EP1294895A2 - Calpain-protease 12 - Google Patents

Calpain-protease 12

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Publication number
EP1294895A2
EP1294895A2 EP01949449A EP01949449A EP1294895A2 EP 1294895 A2 EP1294895 A2 EP 1294895A2 EP 01949449 A EP01949449 A EP 01949449A EP 01949449 A EP01949449 A EP 01949449A EP 1294895 A2 EP1294895 A2 EP 1294895A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
capnl2
seq
calpain
expression
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01949449A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Boehm
Neil T. Dear
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott GmbH and Co KG
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1294895A2 publication Critical patent/EP1294895A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the invention relates to a new calpain protease called calpain protease 12 and functional analogs thereof (hereinafter referred to as Capnl2); nucleic acids coding therefor; recombinant vectors containing these coding sequences; microorganisms transfected therewith; Process for recombinant production of Capnl2; as well as various applications of Capnl2 and nucleic acids coding therefor.
  • Capnl2 calpain protease 12 and functional analogs thereof
  • Calpaine are a family of cytosolic cysteine proteases.
  • the classic calpains consist of an isoform-specific large subunit (80 kDa) and an invariable small subunit (30 kDa), which is called Capn4.
  • the large subunit of classic calpains has a four-domain structure, comprising a domain with protease activity and a C-terminal, calmodulin-like domain that can bind calcium.
  • Calpaine cleave numerous substrates (Carafoli and Molinari, 1998) and have been associated with a variety of processes, including apoptosis (ang, 2000), cell division (Mellgren, 1997), modulation of integrin cytoskeleton interactions (S ⁇ hoenwalder et al ., 1997) and synaptic plasticity (Chan and Mattson, 1999). They have also been associated with numerous pathological conditions, such as Alzheimer's, cataract, demyelination, cardiac ischemia, inflammation and traumatic brain injury (review: Carafoli and Molinari, 1998; Sorimachi et al., 1997; Wang and Yuen, 1997).
  • Capn3 Mutations in the Capn3 gene are responsible for type 2A pelvic girdle muscular dystrophy (Richard et al., 1995). Due to the diverse physiological and pathological functions of calpains, the task was to provide new homologs of the gene family of the large calpain subunit. In this way, for example, new active substances or new active substance targets can be found or developed which can be used in the diagnosis, therapy and / or prophylaxis of disease states in which calpains and their substrates or substances acting on them are involved. This task was surprisingly achieved by the provision of a new calpain protease, the calpain protease 12 (Capnl2) and functional equivalents thereof.
  • the Capnl2 is characterized in that it has an amino acid sequence comprising amino acids 1 - 342 of SEQ ID NO: 1.
  • the invention also relates to functional equivalents of this partial sequence.
  • Preferred variants thereof are characterized in that they have an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 1 stands for the amino acid sequence of the splice variant Capnl2A
  • SEQ ID NO: 2 for the amino acid sequence of the splice variant Capnl2B
  • SEQ ID NO: 3 for the amino acid sequence of the splice variant Capnl2C
  • SEQ ID NO: 4 for the Amino acid sequence of Capnl2 from clone 914413 of the mouse EST database.
  • the amino acid sequences SEQ ID NO: 1 to 4 in the N-terminal section of amino acids 1 - 342 are identical to one another.
  • the predicted protein corresponding to the Spli ⁇ e variant Capnl2A has 720 amino acids and a molecular weight of 80.5 kDa.
  • the invention also relates to the functional equivalents of Capnl2 or the specifically disclosed amino acid sequences.
  • Functional equivalents comprise amino acid sequences which can be derived from the specific sequences and in which, in comparison, one or more amino acids are substituted, deleted, inverted or added, without the cysteine protease activity and / or at least Another characteristic of the Capnl2 can be essentially influenced. Additional Capnl2 characteristics are described in later sections.
  • the specifically disclosed amino acid sequences represent amino acid sequences of Spli ⁇ e variants of Capnl2, which were determined from a mouse EST database.
  • the invention also relates to all Capnl2 homologs of eukaryotic species, ie the evertebrates and vertebrates, in particular mammals, for example rats, cats, dogs, pigs, sheep, cattle, horses, monkeys and, with particular preference, humans and other naturally occurring variants.
  • all developmental and organ or tissue-specific expressed Capnl2 forms and artificially generated homologs are also included, which have the specified structural and / or functional properties.
  • Capnl2 according to the invention is particularly characterized in that it has cysteine protease activity. In its amino acid sequence, it has the amino acids Cys, His and Asn (in the Spli ⁇ e variants Capnl2A, B and C: Cysl05, His259 and
  • Capnl2A also has a distinctly acidic region and a Calmodulin-like, presumably Ca 2+ -binding region.
  • the Capnl2 according to the invention is also characterized in that the mouse coding gene is located on chromosome 7 between the markers D7Mit72 (10.4 ⁇ M) and D7Mit267 (11.0 cM).
  • the Capnl2 according to the invention is also characterized in that it e.g. in the mouse, in the cortex of the hair follicle of the skin.
  • Capnl2 according to the invention is characterized in that it is expressed in the anagen phase of the hair cycle.
  • the invention also relates to calpain proteins which are characterized in that they have at least one Capn12 according to the invention.
  • a calpain protein preferably has, besides the Capnl2 as a large subunit, a Capn4 as a small protein subunit.
  • no other protein subunits such as regulatory subunits or subunits that mediate the localization of the protein in defined cell compartments, can be included.
  • the invention also comprises polynucleotides which code for a Capn12 according to the invention, and their functional equivalents and polynucleotides which can be hybridized or complementary thereto, comprising single and double-stranded DNA and RNA sequences. quences.
  • polynucleotides can be found when genomic or DNA libraries are patterned and, if appropriate, can be amplified therefrom with suitable primers by means of PCR and then isolated, for example, with suitable probes.
  • Another possibility is the transformation of suitable microorganisms with polynucleotides or vectors according to the invention, the multiplication of the microorganisms and thus the polynucleotides and their subsequent isolation.
  • polynucleotides according to the invention can also be synthesized by ⁇ hemis ⁇ hem ways.
  • the invention also relates to polynucleotides with a nucleic acid sequence selected from SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, Seq ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • SEQ ID NO: 5 stands for the nucleic acid sequence of ⁇ DNA of the Spli ⁇ e variant Capnl2A
  • SEQ ID NO: 6 for the nucleic acid sequence of the ⁇ DNA of Capnl2B
  • SEQ ID NO: 7 for the nucleic acid sequence of the ⁇ DNA of Capnl2C
  • SEQ ID NO: 8 for the genomic nucleic acid sequence of the Capnl2 of the mouse, comprising all exons - and intron sequences.
  • the predicted genomic sequence of the mouse Capnl2 comprises 21 exons and a genomic separation of 13116 base pairs.
  • Functional equivalents of polynucleotides according to the invention include sequences derived by degeneration of the genetic code and thus silent nucleotide substitutions (i.e. without changes in the resulting amino acid sequence) and conservative nucleotide substitutions (i.e. the amino acid in question is replaced by an amino acid of the same charge, size, polarity and / or solubility).
  • Functional equivalents of polynucleotides according to the invention thus have a sequence changed by nucleotide substitution, deletion, inversion or addition, but also code for a functionally equivalent Capnl2, such as e.g. with the same or comparable cysteine protease activity.
  • polynucleotides which are suitable according to the invention comprise at least one of the partial sequences which code for characteristic amino acid sequences of the Capn12.
  • the invention also relates to the primer sequences SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, which can hybridize or are complementary to polynucleotides according to the invention and can be used, for example, for their amplification by RT-PCR or PCR.
  • the property of being able to hybridize to polynucleotides means the ability of a poly- or oligonucleotide to bind to an almost complementary sequence under stringent conditions, while under these conditions unspecific bindings between no complementary partners.
  • the sequences must be 70-100%, preferably 90-100%, complementary.
  • the property of complementary sequences of being able to specifically bind to one another is exploited, for example, in Northern or Southern blot technology or in primer binding in PCR or RT-PCR. Usually oligonucleotides from a length of 30 base pairs are used.
  • Stringent conditions mean, for example, in Northerner blot technology the use of a 50-70 ° C, preferably 60-65 ° C warm water solution, for example 0.1x SSC buffer with 0.1% SDS (20x SSC: 3M NaCl, 0.3M Na citrate, pH 7.0) for the elution of unspecific hybridized ⁇ DNA probes or oligonucleotides.
  • a 50-70 ° C, preferably 60-65 ° C warm water solution for example 0.1x SSC buffer with 0.1% SDS (20x SSC: 3M NaCl, 0.3M Na citrate, pH 7.0) for the elution of unspecific hybridized ⁇ DNA probes or oligonucleotides.
  • SDS 3M NaCl, 0.3M Na citrate, pH 7.0
  • the invention also relates to expression cassettes which comprise at least one polynucleotide according to the invention which is operatively linked to at least one regulatory nucleic acid sequence.
  • a promoter sequence is preferably located 5 'upstream from the polynucleotide according to the invention and in this way enables controlled expression of the Capn12.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of regulatory and coding sequences, such as of promoter, coding sequence, terminator and possibly further regulatory elements such that each of the regulatory elements can perform its function as intended before, during or after expression of the coding sequence.
  • regulatory and coding sequences such as of promoter, coding sequence, terminator and possibly further regulatory elements such that each of the regulatory elements can perform its function as intended before, during or after expression of the coding sequence.
  • further operatively linkable sequences are targeting sequences, translation enhancers, enhancers, polyadenylation signals and the like.
  • Usable regulatory elements also include selectable markers, amplification signals, origins of replication and the like.
  • the natural regulatory sequence may be present before the actual structural gene. This natural regulation can possibly be withheld by genetic modification and the expression of the genes increased or decreased.
  • the expression cassette can, however, have a more simple structure, ie no additional regulation signals are inserted in front of the structural gene and the natural promoter with its regulation is not removed. Instead, for example, the natural regulatory sequence are mutated in such a way that regulation no longer takes place and gene expression is increased or decreased.
  • the nucleic acid sequences can be contained in the expression cassette in one or more copies.
  • brewable promoters are: ⁇ os-, ta ⁇ -, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, la ⁇ -, lpp-la ⁇ -, la ⁇ lq-, T7-, T5-, T3-, gal-, tr ⁇ -, ara, SP6, ⁇ -PR or in the ⁇ -PL promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria; as well as the gram-positive promoters amy and SP02, the yeast promoters ADCl, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH or the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos or the Ubiquitin or phaseolin promoter.
  • inducible promoters such as, for example, light-inducible and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P ⁇ promote
  • the regulatory sequences mentioned are intended to enable the targeted expression of the nucleic acid sequences and the protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is immediately expressed or overexpressed. These regulatory elements can also be used to express tissue, cell or development-specific elements if the vector is introduced into a higher organism, such as an animal or a plant.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the expression and thereby increase or decrease it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example by increasing the stability of the mRNA.
  • Enhancers are to be understood, for example, as DNA sequences which bring about increased expression via an improved interaction between RNA polymerase and DNA.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusion of a suitable promoter with a suitable polynucleotide encoding Capn12, and a terminator or polyadenylation signal. Common recombination and cloning techniques are used for this, such as insertion via restriction enzyme sections or how they are used. for example in T. Maniatis, EF Frits ⁇ h and J.
  • the invention also relates to recombinant vectors for transforming eukaryotic or prokaryotic hosts which carry a polynucleotide according to the invention or an expression cassette according to the invention. These vectors allow the expression of Capnl2 in a suitable host organism. Vectors are well known to the person and can be found, for example, in "Cloning Ve ⁇ tors" (Pouwels P.H. et al., Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person, such as phages, viruses, such as SV40, CMV, Baululovirus and adenovirus, transposons, IS elements, plasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or chromosomally.
  • the invention also relates to microorganisms which contain a vector according to the invention or which express the Capnl2 endogenously. These can be used to produce recombinant
  • Capnl2 can be used.
  • the recombinant expression cassettes according to the invention described above are advantageously incorporated and expressed as part of an expression vector in a suitable host system.
  • Common cloning and transfection methods known to the man are preferably used, such as, for example, co-precipitation, protoplast fusion, electroporation, retroviral transfection and the like, in order to express the nucleic acids mentioned in the respective expression system.
  • Suitable systems are described, for example, in Current Proto ⁇ ols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Ed., Wiley Inters ⁇ ien ⁇ e, New York 1997 and in J. Sambrook, E.F. Frits ⁇ h and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980).
  • host organisms for transformation with vectors according to the invention.
  • Host organisms mean, for example, bacteria, fungi, yeasts, plant or animal cells.
  • Preferred organisms are bacteria, such as those of the genera Es ⁇ heri ⁇ hia, such as eg Escheri ⁇ hia ⁇ oli, Streptomy ⁇ es, Bacillus or Pseudomonas, eukaryotic microorganisms, in particular yeasts such as Sa ⁇ haromy- ⁇ es ⁇ erevisiae, Aspergillus, higher eukaryotic cells from animals or plants, for example Sf9 or CHO cells.
  • the gene product can also be used for expression in transgenic organisms such as transgenic animals, such as, in particular, mice, ports or transgenic plants.
  • the transgenic organisms can also be so-called knock-out animals or plants in which the corresponding endogenous gene has been kept, such as by mutation or partial or complete deletion.
  • Successfully transformed organisms can be selected using marker genes which are also contained in the vector or in the expression cassette.
  • marker genes are genes for antibiotic resistance and for enzymes which catalyze a color-giving reaction which stains the transformed cell. These can then be selected using automatic cell sorting.
  • Microorganisms transformed successfully with a vector and carrying an appropriate antibiotic resistance gene e.g. G418 or hygromy ⁇ in
  • an appropriate antibiotic resistance gene e.g. G418 or hygromy ⁇ in
  • Marker proteins which are presented on the cell surface, can be used for selection by means of affinity chromatography.
