DD218389A5 - Verfahren zur herstellung von faktoren von a-58365 - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung der Faktoren A, B und C von A-58365 mit der aus dem Formelblatt hervorgehenden allgemeinen Formel, worin n fuer 1 oder 2 steht, R und R1 gleich oder verschieden sein koennen und jeweils Wasserstoff, C1-C6-Alkyl, Indan-5-yl, Phthalidyl oder eine Acyloxymethylgruppe der FormelR2-O R2-C-O-CH2-bedeuten, worin R2 fuer C1-C4-Alkyl, Phenyl, Halogenphenyl oder Methylphenyl steht, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzen hiervon, durch Zuechtung von Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 in einem Naehrmedium, das assimilierbare Quellen fuer Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthaelt, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen. Die hierdurch erhaeltlichen neuen Verbindungen hemmen das Angiotensin umwandelnde Enzym und greifen so in den Mechanismus der Hypertension ein.

Description

X-59 72M

-A-

Titel der. Erfindung; Verfahren zur Herstellung von Faktoren von A--58365

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Faktoren des Antibiotikums A-58365, die wertvolle Mittel zur Behandlung von Hypertension sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: Jedes Jahr sterben hunderttausende von Menschen infolge von Hypertension. Zur Behandlung dieses Problems gibt es eine;Reihe verschiedener Mittel, doch ist eine spezielle Bekämpfung von Hypertension infolge überlappender Wirkung smechanisinen nur schwierig zu erreichen, ohne daß zugleich verschiedene andere biologische oder biochemische Funktionen beeinträchtigt werden. Infolgedessen kommt es

3Ö häufig zu unerwünschten Nebenwirkungen. Man ist daher ständig auf der Suche nach Wirkstoffen, die in einer spe-. zifischen Weise wirken, so daß sich das gewünschte Ergebnis erzielen läßt. Hierzu wird allgemein hingewiesen auf W.O. Faye, Principles of Medicinal Chemistry, Lea & Febiger, Philadelphia, 1974, Seiten.377 bis 398.

Ein bei Hypertension involvierter Mechanismus ist das . Renin-Angiotensin-System. ,Das Decapeptid Angiotensin I, das früher auch als Hypertensin oder Angiotonin bezeich-· net.worden ist, wird durch ACE, nämlich ein Angiotensin umwandelndes Enzym, zum Octapeptidangiotensin II umgewandelt. Das umwandelnde Enzym ACE spalte't den C-endständigen -Histadylleucylrest von Angiotensin I ab und bildet so Angiotensin II..Angiotensin II ist ein _starker Vasokonstriktor und wirkt direkt auf die Nebennierendrüsen, so

IQ daß diese Aldosteron freisetzen. In diesem Zusammenhang wird hingewiesen auf M. Bodanszky, M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, John Wiley, New York 1966, Seiten 215 bis 223 und Pumpus, "Angiotensin", Renal Hypertension, I.Page, J. McCubbin (Yearbook Medical Publishers,- Chicago, IL,-

I^ V.St.A. (1968), Seiten 62 bis 68). Angiotensin .1 wird durch Einwirkung des Enzyms Renin auf das Substrat angiotensinogen gebildet. Die Rolle des Renin-Angiotensin-Systems in der Ethologie der Hypertension ist eingehend untersucht worden, in diesem Zusammenhang wird beispiels-' weise hingewiesen auf J. Med. Chent. 24 · 04) , .355 bis .361

(1981) und die darin angeführten Literaturstellen.

ι - -.' Es gibt auch bereits synthetische Verbindungen, die die Wirkung von ACE hemmen und hypotensive Eigenschaften aufweisen. Solche Verbindungen sind beispielsweise die in US-PS 4 316 904 und 4 316 906 beschriebenen Mercaptoacylderivate substituierter Proline, die aus US-⁷PS 4 154 936 hervorgehenden mercaptosubstituierten Derivate bestimmter Aminosäuren, die in US-PS 4 15.4 937 beschriebenen Hydroxycarbamoylderivate von Pipecolinsäure und die' in US-PS.

' · ^:

4 046 889 beschriebenen .MercaptoacyIderivate bestimmter Azetidin-2-carbonsäuren. .

Ziel, der Erf indunq: ^: ' ' ; - '

Obiae, Ausführungen zeigen, daß das Problem einer Syrier- -

5 ·

tension immer noch nicht zufriedenstellend gelöst ist, und Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung eines

Verfahrens zur Herstellung neuer Verbindungen, die das Angiotensin umwandelnde Enzym hemmen und so in den Mechanismus der Hypertension eingreifen. ·

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur. Herstellung einer Verbindung der Formel I

ROOC-CHz-CH;

V » J

worin η für 1 oder 2 steht, R und R₁. gleich oder verschieden sein können und jeweils Wasserstoff, C.-Cg-Alkyl, Indan-5-yi, Phthalidyl oder eine Acyloxymethylgruppe der

Formel

0 C-O-

bedeuten, worin R₂ für C.-C.-Alkyl, Phenyl, Halogenphenyl oder Methylphenyl steht, oder pharmazeutisch annehmbarer Salze hiervon gerichtet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submer.sen aeroben Fermentationsbedingungen züchtet.

Der Faktor A des Antibiotikums A-58365 läßt sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in besonders hohem Anteil im Verhältnis zu den Faktoren B und G herstellen, wenn man -.: das Kulturmedium mit etwa 1 bis 6 g Prolin pro Liter

Medium ergänzt. \

Der Faktor B des Antibiotikums A-583 65 kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in besonders hohem Anteil i^m Verhältnis zu den Faktoren A und C hergestellt werden, ' wenn man das Kulturmedium mit etwa 1 bis 6 g Prolin und .1 bis 3 g Lysin pro Liter Medium ergänzt.

Die erfindungsgemäß erhältliehen ACE hemmenden Verbindungen dürften chemisch, physikalisch und biologisch eng miteinander verwandt sein. Die folgenden physikalischen Daten .und chemischen Eigenschaften charakterisieren die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen einzelnen Faktoren.

A-58365 Faktor A .''

. ' . '

per Faktor A wird, wie dies später beschrieben wird, als weißes amorphes Pulver isoliert und' ist hochlöslich in Wasser und polaren organischen Lösungsmitteln, wie Methylalkohol , Ethy!alkohol, Dimethylformamid und Dimethylsulf- : oxid, jedoch nur schwach löslich in Aceton und unlöslich . in Kohlenwasserstofflösungsmitteln, wie Benzol und Hexan.

Der Faktor A absorbiert Strahlung im Ultraviolettbereich des Spektrums. Das folgende¹Ultraviolettabsorptionsspek-

trum des Faktors A ist in einem Varian Cary-Spektrophotometer. Modell 118 aufgenommen worden. Das Spektrum ist erhalten worden.in einer wäßrigen Lösung des Faktors A unter neutralen, sauren und alkalischen Bedingungen. 5

Neutrale und saure Bedingungen ·

λ max = 232 nm, ε = 6000 (bezogen auf ein Molekulargewicht

von 267) . ^Λ

Xmax - 325 nm, ζ = 7600 (bezogen auf ein Molekulargewicht

. von 26.7) -

Alkalische Bedingungen . ·

>.max = 243 nm, ε = 7200

Xmax - 3 53 nm, Z = 7 400 . . . ^: _:

Der Faktor A zeigt ein charakteristisches Fluoreszenzmuster. Das folgende Fluoreszenzspektrum des Faktors A. ist mit einem Amino-Bowman-Spektrophotof/luorometer mit einer wäßrigen Lösung 'des Faktors A unter sauren, neutralen und alkalischen Bedingungen erhalten worden.

