA von Fig. 3 (a) bzw. (b) hybridisiert und Exon 2 und Exon 3-Sequenzen aufweist. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 3 (a) bzw. (b) durch Additionen,   Deletionen,    Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks    "Hybridisierung"wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.   



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination aus einer GDNF-Variante und einem Rezeptor, an den die GDNF-Variante bindet. Der   Ausdruck"GDNF-Variante"umfasst    eine vorstehende GDNF-Variante. Ferner   umfasst    er eine GDNF-Variante, die keine durch Exon 2 kodierten Aminosäuren aufweist.



  Eine   erfindungsgemässe    DNA kann   als solche    oder in Kombination mit jeglicher anderen DNA vorliegen.   Beispielsweise    kann eine   erfindungsgemässe,    eine   Promotor-Aktivität    aufweisende DNA in Kombination mit einer zu transkribierenden DNA, z. B. einem Reporter-Gen oder einem Struktur-Gen, vorliegen. Eine solche Kombination kann in üblichen Vektoren erfolgen.   Für    eine Kombination mit einem Reporter-Gen, z. B. einem Luciferase-Gen, bieten sich Vektoren, wie pXP1 und   pAH1409,    an. Diese können dann zur Transfektion von Zellen, wie NIH3T3 und   293-Zellen,    verwendet werden.

   Mit der Kombination aus einer   erfindungsgemässen,    eine Promotor-Aktivität aufweisenden DNA und einem Reporter-Gen ist es möglich, die Promotor-Aktivität unter den verschiedensten Bedingungen zu testen. Damit können Substanzen gefunden werden, mit denen die Promotor-Aktivität und somit die Regulation der Expression einer GDNF-DNA   beeinflusst    werden   können.    Solche Substanzen können aktivierend bzw. inhibierend sein.



  Ferner kann eine   erfindungsgemässe, für    eine GDNF-Variante kodierende DNA in einem Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors   für    E. coli sind dies z. B.   pGEMEX,    pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8.   Für    die Expression in Hefe sind z. B.   pY100    und   Ycpad1    zu nennen, während   für    die Expression in tierischen Zellen z. B.   pKCR,      pEFBOS,    cDM8, pCEV4, pBC140 und Rep 7 anzugeben sind.   Für    die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.  



  Der Fachmann kennt geeignete   Zelien,    um die   erfindungsgemässe,    in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele   solcher      Zellen    umfassen die E.   coli-Stämme    HB101,   DH1, x1776, JM101, JM    109, BL21 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen   Zellen    L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa und HEK293 sowie die Insektenzelien sf9.



  Der Fachmann   weiss,    in welcher Weise die   erfindungsgemässe    DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden   muss.    Ihm ist auch bekannt,   dass    diese DNA in Verbindung mit einer   für    ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so dass die   erfindungsgemässe    DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.



  Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zelien zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die   erfindungsgemässe    DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu   isolieren    und zu reinigen.



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter   Antikörper.    Ein   solcher      Antikörper    kann durch übliche Verfahren   hergestellt    werden. Er kann   polyklonal    bzw. monoklonal sein.

   Zu seiner Herstellung ist es   günstig,    Tiere, insbesondere Kaninchen,   Hühner    oder Ratten   für    einen   polyklonalen    und   Mäuse    oder Ratten   für    einen monoklonalen   Antikörper,    mit einem vorstehenden (Fusions) protein oder Fragmenten davon zu   immunisieren.    Weitere"Booster"der Tiere können mit dem gleichen (Fusions) protein oder Fragmenten davon   erfolgen.    Der   polyklonale      Antikörper    kann dann aus dem Serum bzw.

   Eigelb der Tiere   erhalten    werden.   Für    den   monoklonalen      Antikörper    werden   Milzzellen    der Tiere mit   Myelomzellen    fusioniert.



  Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit. Ein   solcher      umfasst    eine oder mehrere der folgenden Komponenten :   (a) eine   erfindungsgemässe    DNA, (b) eine   erfindungsgemässe    GDNF-Variante, (c) ein   erfindungsgemässer      Antikörper,    sowie (d)   übliche    Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer,   Lösungsmittel,      Kontrollen,    etc.



  Von den einzelnen Komponenten können jeweils ein oder mehrere Vertreter   vorliegen. Hinsichtlich    der einzelnen   Ausdrücke    wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Diese gelten hier entsprechend.



  Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die Regulation von GDNF auf molekularer Ebene zu untersuchen. Mit einem   erfindungsgemässen      Antikörper    kann eine GDNF-Variante nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung der GDNF-Variante zu Geweben und/oder Funktionen   hergestellt    werden. Ferner kann mit einer   erfindungsgemässen    GDNF-Variante ein gegen dieses Protein gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden.

   Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen   ELISA,    eine Immunpräzipitation oder durch   Immunfluoreszenz, erfolgen.    Desweiteren kann mit einer   erfindungsgemässen Nukleinsäure,    insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Organisation und die Expression des   für    GDNF kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher Weise, insbesondere in einem Southern Blot oder   über"in    situ"Hybridisierung, erfolgen.



  Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung,   Massnahmen      für    und gegen das   Vorliegen    von GDNF in Personen zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemässen   Antikörper    kann eine GDNF-Variante inhibiert werden. Andererseits kann mit einer   erfindungsgemässen    GDNF-Variante, insbesondere nach Kopplung an ein vom   Körper    nicht als fremd angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder BSA, die Menge der GDNF-Variante in Personen   erhöht    werden. Entsprechendes kann auch mit einer   erfindungsgemässen    Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, erreicht werden, die unter die   Kontrolle    eines in bestimmten Geweben, z.

   B. Gehirn, induzierbaren Promotors   gestellt    wird und nach ihrer Expression zur    Bereitstellung einer GDNF-Variante in diesen Geweben führt. Darüberhinaus kann    eine   erfindungsgemässe    Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, auch zur   Inhibierung    von GDNF genutzt werden. Hierzu wird die Nukleinsäure, z. B. als Basis   für    die Erstellung von Anti-Sinn-Oligonukleotiden zur Expressions Inhibierung des   für    GDNF kodierenden Gens verwendet. Somit   stellt    die vorliegende Erfindung Mittel dar, neurodegenerative Erkrankungen, wie Parkinson, amyotrophische   Lateralsklerose    und   Alzheimer,    besser zu diagnostizieren und therapeutisch eingreifen   können.   



  Kurze Beschreibung der Zeichnungen.



  Fig. 1 zeigt die Organisation einer genomischen GDNF-DNA, wobei in A) eine grobe und in B) eine detaillierte Restriktionskarte angegeben ist. Exons sind als Boxen angegeben, wobei   ausgefüilte    Teile dieser kodierende Bereiche und nicht-ausgefüllte Teile UTRs sind. Ferner ist die Lage des AGG-"repeat"und der Poly A-Sequenzen angegeben.



  Fig. 2 zeigt die Sequenzen der Exons 1,2 und 3 einer genomischen
GDNF-DNA. Ferner sind Sequenzen der Introns, des
Promotorfragments 1, des AGG-"repeat"und der   Poly    A
Sequenzen angegeben.



  Fig. 3 zeigt die DNA-und Aminosäuresequenzen   für    GDNF-Varianten, In
Fig. 3 (a)   umfasst    die Variante auf der DNA-Ebene die Exons 1,2 und 3, in Fig. 3 (b) die Exons 1,2 und 3, wobei Exon 2 eine 78 bp grosse Deletion aufweist, und in Fig.   3 (c)    die Exons 1 und 3. Auf der Proteinebene   umfasst    die GDNF-Variante jeweils nicht den durch
Exon 1 kodierten Bereich.



  Fig. 4 zeigt Primer-Paare, die sich   für    eine PCR-Reaktion zum Nachweis von GDNF-Sequenzen eignen.   Fig. 5 zeigt die Expression einer GDNF-Variante, welche die durch die
Exon 2 und 3 kodierten Bereiche   umfasst.    Die GDNF-Variante wird in das Medium sekretiert.



  Fig. 6 zeigt die Promotor-Aktivität des Promotorfragments 1 von Fig. 2 und ihre Verstärkung durch Substanzen.



  Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.



  Beispiel 1 : Expression einer   für    eine GDNF-Variante kodierenden DNA Es wird eine   erfindungsgemässe      für    eine GDNF-Variante kodierende DNA exprimiert, welche die Exons 1,2 und 3   umfasst.    Hierzu wird aus   293-Zellen    Gesamt-RNA isoliert und einem RT-PCR-Verfahren unterzogen. Als Primer-Paar   für    das PCR-Verfahren werden die nachstehenden Primer verwendet, die eine Xhol-Restriktionsstelle aufweisen :
GDL.   f    : 3'-ATGGCCGCCTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGG-3'
GDX.   r    : 5'-GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACC-3' Die erhaltene cDNA wird einer Xhol-Spaltung unterzogen und in den mit Xholgeöffneten Expressionsvektor   pBC140    bzw. Rep 7 inseriert.

   Es wird das Expressionsplasmid pBC140-GDNF bzw. Rep 7-GDNF erhalten.