  • the combination of the host organisms and the vectors suitable for the organisms form an expression system.
  • the term “expression system” means the combination of mammalian cells, such as CHO cells, and vectors, such as p ⁇ DNA3neo vector, which are suitable for mammalian cells.
  • the gene product can advantageously also be found in transgenic animals, e.g. Mice, ports or transgenic plants are brewed for expression. It is also possible to program cell-free translation systems with the RNA derived from the nucleic acid.
  • the invention furthermore relates to processes for producing a Capnl2 according to the invention, in which a Capnl2-producing microorganism is cultivated, where appropriate the expression of the Capnl2 is induced and the Capnl2 is isolated from the culture.
  • the Capnl2 can thus also be produced on an industrial scale if this is desired.
  • the microorganism can be cultivated and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 ° C and a pH of 6 to 9. Suitable cultivation conditions are described in detail, for example, in T. Maniatis, E.F. Frits ⁇ h and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
  • Capnl2 is not secreted into the culture medium, the cells are then disrupted and the Capnl2 is obtained from the lysate by known protein isolation methods.
  • the cells can optionally have high frequency ultrasound, high pressure, e.g. in a Fren ⁇ h pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by a combination of several of the listed processes.
  • a purification of the Capnl2 can be achieved with known chromatographic processes, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as with other conventional processes such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis.
  • chromatographic processes such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as with other conventional processes such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis.
  • Suitable methods are described, for example, in Cooper, F.G., Bio ⁇ hemis ⁇ he Working Methods, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in S ⁇ opes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • vector systems or oligonucleotides which extend the ⁇ DNA by certain nucleotide sequences and thus code for modified polypeptides or fusion proteins which serve for easier purification.
  • suitable modifications are, for example, so-called “tags” which act as anchors, such as, for example, the modification known as hexa-histidine anchors or epitopes which can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane , D., 1988, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (NY) Press).
  • anchors can be used to attach the proteins to a solid support, such as a polymer matrix, for example, which can be filled in a chromatography column, or can be used on a microtiter plate or on another support. At the same time, these anchors can also be used to recognize the proteins.
  • a solid support such as a polymer matrix, for example, which can be filled in a chromatography column, or can be used on a microtiter plate or on another support.
  • these anchors can also be used to recognize the proteins.
  • conventional markers such as fluorescent dyes, enzyme markers, which form a detectable reaction product after reaction with a substrate, or radioactive markers, alone or in combination with the anchors, can be used to derivatize the proteins.
  • the invention also relates to the use of a Capnl2 according to the invention or a calpain protein according to the invention as a cysteine protease.
  • a Capnl2 according to the invention or a calpain protein according to the invention as a cysteine protease.
  • the use in connection with natural substrates of Capnl2 is preferred, however, all substrates can be used which bind to the active center of Capnl2 and are split there.
  • the Capnl2 can thus be used, for example, as a cysteine protease in molecular biological and chemical processes.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions which contain a Capn12 according to the invention, a calpain protein according to the invention or a recombinant vector according to the invention, and at least one pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the Capnl2 according to the invention, the calpain protein according to the invention or the vector can be administered as such, but preferably together with a carrier or diluent.
  • This carrier can be in solid or liquid form depending on the dosage form desired.
  • Suitable pharmaceutical agents can also contain, in addition to a Capn12 according to the invention, a calpain protein according to the invention or a recombinant vector according to the invention, if desired, no further pharmaceutical active ingredients in a mixture or separately in a combination preparation.
  • active substances can enhance the action of the contained Capnl2, the calpain protein or the vector, have a different action mechanism and thus have an additive effect or improve the overall constitution of the patient.
  • the invention furthermore relates to the use of a Capnl2 according to the invention, a calpain protein according to the invention or a vector according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases or disease states which are associated with inadequate expression of the
  • Capnl2 stand.
  • a treatment according to the invention includes the prevention of the development of the disease in a patient with a corresponding predisposition or the therapy of an already existing disease by slowing down or even improving the condition of the patient, possibly until it heals completely.
  • several substitution methods can be used.
  • a Capnl2 or a calpain protein according to the invention can be applied directly or by gene therapy in the form of its coding nucleic acids (DNA or RNA) in a medicament according to the invention.
  • Any vehicle for example both viral (retroviral transfection) and also non-viral vehicles (for example liposome transfection), can be used for gene therapeutic use.
  • Suitable vehicles can bind to precisely defined target cells via suitable receptor molecules or the same specific ones and transform them in a targeted manner.
  • the transfection can take place in the patient's body or removed cells are transfected in vitro and subsequently applied to the patient again.
  • Suitable methods are described, for example, by Strauss and Barranger in Con ⁇ epts in Gene Therapy (1997), Walter de Gruyter, ed.
  • Another method for Capnl2 substitution is the stimulation of the endogenous, endogenous gene.
  • the turn-over or the inactivation of Capnl2 according to the invention for example by proteases, can be blocked in order to achieve an increased number of active Capn12 molecules.
  • agonists of Capnl2 can be used to increase the activity of existing Capnl2 molecules. With reduced Capnl2 expression, this can only be a therapy-supporting procedure.
  • Pharmaceutical agents or medicaments according to the invention can be in the form of tablets, granules, powders, dragées, pastilles, pellets, capsules, suppositories, solutions, emulsions and suspensions for enteral and parenteral administration.
  • Pharmaceutical compositions according to the invention can preferably be contained in gels, lotions and creams for cutaneous application.
  • the respective dosage of pharmaceutical agents or medications according to the invention and the respective dosage schedule are the decision of the treating doctor.
  • the patient will select a suitable dose and a suitable dosing schedule.
  • the pharmacologically active substances can be administered to a mammal (human and animal) in doses of approximately 0.5 mg to 100 mg per kg of body weight per day. They can be administered in single dose or in multiple doses.
  • the areas of application include diseases and disease states which are associated with an inadequate Capn12 expression.
  • the invention also relates to the use of a Capn12 according to the invention or a calpain protein according to the invention for screening for calpain protease E fectors.
  • Calpain protease effectors are understood to mean, for example, substances which can influence the activity of Capnl2 and / or other calpaines, such as activators or inhibitors, or those which can act on the substrates of Capnl2 during enzymatic catalysis or Capn12- binding molecules, such as immunoglobulins or low-molecular Capnl2-binding molecules, which can also modulate the biological function of Capnl2.
  • Capnl2-binding molecules are understood to mean all natural and synthetic ligands and interaction partners of Capnl2.
  • the Capnl2 or a calpain protein according to the invention is incubated with an analyte which contains an effector of a physiological or pathological Capn12 activity, for example the cysteine protease activity, and the activity of the Capnl2, if appropriate determined by adding substrates and cosubstrates.
  • an analyte which contains an effector of a physiological or pathological Capn12 activity, for example the cysteine protease activity, and the activity of the Capnl2, if appropriate determined by adding substrates and cosubstrates.
  • the Capnl2 or the calpain protein according to the invention if appropriate after corresponding derivatization, can be immobilized on a support and brought into contact with an analyte in which at least one Capnl2 binding partner is suspected.
  • the components of the analyte bound to the immobilized Capn12 or the immobilized calpain protein according to the invention can then optionally be eluted, determined and characterized after an incubation phase.
  • the analyte can also be immobilized and then linked to
  • Capnl2 molecules or bindable Capn12 fragments are examined for constituents of the analyte.
  • the invention furthermore relates to immunoglobulins with specificity for a Capn12 according to the invention.
  • immunoglobulins include mono- or polyclonal antibodies that can bind to characteristic epitopes of Capnl2, as well as their fragments.
  • Anti-Capnl2 immunoglobulins are produced in a manner familiar to the company. Immunoglobulins mean both polyclonal, monoclonal, optionally human or humanized antibodies or fragments thereof, single- ⁇ hain antibodies or also synthetic antibodies, and antibody fragments such as Fv, Fab and F (from ') 2 .
  • peptides can be synthesized which can be used individually or in combination as antigens for the production of monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the invention also relates to the use of immunoglobulins according to the invention or polynucleotides according to the invention for the diagnosis of diseases or disease states which are related to Capnl2 expression.
  • the amount, activity and distribution of the Capnl2 or its underlying mRNA in the human body can be determined.
  • the Capn12 concentration can be determined in biological samples, e.g. Determine cells or body fluids.
  • polynucleotides according to the invention for example by means of Northern blot technology or RT-PCR, the expression can be assessed at the mRNA level and, for example, a lower expression can be detected and a disease associated therewith diagnosed.
  • FIG. 1 shows a sequence comparison of the predicted amino acid sequence of Capnl2 with representative members of the vertebrate gene family of the large calpain subunit:
  • Capnl has a classic calmodulin-like, C-terminal domain
  • Capn5 Capn7 and CapnlO have C-terminal domains, which are labeled N, T and X, respectively.
  • Hyphens indicate gaps that have been inserted for comparison and thus for the best possible comparison of the sequences.
  • the three conserved amino acids that are part of the active center of the calpaine are marked with arrows.
  • the Cal ⁇ ium-binding EF hand domains of Capnl (Lin et al., 1997; Blan ⁇ hard et al., 1997) are highlighted by a bar above the respective sequence and are only numbered in sections.
  • the calpain domains predicted from the crystal structure (Hosfield et al., 1999) are also characteristic.
  • the exceptionally acidic region in domain III which can interact with calcium and possibly acts as an "electrostatic holder" of the protease activity, is known by circles above the relevant sequence.
  • FIG. 2 shows the genomic structure of the Capnl2 gene:
  • A Chemical diagram of the intron / exon structure of the Capnl2 gene.
  • the black rectangles represent exons of Capnl2. These are numbered consecutively.
  • the checkered Re ⁇ hte ⁇ k identifies the outermost 3 'end exon of A ⁇ tn4.
  • the dotted Re ⁇ hte ⁇ k identifies the exon sequence that Capnl2 and A ⁇ tn4 share.
  • the arrows indicate the transcription direction of both genes. The location of the repeats that were discovered in the sequence are given above.
  • the Spli ⁇ e event between exons 9 and 20, from which the mRNA transcript of clone 914413 resulted, and the partial sequences surrounding the Spli ⁇ e donor and Spli ⁇ e acceptor site of exons 9 and 20 of Capnl2 are also given. Large letters identify the coding sequence and small letters the intron sequence.
  • a schematic diagram of exons 11, 12 and 13 shows the alternative splice variants A, B and C.
  • the sequence of the common exon 11 is shown on the left and the associated exon used in the respective splice variant will be on the right.
  • the predicted amino acid sequence is given under the corresponding nucleotide sequence.
  • the last two nucleotides of the Spli ⁇ e acceptor in exon 12, AG, which are used in Spli ⁇ e variant B, are shown in bold.
  • the table shows the Spli ⁇ e events of the individual exons with the nucleotide sequence surrounding the respective Spli ⁇ e donor and Spli ⁇ e acceptor. Spli ⁇ e donor and Spli ⁇ e acceptor are shown in bold. The size of the respective exons and introns is indicated.
  • FIG. 3 shows the phylogenetic family tree of the mammalian gene family of the large calpain subunit:
  • Capnl AF021847)
  • Capn2 Y10139
  • Capn3 X92523
  • Capn5 Y10656
  • Capn ⁇ Y12582
  • Capn7 AJ012475
  • Rat Capn ⁇ D14480
  • human CAPN9 AF022799
  • CapnlO AF126867
  • human CAPN11 AJ242832
  • FIG. 4 shows an mRNA expression analysis of A ⁇ tn4 and Capnl2:
  • A. Expression of A ⁇ tn4 in Different Mouse Tissues A 32 P-labeled sample, which corresponds to the 3 'end of the mouse A ⁇ tn4 ⁇ DNA, was hybridized to a Clonte ⁇ h mouse master blot. The location of the RNAs on the filters is shown on the right side. The blot was stripped and hybridized with a mouse Hprt probe (in the middle) to check the RNA loading. The exposure time was 48 hours.
  • a 32 P-labeled sample was hybridized to a Northern filter that carried RNAs from the skin of mice of the specified age. The blot was then hybridized once more with a ß- ⁇ tin- ⁇ DNA sample to check the applied RNA levels. The positions of the 28S and 18S rRNAs are marked and the specific Capnl2 RNA band marked with an arrow. The exposure time for Capnl2 was 144 hours and 2 hours for ß-A ⁇ tin.
  • FIG. 5 shows an in-situ hybridization on skin tissue sections from mouse embryos:
  • Capnl2 is selectively expressed in the cortex of the hair follicle (irs: inner root sheath; ors: outer root sheath; ⁇ o: ⁇ ortex).
  • a cosmid library created by cloning partially digested Sau3A mouse 129 / Sv DNA into the cosmid vector pSuper-Cos (Stratagene), was analyzed by PCR using the Capnl2-specific primer 5 '-gaatgg ⁇ gagtgg ⁇ aacaggaag-3' ( SEQ ID NO: 9) and 5 '-tgggg ⁇ t ⁇ ag ⁇ a ⁇ aaaa ⁇ t ⁇ at-3' (SEQ ID NO: 10). The cosmid DNA was purified using the Qiagen Plasmid Midi Kit according to the manufacturer's instructions.
  • RNA Five micrograms of total RNA were transcribed into ⁇ DNA using AMV reverse transcriptase using the Promega reverse transcription system.
  • the PCRs were in 50 ul reaction volume, the 50 mM KC1, 10 itiM Tris-HCl, pH 9, 0.1% Triton X-100, 2 units Taq DNA polymerase, 50 pmol both the forward and the reverse primer and contained 0.1 ng of cDNA using a Thermo ⁇ y ⁇ ling protocol of 35 cycles comprising 15 s at 94 ° C, 30 s at 55 ° C and 1 min at 72 ° C.