Saure Bedingungen Erregüngsmaximum: 327 nm Emissionsmaximum: 398 nm

Neutrale Bedingungen Erregungsmaximum: 324 nm

Emissionsmaximum: 396 nm :

' Alkalische Bedingungen '

Erregungsmaximum: 3 50 nm or Emissionsmaximum: 4 24 nm

Das ^L C NMR-Spektrum des Faktors A ist mit einem NMR-Spektrometer von Bruker, Modell WM 270, bestimmt worden.

• . - 6 - . '

¹ Das. Spektrum zeigt folgende charakteristische Signale:

¹³C NMR (67,9'MHz-,- D₂O) : δ = 25,66 (IC, t), 26,7 6 (IC, t) , 27,66 (IC, t), 33,19 (IC, t), 63,80 (IC, dl, 128,52 (IC, ⁵ s), 134,72 (IC, d), 135,20 (IC, s)., 136,06 (IC, s), 159,86 (IC, s), 174,42 (IC, s), 177,89 (IC, s).

Das Infrarotabsorptionsspektrum weist folgende signifikante Absorptionsmaxima auf: 10 ' . ' . ' ' ^: IR (KBr): Frequenz (cm" )

- 2700 \ 2960 ' 270.0 -2400 '

1719

- . ' /.. 1660' ^; .' ' 1526 1440 . 1410 ' \ , ' 1320 . ^: ; . . . 1285 . ". . .' -1210 . .

1126 .

'' , 1055

. 1028

957 ...

911 878 .836

br - breit, m = mittel, s,- = stark, w = schwach, vw = sehr·schwach, m-s = mittel bis stark, fn-w = mittel

bis schwach, shd = Schulter.

Das H NMR-Spektrum zeigt folgende charakteristische Signale-: · .

Intensität	S
br,
W	m
br,
S-
shd
S	W
m -	S
; m -
S
m
m
W
VW
W
VW
VW
VW

. .* ¹H NMR (360 MHz, D₂O): 6 = 2,30 (IH, m), 2,57 (IH, <m) , 2,64 (2H, t), 2,74 (IH, dt), 2,81 (IH, dt), 3,05 (IH, dd), 3,15 (IH, ddd), 5,01 (IH, dd.) , 7,3 3 (IH, s). ...

Das Molekulargewicht des Faktors A beträgt .267 gemäß einer Bestimmung durch Massenspektralanalyse des Faktors A.

Bombardierung mit schnellen Atomen (FAB): m/e = 268 Feiddesorption: m/e = 267, 223

FAB unter hoher Auflösung: m/e = . 268,081890, berechnet 268,08211 für C₁₂H₁₄NO₆ (M + H⁺).

. Eine an 'einer Probe des Faktors A durchgeführte Elementaranalyse ergibt auf Basis der empirischen Formel C,„H.^NO^ ° folgende prozentuale Elementarzusammensetzung:

Berechnet: C. 53,,93 H 4,90 N 5,24 Gefunden: C 53,72 H 5,10 N 5,16

Der Faktor A hat folgenden spezifischen Drehwert: M/q⁵ (c = 1 %, H₂O) = -199,5°

Eine an einer Probe des Faktors A in 66%-igem Dimethylformamid durchgeführte elektrometrische Titration zeigt die Anwesenheit von drei titrierbaren Gruppen: pK = 5,7, 7,5, 12,3. . . ...

A-58365 Faktor B ' , . .

Die physikalischen und spektroskopischen Eigenschaften von A-58365 Faktor B gehen aus den folgenden Abschnitten hervor. Der Faktor B scheint anhand der folgenden Daten mit dem Faktor A eng verwandt zu sein, so daß er sich in seiner Struktur durch nur eine Methyleneinheit unterschei-

det. ' ."·..- '

Das Infrärotabsorptionsspektrum des Faktors B enthält fol-

- 8 - . ' '

* gende signifikante Absorptiönsmaxima:

—1 '

IR (KBr): Frequenz (cm ) . : Intensität

3600 - 2800 · ',. ' br, s

2960 m - w

2700 -'2400 br, w

^: ' . 1717 ' s

16 52 s

1538 s

1436 m - w

1412 .. ; s

1350 ' ' . vw

·. /' 1280 " ·. m

1220 m

1157 · w

1072 . w

. 1049 : w "

1002 ' : .— w

906 . ; .·'. w

. -. .783 ^ ' m - w

. 639 . .' ' ' :: ^: br, w

Die oben angegebenen Abkürzungen entsprechen den beim IR-Spektrum für.den Faktor A angegebenen Abkürzungen. , ' ' " ' . ·

Das protonenmagnetische Resonanzspektrum ( H NMR) für den Faktor B enthält folgende Signale: _; .

¹H NMR (360 MHz, D₂O): 6 =1,67 (IH,. m.) , 1,86 (IH, m), 2,08 (IH, m), 2,3.5 (IH, m) , 2,66 ( 2H, t) , 2,76 (IH, m, 2,78 (2H, m), 2,93 (IH, m), 5,10 (IH, dd), 7,35 (IH, s).

Das kohlenstoffkernmagnetische Resonanzspektrum des Faktors B ist ebenfalls ermittelt worden, wobei folgende Signale beobachtet worden sind: .

¹³C NMR (67,9 MHz, D₂O): δ·= 16,08 (IG, t), 23,43 (IC,'t)_v

26,07 (IC, t). , 26,36 (IC, t), 33,44 (IC, t), 58,03 (IC, d), 126,60 (IC, s), 132,88 (IC, s), 133,06 (IC, d), 137,14 (IC, . s), 161,73 (IC, s.), 176,97 ( IC, s) , 178 > 57 (IC, s).

Der Faktor B absorbiert Strahlung im Ultraviolettbereich

des Spektrums, wobei die unter neutralen und sauren Bedingungen beobachteten Maxima nach Zusatz von Base genauso wie beim Faktor A zu längeren Wellenlängen verschoben werden. Mit einer wäßrigen Lösung des Faktors A sind folgende Maxi- ma erhalten worden:

Neutrale und saure Bedingungen:

Amax = 232 nm (£ = 3800) und Amax = 333 nm (8 = 5600): Der λ max-Wert von 232 nm verschiebt sich in einer Base auf 244 nm, während sich der λmax-Wert von 333 nm in einer Base auf 360 nm verschiebt.

Der Faktor B fluoresziert unter langwelliger Ultraviolett-²^ strahlung genauso blau wie der Faktor A.

Das Molekulargewicht des Faktors B beträgt 281 gemäß einer Bestimmung durch Massenspektralanalyse. . · .

