DD225442A1 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aphanomycin - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Aphanomycin. Grundlage der Erfindung ist der Mikroorganismus Aphanocladium spec., der unter emersen Bedingungen in einem Komplexmedium Aphanomycin produziert. Aphanomycin ist eine neue, natuerlich vorkommende Verbindung. Es ist bis zum gegenwaertigen Zeitpunkt kein weiterer Mikroorganismus bekannt, der Aphanomycin bildet. Auf Grund seiner biologischen Aktivitaet kann Aphanomycin als Antibiotikum einsetzbar sein.
Description
Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Aphanomycin. Aphanomycin ist die natürlich vorkommende Chinon-Benzofuran-Verbindung 4', 6, y'-Trihydroxy-e'-methyl-i^-cyclohexadien^-yl-^T-dion-benzofuran, die von dem Mikroorganismus Aphanocladium spec, produziert wird. Die Verbindung besitzt antibakterielle Eigenschaften und ist in der Lage, höhere Pflanzen zu schädigen. Eine Anwendungsmöglichkeit der Erfindung besteht in dem Einsatz von Aphanomycin als Antibiotikum.
Aphanomycin ist eine Verbindung, von der bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht bekannt ist, daß sie von einem Mikroorganismus gebildet wird.
Das Ziel der Erfindung ist die mikrobielle Herstellung von Aphanomycin
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Aphanomycin zu beschreiben. Der Mikroorganismus Aphanocladium spec, ist in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena der Akademie der Wissenschaften der DDR für die Hinterlegung von Mikroorganismen bei der Vornahme von Erfindungsanmeldungen unter der Nummer 43718 hinterlegt.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß der Stamm Aphanocladium spec, unter emersen Bedingungen in einem Komplexmedium bei einem pH-Wert von 5 bis 6 und einer Temperatur von 26 bis 300C kultiviert wird. Nach einer Kultivierungszeit von 4 Tagen wird die höchste Ausbeute erreicht. Als Impfmaterial für die Vorkultur dienen Kulturen von Schrägagarröhrchen. Die Vorkultur wird in Petrischalen auf Malzagar durchgeführt. Als Impfmaterial für die Hauptkultur dienen 5 Stanzstücke der Vorkultur.
Die Kulturlösung wird vom Myzel getrennt und zur Isolierung von Aphanomycin mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die organische Phase wird zunächst mit Natriumhydrogencarbonatlösung behandelt und nach Abtrennen der anorganischen Phase mit Natriumcarbonatlösung extrahiert. Aus dieser Phase kann durch nochmalige Extraktion mit Essigsäureäthylester Aphanomycin isoliert werden.
Die Verbindung Aphanomycin kann durch folgende Eigenschaften und Parameter charakterisiert werden:
(1) Massenspektrum
Aus der Präzisionsmassen bestimmung des Molekül ions M* folgt für die elementare Zusammensetzung die Summenformel C13H3O6 (gefundene Masse 260,0346: berechnet 260,0321); charakteristische Fragmente bei 242, 216,188,160,149.
(2) Elementaranalyse berechnet: C 60,05 H 3,88 gefunden: C59.18 H3.35
(3) Schmelzpunkt
Aphanomycin schmilzt unter Zersetzung über 27O0C.
(4) IR-Spektrum
Es wurden folgende charakteristische Banden erhalten: 3400, 1 710, 1 600, 1 420,1 190,1 050 und 810 cm"1.
(5) 'H-NMR-Spektrum
Das Spektrum zeigt folgende Signale: 2,85; 6,44; 6,75 ppm.
(6) 13C-NMR-Spektrum
Das Spektrum zeigt folgende Signale:
136,1; 151,8; 112,6; 117,1; 165,3; 97,6; 91,3; 167,7; 166,0; 100,0; 169,7; 164,9; 25,5 ppm.
(7) Aphanomycin ist gut löslich in Aceton, löslich in Methanol, Äthanol, Essigsäureäthylester, unlöslich in Wasser, Dimethylsulfoxid.