  • Capnl2 forward and backward primer sequences for RT-PCR were 5'-tt ⁇ aaga ⁇ ttt ⁇ t ⁇ a ⁇ g-3 '(SEQ ID NO: 11) and 5' -t ⁇ g ⁇ ttgagtttattctga-3 '(SEQ ID NO: 12).
  • the Hprt forward and backward primer sequences were 5'-atg ⁇ gac ⁇ g ⁇ agt ⁇ ag ⁇ g-3 '(SEQ ID NO: 13) and 5'-gg ⁇ tttgtatttgg ⁇ tttt ⁇ -3' (SEQ ID NO: 14).
  • a 20 ⁇ l reaction mixture containing 8 ⁇ l BigDye reaction mix (Perkin-Elmer Biosystems), 500 ng purified DNA and 10 pmol primer was used for 30 cycles, including 15 s at 94 ° C, 15 s at 50 ° C and Incubated for 2 min at 60 ° C.
  • the reaction products were separated by polyacrylamide gel electrophoresis using an ABI 377 DNA sequencer and the sequence was dye-terminated by fluorescence using the Perkin-Elmer Biosystems sequence analysis software version 3.3. Further sequencing with synthesized oligonucleotides expanded the DNA sequences. The sequences were put together using the SeqMan from the DNASTAR program series to form a contig.
  • DNA and amino acid sequences were homologated with the non-redundant nucleotide, protein, and EST databases of the National Center for Biotechnology Information (http://www.nabi.nlm.nih.gov) using the BLAST program series ( Alts ⁇ hul et al., 1990).
  • the sequence comparison and the comparison of amino acid sequences was carried out with CLUSTAL W (Thompson et al., 1994).
  • the prediction of the exons was possible using the FGNENESH program, which is available on the Sanger Center web server (www.sanger.aa.uk). Repetitive sequences were identified using the "RepeatMasker” (http: // repeatmasker.genome.washington.edu).
  • the phylogenetic analysis was carried out with the CLUSTREE program, available from the HUSAR server of the German Cancer Research Center, Heidelberg (www.dkfz-heidelberg.de).
  • RNA from mouse tissues was isolated using the guanidine isothiocyanate method (Chomzynski and Sa ⁇ hi, 1987). 10 ⁇ g of total RNA were separated by electrophoresis in a 1.4% (w / v) agarose sail which, as already described, contained 2.2 M formaldehyde (Sambrook et al., 1989), and was separated onto a Hybond according to the manufacturer's instructions -N-nylon membrane (Amersham) blotted. The blot was hybridized with a 32 P-labeled ⁇ DNA fragment which corresponded to the nucleotides 33-852 cDNA sequence of the Capnl2 in Expresshyb hybridization solution (Clonte ⁇ h). The conditions of hybridization and highly stringent washing were determined according to the Manufacturer information selected. In a second step, the blot was hybridized with a ⁇ DNA sample of ß-a ⁇ tin in order to check the RNA loading.
  • Capnl2 cDNA which was used as a template for the synthesis of RNAs corresponding to nucleotides 33-852 of the described sequence, was cloned into the E ⁇ oRV site of the pBlues ⁇ ript. This ⁇ DNA fragment does not overlap with the Actn4 gene.
  • RNAs were obtained by in vitro transcription of restriction enzyme linearized plasmid DNA in a reaction volume of 12.5 ⁇ l, the 1 x transcription buffer (buffer for T7 and T3 RNA polymerases, from Statagene), 200 ⁇ M ATP, CTP, GTP, 40 ⁇ Ci ⁇ - 33 P-UTP (Amersham), 10 mM DTT, 1 ⁇ g linearized plasmid DNA, 40 units RNAsin (Promega) and 10 units RNA polymerase , After 2 hours of incubation at 37 ° C, the template DNA was removed by adding 2 units of DNAasel (Boehringer Mannheim) followed by a 30-minute incubation at 37 ° C.
  • the reaction mixture was extracted, precipitated with ethanol and resuspended in 26 ⁇ l DEPC-treated dH 2 0.
  • the embryos were fixed in 4% (w / v) paraformaldehyde in PBS and the 5 ⁇ m tissue sections obtained were transferred to pre-cleaned SuperFrost Plus slides (Menzel-Glaeser).
  • the hybridization and washing conditions were as already described (Dressler and Gruss, 1989). A hybridization temperature of 55 ° C was chosen.
  • the DNAs of the T31 radiation hybrid mapping plate were PCR by means of two, the Capnl2 [Set 1: 5'-gggagggccaggacaagga ⁇ t-3 '(SEQ ID NO: 15), 5'-agggaagg ⁇ tggaa ⁇ aatggagaa-3' (SEQ ID NO: 15) 16), Set 2: 5'-gaatgg ⁇ gagtgg ⁇ aa ⁇ aggaag-3 '(SEQ ID NO: 17), 5'- ⁇ tgggg ⁇ tcag ⁇ a ⁇ aaaa ⁇ t ⁇ at-3' (SEQ ID NO: 18)] and the Capn5 (Set 1: 5'- ⁇ ggtga ⁇ tg ⁇ g SEQ ID NO: 19), 5 '-aag ⁇ g ⁇ tg ⁇ agagca ⁇ tgtgg-3' (SEQ ID NO: 20); Set 2: 5'- ⁇ gggagtgga ⁇ ggg ⁇ c ⁇ tg-3 '(SEQ ID NO: 15) 16), Set 2
  • the PCRs were in a reaction volume of 20 ul, containing 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 9, 1.5 mM MgCl 2 , 1 Unit Taq DNA polymerase and 25 ng DNA, with a Thermo ⁇ y- ⁇ ling protocol of 35 cycles, comprising 15 s at 94 ° C, 30 s at 60 ° C and 1 min at 72 ° C.
  • the raw data were submitted for analysis to the mouse radiation hybrid database in the Ja ⁇ kson Laboratory (www.jax.org/resour ⁇ es/do ⁇ uments/ ⁇ mdata/rhmap/).
  • the publicly accessible EST databases were used to identify new Calpaingen genes. Using the data obtained previously, a new member of the mammalian gene family of the large calpain subunit, which is characterized by a cell-specific expression pattern, was found and characterized.
  • the mouse EST database was screened with protein sequences from known vertebrate calpains using the TBLAST algorithm (Alts ⁇ hul et al., 1990).
  • the translated protein of a 3'EST, AA1314413 was typical of the large calpain subunit family.
  • the ⁇ DNA clone, 914413 which corresponds to this EST clone, was sequenced in its entirety.
  • the cDNA has a polyA tail and contains an open reading frame, the predicted protein of which shows homology to domains I and II of the large subunit of classic Calpaine. However, the predicted sequence deviates from the classic Calpaine in the connection to domain II and ends shortly thereafter (FIG. 1).
  • the ⁇ DNA clone 914413 appears to be the result of an atypical or faulty RNA splicing event that has deleted the exons of this calpain gene coding for domains III and IV.
  • a genomic DNA cosmid clone was isolated and sequenced. A continuous sequence (SEQ ID NO: 8) of 13116 bp was obtained.
  • the gene prediction software FGE-NESH identified a potential gene with 21 exons, with an exon / intron structure that is typical of the Calpaine gene family. These include exons with pronounced homology to domains III and IV of classic Calpaine.
  • mRNA isolated from the skin was analyzed using RT-PCR.
  • the software predicted 20 of the 21 exons, allowing some errors in the position of the donor or acceptor splice site.
  • the intron / exon limits of the complete gene are shown in Figure 2A and summarized in Table 1.
  • the mouse genome nomenclature committee named this gene Capnl2.
  • Four simple repeats and 16 SINES short interspersed repeats; 4 Bl, 1 B2, 3 B4 and 8 ID; Fig. 2A) were found in the Capnl2 intron sequence.
  • the ⁇ DNA clone 914413 appears to be the result of an incorrect splice event, because both the splice donor and the splice acceptor site are atypical and most of the Exons of domains III and IV will then be deleted.
  • the splice takes place between exons 9 and 20 within a 5-base pair region, CACTG, which is common to these two exons (FIG. 2A).
  • Capnl2 mRNA identified (here called Capnl2A, Capnl2B and Capnl2C).
  • the Spli ⁇ e variant A has an open reading frame, which presumably encodes a protein of 720 amino acids (M r 80.5 kDa).
  • the proposed start methionine (cgaATGg) corresponds to the minimal consensus sequence of the translation start site (Kozak, 1996).
  • a further 5 'starting points are excluded by a TAA stop o-don in the reading frame, which is located 39 nucleotides upstream of this ATG.
  • the predicted amino acid sequence shows similarities to members of the family of the large calpain subunit and can be divided into the four domains I to IV typical for calpains (FIG. 1).
  • Domain II of the Capn12 according to the invention has the three amino acid residues (Cysl05, His259 and Asn283) which are essential for the active center of cysteine proteases (Berti and Storer, 1995). Accordingly, the Capn12 according to the invention, like most classic calpains, has cysteine protease activity.
  • Capn2 Each of the five Ca 2+ -binding sequences described for Capn2 (Blan ⁇ hard et al., 1997; Lin et al., 1997) is conserved to a certain extent in the amino acid sequence of Capnl2 (FIG. 1).
  • the crystal structure of Capn2 revealed an extremely acidic region in domain III, which interact with Ca 2+ and could act as an "electrostatic switch" of protease activity (Strobl et al., 2000). The authors suspect that the large number of acidic residues in this region could reduce the Ca 2+ concentration required for activation.
  • the corresponding region of the Capnl2 is also markedly acidic (DEEEDDDDEE; Fig. 1).
  • transcripts of the Spli ⁇ e variants A and B are examined in the Spli ⁇ e acceptor of exon 12, while in variant C the exon
  • the predicted proteins of the alternative splice variants B and C thereby show a different amino acid sequence in domain III and due to a shift in the reading frame the translation ends within this domain (FIG. 2B). As a result, they may also lack the calmodulin-like
  • Spli ⁇ e variant B is more abundant than that of the Spli ⁇ e variant A.
  • a Capnl2 protein which lacks a Ca 2+ -binding domain is probably a substantial part of the Capnl2 protein pool.
  • the RT-PCR product of the Spli ⁇ e variant C was the least abundant.
  • the complete amino acid sequences of representative members of all known large calpain subunits of the mammals were subjected to phylogenetic analysis. This enabled the calpaine to be divided into three main groups 0 (Fig. 3).
  • the first group (A) is represented by Capnl, Capn2, Capn3, Capn8 and Capn9 and the second group (B) by Capn5, Capn ⁇ , Capn7, CapnlO and Capnl2.
  • Capnl1 a very different calpain (Dear et al., 1999), does not fit in any of the groups.
  • Group (A) contains all calpains with a calmodulin-like, 5 C-terminal domain, while group (B) contains all those "atypical"
  • Calpaine contains which presumably lack the ability to bind Ca 2+ .
  • An exception is the Capnl2, which in general is more similar to group (B) except that it has a calmodulin-like C-terminal domain.
  • the phylogenetic analysis suggests that Capnl2 is the oldest member of this group.
  • a predecessor of the Capnl2 gene could consequently be the founder of the genes of the atypical large calpain subunit, the Capn12 possibly serving as a source of both classic and also atypical proteins via alternative splicing.
  • the location of the Capnl2 gene on mouse chromosomes was determined by PCR analysis of the T31 radiation hybrid mapping plate using primers that bind within intron 1 of the Capnl2 gene.
  • the raw data were analyzed using the radiation hybrid map of the mouse genome (Van Etten et al., 1999) and the associated World Wide Web server.
  • the highest LOD value was 16 in connection with the marker D7Mit72.
  • Other high LODs were 14.4 in connection with D7Mitll6, 14.4 in connection with D7Mit77, and 13.9 in connection with D7Mit267. These markers were located on chromosome 7 at 9.4 (D7Mit77), 10.7 (D7Mitll ⁇ ), 10.4 (D7Mit72), and 11.0 cM (D7Mit267).
  • the most logical order is: proximal - D7Mit77 - D7Mitll ⁇ - D7Mit72 - Capnl2 - D7Mit267 - distal.
  • the region is orthologous to human chromosome 19ql3.
  • the mouse Capn5 gene was also recently localized on mouse chromosome 7 using a radiation hybrid mapping plate of the chromosomes of somatic cells of the mouse (Matena et al., 1998). In order to determine the exact distance between Capn5 and Capnl2 on chromosome 7, the T31 plate was analyzed with mouse Capn5-specific PCR primers. The highest LOD value was 13.4 in connection with D7Mit321.
  • a ⁇ tn4 must also be on mouse chromosome 7. Since the human A ⁇ tn4 gene was located on chromosome 19ql3 (Kaplan et al., 2000), the human Capnl2-0rtholog is also very likely to be found in this region.
  • the sequence of overlapping ESTs formed a sequence with an open reading frame, which codes for the mouse ortholog of ⁇ -A ⁇ tinin-4 (A ⁇ tn4).
  • the RT-PCR of various mouse tissue RNAs confirmed the sequence.
  • the predicted mouse protein is 98.9% identical to human Actn4.
  • the last exon overlaps the last exon of the Capnl2 gene by 330 bp, but in the opposite orientation (FIG. 2). It has recently been shown that mutations in the human Actn4 gene can cause familial segmental herbal nephretitis (Kaplan et al., 2000).
  • RNA dot blot analysis and in situ hybridization using a specific sample showed that the A ⁇ tn4 gene is expressed ubiquitously (FIG. 4).
  • the 914413 ⁇ DNA clone was isolated from a mammary gland cDNA library, Northern blot and RT-PCR analysis showed no significant level of expression in this tissue.
  • Only a more precise RT-PCT analysis in connection with an in situ hybridization on mouse embryos of the stages dElO, 5 to dE18.5 and various adult tissues showed that Capnl2 is expressed exclusively in the skin.
  • Capnl2 is expressed in the cortex of the hair follicle (Fig. 5).