  Dieses wird zur Transfektion von tierischen   Zellen    verwendet, wobei   2, ug    des Expressionsplasmids 1,5 x   106Zellen    zugegeben werden. Die Zellen werden in konditioniertem Medium kultiviert. 24 Stunden bzw. 48 Stunden nach Transfektion werden die Zellen geerntet und das Medium gesammelt. Die   Zellen    werden einer   Ultraschall-Behandlung    unterzogen, wodurch Zellysate gewonnen werden.

   Diese werden zusammen mit dem Medium und GDNF-Kontrolle einer 12   % igen Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, der   anschliessend    ein Blot Verfahren   folgt.    Nach diesem wird die   Nitrocellulosemembran      über    Nacht bei   4 C    mit einem   Kaninchen-Antikörper    (Sta. Cruz) inkubiert, der den durch Exon 3 kodierten Bereich von GDNF erkennt. Die   Antikörperbindung    wird dann durch   2stündige    Inkubation bei   4 C    mit einem markierten Ziege-anti-Kaninchen  Antikörper    (Tropix) sichtbar gemacht   (vgl.    Fig. 5).



  Es zeigt sich, dass eine   erfindungsgemässe,      für    eine GDNF-Variante kodierende DNA exprimiert werden kann. Ferner wird deutlich,   dass    eine die Exons 1,2 und 3 umfassende GDNF-DNA   für    eine GDNF-Variante kodiert, die von der Zelle   sekretiert    wird.



  Beispiel 2 : Nachweis von Promotor-Aktivität einer   erfindungsgemässen    DNA Es wird der Vektor   pAH 1409    verwendet. Dieser enthält ein Reporter-Gen, nämlich ein Luciferase-Gen. Am 5'-Ende des Luciferase-Gens befindet sich ein Polylinker, in den das 1,1 kb grosse EcoRI/Pstl-Fragment (Promotorfragment 1 von Fig. 2) inseriert wird. Es wird das Expressionsplasmid pAH 1409-GDNF erhalten.



  Dieses wird zur Transfektion von tierischen   Zellen    verwendet, wobei   2, ug    von    pAH1409-GDNF 1,5 x 106 Zellen zugegeben werden. Ferner wird in einem      Verhäitnis    von 1 : 5 ein DNA-Konstrukt cotransfiziert, das   für    GFP ("Green Fluorescent Protein") kodiert. Als   Kontrolle    wird   pAH1409    in   Parallelversuchen    transfiziert.

   Die   Zellen    werden unbehandelt bzw. mit TPA   (100 ng/ml),    8-BromcAMP (1   mM),      Retinoesäure    (RA   1 O, uM), bFGF    (10   ng/ml)    oder   IFNg    (1000 Enzymeinheiten) behandelt. 44-48 Stunden nach Transfektion werden die   Zellen    geerntet und es wird ein   Luciferase-Nachweis durchgeführt (vgl.    Fig. 6).



  Es zeigt sich,   dass    eine   erfindungsgemässe,    das Promotorfragment 1 von Fig. 2 umfassende DNA eine Promotor-Aktivität aufweist und diese durch Substanzen verstärkt werden kann.  



  Beispiel 3 :   Herstellung    und Reinigung einer   erfindungsgemässen    GDNF-Variante Die amplifizierte DNA von Beispiel 1 wird mit   Xhol    gespalten und in den mit   Xhol      gespaltenen    Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wird das Expressionsplasmid pQ/GDNF erhalten. Ein solches kodiert   für    ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem   erfindungsgemässen    GDNF von Fig. 3 (a)   (C-Terminuspartner).    pQ/GDNF wird zur Transformation von E. coli SG 13009   (vgl.    Gottesman, S. et   al.,    J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwendet.

   Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit   100, ug/ml Ampicillin    und   25, ug/ml Kanamycin kultiviert    und 4 h mit 60, uM   Isopropyl-ss-D-Thiogalactopyra-    nosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M   Guanidinhydrochlorid    wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschliessend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8   M    Harnstoff entsprechend der Angaben des   Herstellers    (Qiagen) des   Chromatographie-Materials durchgeführt.   



  Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner   Neutralisierung    wird das Fusionsprotein einer 18 %   SDS-Polyacrylamid-      Gelelektrophorese      unterworfen    und mit Coomassie-Blau   angefärbt      (vgl.    Thomas, J.   O.    und Kornberg, R. D., J.   Mol. Biol.    149 (1975), 709-733).

 

  Es zeigt sich,   dass    ein   erfindungsgemässes    (Fusions) protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.