²^ Fe.lddesorptionsmassenspektrum: m/e .· = 281 (M ). ;

Auf Basis einer Analyse der physikalischen und spektralen Eigenschaften hat der Faktor B die empirische Formel C, ,H, -NO '. Eine vergleichende Analyse der Spektralwerte der Faktoren A und B zeigt, daß der Faktor B ein höheres Homologes des Faktors A ist.

Der Faktor B weist ähnliche Löslichkeitseigenschaften/auf wie der Faktor A. Der Faktor,B. ist hochlöslich in Wasser und polaren organischen Lösungsmitteln, wie Methylalkohol,

Ethylalkohol ,· Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, je-. · doch nur schwach löslich in Aceton und unlöslich in Kohlen-

-ΙΟΙ wasserstofflösungsmitteln, wie Benzol und Hexan..

A-58365 Faktor C /

' 5 Aus der Fermentationsbrühe von Streptomyces chromofuscus - NRRL 15098 erhält man einen weiteren Faktor, der in geringerer Menge als die Faktoren A und B erzeugt wird und als A-58365 Faktor C bezeichnet wird. Aufgrund der bisher verfügbaren Eigenschaften ähnelt dieser Faktor C sowohl dem Faktor A als auch dem Faktor B. Wie die vorher beschriebenen Faktoren fluoresziert auch der Faktor C in langwelliger Ultraviolettstrahlung blau.

. Das Molekulargewicht des Faktors C beträgt 295, bestimmt durch Massenspektralanalyse.

Felddesorptionsmassenspektrum: m/e = 295 (M ).

Der Faktor C hat die empirische Formel C₁-H₁-NO,..

14 17 6 -.. '. .Die Faktoren von A-58365 sind zwar, zueinander ähnlich, zeigen in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) jedoch charakteristische Verweilzeiten. Die einzelnen Faktoren können durch HPLC voneinander getrennt werden. Zur Auftrennung dieser Faktoren durch HPLC wird eine mit Bondapak C18 (Waters Associates) gefüllte und 4- χ 300 mm messende Säule als stationäre Phase verwendet. Die mobile Phase besteht aus einem Gemisch aus 6 % Acetonitril, 0,3 % Ameisensäure und 93,7 % Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml/min. Die charakteristische Fluoreszenz der - Faktoren wird zur Detektion ihrer Anwesen-

heit im System herangezogen. Die Fluoreszenz wird mit einem Spektrophotometer von Schoeffel, Modell FS970 bestimmt . ' ' -

, · . ' Im obigen HPLC-System verfügen die einzelnen Faktoren über folgende Retentionszeiten:

1 Faktor » . ' Retention (min)

,A 4,88

B - " 12,47

C . 18,21 ,

Die Strukturen, der Faktoren A und B von A-58365 sind bestimmt wo rden und entsprechen den folgenden Strukturformeln;

HOOC-CHs-CHs-	V1	COCH
	A	'\ - β
' Faktor	's	t COCH
( S		--
I . ." i	B
Faktor

Zur Erfindung gehören ferner auch die Faktoren A und B von A-58365 in veresterter Form sowie in Salzform. Die Erfin-30 dung betr-ifft daher auch Verbindungen'der Formel

ROOC-CHa-CHa-35

CCCRv

^- worin η für 1 oder 2 steht, R und R, gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff, C₁-C--Alkyl, Indan-5-yl,

1 b

Phthalidyl oder eine Acyloxymethylgruppe der Formel

- ο

R₂ - C- 0 - CH₂- . '

bedeuten, worin R^ für C.-C.-Alkyl, Phenyl, Halogenphenyl oder Methylphenyl steht oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon'. '

In der obigen Formel bezieht sich die Angabe C-,-Cg-Alkyl . auf geradkettige und verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste/ wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, sec-Butyl, t-Butyl,. n-Amy.l, Isoamyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylbutyl und ähnliche Reste« Die Angabe C-.-C.-Alkyl bezieht . sich auf Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Bütyl, t-Butyl und ähnliche niedere Alkylkohlenwasserstoffreste-Die Angabe Halogenphenyl bezieht sich.auf die Mono- oder Dihalogenphenylgruppen, wie 4-Chlorphenyl, 3-Chlorphenyl,. 2-Chlorphenyl, 3 , 4-Dichlo,rphenyl, 3-Bromphenyl, 4-Bromphenyl, 2-Fluorphenyl, 4-Fluorphenyl, 3-Iodphenyl und dergleichen. Die Angabe Methylphenyl bezieht sich auf - die Mono- und Dimethylphenylgruppen, wie 4-Methylphenyl, 3-Methylphenyl, 2-Methylphenyl, 2,6-Dimethylphenyl, 2,4-. Dimethylphenyl und ähnliche Gruppen.

Die Faktoren von A-58365 werden zur Bildung der jeweiligen . Mono- und Diester unter Anwendung herkömmlicher Veresterungsverfahren verestert. Die Verbindungen der obigen Formel , worin R und R, für C,-Cg-Alkyl stehen, werden beispielsweise durch das Veresterungsverfahren nach Fischer hergestellt, indem man die Disäure mit einem

₁C^

1 D

in Gegenwart eines Säurekatalysators umsetzt..Typische ver-'wendbare Säurekatalysatoren sind Bortrifluoridetherat, . wasserfreier Chlorwasserstoff oder p-Toluolsulfonsäure. Die Veresterung wird in einem inerten Lösungsmittel durch-

geführt, bei dem es sich um den C,-C,-Alkohol selbst oder ein anderes Lösungsmittel, wie Diethylether, handeln kann. Ein Beispiel für eine solche Veresterung besteht darin,, daß man den Faktor A in Methylalkohol löst und in die Lösung etwa 1 bis 3 % wasserfreien Chlorwasserstoff einleitete Die saure Lösung wird dann etwa 1 bis 2 Stunden gerührt und der Dimethylester gewonnen.

Wahlweise kann man die Faktoren von A^-58365 auch mit dem. geeigneten Diazoalkan verestern, wodurch man ebenfalls zu einem erfindungsgemäßen Ester gelangt.

Die Indan-5-ylester der obigen Formel werden hergestellt durch Veresterung des gewünschten Faktors von A-58365 mit Indan-5-ol beispielsweise durch Kondensation des Alkohols mit der Säure in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels, beispielsweise eines Carbodiimids, wie Dicyclohexylcarbodiimid.

Die Phthalidylester der Faktoren A und B von A-58365-werden hergestellt durch Umsetzung eines Alkalimetallsalzes des jeweiligen Faktors mit Bromphthalid. Die Umsetzung kann in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Dimethy!acetamid, durchgeführt werden, indem man äquimolare Mengen von Salz und Bromphthalid zur Reaktion bringt. _;

Die Ester der obigen Formel, worin R oder R, für eine Acyl-.oxymethylgruppe stehen, werden hergestellt durch Umsetzung des jeweiligen Faktors von A-58365 in Form des Natriumoder Kaliumsalzes mit einem Acyloxymethylhalogenid der Formel ... ' .^:

O . .