  • Hair undergoes a cycle that lasts about 25 days in the mouse (Chase, 1965).
  • the cycle is roughly divided into three phases: the anagen (proliferation), the catagen (regression) and the telogen phase (resting phase).
  • the back skin of the adult mouse contains hair follicles in all phases of the hair cycle.
  • mice have been different Samples were taken from the back skin at times after birth and the extracted RNAs were examined by Northern blot hybridization.
  • the first hair cycle of the mouse runs synchronously (Chase, 1965) and thus relatively pure hair follicle populations 5 of a specific cycle phase can be examined.
  • Capnl2 mRNA of approximately 3.5 kb can be detected in the anagen phase (approximately P1-P16) but not in the telogen phase (P19-P25) (Fig. 4B).
  • the mRNA reaches its highest level of expression around day P12, in the middle of the anagen phase.
  • An RT-PCR-10 analysis of the same skin samples confirmed this result (Fig. 4C).
  • Capnl2 thus shows a high-specific mRNA expression pattern.
  • the gene family of the large calpain subunit can be any gene family of the large calpain subunit.
  • Capnl, Capn2, Capn7 and CapnlO are to be ubiquitously expressed, while the other Calpains are differentiated
  • Capn9 is predominantly expressed in the intestine and stomach, but is also detectable in other tissues (Li et al., 1998). In contrast, Capnll is apparently only expressed in certain cells of the testis (Dear and Boehm,
  • Capn5 is expressed in embryonic thymus in the T cell precursors, while after birth, expression in the thymus is down-regulated (Dear and Boehm, 1999).
  • CAPN 8 isolation of a new ouse ⁇ alpain isoenzyme. Bio ⁇ hem. Biophys. Res. Commun. 260: 671-675
  • CAPN11 A calpain with high mRNA levels in testis and lo ⁇ ated on ⁇ hromosome 6. Genomi ⁇ s 59: 243-247
  • Capn7 A highly divergent vertebrate ⁇ alpain with a novel C-terminal do-main. Mamm. Genome 10: 318-321
  • Genomi ⁇ organization of mouse Capn5 and Capn6 genes ⁇ onfirms that they are a distin ⁇ t ⁇ alpain subfamily. Genomi ⁇ s 48: 117-120

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Abstract

Calpain-Protease 12 (Capn12), dadurch gekennzeichnet, dass die eine Aminosäuresequenz, umfassend die Aminosäuren 1 - 342 der SEQ ID NO: 1 oder eine Aminosäuresequenz ausgewählt unter SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 aufweist; sowie deren funktionale Analoge; dafür kodierende Nukleinsäuren; rekombinante Vektoren, welche diese kodierenden Sequenzen enthalten; damit transfizierte Mikroorganismen; Verfahren zur rekombinanten Herstellung der Capn12; und verschiedene Anwendungen der Capn12 und dafür kodierender Nukleinsäuren.

Description

Calpain-Protease 12
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine neue Calpain-Protease mit der Bezeichnung Calpain-Protease 12 und funktionale Analoge davon (im Folgenden bezeichnet als Capnl2); dafür kodierende Nukleinsäuren; rekombinante Vektoren, welche diese kodierenden Sequenzen enthalten; damit transfizierte Mikroorganismen; Verfahren zur rekombi- nanten Herstellung der Capnl2; sowie verschiedene Anwendungen der Capnl2 und dafür kodierender Nukleinsäuren.
Calpaine sind eine Familie cytosolischer Cystein-Proteasen. Die klassischen Calpaine bestehen aus einer isoformspezifisσhen großen Untereinheit (80 kDa) und einer unveränderlichen kleinen Untereinheit (30 kDa), die Capn4 genannt wird. Die große Untereinheit klassischer Calpaine weist eine Vier-Domänen-Struktur auf, umfassend eine Domäne mit Proteaseaktivität und eine C-terminale, Calmodulin-ähnliche Domäne, die Calσium binden kann. Man fand jedoch kürzlich mehrere atypische Säugetierhomologe der großen Cal- pain-Untereinheit, denen die Kennzeichen eines aktiven Zentrums einer Protease fehlten (Capnö; Dear et al., 1997) und/oder die eine alternative C-terminale Domäne aufweisen, die möglicherweise kein Calcium bindet (Capn5, Capnβ, Capn7, Capnβ; Dear et al., 1997; Braun et al., 1999; Franz et al., 1999). Eine Zusammenfassung der gegenwärtig bekannten Mitglieder der Genfamilie der Säu- getier-Calpaine ist im Internet erhältlich (http://Ag.Arizona.Edu/calpains) .
Die physiologische Rolle der Calpaine ist unklar. Calpaine spalten zahlreiche Substrate (Carafoli und Molinari, 1998) und wurden mit einer Vielzahl von Prozessen in Zusammenhang gebracht, einschließlich Apoptose ( ang, 2000), Zellteilung (Mellgren, 1997), Modulation der Interaktionen des Integrin-Cytoskeletts (Sσhoenwa- elder et al., 1997) und synaptisσhe Plastizität (Chan und Matt- son, 1999). Sie wurden außerdem mit zahlreichen pathologischen Krankheitszuständen in Verbindung gebracht, wie Alzheimer, Katarakt, Demyelinisierung, kardiale Ischämie, Entzündung und traumatische Hirnverletzung (Übersiσhtsartikel: Carafoli und Molinari, 1998; Sorimachi et al., 1997; Wang und Yuen, 1997). Mutationen im Capn3-Gen sind für die Beσkengürtel-Muskeldystrophie Typ 2A verantwortlich (Richard et al., 1995). Aufgrund der vielfältigen physiologischen und pathologischen Funktionen der Calpaine, stellte sich die Aufgabe, neue Homologe der Gen-Familie der großen Calpain-Untereinheit bereitzustellen. Damit ließen sich beispielsweise neue Wirkstoffe bzw. neue Wirk- stofftargets finden oder entwickeln, die bei der Diagnose, Therapie und/oder Prophylaxe von Krankheitszuständen einsetzbar sind, in die Calpaine und deren Substrate oder auf diese wirkende Stoffe involviert sind. Diese Aufgabe wurde überraschenderweise durch die Bereitstellung einer neuen Calpain-Protease, der Cal- pain-Protease 12 (Capnl2) und funktionalen Äquivalenten davon, gelöst.
Die Capnl2 ist dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aminosäuresequenz, umfassend die Aminosäuren 1 - 342 der SEQ ID NO: 1 auf- weist. Gegenstand der Erfindung sind auch funktionale Äquivalente dieser Teilsequenz.
Bevorzugte Varianten davon sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz ausgewählt unter SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 aufweisen. SEQ ID NO: 1 steht für die Aminosäuresequenz der Spliσe-Variante Capnl2A, SEQ ID NO: 2 für die Aminosäuresequenz der Splice-Variante Capnl2B, SEQ ID NO: 3 für die Aminosauresequenz der Splice-Variante Capnl2C und SEQ ID NO: 4 für die Aminosäuresequenz der Capnl2 aus Klon 914413 der Maus-EST-Datenbank. Dabei sind die Aminosauresquenzen SEQ ID NO: 1 bis 4 im N-terminalen Abschnitt der Aminosäuren 1 - 342 zu- eineinander identisch. Das vorhergesagte Protein entsprechend der Spliσe-Variante Capnl2A weist 720 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 80,5 kDa auf.
Gegenstand der Erfindung sind auch die funktionalen Äquivalente der Capnl2 bzw. der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen. Funktionale Äquivalente umfassen Aminosäuresequenzen, die sich von den konkreten Sequenzen ableiten lassen und in denen im Ver- gleich dazu eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, dele- tiert, invertiert oder addiert sind, ohne dass die Cystein-Pro- tease-Aktivität und/oder wenigstens ein weiteres Charakteristikum der Capnl2 im Wesentlichen beeinflusst werden. Weitere Capnl2-Charakteristika werden in späteren Abschnitten beschrie- ben. Erfindungsgemäß umfasst sind auch Capnl2-σharakteristisσhe Teilsequenzen oder Fragmente der Capnl2, die beispielsweise durch proteolytisσhen Verdau, Peptidsynthese oder rekombinante DNA- Technik herstellt werden können. Diese können beispielsweise zur Herstellung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper verwendet werden.
Die konkret offenbarten Aminosäuresequenzen repräsentieren Amino- säuresequenzen von Spliσe-Varianten der Capnl2, die aus einer Maus-EST-Datenbank bestimmt wurden. Gegenstand der Erfindung sind jedoch auch alle Capnl2-Homologe eukaryontisσher Spezies, d.h. der Evertebraten und Vertebraten, insbesondere der Säugetiere, z.B. Ratte, Katze, Hund, Schwein, Schaf, Rind, Pferd, Affe und besonders bevorzugt Mensch und weitere natürlich vorkommende Varianten. Erfindungsgemäß umfasst sind auch alle entwicklungs- und organ- bzw. gewebespezifisch exprimierte Capnl2-Formen und künstlich erzeugte Homologe, die die vorgegebenen strukturellen und/ oder funktionalen Eigenschaften aufweisen.
Die erfindungsgemäße Capnl2 ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie Cystein-Protease-Aktivität aufweist. Sie weist in ihrer Aminosäuresequenz die Aminosäuren Cys, His und Asn auf (in den Spliσe-Varianten Capnl2A, B und C: Cysl05, His259 und
Asn283), die für das aktive Zentrum von Cystein-Proteasen charakteristisch und für dessen Funktion wesentlich sind. Die Spliσe- Variante Capnl2A weist darüber hinaus eine ausgeprägt saure Region und eine Calmodulin-ähnliche, vermutlich Ca2+-bindende Region auf.
Die erfindungsgemäße Capnl2 ist außerdem dadurch gekennzeichnet, dass das sie kodierende Gen der Maus auf dem Chromosom 7 zwischen den Markern D7Mit72 (10,4 σM) und D7Mit267 (11,0 cM) lokalisiert ist.
Die erfindungsgemäße Capnl2 ist außerdem dadurch gekennzeichnet, dass sie, z.B. in der Maus, im Cortex des Haarfollikels der Haut exprimiert wird.
Weiterhin ist die erfindungsgemäße Capnl2 dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Anagenphase des Haarzyklus exprimiert wird.
Gegenstand der Erfindung sind auσh Calpain-Proteine, die dadurσh gekennzeiσhnet sind, daß sie wenigstens eine erfindungsgemäße Capnl2 aufweisen. Vorzugsweise weist ein solσhes Calpain-Protein neben der Capnl2 als große Untereinheit noσh eine Capn4 als kleine Protein-Untereinheit auf. Darüber hinaus können noσh weitere Protein-Untereinheiten, wie beispielsweise regulatorisσhe Untereinheiten oder Untereinheiten, die die Lokalisation des Proteins in definierten Zellkompartimenten vermitteln, enthalten sein.
Weiterhin umfasst die Erfindung auσh Polynukleotide, die für eine erfindungsgemäße Capnl2 kodieren, sowie deren funktionale Äquivalente und damit hybridisierbare oder dazu komplementäre Polynukleotide, umfassend einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Se- quenzen. Diese Polynukleotide lassen siσh bei Durσhmusterung von genomisσhen oder σDNA-Bibliotheken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf σhemisσhem Wege synthetisiert werden.
Gegenstand der Erfindung sind auσh Polynukleotide mit einer Nu- kleinsäuresequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, Seq ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 5 steht für die Nu- kleinsäuresequenz der αDNA der Spliσe-Variante Capnl2A, SEQ ID NO: 6 für die Nukleinsäuresequenz der αDNA der Capnl2B, SEQ ID NO: 7 für die Nukleinsäuresequenz der σDNA der Capnl2C und SEQ ID NO: 8 für die genomisσhe Nukleinsäuresequenz der Capnl2 der Maus, umfassend alle Exon- und Intron-Sequenzen. Die vorhergesagte genomisσhe Sequenz der Capnl2 der Maus umfasst 21 Exons und einen genomisσhen Absσhnitt von 13116 Basenpaaren.
Funktionale Äquivalente erfindungsgemäßer Polynukleotide umfassen durσh Degeneration des genetisσhen Codes abgeleitete Sequenzen und damit stumme Nukleotidsubstitutionen (d.h. ohne Veränderungen der resultierenden Aminosäuresequenz) und konservative Nukleotidsubstitutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durσh eine Aminosäure gleiσher Ladung, Größe, Polarität und/oder Lösliσhkeit ersetzt) . Funktionale Äquivalente erfindungsgemäßer Polynukleotide weisen somit eine durσh Nukleotidsubstitution, -deletion, -inversion oder -addition veränderte Sequenz auf, kodieren jedoσh ebenfalls für eine funktional äquvalente Capnl2, wie z.B. mit gleiσher oder vergleiσhbarer Cystein-Protease-Aktivität. Insbesondere umfassen erfindungsgemäß geeignete Polynukleotide wenigstens eine der Teilsequenzen, welσhe für σharakteristisσhe Amino- säuresequenzen der Capnl2 kodieren.
Gegenstand der Erfindung sind auσh die Primersequenzen SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18, die an erfin- dungsgemäße Polynukleotide hybridisieren können bzw. komplementär dazu sind und beispielsweise zu deren Amplifikation durσh RT-PCR oder PCR eingesetzt werden können.
Unter der Eigensσhaft, an Polynukleotide hybridisieren zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifisσhe Bindungen zwisσhen niσht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu müssen die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Übliσherweise werden dazu Oligonu- kleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Nort- hern-Blot-Teσhnik die Verwendung einer 50 - 70°C, vorzugsweise 60 - 65°C warmen Wasσhlösung, beispielsweise 0,lx SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20x SSC: 3M NaCl, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspe- zifisσh hybridisierter σDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden.