  Beispiel 4 : Herstellung und Nachweis eines   erfindungsgemässen    Antikörper. s Ein   erfindungsgemässes    Fusionsprotein von Beispiel 3 wird einer 18 % SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach   Anfärbung    des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 30 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter   Kochsatztösung    inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert, bevor die Prote  Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen Pro Immunisierung werden   35, ug Gel-gereinigtes    Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.



  Tag   0    : 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 14 : 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans ; icFA) Tag 28 : 3. Immunisierung (icFA) Tag 56 : 4. Immunisierung (icFA) Tag 80 : Ausbluten Das Serum des Kaninchens wird im   Immunoblot    getestet. Hierzu wird ein   erfindungsgemässes    Fusionsprotein von Beispiel 1 einer   SDS-Polyacrylamid-    Gelelektrophorese unterzogen und auf ein   Nitrocellulosefilter übertragen (vgl.   



  Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et   al.,    Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben,   durchgeführt.    Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei   37 C    mit einem ersten   Antikörper    inkubiert. Dieser   Antikörper    ist das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten   Antikörper    inkubiert. Dieser   Antikörper    ist ein mit   alkalischer    Phosphatase   gekoppelter      monoklonaler    Ziege   Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper    (Dianova) (1 : 5000) in PBS.

   Nach   30-minütiger    Inkubation   bei-37 C folgen    mehrere Waschschritte mit PBS und anschliessend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung   (36, uM.    5'   Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400, uM Nitrobiau-tetrazolium, 100mM    Tris  HCI,    pH 9.5,100 mM NaCI, 5 mM   MgCI2)    bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.



  Es zeigt sich,   dass      erfindungsgemässe,      polyklonale      Antikörper      hergestellt    werden   können.     



     Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn    Pro Immunisierung werden   40Ng Gel-gereinigtes    Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8   ml komplettem    bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.



  Tag   0.1.    Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 28 : 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans ; icFA) Tag 50 : 3. Immunisierung (icFA) Aus Eigelb werden   Antikörper    extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden   erfindungsgemässe,      polykionale Antikörper    nachgewiesen.



  Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus bzw. Ratte Pro Immunisierung werden   12, ug Gel-gereinigtes    Fusionsprotein in 0,25   ml    PBS und 0,25 ml   komplettem    bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt ; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans)   gelost.   



  Tag   0.1.    Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 28 : 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans ; icFA) Tag 56 : 3. Immunisierung (icFA) Tag 84 : 4. Immunisierung (PBS) Tag 87 : Fusion Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungs  gemäRe,    monoklonale   Antikörper    werden nachgewiesen.



  Es zeigt sich, dass eine   erfindungsgemässe    DNA eine Promotor-Aktivität aufweist und diese durch Substanzen verstärkt werden kann.   

Claims

Patentansprüche

1 . GDNF-kodierende DNA, umfassend die Sequenz von Fig. 2 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der DNA von Fig. 2 hybridisiert und keine GDNF-cDNA ist.

2. DNA mit Promotor-Aktivität, umfassend die in Fig. 2 als Promotorfragment 1 angegebene Sequenz oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der ersteren hybridisiert.

3. DNA nach Anspruch 2, wobei die DNA in Kombination mit einer zu transkribierenden DNA vorliegt.

4. DNA nach Anspruch 3, wobei die zu transkribierende DNA ein Reporter- Gen ist.

5. DNA, geeignet zum Nachweis von GDNF-Sequenzen, umfassend eine der in Fig. 4 angegebenen Sequenzen oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basen unterschiedliche Sequenz, wobei letztere mit der komplementä- ren Sequenz der in Fig. 4 angegebenen DNA hybridisiert.

6. DNA, kodierend für eine GDNF-Variante, umfassend:

(a) Die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und Exon-1 und/oder Exon 2-Sequenzen von

GDNF aufweist, oder

(b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

7. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 6.

8. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 7.

9. GDNF-Variante, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 3 (a) bzw. (b) oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei die DNA-Sequenz der letzteren Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 3 (a) bzw. (b) hybridisiert und Exon 2- und Exon 3-Sequenzen aufweist.

10. Antikörper, gerichtet gegen die GDNF-Variante nach Anspruch 9.

1 1 . Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1 -6 oder der GDNF- Variante nach Anspruch 9 zur Untersuchung der Regulation von GDNF.

12. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1 -6 oder der GDNF- Variante nach Anspruch 9 zur Diagnose und/oder Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen.

1 3. Verwendung nach Anspruch 1 2, wobei die neurodegenerativen Erkrankungen Parkinson, amyothrophische Lateralsklerose und Alzheimer umfassen.