R₂-C-O- CH₂ - x, " ' ; y

worin X vorzugsweise für Chlor oder Brom steht und R„ die oben angegebene Bedeutung hat. Beispiele für verwendbare.

Acyloxymethylchloride und Acyloxymethylbromide sind Chlormethylacetat , Brommethylacetat, Brommethylpropionat, Chlormethylpivaloat, Chlormethylbenzoat, Brommethyl-4-chlor--... benzoat und ähnliche Acyloxymethylhalogenide, .

Nach erfolgter Herstellung der Diester des Faktors A oder des Faktors B kann man irgendeinen eventuell vorhandenen Monoester durch Lösungsmittelextraktion bei einem pH-Wert von etwa. 1 vom Diester abtrennen. Der,einen Monoester enthaltende Diester wird hierzu beispielsweise in,einem mit Wasser¹nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, gelöst und die Lösung mit einer verdünnten Lösung einer Base gewaschen. .Durch das neutrale bis basische Waschen wird der Monoester in Form seines wasserlösliehen Salzes entfernt. . ...- ,-

Die einzelnen Monoester der obigen Formel lassen sich erhalten durch Veresterung des jeweiligen Faktors von : A-58365 mit einem Äquivalent des Alkohols. Irgendein dabei mitgebildeter Diester IaBt₁ sich von den Monoesterη durch Lösungsmittelextraktion unter gesteuertem pH-Wert in der oben beschriebenen Weise abtrennen. Die bei der Veresterung erhaltenen gemischten Monoester werden durch herkömmliche chromatographische Methoden, voneinander getrennt, beispielsweise durch Dünnschichtchromatographie über SiIiciumdioxidgel oder vorzugsweise durch HPLC. . , .

Die Faktoren von A-58365 sind saure Verbindungen, die zwei Carboxylgruppen als funktioneile Gruppen besitzen. Wie die meisten Carbonsäuren.sind auch die Faktoren zur Bildung von Salzen mit geeigneten Basen befähigt. Zu solchen Salzen gehören pharmazeutisch annehmbare Salze, die sich zur Behandlung von Hypertension eignen, sowie. Salze, die zur Isolierung und Reinigung der einzelnen Faktoren brauchbar sind. Unter-pharmazeutisch annehmbaren Salzen werden die Salze verstanden, die zur Chemotherapie warmblütiger Tiere verwendet werden können. Mit Alkalimetall- sowie Erdalkali-

metallbasen,gebildete Salze, wie Natrium-, Kalium- und CaI-ciumsalze, lassen sich bilden durch Neutralisation einer wäßrigen Lösung der einzelnen Faktoren mit der stöchiome-,trischen Menge der Base und anschließende Lyophilisierung 5, der wäßrigen Salzlösung. Zu geeigneten Basen gehören beispielsweise die Alkalimetallcarbonate, Alkalimetallbicarbonate und Alkalimetallhydroxide, wie Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Natriumhydroxid, Kaliumcarbonat, Kalium*- bicarbonat, Kaliumhydroxid und Calciumhydroxid. Salze der Faktoren können auch mit geeigneten Aminen gebildet werden, beispielsweise mit primären und sekundären Aminen, wie Methylamin, Ethylamin, ,Isopropylamin, n-Butylamin, Dirne-. thylamin, Cyclohexylamin, Dicyclohexylamin,'Benzylamin, Dibenzylamin, Abietylämin,.Procain und ähnlichen basischen Aminen. Das Ammo.niumsalζ der Faktoren läßt sich ebenfalls in herkömmlicher Weise erhalten. Die Aminsalze lassen sich bilden durch Zusatz einer Lösung des gewünschten Amins in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel zu einer wäßrigen Lösung des Faktors. Manche Aminsalze fallen aus der wäßrigen Lösung aus oder lassen sich, falls sie im Gemisch löslich sind, durch Lyophilisierung der Salzlösung erhalten.

_: Die erfindungsgemäßen Faktoren von Ä-58365 hemmen das Angiotensin I umwandelnde Enzym, wie sich durch in vitro-üntersuchungen unter Verwendung von· isoliertem.Meerschweinchenileum zeigen läßt. Diese in vitro-Untersuchungen werden wie folgt durchgeführt: Man ordnet Segmente (2 bis 3 cm lang) des Meerschweinchenileums der Länge nach in 10 ml isolierten Gewebebädern an, die eine Krebs-Lösung mit folgender Zusammensetzung (Konzentrationen jeweils in mMol)

enthalten: Natriumchlorid (118,2)., Kaliumchlorid (4,6), : Calciumchlorid-Dihydrat (2,5 ): , Monokaliumphosphat (1,2), _: Magnesiumsulfat (1,2),. Dextrose (10,0) und ,Natriumbicarbonat (24,8).. Bei allen Versuchen werden die Gewebe bei 37°C gehalten und mit 95 %, Sauerstoff sowie 5 % Kohlendioxid belüftet. Die Ilea sind zwischen zwei Elektroden montiert, die aus einem rostfreien:Stahlstab (Boden) und einem kreis-

förmigen Platindraht (Kopf) bestehen, über.einen Stimulator von Grass Modell.S44 werden Quadratwellenimpulse. (0,1Hz) mit einer supramaximalen Spannung (40 V) und einer Dauer von 0,7 msec zugeführt. Die Gewebe werden etwa eine Stunde, unter einer angelegten Kraft von 1 g äquilibriert. Die isometrischen Signale werden auf Dynographen von Beckman aufgezeichnet. . .' ''

Es werden Konzentrations-Wirkungs-Kurven für drei oder vier Konzentrationen an Angiotensin I gebildet. Die Gewe-

— 6 —5 be werden dann mit dem Faktor von A-58365 (10 ' bis 10 Mol) äquilibriert und die Konzentrations-Wirkungs-Kurven von Angiotensin I wiederum bestimmt. Jedes Gewebe erhält nur eine Konzentration des Faktors. . ·'.

. .. ; ' . In allen Fällen kommt es zu einer ; signifikanten Verschie-. bung im Kontraktionssignal gegenüber Angiotensin I. Die Hemmung von ACE im Meerschweinchenileum ist kompetitiv. Die beim obigen Versuch mit den Faktoren A und B erhaltenen Daten zeigen auch,, daß die Faktoren A und. B die Freisetzung von Acetylcholin nicht hemmen und auch die choli.nergischen Rezeptoren nicht blockieren. Im in vitro-System zeigen die Faktoren A und B von A-58,365 eine pharmakologi-. sehe Spezifität für die Hemmung von ACE.

\ - \ ' ; '· Die erfindungsgemäßen Faktoren.von A-58365 sind hypotensive Mittel, die infolge'ihrer. Fähigkeit zur Hemmung der enzymatisehen' Spaltung von Angiotensin L,zum Pressormittel Angiotensin II in Säugetiergewebe brauchbare hypotensive Mittel darstellen. Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen ACE-Hemmfaktoren zur Erniedrigung des Blutdrucks wird für den-Faktor A bei an Natrium erschöpften'Ratten gezeigt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich zur Ernie-

3g drigung des Blutdrucks bei einem,hypertensiven Säugetier.