Gegenstand der Erfindung sind auσh Expressionskassetten, die wenigstens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfassen, das mit wenigstens einer regulatorisσhen Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft ist. Vorzugsweise liegt 5 '-strangaufwärts vom erfin- dungsgemäßen Polynukleotid eine Promotorsequenz und ermögliσht auf diese Weise eine kontrollierte Expression der Capnl2. Besonders bevorzugt liegen 3'-strangabwärts vom erfindungsgemäßen Polynukleotid eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliσhe regulatorisσhe Elemente, und zwar jeweils operativ ver- knüpft mit der die Capnl2 kodierenden Sequenz.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung regulatorisσher und kodierender Sequenzen, wie z.B. von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls wei- terer regulatorisσher Elemente derart, sodass jedes der regulatorisσhen Elemente seine Funktion vor, während oder nach Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für weitere operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen, Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylierungssi- gnale und dergleichen. Brauchbare regulatorisσhe Elemente umfassen auσh selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikati- onsursprünge und dergleiσhen.
Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die na- türliσhe Regulationssequenz vor dem eigentliσhen Strukturgen noσh vorhanden sein. Durσh genetisσhe Veränderung kann diese natürli- σhe Regulation gegebenenfalls ausgesσhaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Die Expressionskassette kann aber auσh einfaσher aufgebaut sein, d.h. es werden keine zu- sätzliσhen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliσhe Promotor mit seiner Regulation wird niσht entfernt. Stattdessen kann beispielsweise die natürliσhe Regulati- onssequenz so mutiert werden, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nu- kleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette enthalten sein.
Beispiele für brauσhbare Promotoren sind: σos-, taσ-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, laσ-, lpp-laσ-, laσlq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trσ-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SP02, die Hefepromotoren ADCl, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpro otoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z.B. liσht- und insbesondere temperatu- rinduzierbarer Promotoren, wie der PrPχ-Promotor.
Prinzipiell können alle natürliσhen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auσh s n- thetisσhe Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Die genannten regulatorisσhen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und die Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überex- primiert wird, oder dass es sofort exprimiert oder uberexprimiert wird. Die Expression kann durch diese regulatorisσhen Elemente auσh gewebe-, zell- oder entwiσklungsspezifisσh erfolgen, wenn der Vektor in einen höheren Organismus, wie in ein Tier oder eine Pflanze, eingebraσht wird.
Die regulatorisσhen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorisσhen Elemente vorteilhafterweise auf Transkriptionsebene erfolgen, in- dem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhan- cer" verwendet werden. Daneben ist aber auσh eine Verstärkung der Translation mögliσh, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöht wird. Unter "Enhanσer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Weσhselwirkung zwisσhen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durσh Fusion eines geeigneten Promotors mit einem geeigneten die Capnl2 kodierenden Polynukleotid, sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekom- binations- und Klonierungsteσhniken, wie beispielsweise die In- sertion über Restriktionsenzymschnittsteilen, oder wie sie bei- spielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsσh und J. Sambrook, Moleσular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Har- bor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protoσols in Moleσular Biology, Greene Publishing Assoσ. and Wiley Intersσienσe (1987) beschrieben sind.
Gegenstand der Erfindung sind auσh rekombinante Vektoren zur Transformation von eukaryontisσhen oder prokaryontisσhen Wirten, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette tragen. Diese Vektoren erlauben die Expression der Capnl2 in einem geeigneten Wirtsorganismus. Vektoren sind dem Faσhmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Veσtors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amster- dam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind neben Plasmiden auσh alle anderen dem Faσhmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baσulovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Plasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus oder chromosomal repliziert werden.
Gegenstand der Erfindung sind auσh Mikroorganismen, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten oder solσhe, die die Capnl2 en- dogen exprimieren. Diese können zur Produktion rekombinanter
Capnl2 eingesetzt werden. Vorteilhafterweise werden die oben be- sσhriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionskassetten als Teil eines Expressionsvektors in ein geeignetes Wirtssystem eingebraσht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Faσh- mann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden verwendet, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfu- sion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispiels- weise in Current Protoσols in Moleσular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Intersσienσe, New York 1997 und in J. Sambrook, E.F. Fritsσh und T. Maniatis, Moleσular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY (1980), besσhrieben.
Als WirtsOrganismen zur Transformation mit erfindungsgemäßen Vektoren sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Polynukleotide, ihrer Allelvarianten, ihrer funktioneilen Äquivalente oder Derivate ermögliσhen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliσhe oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Esσheriσhia, wie z.B. Escheriσhia σoli, Streptomyσes , Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotisσhe Mikroorganismen, insbesondere Hefen wie Saσσharomy- σes σerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryontisσhe Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen. Ge- wünsσhtenfalls kann das Genprodukt auσh in transgenen Organismen wie transgenen Tieren, wie insbesondere Mäusen, Sσhafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebraσht werden. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knoσk-Out- Tiere oder -Pflanzen handeln, in denen das korrespondierende en- dogene Gen ausgesσhaltet wurde, wie z.B. durσh Mutation oder partielle oder vollständige Deletion.
Die Selektion erfolgreiσh transformierter Organismen kann durσh Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expres- sionskassette enthalten sind. Beispiele für solσhe Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farb- gebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatisσher Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreiσh mit einem Vektor trans- formierte Mikroorganismen, die ein entspreσhendes Antibiotikare- sistenzgen (z.B. G418 oder Hygromyσin) tragen, lassen sich durσh entspreσhende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläσhe präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätsσhromatographie genutzt werden.
Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter-System, die Phagen λ, μ oder andere temperente Phagen oder Transposons und/ oder weiteren vorteilhaften regulatorisσhen Sequenzen bildet ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff "Expressionssystem" die Kombination aus Säugetierzellen, wie CHO-Zellen, und Vektoren, wie pσDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geei- gnet sind, zu verstehen.
Wie oben besσhrieben, kann das Genprodukt vorteilhaft auσh in transgenen Tieren, z.B. Mäusen, Sσhafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebraσht werden. Ebenso ist es mögliσh, zellfreie TranslationsSysteme mit der 'von der Nukleinsäure abgeleiteten RNA zu programmieren.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Capnl2, wobei man einen Capnl2-produzie- renden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Capnl2 induziert und die Capnl2 aus der Kultur isoliert. Die Capnl2 kann so auσh in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Der Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH- Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsσh and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls Capnl2 nicht in das Kulturmedium sezerniert wird, aufgeschlossen und die Capnl2 nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durσh hoσhfrequenten Ultrasσhall, durσh hohen Druσk, wie z.B. in einer Frenσh-Druσkzelle, durσh Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytisσhen Enzymen oder organisσhen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durσh Kombination meh- rerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Capnl2 kann mit bekannten, chromatographi- sσhen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie, Ionenaustausσh- Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen übliσhen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Bioσhemisαhe Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Sσo- pes, R. , Protein Purifiσation, Springer Verlag, New York, Heidel- berg, Berlin besσhrieben.
Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins VektorSysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die σDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die einer einfaσheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epi- tope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (be- schrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibo- dies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann. Gleiσhzeitig können diese Anker auσh zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem üb- liσhe Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enz mmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist auσh die Verwendung einer erfindungsgemäßen Capnl2 oder eines erfindungsgemäßen Calpain-Proteins als Cystein-Protease. Bevorzugt ist die Verwendung in Verbindung mit natürliσhen Substraten der Capnl2, es können jedoch alle Substrate verwendet werden, die an das aktive Zentrum der Capnl2 binden und dort gespalten werden. Die Capnl2 kann so beispielsweise als Cystein-Protease in molekularbiologischen und σhemi- sahen Verfahren eingesetzt werden.
Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus pharmazeutisσhe Mittel, die eine erfindungsgemäße Capnl2, ein erfindungsgemäßes Cal- pain-Protein oder einen erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor, sowie wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthalten. Die erfindungsgemäße Capnl2, das erfindungsgemäße Calpain-Protein oder der Vektor können als solche, vorzugsweise jedoch zusammen mit einem Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht werden. Dieser Träger kann abhängig von der gewünsσhten Dosierungsform in fester oder flüssiger Form vorliegen. Geeignete pharmazeutische Mittel können außerdem neben einer erfindungsgemäßen Capnl2, einem erfindungsgemäßem Calpain- Protein oder einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor ge- wünsσhtenfalls noσh weitere pharmazeutisσhe Wirkstoffe im Ge isσh oder getrennt in einem Kombinationspräparat enthalten. Bespiels- weise können solσhe Wirkstoffe die Wirkung der enthaltenen Capnl2, des Calpain-Proteins oder des Vektors verstärken, einen anderen Wirkmeσhanismus aufweisen und damit additiv wirken oder die Gesamtkonstitution des Patienten verbessern.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen Capnl2, eines erfindungsgemäßen Calpain-Proteins oder eines erfindungsgemäßen Vektors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten oder Krankheitszuständen, die in Zusammenhang mit einer unzureichenden Expression der
Capnl2 stehen. Dabei umfasst eine erfindungsgemäße Behandlung die Verhinderung der Ausbildung der Erkrankung bei einem Patienten mit einer entsprechenden Prädisposition oder die Therapie einer bereits bestehenden Erkrankung durσh verlangsamtes Fortsσhreiten oder sogar durσh Verbesserung des Zustandes des Patienten, mögli- σherweise bis zum völligen Ausheilen. In Situationen, in denen ein Mangel an Capnl2 herrscht, können mehrere Verfahren zur Substituierung eingesetzt werden. Zum einen kann in einem erfindungsgemäßen Medikament eine Capnl2 oder ein erfindungsgemäßes Calpain-Protein direkt oder gentherapeutisch in Form ihrer kodierenden Nukleinsäuren (DNA oder RNA) appliziert werden. Zur gentherapeutisσhen Anwendung können beliebige Vehikel, beispielsweise sowohl virale (retrovirale Transfektio ) , als auσh niσht-virale Vehikel (z.B. Liposomen-Transfektion) zum Einsatz kommen. Geeignete Vehikel können über geeignete Rezeptormo- leküle oder dergleiσhen spezifisσh an genau definierte Zielzellen binden und diese gezielt transformieren. Die Transfektion kann im Körper des Patienten erfolgen oder es werden entnommene Zellen in-vitro transfektiert und nachfolgend wieder dem Patienten appliziert. Geeignete Verfahren werden beispielsweise von Strauss und Barranger in Conσepts in Gene Therapy (1997), Walter de Gruy- ter, Hrsg. , beschrieben. Ein weiteres Verfahren zur Capnl2-Sub- stitution stellt die Stimulation des endogenen, körpereigenen Gens dar. Auσh der turn-over oder die Inaktivierung erfindungsgemäßer Capnl2, z.B. durσh Proteasen, können bloσkiert werden, um eine erhöhte Zahl aktiver Capn12-Moleküle zu erreiσhen. Sσhließ- liσh können Agonisten der Capnl2 zum Einsatz gelangen, um die Aktivität vorhandener Capnl2-Moleküle zu steigern. Bei verminderter Capnl2-Expression kann dies nur ein die Therapie unterstützendes Verfahren sein.
Erfindungsgemäße pharmazeutisσhe Mittel oder Medikamente können in Form von Tabletten, Granulaten, Pulver, Dragees, Pastillen, Pellets, Kapseln, Zäpfchen, Lösungen, Emulsionen und Suspensionen zur enteralen und parenteralen Verabreichung vorliegen. Vorzugs- weise können erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel in Gelen, Lotionen und Cremes zur kutanen Applikation enthalten sein.
Die jeweilige Dosierung erfindungsgemäßer pharmazeutischer Mittel oder Medikamente und der jeweilige Dosierungsplan obliegen der Entsσheidung des behandelnden Arztes. Dieser wird in Abhängigkeit vom gewählten Verabreiσhungsweg, von der Wirksamkeit des jeweiligen Medikaments, von der Art und Sσhwere der zu behandelnden Erkrankung, von dem Befinden des Patienten und dessen Anspreσhen auf die Therapie eine geeignete Dosis und einen geeigneten Dosie- rungsplan auswählen. So können z.B. die pharmakologisσh wirksamen Substanzen an ein Säugetier (Mensch und Tier) in Dosen von etwa 0,5 mg bis 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. Sie können in Einzeldosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden. Die Anwendungsgebiete umfassen Krankheiten und Krankheitszustände die im Zusammenhang mit einer unzureiσhenden Capn12-Expression stehen.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung einer erfindungsgemäßen Capnl2 oder eines erfindungsgemäßen Calpain-Proteins zum Sσreening auf Calpain-Protease-E fektoren. Unter Calpain-Pro- tease-Effektoren sind beispielsweise Substanzen zu verstehen, die die Aktivität der Capnl2 und/oder anderer Calpaine beeinflussen können, wie Aktivatoren oder Inhibitoren, oder solσhe, die auf die Substrate der Capnl2 während der enzymatisσhen Katalyse wirken können oder Capn12-bindende Moleküle, wie Immunglobuline oder niedermolekulare Capnl2-bindende Moleküle, die ebenfalls die biologische Funktion der Capnl2 modulieren können. Unter Capnl2-bin- denden Molekülen versteht man alle natürlichen und synthetischen Liganden und Interaktionspartner der Capnl2.
In einem geeigneten Sσreening-Verfahren wird beispielsweise die Capnl2 oder ein erfindungsgemäßes Calpain-Protein mit einem Ana- lyten inkubiert, welcher einen Effektor einer physiologisσhen oder pathologischen Capn12-Aktivität enthält, beispielsweise der Cystein-Protease-Aktivität, und die Aktivität der Capnl2, gegebenenfalls durch Zugabe von Substraten und Cosubstraten bestimmt.