(8) DerRf-Wert von Aphanomycin, gelaufen auf SiI uf öl-Platten im EluierungssystemToluol/Essigsäureäthyiester/Ameisensäure i. V. 50/40/10, beträgt 0,58.
(9) Die antibakterielle Wirksamkeit von Aphanomycin ist in der folgenden Tabelle wiedergegeben:
- 2 - 263 697
Mikroorganismen Mit 50/xg/ml Aphanomycin
wurden unter Standartbedingungen folgendeHemmhofdurchmesser erreicht
Staphylococcus aureus 17
Bacillus subtilis 18
Escherichiacoli 13,5
Proteus morganii 19,5 Pseudomonas aeruginosa Saccharomyces
An einem Ausführungsbeispiel soll das Verfahren näher erläutert werden.
Die Stammhaltung von Aphanocladium spec, erfolgt in Schrägagarröhrchen, die Vorkultur auf Malzagarplatten und die Hauptkultur in Malz-Pepton-Nährlösung (500-ml-Rundkolben mit je 100ml Nährlösung). Der Nährboden und die Nährlösung haben folgende Zusammensetzung:
40g Malzextrakt flüssig (ohne Biotinzusatz)
1 g Pepton
20-3Og Agar-Agar auf 11 Aqua dest.
Bei der Flüssigkeitskultur entfällt der Agarzusatz. Der pH-Wert der Nährlösung beträgt 5,6 bis 6,6. Sie wurde jeweils bei 1,2 atm. 20min. bei 12O0C im Autoclaven sterilisiert.
Die Beimpfung der Emers-Hauptkultur erfolgt mit 5 Stanzstückchen von je 1 cm Durchmesser einer 7 Tage alten Pilzkultur. Nach einer Kultivierungszeit von 4 Tagen bei 28°C wird die Myzeldecke entnommen und die Kulturlösung aufgearbeitet. Aufarbeitung der Kulturlösung:
Die Kulturlösung wird auf einen pH-Wert von 2,9 bis 3,0 eingestellt und viermal mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die neutralgewaschene und getrocknete organische Phase wird zweimal mit 1 η Natriumhydrogencarbonatlösung ausgezogen. Nach Abtrennung der anorganischen Phase wird die Essigsäureäthylesterphase zweimal mit 1 η Natriumcarbonatlösung extrahiert. Nach Abtrennung der wässrigen Phase säuert man diese sofort an und extrahiert bis zur Farblosigkeit mit Essigsäureäthylester. Die neutralgewaschene und getrocknete und organische Phase wird im Vakuum zur Trockene eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt wird durch Chromatografie an Kieselgel 60 mit einem Eluationsgemisch von Toluol/ Essigsäureäthylester/Ameisensäure (50 + 40 + 10) gereinigt
Der Stamm Aphanocladium spec, produziert 30 bis 40mg Aphanomycin pro Liter Kulturlösung.
Claims (2)
- -1- 263 697 6Erfindungsansprüche:1. Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Aphanomycin, gekennzeichnet dadurch, daß der Stamm Aphanocladium spec, unter emersen Bedingungen in einem Komplexmedium bei einem pH-Wert von 5 bis 6 und einer Temperatur von 26 bis 300C kultiviert wird und daß aus dem Kulturfiltrat des Stammes durch Extraktion mit Essigsäureäthylester und anschließende Behandlung des Essigsäureäthylesterextraktes mit Natriumhydrogencarbonatlösung und Natriumcarbonatlösung, Aphanomycin isoliert und zu einem reinen Produkt aufgearbeitet wird.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Kultivierung im pH-Bereich von 5,6 bis 6,6 und bei ei η er Temperatur von 28°C durchgeführt wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD26369784A DD225442A1 (de) | 1984-06-01 | 1984-06-01 | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aphanomycin |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|
| DD225442A1 true DD225442A1 (de) | 1985-07-31 |
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Family Applications (1)
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| DD26369784A DD225442A1 (de) | 1984-06-01 | 1984-06-01 | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aphanomycin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD225442A1 (de) |
-
1984
- 1984-06-01 DD DD26369784A patent/DD225442A1/de not_active IP Right Cessation
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