Man kann die Faktoren oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon einzeln oder in irgendeiner Kombination ver-

abreichen, so daß sich der Faktor A beispielsweise allein oder in Kombination mit dem Faktor B verabfolgen läßt. Zur Durchführung einer solchen, Behandlung verabreicht man den jeweiligen Faktor von A-58365 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon oral, intramuskulär, intravenös oder subkutan. Für eine parenterale Verabreichung löst man den jeweiligen Faktor von A-58365 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon in einer zur Injektion geeigneten physiologisch annehmbaren Flüssigkeit. Hierzu lassen sich geeignete physiologische Verdünnungsmittel verwenden, wie zur Injektion geeignetes Wasser, 0,9 %-ige Kochsalzlösung, 5 %-ige Glucoselösung oder sonstige herkömmliche Verdünnungsmittel. Für eine orale Verabreichung kann der jeweilige Faktor von A-58365 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zu Kapseln, Tabletten oder flüssigen,Suspensionen formuliert sein. Man kann den jeweiligen Faktor ' von A-58365 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon in einer nichttoxischen einzelnen Tagesdosis zwischen . etwa 100 mg/kg und etwa 2000 mg/kg Körpergewicht verabrei-.chen. Wahlweise kann auch eine Verabfolgung in mehreren unterteilten Tagesdosen erfolgen. Das jeweilige Verabreichungsregime ist abhängig von Faktoren, wie dem Ausmaß der Hypertension beim jeweiligen Patienten und der Wirkstoffverträglichkeit durch den jeweiligen Empfänger sowie von

anderen Faktoren. . ' .

Die Ester der erfindungsgemäßen Faktoren von A-58365 ver~. fügen genauso wie die freien Säuren über ACE hemmende Eigenschaften. Die Acyloxymethylester und die Indanyl- sowie Phthalidylester der Faktoren eignen sich:'möglicherweise als Vorarzneiformen der Faktoren zur Herstellung von, Formulierungen der Faktoren für eine orale Anwendung. Weiter lassen sich die C,-Cg-Alkyldiester auch zur Isolierung und Reinigung der'Faktoren durch chromatographische Verfahren

/verwenden. .

Die erfindungsgemäßen ACE hemmenden Faktoren werden herge-

stellt durch Züchtung von Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 unter aeroben Fermentationsbedingurigen in einem wäßrigen¹ Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohr

. lenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält. Für

' ' ' '

; diese Fermentation läßt sich irgendeines der zahlreichen Nährmedien verwenden, da der Mikroorganismus zur Verwertung von Energie aus den -verschiedensten Nährstoffquellen befähigt ist. Zur Deckung des Kohlenstoffbedarfs des Mikroorganismus können im Nährmedium beispielsweise die verschiedensten Kohlenhydrate unter Einschluß von Zuckern und Stärken enthalten sein. In/ähnlicher Weise lassen sich im -Nährmedium auch die verschiedensten' Stickstoffquellen, wie'Aminosäuren, Destillatidnsextrakte, Fleischpeptone. und Caseinhydrolysate, verwenden. Im Interesse einer wirtschaft liehen Produktion,, optimalen Ausbeute und leichten Isolie'r- _; barkeit der ACE-Faktoren sind bestimmte Züchtungsmedien bevorzugt. So ist beispielsweise eine der bevorzugten Kohlenstoff quellen Kartoffeldextrin, obwohl auch verschiedene Zucker, wie Glucose oder,Fructose, verwendet werden .können. Bevorzugte Stickstoffquell en sind Peptone und die Hydrolysate von Casein. Wie dies bei der Fermentation von Mikroorganismen üblich ist, lassen sich in das Kulturmedium .zur' Bildung der AGE-Faktoren auch anorganische Nährsalze einführen. Solche Salze sind die -üblichen Salze, die Ionen von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat,

Chlorid, Carbonat und ähnlichen Ionen bilden können. Das Fermentationsmedium kann auch mit Spurenelementen versetzt wer- ' den. Diese sind gewöhnlich jedoch in ausreichenden Mengen als Komponenten der anderen den Medien zugesetzten Bestand-,

teile vorhanden. '

Während der Fermentation von Streptomyces chromofuscus . NRRL 15098 zur Bildung der Faktoren von A-58365 wird da-s Fermentationsmedium mit Kobältionen oder anderen zv/eiwertigen Kationen versetzt. Kobalt(II)-chlorid ist eine bequeme Quelle für zweiwertiges Kobalt. Das zweiwertige Kation, wie das Kobalt(TI)-ion, wird in geringen Mengen

- 19 - '

zugesetzt, so daß beispielsweise eine Zugabe zwischen etwa. 5 und etwa 15 mg Kobalt(TI)-chlorid-hexahydrat pro Liter' Medium ausreichend ist. .

Es hat sich gezeigt, daß sich die Bildung des Faktors A

von A-58365 durch Streptomyces chromofuscus stark verbessern, läßt, wenn man dem Fermentationsrnedium Prolin zugibt. Im allgemeinen reichen zwischen etwa 1 und etwa 6 g Prolin pro Liter Fermentationsbrühe "aus. Ferner hat sich gezeigt, daß der Faktor B von A-58365 in erhöhter Ausbeute und reichlicher gebildet wird, wenn man das Kulturmedium ( ) zusätzlich zu Prolin auch noch mit Lysin, vorzugsweise L-Lysin, versetzt. Zur Bildung des Faktors B wird das Kulturmedium vorzugsweise mit etwa 1 bis etwa 6 g Prolin pro Liter und mit etv/a 1 bis -etwa 3 g Lysin pro Liter Kulturmedium versetzt.

Der ACE hemmende Faktor A von A-58365 wird¹überraschenderweise in höherer Häufigkeit gebildet, wenn man Streptomy-.... ces chromofuscus NRRL 15098 untersubmersen aeroben Fer-

. mentationsbedingungen in.einem wäßrigen Kulturmedium züchtet, das mit Prolin ergänzt ist. . '

Die zur Ergänzung des Prpduktionsmediums verwendete Amino- ^ säure kann D-Prolin, L-Prolin oder D,L-Prolin sein. L-Prolin ist bevorzugt, da es wohlfeiler ist als die D-Form oder die D,L-Form dieser Aminosäure. Das zur Ergänzung des Mediums verwendete Prolin kann auch eine Komponente eines, im Handel erhältlichen Proteinhydrolysats, eines enzymatisehen Verdauungsprodukts oder einer sonstigen Quelle für diese Aminosäure sein. Bei der Durchführung des Verfahrens werden zwischen etwa 1 und etwa 6 g Prolin pro Liter Kulturmedium verwendet. Die Bildung der Faktoren von

. . j ... . ' -

A-5,8365 erfolgt unter besten Ergebnissen und am wirtschaftlichsten bei Einsatz von etwa 3 bis etwa 4 g Prolin pro Liter Kulturmedium. . .

- 20 - . ,.