Den folgenden Verfahren liegt dagegen die Eigenschaft vieler Effektoren zugrunde, an das Zielprotein zu binden. So kann die Capnl2 oder das erfindungsgemäße Calpain-Protein, gegebenenfalls nach entspreσhender Derivatisierung, an einem Träger immobilisiert und mit einem Analyten in Kontakt gebraσht werden, in wel- σhem wenigstens ein Capnl2-Bindungspartner vermutet wird. Die an die immobilisierte Capnl2 oder das immobilisierte, erfindungsgemäße Calpain-Protein gebundenen Bestandteile des Analyten können dann gegebenfalls nach einer Inkubationsphase eluiert, bestimmt und charakterisiert werden. Entspreσhend kann aber auσh der Ana- lyt immobilisiert werden und ansσhließend auf Bindung von
Capnl2-Molekülen oder bindungsfähigen Capn12-Fragmenten an Bestandteile des Analyten hin untersucht werden.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Immunglobuline mit Spezi- fität für eine erfindungsgemäße Capnl2. Solσhe Immunglobuline umfassen mono- oder polyklonale Antikörper, die an charakteristische Epitope der Capnl2 binden können, sowie deren Fragmente. Die Herstellung von Anti-Capnl2-Immunglobulinen erfolgt in einer dem Faσhmann geläufigen Weise. Mit Immunglobulinen sind sowohl poly- klonale, monoklonale, gegebenenfalls humane oder humanisierte Antikörper oder Fragmente davon, single-σhain-Antikörper oder auch synthetische Antikörper gemeint, sowie Antikörperfragmente, wie Fv, Fab und F(ab')2. Geeignete Herstellungsverfahren sind z.B. in Campbell, A. M. , Monoσlonal Antibody Technology, (1987) Elsevier Verlag, Amsterdam, New York, Oxford und in Breitling, F. und Dübel, S., Rekombinante Antikörper (1997), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg beschrieben. So können beispielsweise ausgehend von den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen Peptide synthetisiert werden, die einzeln oder in Kombination als Antigene zur Herstellung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper eingesetzt werden können.
Gegenstand der Erfindung ist auσh die Verwendung erfindungsgemäßer Immunglobuline oder erfindungsgemäßer Polynukleotide zur Diagnose von Krankheiten oder Krankheitszuständen, die im Zusammenhang mit der Capnl2-Expression stehen. Dabei kann die Menge, Ak- tivität und Verteilung der Capnl2 oder ihrer zugrunde liegenden mRNA im mensσhliσhen Körper bestimmt werden. Mit Hilfe von Immun- globulinen oder Capn12-bindenden Molekülen läßt siσh beispielsweise die Capnl2-Konzentration in biologisσhen Proben, z.B. Zellen oder Körperflüssigkeiten, bestimmen. Mit Hilfe erfindungsge- mäßer Polynukleotide läßt siσh beispielsweise mittels Northern- Blot-Teσhnik oder RT-PCR die Expression auf mRNA-Ebene beurteilen und beispielsweise eine Minderexpression naσhweisen und eine damit verbundene Krankheit diagnostizieren. Außerdem lassen siσh mit Hilfe erfindungsgemäßer Polynukleotide in Form geeigneter Sonden Gendefekte oder Mutationen bezügliσh des Capnl2-Gens und damit die Prädisposition eines Patienten für bestimmte Krankheiten naσhweisen. Weiterhin lassen siσh aus der Untersuchung einer großen Anzahl von Patienten im klinisσhen Monitoring Aussagen über genetisσhe Ursachen und Prädispositionen bestimmter Erkran- kungen machen.
Die Erfindung wird nun in den folgenden niαhtli itierenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher be- sσhrieben. Dabei zeigt:
Figur 1 einen Sequenzvergleiσh der vorhergesagten Aminosäuresequenz der Capnl2 mit repräsentativen Mitgliedern der Wirbeltier- Genfamilie der großen Calpain-Untereinheit:
Die vorhergesagte Aminosäuresequenz (hier dargestellt im EinBuchstaben-Code) der Spliσe-Variante Capnl2A wurde mit Mitgliedern der wiσhtigs en Klassen der großen Calpain-Untereinheit verglichen, die siσh durσh verschiedene C-terminale Domänen unterscheiden. Capnl besitzt eine klassische Calmodulin-ähnliche, C-terminale Domäne, während Capn5, Capn7 und CapnlO C-terminale Domänen aufweisen, die mit N, T bzw. X bezeichnet sind. Aminosäuren anderer Proteine, die zu denen der Capnl2 identisch sind, sind sσhwarz hinterlegt. Bindestriσhe kennzeichnen Lücken, die zur Gegenüberstellung und damit zum bestmögliσhen Vergleiσh der Sequenzen eingefügt wurden. Die drei konservierten Aminosäuren, die Teil des aktiven Zentrums der Calpaine sind, sind mit Pfeilen markiert. Die Calσium-bindenden EF-Hand-Domänen von Capnl (Lin et al., 1997; Blanσhard et al. , 1997) sind durσh einen Balken über der jeweiligen Sequenz hervorgehoben und absσhnittsweise nurome- riert. Die aus der Kristallstruktur vorhergesagten (Hosfield et al., 1999) Calpain-Domänen sind ebenfalls gekennzeiσhnet. Zur besseren Übersiσhtliσhkeit wurden die ersten 122 Aminosäuren des vorhergesagten Capn7-Proteins, die nur dieses Protein aufweist, niσht angegeben und durσh ein "Gleiσhheitszeiσhen" (=) ersetzt. Die ausgesprochen saure Region in Domäne III, die mit Calσium in- teragieren kann und mögliσherweise als "elektrostatisσher Sσhal- ter" der Protease-Aktivität wirkt, ist durσh Kreise über der relevanten Sequenz kenntliσh gemaσht. Die von der Spliσe-Variante A abweiσhenden C-terminalen Enden der aus der 914413-σDNA vorhergesagten Proteinsequenz und der vorhergesagten Proteinsequenzen der Spliσe-Varianten B und C sind von dem Punkt an gezeigt, an dem sie siσh von der Proteinsequenz der Spliσe-Variante Capnl2A unterscheiden. Die EMBL/GenBank-Zugangsnummern der Calpain-Sequen- zen sind in der Legende zu Figur 3 angegeben.
Figur 2 die genomisσhe Struktur des Capnl2-Gens:
A. Sσhematisσhes Diagramm der Intron/Exon Struktur des Capnl2-Gens. Die schwarzen Rechtecke stehen für Exons der Capnl2. Diese sind fortlaufend nummeriert. Das karierte Reσhteσk kennzeiσhnet das am äußersten 3 '-Ende gelegene Exon von Aσtn4. Das gepunktete Reσhteσk kennzeiσhnet die Exonsequenz, die sich Capnl2 und Aσtn4 teilen. Die Pfeile geben die Transkriptionsriσhtung beider Gene an. Die Lage der Sequenzwiederholungen, die man in der Sequenz entdeσkte, sind oben angegeben. Das Spliσe-Ereignis zwisσhen den Exons 9 und 20, aus dem das mRNA-Transkript des Klons 914413 resultierte und die Teilsequenzen, die Spliσe-Donor- und Spliσe-Akzeptorstelle der Exons 9 und 20 der Capnl2 umgeben, sind ebenfalls angegeben. Große Buσhstaben kennzeiσhnen jeweils die kodierende Sequenz und kleine Buσhstaben die Intronsequenz . Die Sequenz CACTG, die der anomalen Spliσe-Donor- und der Spliσe- Akzeptorstelle gemeinsam ist und in der das anomale Spliσe-Ereignis auftrat, ist unterstriσhen . Die siσh daran ansσhließende Sequenz der 914413-σDNA, die diese zwei Exons miteinander verbindet, ist ebenfalls angegeben.
B. Ein sσhematisσhes Diagramm der Exons 11, 12 und 13 zeigt die alternativen Splice-Varianten A, B und C. Die Sequenz des gemeinsamen Exons 11 ist auf der linken Seite gezeigt und das damit verbundene Exon, das in der jeweiligen Spliσe-Variante verwendet wird, auf der rechten Seite. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist unter der entsprechenden Nukleotidsequenz angegeben. Die letzten zwei Nukleotide des Spliσe-Akzeptors in Exon 12, AG, die in Spliσe-Variante B verwendet werden, sind fettgedruσkt darge- stellt.
C. Die Tabelle zeigt die Spliσe-Ereignisse der einzelnen Exons mit der den jeweiligen Spliσe-Donor und Spliσe-Akzeptor umgebenden Nukleotidsequenz. Spliσe-Donor und Spliσe-Akzeptor sind fettgedruσkt dargestellt. Die Größe der jeweiligen Exons und Introns ist angegeben.
Figur 3 den phylogenetisσhen Stammbaum der Säugetier-Genfamilie der großen Calpain-Untereinheit:
Die Analyse wurde mit Hilfe des Programms CLUSTAL durσhgeführt, der Stammbaum wurde mit CLUSTREE erstellt. Die jeweilige Länge der horizontalen Linien ist proportional zum vermuteten phylogenetisσhen Abstand; die vertikalen Abstände haben keine Bedeutung. Es wurden 1000 Bandwiederholungen durσhgeführt und die Werte sind in den inneren Knotenpunkten angegeben. Es wurden vorzugsweise Sequenzen der Maus verwendet. Da diese nicht für Capnβ, Capn9 und Capnll verfügbar sind, wurden ersatzweise die orthologen Sequenzen der Ratte und des Menschen verwendet. Die EMBL/GenBank-Zug- angsnummern der Sequenzen sind: Capnl (AF021847), Capn2 (Y10139), Capn3 (X92523), Capn5 (Y10656), Capnβ (Y12582), Capn7 (AJ012475), Ratte Capnδ (D14480), Mensch CAPN9 (AF022799), CapnlO (AF126867) und Mensch CAPN11 (AJ242832).
Figur 4 eine mRNA-Expressionsanalyse von Aσtn4 und Capnl2:
A. Expression von Aσtn4 in verschiedenen Mausgeweben. Eine 32P- markierte Probe, die dem 3 '-Ende der Aσtn4-σDNA der Maus ent- spraσh, wurde an einen Clonteσh Mouse-Master-Blot hybridisiert. Die Lokalisation der RNAs auf den Filtern ist auf der reσhten Seite angegeben. Der Blot wurde gestrippt und mit einer Maus Hprt-Probe hybridisiert (in der Mitte), um die RNA-Beladung zu überprüfen. Die Expositionszeit betrug 48 Stunden.
B. Eine 32P-markierte Probe wurde an einen Northern-Filter, der RNAs aus der Haut von Mäusen angegebenen Alters trug, hybridi- siert. Der Blot wurde zur Überprüfung der aufgetragenen RNA-Level ansσhließend ein weiteres Mal mit einer ß-Aσtin-σDNA-Probe hybridisiert. Die Positionen der 28S- und 18S-rRNAs sind gekennzeiσh- net und die spezifisσhe Capnl2-RNA-Bande mit einem Pfeil markiert. Die Expositionszeit bei der Capnl2 betrug 144 Stunden und 2 Stunden bei ß-Aσtin.
C. Capnl2-RT-PCR von RNAs der Haut von Mäusen versσhiedenen post- natalen Alters. M, pSM verdaut mit Hindlll als Molekulargewichts- marker. Die Größe der Banden ist in Basenpaaren angegeben. Neg, negative Kontrolle ohne eingesetzte DNA. Die Sequenzierung der hervorgehobenen PCR-Produkte bestätigte, dass die verstärkte Bande der Capnl2-σDNA entspricht.
Figur 5 eine in-situ-Hybridisierung an Hautgewebesσhnitten aus Mausembryonen:
Auf der linken Seite sind liσhtmikroskopisσhe Aufnahmen der Gewe- bensσhnitte dargestellt. Reσhts daneben ist das entspreσhende Bild der in-situ-Hybridisierung zu sehen. Die Capnl2 wird selektiv im Cortex des Haarfollikels exprimiert (irs: inner root sheath; ors: outer root sheath; σo: σortex) .
Beispiel 1
Sσreening einer genomischen Bibliothek
Eine Cosmid-Bibliothek, erstellt durσh Klonierung von partiell durσh Sau3A verdauter Maus-129/Sv-DNA in den Cosmidvektor pSuper- Cos ( Stratagene) , wurde durσh PCR-Analyse unter Verwendung der Capnl2-spezifisσhen Primer 5 '-gaatggσgagtggσaacaggaag-3' (SEQ ID NO: 9) und 5 '-tggggσtσagσaσaaaaσtσat-3' (SEQ ID NO: 10) ges- σreent. Die Cosmid-DNA wurde mit Hilfe des Qiagen Plasmid Midi Kits gemäß den Herstellerangaben aufgereinigt.
Beispiel 2
cDNA-Amplifikation durch PCR
Fünf Mikrogramm Gesamt-RNA wurden mit AMV Reverse Transkriptase unter Verwendung des Promega Reverse Transkription Systems in σDNA transkribiert. Die PCRs wurden in 50 μl Reaktionsvolumen, die 50 mM KC1, 10 itiM Tris-HCl, pH 9, 0,1% Triton X-100, 2 Units Taq DNA-Polymerase, 50 pmol sowohl der Vorwärts- als auσh der Rüσk- wärtsprimer und 0,1 ng cDNA enthielten, mit einem Thermoσyσling- Protokoll von 35 Zyklen, umfassend 15 s bei 94°C, 30 s bei 55°C und 1 min bei 72°C, durσhgeführt. Die Capnl2 Vorwärts- und Rück- wärtsprimersequenzen zur RT-PCR waren 5'-ttσaagaσtttσtσaσg-3' (SEQ ID NO: 11) und 5 ' -tσgασσσσttgagtttattctga-3' (SEQ ID NO: 12). Die Hprt Vorwärts- und Rüσkwärts-Primersequenzen waren 5'-atgσσgacσσgσagtσσσagσg-3' (SEQ ID NO: 13) und 5'-ggσtttgtatttggσttttσσ-3' (SEQ ID NO: 14).