Die Zugabe von Prolin oder einer Quelle für Prolin zum Kulturmedium auf Basis von Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 ergibt eine wenigstens 10-fache Erhöhung der. Menge des bei. der Fermentation gebildeten Faktors A. Fer-

.. ' · .

mentationen von Streptomyces chromofuscus NRRL 15098, die ohne Zusatz von Prolin durchgeführt werden, führen zu einer Bildung von etwa 1 μg oder weniger an Faktor A von A-58365 pro.ml filtrierter Brühe, während sich bei Fermentationen, die in einem Kulturmedium durchgeführt werden, "das' erfindungsgemäß mit Prolin ergänzt worden ist, eine Bildung von etwa 10 bis 12 μg des Faktors A pro ml filtrierter Fermentationsbrühe ergibt. ,

In der mit Prolin ergänzten Kultur ist der Faktor A von ¹^ A-58365 der überwiegende Faktor, nämlich der in größerer Menge gebildete Faktor, während die Faktoren B und C untergeordnete Faktoren sind. Anscheinend werden die untergeordneten Faktoren, nämlich die Faktoren B und C von A-58365, durch das verbesserte erfindungsgemäße Verfahren in erhöhter" Menge gebildet,, doch bleiben sie im Vergleich zur Menge an gebildetem Faktor A stets die untergeordne- · ten Faktoren im Fermentationsmedium..

Die Fermentation kann bei Temperaturen zwischen etwa 23 25, und etwa 30⁰C durchgeführt werden. Beste Ergebnisse werden jedoch dann erzielt, wenn man die Fermentation bei 25⁰C durchführt. Während der Fermentation erhöht sich der pH-Wert des Mediums. Der anfängliche pH-Wert der Brühe wird im allgemeinen auf etwa 7 eingestellt, und der pH-Endwert beträgt etwa 8 bis 8,3.

Zur Verbesserung der Ausbeute an Faktor B von A-58365 züchtet man den neuen Stamm von Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen, wobei das Kulturmediummit etwa 1 bis etwa 6 g Prolin pro Liter.und mit etwa 1 bis 3g Lysin pro Liter ergänzt wird. Das verwendete

Nährmedium enthält die bereits oben erwähnten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze und zusätzlich auch noch die' Aminosäuren Prolin und Lysin.

' :'· . / '

Bei diesem Verfahren kann die Fermentation bei einer Temperatur zwischen etwa 25 und etwa 35⁰C durchgeführt werden. Bei etwa 30⁰C durchgeführte Fermentationen ergeben den Faktor B in höchster Ausbeute, so daß die bevorzugte Temperatur bei etwa 3O⁰C liegt. · " ' :

' , · ' ' '

Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kann man die Aminosäuren Prolin und Lysin in der LKForm, der D-Form oder der D/L-Form verwenden. Das Kulturmedium kann_v auch mit anderen Quellen der Aminosäuren versetzt werden, wie mit 'Proteinhydrolysaten und enzymatischen Verdauungsprodukten, die Prolin und Lysin enthalten, damit sich die benötigten Aminosäuren ergeben. Infolge ihrer niedrigen Kosten sind L-^Prolin und L-Lysin die bevorzugten Formen der Aminosäuren. Beide Aminosäuren, nämlich Prolin und Lysin, sind erforderliche Bestandteile des Kulturmediums, damit der Faktor B vermehrt gebildet wird. Die nur unter Zugabe von Prolin durchgeführte Fermentation ergibt nur überraschenderweise höhere Ausbeuten an Faktor A von A-58365, während unter lediglicher Ergänzung des Kulturmediums durch Lysin durchgeführte Fermentationen keinen merklichen Einfluß auf die Ausbeuten an irgendeinem Faktor haben.

Vorzugsweise werden zwischen etwa 3 und etwa 4 g Prolin und etwa 2 g Lysin pro Liter Kulturmedium bei diesem Verfahren angewandt.

Vor der Auffindung dieses Verfahrens zur Verbesserung der Ausbeute an Faktor B wurde in einem mit Prolin ergänzten Kulturmedium von Streptomyces chromofuscüs NRRL^ISOSS bei der Fermentation der Faktor A in einer Menge von etwa 10 bis 12 μg pro ml,und der untergeordnete Faktor B in einer Menge von etwa 2 bis 3 ^g pro ml gebildet. Der Faktor C

von A-58365 kommt sogar in noch geringerer Menge als der Faktor B vor. Züchtet man Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 unter Verwendung von Lysin in angereicherter Form, dann wird der Faktor B.in einer Menge von etwa 5 μg pro ml

' "

gebildet, während der Faktor A in einer Menge von über

1 μg pro ml bis etwa 2 μg pro ml erzeugt wird.

Durch die Erfindung wird somit ein Verfahren geschaffen, durch das sich der Faktor. B von A-58 365 als am häufigsten vorkommender Angiotensin umwandelnder Enzyminhibitor erhalten . läßt. ' " .

Der Faktor.B wird durch die im folgenden beschriebenen Verfahren aus der filtrierten Fermentationsbrühe gewonnen . . und vom Faktor A abgetrennt und gereinigt.

Die Fermentation wird stets unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Durch das Fermentationsmedium wird sterile Luft geführt, wobei man während der Fermentation rührt

Zur Erzielung bester Ergebnisse soll man die Menge an im Fermentationsmedium gelöstem Sauerstoff auf etwa 30 bis '40 % Luftsättigung halten. . .

Zur Verhinderung einer übermäßigen Schaumbildung empfiehlt sich.im allgemeinen die Verwendung eines Antischaummittels, und hierzu lassen sich alle bei Fermentationen üblichen Antischaummittel verwenden, wie beispielsweise die Antischaummittel· auf Basis von Siliconen.

Die Bildung der ACE-Hemmfaktoren im Verlaufe der Fermentation wird verfolgt, indem man eine von Zeit zu Zeit entnommene Probe der Brühe durch Hochleistungsflüssigkeits- Chromatographie untersucht. Zu einer maximalen Produktion kommt es im allgemeinen nach einer Fermentationszeit von etwa 70 bis etwa 90 Stunden. Zur Durchführung dieser Untersuchung verwendet man eine mit μ Bondapak C18 '(Waters Associates) gefüllte und 4 χ 300 mm messende. Säule als

stationäre Phase, während die mobile Phase aus einem-Gemisch aus Acetonitril, Ameisensäure und Wasser (6 : 0,3 : 93,7, VoI ./VoI ./VoI.) besteht. D.ie Fließgeschwindigkeit. beträgt 2,5 ml/min. Die Detektion der Faktoren wird mit einem Spektrofluorometer von Schoeffel Modell FS970 durchgeführt, und zwar unter Anwendung der Wellenlänge A von 327 nm und Einsatz eines 370 nm Emissionsgrenzfilters.

Zur Durchführung der Fermentation beimpft man ein kleines Volumen an vegetativem Medium mit einem lyophilisierten Pellet von Streptomyces chromofuscus NRRL 15098. Die Kultur wird bei etwa 3O⁰C bebrütet, wobei man nach Erreichen eines guten Wachstums, zu dem es'im allgemeinen nach etwa 2 Tagen kommt, das vegetative Medium oder Teile hiervon zur Beimpfung eines Mediums mit größerem Maßstab verwen-

,. det, das auch als sogenanntes Stoßmedium bezeichnet wird.

Bei diesem Stoßmedium handelt es sich um ein Medium mittlerer Größe, welches als großes Inokulum' für großtechnische Fermentationstanks verwendet wird. Im allgemeinen ist das Stoßmedium gleich oder etwa gleich zusammengesetzt wie das vegetative Medium. Das anfängliche kleinvolumige vegetative Medium kann ein Medium mit hohem Nährstoffgehalt sein, wie es zur Züchtung von Mikroorganismen verwendet wird.

Ein geeignetes vegetatives Medium, in dem Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 gut wächst, ist zusammengesetzt aus Tryptxcasesojabrühe und etwa 1 %,Glucose. Bei Trypti-' casesojabrühe handelt es sich um ein handelsübliches Sojabohnen-Casein-Verdauungsprodukt, das pankreatische Verdauungsprodukte von Casein, Sojapepton (ein Verdauungsprodukt von Sojabohnen), Natriumchlorid, Dikaliumphosphat und Glucose enthält.

Wahlweise kann man das lyophilisierte Pellet von Streptomyces chromofuscus auch zuerst auf Schrägagar wachsen lassen, wobei man dann Sporen vom Schrägagar unter steri-

I

len Bedingungen auf ein vegetatives Medium überträgt. Das

gewachsene vegetative Medium kann man dann wie oben beschrieben zur Inokulation von Stoßmedien mittlerer Größe verwenden. ' .

Der beim Verfahren zur Bildung der erfindungsgemäßen ACE-Inhibitoren verwendete Mikroorganismus ist als ein neuer Stamm von Streptomyces chromofuscus (Preobrashenskaya, Blinov und Ryabova 1957), Pridham, Hesseltine und Benedict, "A Guide for the Classification of Streptomycetes ¹^ According to Selected Groups", -Appl. Microbiol. 6, 52 bis 59 (.1957)) identifiziert worden.

Der neue Stamm von Streptomyces chromofuscus ist ohne Beschränkung über seine Zugänglichkeit bei der ständigen' Kulturensammlung, von Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center, Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, V.St.A. hinterlegt worden (23._:Juni 1982) und kann vpn dort unter der Hinterlegungsnummer NRRL 15098 frei be-

2G zogen werden.

Die Stammkultur, aus der der neue Stamm selektiert worden ist, ist aus einer in Brasilien, Südamerika,.gesammelten Bodenprobe isoliert worden.

Die folgenden Abschnitte und Tabellen enthalten die taxonomische Beschreibung des neuen Stammes, und zwar bestimmt unter Anwendung herkömmlicher Methoden und durch Vergleich mit veröffentlichten täxonomischen Beschreibungen von Streptomyces,.die dem neuen Stamm ähnlich sind.

Hierzu wurden die vom International Streptomyces Projekt (ISP) zur Charakterisierung von Streptomycesspezies empfohlenen Methoden zusammen mit bestimmten ergänzenden Untersu-,chungen herangezogen, wie sie von jE-B.. Sh.irling und D. Gottlieb, in der Arbeit "Methods of Characterization of . Streptomyces Species" in Int. J. Syst. Bacteriol. 16 (3), ·

χ - 25 Seiten 313 bis 340 (1966) beschrieben worden sind.

Züchtungscharakteristiken von Streptomyces chromofuscus·

NRRL 1509 8 . . ' '

.5 . ...

Die folgende Tabelle I enthält die Beschreibung des Wachstums des neuen Stamms auf verschiedenen Kulturmedien. Die in der Tabelle enthaltenen Farbnamen beruhen auf den ISCC-NBS Centroid Color Charts, Standardprobe Nr. 2106,.

US-Department of Commerce, National Bureau of Standards .(1958), auf H.D. Tresner und E.J. Backus "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy" in Appl. Microbiol. 11, 335 bis 338 (1956) und auf Color Harmony Manual, 4. Auflage, Color Standards Department, Container Corporation of

¹^ America, Illinois, V.St.A. (1958). Zusammenfassendelä^:ßt sich sagen, daß Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 ein reichliches Luftmycel produziert, dessen Sporenmassenfar-• be im Farbbereich Grau (GY) liegt. Die am nächsten kommende Farbtafel für den Farbbereich Grau im System von. Tres- ηer und Backus entspricht 2 dc Gelblichgrau bis 2 fe Mit-.teigrau. Im System ISCC-NBS liegt der am nächstenkommende Farbstreifen bei 112, nämlich Hellolivgrau, und bei 93-., nämlich Gelblichgrau * Dieses Kulturmerkmal wird auf Hefe-Mal zextrakt-Agar (ISP Nr. 2), Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3), Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr..5), Czapek-Lösung-Agar und Tomatenpaste-Hafermehl-Agar gebildet. Am besten läßt sich dieses Wachstums- und Farbmerkmal bei einem Wachsen- :. lassen auf einem Agar aus anorganischen Salzen und Stärke (ISP Nr. 4) beobachten. Die .Farbe de„r Unterseite ist gelbbraun. Diese Farbe der Unterseite wird vom pH-Wert nicht beeinflußt. In allen Medien wird kein lösliches Pigment, gebildet, mit Ausnahme des Mediums ISP Nr. 5, wo ein hellgelbes Pigment vorhanden ist.. .

. . ..

' - 26 -

TABELLE I

Kulturcharakteristiken von Streptomyces chromofuscus NRRL 15Q98 .

Medium

ISP Nr. 2' ISP .Nr. 3

ISP NR. 4

Wachstumscharakteristik

Reichliches Wachstum,, reichliches Lu-ftmy-'eel: 2dc gelblichgrau. (GY), Unterseite 69, tief OY, kein lösliches Pigment

Ausreichendes Wachstum, Unterseite 91.d. gy.Y, schlechtes Lüftmyce!wachstum: 5fe hellgräulich rettichartig, kein lösliches Pigment '

Reichliches Wachstum, Unterseite 5b, tief Br, reichliches Luftmycel: 2fe mittelgrau (GY), kein lösliches Pigment

ISP. Nr. 5.

Ausreichendes Wachstum, Unterseite: 94.1. 01 Br; ausreichende Luftmycelentwicklung: 2dc gelblichgrau (GY), hellgelbes lösliches Pigment

Czepak-Agar

Ausreichendes Wachstum, Unterseite: 79.1. gy.yBr, ausreichende Luftmycelentwicklung: ,3qe, hellgräulich-gelblich-braun .(GY), kein lösliches: Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite: 75.. tief yBR, reichliches Luftmycel: 3ge hellgräulich-gelbbraun (GY), kein lösliches Pigment

Die für die Kennzeichnung der Farbe der Unterseite verwendeten Zahlen und Buchstaben sind bezogen auf die Farbkarten von ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Probe Nr. 2106, US-Department of Commerce, National Bureau of Standards. Die zur Bestimmung der Farbe des Luftmycels ver-

wendeten unterstrichenen Zahlen und Buchstaben beziehen sich auf H.D. Tresner und E.J. Backus "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy" Appl. Microbiol. 11·, 335 bis 338 ^Λ(1956) .

(GY) bezieht sich auf die Graureihe.

2 · '

ISP = International Streptomyces Project Medium

TPO = Tomatenpaste-Hafermehl-Agar. .