Beispiel 3 DNA-Sequenzierung
Ein 20 μl-Reaktionsgemisσh, das 8 μl BigDye Reaktion Mix (Perkin- Elmer Biosystems), 500 ng gereinigte DNA und 10 pmol Primer ent- hielt, wurde 30 Zyklen, umfassend 15 s bei 94°C, 15 s bei 50°C und 2 min bei 60°C, inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden durσh Po- lyaσrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung eines ABI 377 DNA- Sequenσers aufgetrennt und die Sequenz durσh Dye-Terminator-Fluoreszenz mit Hilfe der Perkin-Elmer Biosystems Sequenzanalyse Software Version 3,3 sequenziert. Weitere Sequenzierung mit synthetisierten Oligonukleotiden erweiterte die DNA-Sequenzen. Die Sequenzen wurden mit Hilfe des SeqMan der Programmreihe DNASTAR zu einem Contig zusammengesetzt.
Beispiel 4
Sequenzanalysen
DNA- und Aminosäuresequenzen wurden bezügliσh ihrer Homologie mit den niσht-redundanten Nukleotid-, Protein- und EST-Datenbanken des National Center for Bioteαhnology Information (http://www.nabi.nlm.nih.gov) mit Hilfe der Programmreihe-BLAST (Altsσhul et al., 1990) untersucht. Der Sequenzvergleiσh und die Gegenüberstellung von Aminosäuresequenzen wurde mit CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) durσhgeführt. Die Vorhersage der Exons war mit Hilfe des FGNENESH-Programms mögliσh, das über den Sanger Centre Web-Server (www.sanger.aa.uk) erhältliσh ist. Repetitive Sequenzen wurden unter Verwendung des "RepeatMasker" (http://re- peatmasker.genome.washington.edu) identifiziert. Die phylogeneti- sσhe Analyse wurde mit dem Programm CLUSTREE, erhältliσh vom HU- SAR-Server des Deutschen KrebsforsσhungsZentrums, Heidelberg (www. dkfz-heidelberg.de) durchgeführt.
Beispiel 5
Northern-Blot-Hybridisierung
Die Gesamt-RNA aus Mausgeweben wurde mit Hilfe der Guanidin-Iso- thiocyanat-Methode (Chomzynski und Saσσhi, 1987) isoliert. 10 μg Gesamt-RNA wurden durσh Elektrophorese in einem 1,4% (w/v) Agaro- segel, das wie bereits besσhrieben 2,2 M Formaldehyd enthielt (Sambrook et al., 1989), aufgetrennt und gemäß den Herstellerangaben auf eine Hybond-N-Nylonmembran (Amersham) geblotted. Der Blot wurde mit einem 32P-markierten σDNA-Fragment, das den Nukleo- tiden 33-852 cDNA-Sequenz der Capnl2 entsprach in Expresshyb Hy- bridisierungslösung (Clonteσh) hybridisiert. Die Bedingungen der Hybridisierung und des hoσhstringenten Wasσhens wurden gemäß den Herstellerangaben gewählt. Der Blot wurde in einem zweiten Sσhritt mit einer σDNA-Probe des ß-Aσtins hybridisiert, um die RNA-Beladung zu überprüfen.
Beispiel 6
In-situ-RNA-Hybridisierung an Gewebesσhnitten
Die Capnl2-cDNA, die als Template zur Synthese von RNAs, entspre- chend den Nukleotiden 33-852 der besσhriebenen Sequenz, verwendet wurde, wurde in die EσoRV-Stelle des pBluesσripts kloniert. Dieses σDNA-Fragment überlappt niσht mit dem Actn4-Gen. 33P-markierte Sense- und Antisense-RNAs wurden durch in-vitro-Transkription von Restriktionsenzym-linearisierter Plasmid-DNA in einem Reaktions- volumen von 12,5 μl, das 1 x Transkriptionspuffer (Puffer für T7- und T3-RNA Polymerasen, von Statagene), 200 μM ATP, CTP, GTP, 40 μCi α-33P-UTP (Amersham) , 10 mM DTT, 1 μg linearisierte Plasmid- DNA, 40 Units RNAsin (Promega) und 10 Units RNA-Polymerase enthielt, hergestellt. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37°C wurde die Template-DNA durσh Zugabe von 2 Units DNAasel (Boehringer Mannheim) gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 37°C entfernt. Der Reaktionsansatz wurde extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in 26 μl DEPC-behandeltem dH20 resuspendiert. Die Embryos wurden in 4% (w/v) Paraformaldehyd in PBS fixiert und daraus erhal- tene 5 μm-Gewebesσhnitte wurden auf vorgereinigte SuperFrost Plus- Objektträger (Menzel-Glaeser) überführt. Die Hybridisierungs- und Wasσhbedingungen waren wie bereits besσhrieben (Dressler und Gruss, 1989). Es wurde eine Hybridisierungstemperatur von 55°C gewählt.
Beispiel 7
Bestrahlungshybridkartierung
Die DNAs der T31-Bestrahlungshybridkartierungsplatte (Researσh Genetiσs) wurden durσh PCR mit Hilfe zweier, der Capnl2 [Set 1: 5'-gggagggccaggacaaggaσt-3' (SEQ ID NO: 15), 5'-agggaaggσtggaaσaatggagaa-3' (SEQ ID NO: 16), Set 2: 5'-gaatggσgagtggσaaσaggaag-3' (SEQ ID NO: 17), 5'-σtggggσtcagσaσaaaaσtσat-3' (SEQ ID NO: 18)] und der Capn5 (Set 1: 5'-σggtgaσaσtggaσtgggσσttgσ-3' SEQ ID NO: 19), 5 ' -aagσσgσσtgσagagcaσtgtgg-3 ' (SEQ ID NO: 20); Set 2: 5'-σgggagtggaσgggσcσσtg-3' (SEQ ID NO: 21), 5 ' -σtcactttσtgσσattσσtσ-3 ' (SEQ ID NO: 22)) entspreσhenden Prim- ersets, analysiert. Die PCRs wurden in einem Reaktionsvolumen von 20 μl, das 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 9, 1,5 mM MgCl2, 1 Unit Taq DNA-Polymerase und 25 ng DNA enthielt, mit einem Thermoσy- σling-Protokoll von 35 Zyklen, umfassend 15 s bei 94°C, 30 s bei 60°C und 1 min bei 72°C, durσhgeführt. Die Rohdaten wurden zur Analyse bei der Maus-Bestrahlungshybrid-Datenbank, im Jaσkson Laboratory (www. jax.org/resourσes/doσuments/σmdata/rhmap/) einge- reicht.
Beispiel 8
Identifizierung der Capnl2
Zur Identifizierung neuer Calpaingene durσhsuσhte man die öffentlich zugängliσhen EST-Datenbanken. Unter Verwendung der vorläufig erhaltenen Daten, wurde ein neues Mitglied der Säugetier-Genfamilie der großen Calpain-Untereinheit, die durσh ein zellspezifi- sσhes Expressionsmuster σharakterisiert ist, gefunden und σharakterisiert.
Die Maus-EST-Datenbank wurde mit Proteinsequenzen von bekannten Wirbeltier-Calpainen unter Verwendung des TBLAST-Algorithmus (Altsσhul et al., 1990) durσhsuσht. Das translatierte Protein eines 3'-EST, AA1314413, war für die Familie der großen Calpain-Untereinheit typisch. Aus diesem Grund wurde der σDNA-Klon, 914413, der diesem EST-Klon entspricht, in seiner Gesamtheit sequenziert. Die cDNA weist einen PolyA-Sσhwanz auf und enthält ein offenes Leseraster, dessen vorhergesagtes Protein Homologie zu den Domänen I und II der großen Untereinheit der klassischen Calpaine zeigt. Die vorhergesagte Sequenz weicht allerdings von der klassischer Calpaine im Ansσhluß an die Domäne II ab und endet kurz darauf (Fig. 1) .
Drei Beobaσhtungen deuten an, dass dieser σDNA-Klon von einem anomalen Transkript stammt. Erstens, weist das offene Leseraster keine Homologie zu den Domänen III oder IV anderer Calpaine auf, während alle bisher identifizierten Calpaine eine typisσhe Vier- Domänen-Struktur aufweisen. Zweitens, war es niσht mögliσh, mit Primern, die aus den beiden Enden der erhaltenen Sequenz konstruiert wurden, aus einer großen Zahl von Gewebe-σDNAs ein Transkript dieser Länge zu amplifizieren. Drittens, wurden zum 3 '-Ende von AA1314413 homologe, humane ESTs identifiziert, von denen manσhe Homologie zu der Calmodulin-ähnliσhen Domäne IV der Calpaine zeigten. Daher scheint der σDNA-Klon 914413 das Ergebnis eines atypisσhen oder fehlerhaften RNA-Spliσing-Ereignisses zu sein, das die für die Domänen III und IV kodierenden Exons dieses Calpain-Gens deletiert hat. Um dies zu überprüfen wurde ein genomisσher DNA-Cosmidklon isoliert und sequenziert. Man erhielt eine fortlaufende Sequenz (SEQ ID NO: 8) von insgesamt 13116 bp. Die Genvorhersagesoftware (FGE- NESH) identifizierte ein potentielles Gen mit 21 Exons, mit einer Exon/Intron-Struktur, die typisch für die Genfamilie der Calpaine ist. Darunter sind Exons mit ausgeprägter Homologie zu den Domänen III und IV der klassischen Calpaine. Zur Bestimmung der genauen Exon/Intron-Struktur analysierte man aus der Haut isolierte mRNA mittels RT-PCR. Die Software sagte 20 der 21 Exons vorher, wobei sie einige Fehler in der Position der Donor- oder der Ak- zeptor-Spliσe-Stelle erlaubt. Die Intron/Exon-Grenzen des vollständigen Gens sind in Figur 2A gezeigt und in Tabelle 1 zusammengefaßt. Das Nomenklatur-Komitee des Maus-Genoms gab diesem Gen den Namen Capnl2. Man fand in der Capnl2-Intronsequenz vier ein- faσhe Sequenzwiederholungen und 16 SINES ( Short interspersed re- peats; 4 Bl, 1 B2, 3 B4 und 8 ID; Fig. 2A) . Im Vergleich zu der aus der genomisσhen Sequenz vorhergesagten mRNA-Sequenz scheint der σDNA-Klon 914413 das Ergebnis eines fehlerhaften Spliσe-Erei- gnisses zu sein, denn sowohl die Spliσe-Donor- als auσh die Spliσe-Akzeptorstelle sind atypisσh und der größte Teil der Exons der Domänen III und IV wird dadurσh deletiert. Der Spliσe findet zwisσhen den Exons 9 und 20 innerhalb einer 5-Basenpaarregion, CACTG, statt, die diesen beiden Exons gemeinsam ist (Fig. 2A) .
Mittels RT-PCR wurden drei alternative Spliσe-Varianten der
Capnl2-mRNA identifiziert (hier Capnl2A, Capnl2B und Capnl2C genannt) . Die Spliσe-Variante A weist ein offenes Leseraster auf, das vermutliσh ein Protein aus 720 Aminosäuren (Mr 80,5 kDa) kodiert. Das vorgeschlagene Start-Methionin (cgaATGg) entspriσht der minimalen Konsensussequenz der Translationsstartstelle (Ko- zak, 1996). Weitere 5 ' -Startstellen werden durσh ein TAA-Stopσo- don im Leseraster ausgesσhlossen, das 39 Nukleotide strangauf- wärts dieses ATG lokalisiert ist. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz zeigt Ähnliσhkeiten zu Mitgliedern der Familie der großen Calpain-Untereinheit und kann in die für Calpaine typischen vier Domänen I bis IV unterteilt werden (Fig. 1). Die Domäne II der erfindungsgemäßen Capn12 weist die drei Aminosäurereste (Cysl05, His259 und Asn283) auf, die für das aktive Zentrum von Cystein- Proteasen wesentlich sind (Berti und Storer, 1995). Demgemäß weist die erfindungsgemäße Capnl2, wie die meisten klassischen Calpaine, Cystein-Protease-Aktivität auf.
Jede der fünf, der bei der Capn2 beschriebenen Ca2+-bindenden Sequenzen (Blanσhard et al., 1997; Lin et al., 1997) ist in gewis- sem Ausmaß in der Aminos uresequenz der Capnl2 konserviert (Fig. 1). Die Kristallstruktur der Capn2 braσhte eine extrem saure Region in der Domäne III zum Vorschein, die mit Ca2+ interagieren und als "elektrostatischer Schalter" der Protease-Aktivität wirken könnte (Strobl et al., 2000). Die Autoren vermuten, dass die große Zahl saurer Reste in dieser Region die für die Aktivierung notwendige Ca2+-Konzentration reduzieren könnte. Die entsprechende 5 Region der Capnl2 ist ebenso ausgeprägt sauer (DEEEDDDDEE; Fig. 1). Insgesamt legt die primäre Aminosäuresequenz somit nahe, dass dieses Protein Cystein-Protease-Aktivität aufweist und Calcium bindet. Ein Vergleiσh der vorhergesagten Aminosäuresequenz mit denen anderer Vertebraten- und Invertebraten-Calpaine zeigte 10 starke Sequenzhomologie zur Capnl des Mensσhen und der Maus (39,9% bzw. 39,75%) .
Die Transkripte der Spliσe-Varianten A und B untersσheiden siσh im Spliσe-Akzeptor des Exons 12, während der Variante C das Exon
15 12 ganz fehlt. Die vorhergesagten Proteine der alternativen Spliσe-Varianten B und C zeigen dadurch eine in der Domäne III abweichende Aminosäuresequenz und aufgrund eines Shifts im Leseraster endet die Translation innerhalb dieser Domäne (Fig. 2B). Folglich fehlt ihnen vermutlich auch die Calmodulin-ähnliσhe,
20 Ca2+-bindende, C-terminale Domäne. Analog dazu wurde bereits gezeigt, dass auσh die Capn8 der Ratte und die Capn5 der Maus alternativ gespliσete Transkripte bilden, die Proteine kodieren, denen die C-terminale Domäne fehlt (Sorimaσhi et al. , 1993; Dear et al., 1997). Überrasσhenderweise war das RT-PCR-Produkt der
25 Spliσe-Variante B abundanter als das der Spliσe-Variante A. Somit stellt vermutliσh ein Capnl2-Protein, dem eine Ca2+-bindende Domäne fehlt einen beträσhtliσhen Teil des Capnl2-Proteinpools dar. Das RT-PCR-Produkt der Spliσe-Variante C war dagegen das am wenigsten abundante.
30
Beispiel 9
Phylogenetisσhe Analyse der großen Calpain-Untereinheit der Säugetiere 5
Die jeweils vollständigen Aminosäuresequenzen repräsentativer Mitgliedern aller bekannten großen Calpain-Untereinheiten der Säugetiere wurden einer phylogenetisehen Analyse unterzogen. Da- durch konnte man die Calpaine in drei Hauptgruppen einteilen 0 (Fig. 3). Die erste Gruppe (A) wird durσh Capnl, Capn2, Capn3, Capn8 und Capn9 repräsentiert und die zweite Gruppe (B) durαh Capn5, Capnβ, Capn7, CapnlO und Capnl2. Capnl1, ein stark abweichendes Calpain (Dear et al., 1999), passt in keine der Gruppen. Gruppe (A) enthält alle Calpaine mit einer Calmodulin-ähnliσhen, 5 C-terminalen Domäne, während Gruppe (B) all jene "atypisσhen"
Calpaine enthält, denen vermutliσh die Fähigkeit zur Ca2+-Bindung fehlt. Eine Ausnahme stellt die Capnl2 dar, die im Allgemeinen der Gruppe (B) ähnlicher ist, abgesehen davon, dass sie eine Calmodulin-ähnliche, C-terminale Domäne aufweist. Darüberhinaus legt die phylogenetisσhe Analyse die Vermutung nahe, dass die Capnl2 das älteste Mitglied dieser Gruppe ist. Folgliσh könnte ein Vor- läufer des Capnl2-Gens der Begründer der Gene der atypisσhen großen Calpain-Untereinheit sein, wobei die Capn12 über alternatives Spliσing mögliσherweise als Quelle sowohl klassischer als auσh atypisσher Proteine gedient hat.
Beispiel 10
Chromosomen-Lokalisation
Die Lokalisation des Capnl2-Gens auf Chromosomen der Maus wurde durσh PCR-Analyse der T31-Bestrahlungshybridkartierungsplatte mit Hilfe von Primern bestimmt, die innerhalb des Introns 1 des Capnl2-Gens binden. Die Rohdaten wurden unter Verwendung der Bestrahlungshybridkarte des Maus-Genoms (Van Etten et al. , 1999) und dem dazugehörenden World Wide Web Server analysiert. Der höσhste LOD-Wert lag bei 16, in Verbindung mit dem Marker D7Mit72. Andere hohe LODs lagen bei 14,4 in Verbindung mit D7Mitll6, 14,4 in Verbindung mit D7Mit77, und 13,9 in Verbindung mit D7Mit267. Diese Marker wurden auf Chromosom 7 bei 9,4 (D7Mit77), 10,7 (D7Mitllβ), 10,4 (D7Mit72), und 11,0 cM (D7Mit267) lokalisiert. Die sσhlüssigste Reihenfolge ist: proxi- mal - D7Mit77 - D7Mitllβ - D7Mit72 - Capnl2 - D7Mit267 - distal. Die Region ist ortholog zum humanen Chromosom 19ql3. Das Capn5-Gen der Maus wurde kürzliαh ebenfalls mit Hilfe einer Be- strahlungshybridkartierungsplatte der Chromosomen somatisσher Zellen der Maus auf dem Maus-Chromosom 7 lokalisiert (Matena et al., 1998). Um den genauen Abstand zwischen Capn5 und Capnl2 auf dem Chromosom 7 zu bestimmen, wurde die T31-Platte mit Maus-Capn5-spezifischen PCR-Primern ausgewertet. Der höσhste LOD- Wert lag bei 13,4 in Verbindung mit D7Mit321. Andere hohe LODs lagen bei 10,9, 8,5 und 6,9 in Verbindung mit D7Mitl84, D7Mitl71 bzw. D7Mit39. Die schlüssigste Reihenfolge dieses Loσus ist: pro- ximal - D7Mit321 - 7σR - Capn5 - 42σR - D7Mitl49 - distal. Der D7Mit321-Marker wurde bei 48,5 σM auf Chromosom 7 lokalisiert. Somit sind Capn5 und Capnl2 syntenisσh, liegen aber in deutlichem Abstand voneinander auf Chromosom 7. Da die Gene Aσtn4 und
Capnl2, wie naσhfolgend beschrieben, überlappen, muß Aσtn4 ebenfalls auf dem Maus-Chromosom 7 liegen. Da das humane Aσtn4-Gen auf dem Chromosom 19ql3 lokalisiert wurde (Kaplan et al., 2000), liegt das humane Capnl2-0rtholog sehr wahrsσheinliσh ebenfalls in dieser Region. Beispiel 11
Expressionsanalyse
Eine erste in-situ-Hybridisierungsanalyse an Gewebesσhnitten aus Mausembryonen, die mit Hilfe der 914413-σDNA zur Herstellung strangspezifisσher RNA-Proben durσhgeführt wurde, führte dadurσh zu verwirrenden Ergebnissen, da die als Kontrolle eingesetzte Sense-RNA, die an den Nonsense-Strang von Capnl2 hybridisieren sollte, in jedem Experiment ein Hybridisierungssignal lieferte. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen ist, dass der Non- sense-DNA-Strang ebenfalls eine RNA kodiert. Untersuchungen der DNA-Gendatenbank identifizierte über 200 ESTs, die dem 3 '-Ende des Capnl2-Gens entsprechen. Jedoch entspreσhen alle ESTs, mit Ausnahme von AA914413, dem niσht-kodierenden Strang. Die Abfolge überlappender ESTs bildete eine Sequenz mit einem offenen Leseraster, die für das Maus-Ortholog von α-Aσtinin-4 (Aσtn4) kodiert. Die RT-PCR versσhiedener Mausgewebe-RNAs bestätigte die Sequenz. Das vorhergesagte Mausprotein ist mit dem humanen Actn4 zu 98,9% identisσh. Das letzte Exon überlappt mit dem letzten Exon des Capnl2-Gens um 330 bp, allerdings in entgegengesetzter Orientierung (Fig. 2). Man konnte kürzlich zeigen, dass Mutationen im humanen Actn4-Gen familiäre segmentale Herdnephretitis verursachen kann (Kaplan et al., 2000).
Eine RNA-Dot-Blot-Analyse und in-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer spezifischen Probe zeigte, dass das Aσtn4-Gen ubi- quitär exprimiert wird (Fig. 4). Im Gegensatz dazu war es nicht möglich, in einer von über 30 verschiedenen getestete Poly(A+)-RNA-Isolierungen aus adultem oder embryonalem Gewebe mit Capnl2-spezifisσhen σDNA-Proben ein Hybridisierungssignal zu erhalten. Obwohl der 914413-σDNA-Klon aus einer Brustdrüsen-cDNA- Bibliothek isoliert wurde, zeigten Northern-Blot- und RT-PCR-Ana- lyse in diesem Gewebe keine signifikanten Expressionslevel. Erst eine genauere RT-PCT-Analyse in Verbindung mit einer in-situ-Hybridisierung an Mausembryonen der Stadien dElO,5 bis dE18,5 und verschiedenen adulten Geweben zeigten, dass Capnl2 aussσhließliσh in der Haut exprimiert wird. Hier wird Capnl2 im Cortex des Haar- follikels exprimiert (Fig. 5).
Haare unterliegen einem Zyklus, der bei der Maus ungefähr 25 Tage dauert (Chase, 1965). Der Zyklus ist grob in drei Phasen unterteilt: Die Anagen- (Proliferations-), die Katagen- (Rückbil- dungs-) und die Telogen-Phase (Ruhephase). Die Rüσkenhaut der adulten Maus enthält Haarfollikel aller Phasen des Haarzyklus. Um genauer zu ermitteln, in welchen Phasen des Zyklus die Capnl2-mRNA exprimiert wird, wurden von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Geburt Proben aus der Rüσkenhaut entnommen und die extrahierten RNAs durσh Northern-Blot-Hybridisierung un- tersucht. Der erste Haarzyklus der Maus verläuft synσhron (Chase, 1965) und somit können relativ reine Haarfollikeln-Populationen 5 einer spezifischen Zyklus-Phase untersuσht werden. Eine
Capnl2-mRNA von ungefähr 3,5 kb kann in der Anagenphase (ungefähr P1-P16), aber nicht in der Telogenphase (P19-P25) (Fig. 4B) nachgewiesen werden. Die mRNA erreiσht ihr höσhstes Expressionslevel ungefähr am Tag P12, in der Mitte der Anagenphase. Eine RT-PCR- 10 Analyse derselben Hautproben bestätigte dieses Ergebnis (Fig. 4C). Somit zeigt Capnl2 ein hoσhspezifisσhes mRNA-Expressionsmu- ster.
Die Genfamilie der großen Calpain-Untereinheit kann aufgrund ver-
15 sσhiedener Kriterien unterteilt werden, wie oben erwähnt z.B. aufgrund der Proteinstruktur. Ein weiteres Klassifizierungskriterium ist die ubiquitäre gegenüber der gewebespezifisσhen Expression. Capnl, Capn2, Capn7 und CapnlO sσheinen ubiquitär exprimiert zu werden, während die anderen Calpaine durσh untersσhied-
20 liσh stark ausgeprägte gewebsspezifische Expression σharakterisiert sind. Beispielsweise wird Capn9 vorwiegend im Darm und Magen exprimiert, ist aber auσh in anderen Geweben nachweisbar (Li et al., 1998). Dagegen wird Capnll offenbar ausschließlich in bestimmten Zellen der Testis exprimiert wird (Dear und Boehm,
25 1999). Darüber hinaus werden manσhe Calpain-Gene entwiσklungsspe- zifisσh exprimiert. Capn5 wird beispielsweise im embryonalen Thy- mus in den T-Zell-Vorläufern exprimiert, während naσh der Geburt die Expression im Thymus herunterreguliert wird (Dear und Boehm, 1999) .
30
REFERENCES
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Claims

Patentansprüσhe
5 1. Calpain-Protease 12 (Capnl2), dadurσh gekennzeiσhnet, daß sie eine Aminosäuresequenz, umfassend die Aminosäuren 1 - 342 der SEQ ID NO: 1 aufweist, sowie deren funktionale Äquivalente.
2. Capnl2 gemäß Anspruσh 1, dadurσh gekennzeiσhnet, dass sie
10 eine Aminosäuresequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 aufweist, sowie deren funktionale Äquivalente.
3. Capn12 gemäß einem der Ansprüσhe 1 und 2, dadurσh gekenn- 15 zeiσhnet, dass sie Cystein-Protease-Aktivität aufweist.
4. Calpain-Protein, dadurσh gekennzeiσhnet, dass es wenigstens eine Capnl2 gemäß einem der vorhergehenden Ansprüσhe aufweist.
20
5. Polynukleotid, das für eine Capnl2 gemäß einem der Ansprüσhe 1 bis 3 kodiert, sowie deren funktionale Äquivalente und damit hybridisierbare oder dazu komplementäre Polynukleotide.
25 6. Polynukleotid gemäß Anspruσh 5 mit einer Nukleinsäuresequenz, ausgewählt unter SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8.
7. Expressionskassette, umfassend wenigstens eine regulatorische 30 Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft mit einem Polynukleotid gemäß einem der Ansprüσhe 5 und 6.
8. Rekombinanter Vektor, der ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüσhe 5 oder 6 oder eine Expressionskassette gemäß An-
35 spruσh 7 trägt.
9. Mikroorganismus, enthaltend wenigstens einen rekombinanten Vektor gemäß Anspruσh 8.
40 10. Verfahren zur Herstellung einer Capnl2 gemäß einem der Ansprüσhe 1 bis 3, wobei man einen Mikroorganismus, welσher die Capnl2 produziert, kultiviert und die Capnl2 aus der Kultur isoliert.
45
11. Verwendung einer Capnl2 gemäß einem der Ansprüσhe 1 bis 3 oder eines Calpain-Proteins gemäß Anspruσh 4 als Cystein-Protease.
5 12. Pharmazeutisσhes Mittel, enthaltend eine Capnl2 gemäß einem der Ansprüσhe 1 bis 3, ein Calpain-Protein gemäß Anspruσh 4 oder einen rekombinanten Vektor gemäß Anspruσh 8.
13. Verwendung einer Capnl2 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, 10 eines Calpain-Proteins gemäß Anspruσh 4 oder eines rekombinanten Vektors gemäß Anspruσh 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten oder Krankheitszuständen, die im Zusammenhang mit einer unzureiσhenden Expression der Capnl2 stehen.
15
14. Verwendung einer Capnl2 gemäß einem der Ansprüσhe 1 bis 3 oder eines Calpain-Proteins gemäß Anspruσh 4 zum Sσreening auf Calpain-Protease-Effektoren.
20 15. I munglobulin mit Spezifitat für eine Capnl2 gemäß einem der Ansprüσhe 1 bis 3.
16. Verwendung von Immunglobulinen gemäß Anspruσh 15 oder Capnl2-bindender Moleküle zur Diagnose von Krankheiten oder
25 Krankheitszuständen, die im Zusammenhang mit einer Capnl2-Ex- pression stehen.
17. Verwendung von Polynukleotiden gemäß einem der Ansprüσhe 5 oder 6 zur Diagnose von Krankheiten oder Krankheitszuständen,
30 die im Zusammenhang mit einer Capnl2-Expression stehen.
35
40
45
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