Morphologische Charakteristiken von Streptomyces chromo-. fuscus NRRL 15098 ' _;

Der neue Stamm von Streptomyees chromofuscus bildet gut entwickelte nichtfragmentierte Mycele, die monopodisch verzweigt sind. Auf Lufthyphen werden Sporophoren erzeugt, die Spiralen aus vier bis fünf Wickeln bilden. Einige Spiralen bilden sehr dichte Kugeln am Ende der Sporophoren. Diese Kugeln könnten irrtümlich für Sklerotium gehalt en wer-, den. Die Sporen sind länglich mit einer dornigen Oberfläche. Der neue Stamm ist'dem Spiralabschnitt (S) von Prid- harn et al. zuzuordnen, nämlich von T.G.. Pridham, C.W. Hesseltine und R.G. Benedict "A Guide for the Classification of Streptomycetes According to Selected Groups" in Appl. Microbiol. 6, 52 bis 79 (1957).

Die Morphologie ist mit einem optischen Lichtmikroskop untersucht.worden. Zum Studium der Spprenoberflache und der Ornamentation ist ein Elektronenabtastmikroskop (SEM)

verwendet worden. ,..

Physiologische Charakteristiken von Streptomyces chromofuscus NRRL 150 98 _:

Eine Analyse hydrolysierter Gesamtzellen, des Stammes Streptomyces chromofuscus zeigt die Anwesenheit von LL-Diaminopimelinsäure. Es läßt sich kein meso-Isomeres feststellen. Eine Zuckeranalyse hydrolysierter Gesamtzellen zeigt die Anwesenheit von Glucose, Mannose, Ribose und Rhamnose. Die-

se Ergebnisse zeigen,, daß die Zellwand des Stamms eine Zellwand vom Typ I ist, die kein charakteristisches Zukkermuster zeigt und daß es sich dabei um den Genus Streptomyces handelt, wie sich nach R.E. Buchanan und N.E. Gibbons

"

Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage (1974), The Williams and Wilkins Co., Baltimore, MD, V.St.A. ergibt.

Das Kohlenstoffverwertungsmuster für Streptomyces chromo-.

fuscus NRRL 150 98 geht aus der folgenden Tabelle II hervor. Die KohlenstoffVerwertung ist unter Verwendung von -ISP-Grundmedium bestimmt worden, das bis zu einer Endkonzentration von 1,0 % mit sterilisierten Kohlenstoffquellen versetzt worden ist. Die Platten sind bei 30⁰C bebrütet

*. und nach 14 Tagen abgelesen worden.

TABELLE II .

Kohlenstoffverwertung von Streptomyces chrdmofuscus

' NRRL 15098 . ' '

, Kohlenstoffquelle Verwertung

. Kein Kohlenstoff -

L-Arabino.se ' + '

D-Fructose -. · +

D-Glucose - ' +

Isoinosit , +

D-Mannit +

Raffinose ' · -

QQ- L-Rhamnose ' · +

Saccharose +_

D-Xylose . . . +

D-Ärabinöse ' ' +

Cellobiose . . +

gg D-Ga lactose - ' .....+ '.

Lactose ' ' , ' . +

D-Maltose + .

Mel ibiose ' ' " . ' . ' . ' +

' - 29 -

. TABELLE II (Fortsetzung)

Kohlenstoffquelle . - Verwertung

Natriumacetat' -

Natriumeitrat' + .

Natriumsuecinat . . + .

D-Riböse +

Salicin' . · + .

' . · . ·

- == Keine Verwertung

+ =.Verwertung + = zweifelhafte Verwertung . .

2_5 Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 ergibt eine Hydrolyse von.Stärke und eine Teilhydrolyse von Magermilch. Auf Magermilch wird ein dunkelbrauner Wachstumsring gebildet, Gelatine wird durch den neuen Stamm nicht hydrolysiert. In ISP Nr.- 8, nämlich einer Organonitratbruhe, ist der/

2Q Stamm zu keiner Reduktion von Nitraten zu Nitriten befähigt. V ' ' ; ' ·. .

- Der neue Stamm hält Natriumchlorid bis zu etwa 7 % aus.

Der neue Stamm wächst bei Temperaturen zwischen etwa 15 und etwa 4O⁰C.

TABELLE III

„-. Bildung von Melanoidpigment durch Streptomyces chromofuscus NRRL 15098

Medium ' . Pigmentbildung

ISP.Nr.- 1 ;

Trypton-Hefeextrat-Brühe . +

. ISP Nr. 6 :

Pepton-Hefeextrat-Eisen-Schräg- . ·

agar ' . .- ^: ' +

¹^ . TABELLE III (Fortsetzung)

Medium Pigmentbildung

ISP Nr. 7 . . .

Tyrosin-Agar . . ,.+ .-.'

ISP Nr. 7

Schrägagar ohne Tyrosin . - ' ··

Auf-grund von Vergleichen der morphologischen, züchtungs- ^q technischen und physiologischen Eigenschaften des A-58365 produzierenden Organismus mit den veröffentlichten Beschreibungen ähnlicher Spezies ähnelt die hierin beschriebene Kultur am meisten Streptomyces chromofuscus gemäß E.B. Shirling und D. Gottlieb "Cooperative Description of 15- Type Cultures of Streptomyces" in Int. J. Syst. Bacteriol. 18 (4), 279.,bis 392 (1968). Der Organismus A-58365 unterscheidet sich jedoch von den veröffentlichten Spezies und ist daher als neuer Stamm hiervon klassifiziert worden.. Trqtz mancher ähnlicher Eigenschaften unterscheidet sich «Q der bekannte Stamm von Streptomyces chromofuscus vom , Stamm A-58365 darin, daß er den Zucker Raffinose nicht verwertet und auf.Agar ISP Nr. 7 kein Melanoidpigment bildet.

. Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 bildet zusätzlich zu der beschriebenen.Produktion von ACE-Inhibitoren in geringeren Mengen auch noch das Antibiotikum Asukamycin AMl042 und einen anderen, antibiötischen Metabcliten, bei dem es. sich um Methylenomycin handeln kann. Asukamycin ist in US-PS 4 226 879 beschrieben und wird durch Streptomyces 30. nodosus NRRL 8185 erzeugt. Streptomyces nodosus unter-^; . scheidet sich züchtungsmäßig von Streptomyces chromofuscu's NRRL 15098 in seiner ausgeprägten Unterseite und löslichen Pigmentierung. Die morphologischen Unterschiede sind: schwache Sporophorenentwicklung, kurze Sporenketten und glatte Sporenoberflachenornamentation.' Physiologisch unterscheidet sich Streptomyces nodosus vom vorliegenden neuen Stamm darin, daß in.der Brühe ISP Nr. 1 oder, auf

- .

Schrägagar ISP Nr. 6 und ISP Nr. 7 keine Melanoidpigmente gebildet werden .Diese Unterschiede zeigen, daß Streptomyces nodosus gegenüber dem vorliegend beschriebenen Organismus' eine getrennte und unterschiedliche Spezies ist.

Der andere während des Wachsens von Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 erzeugte antibiotische Metabol'it ist , tentativ als Methylenomycin identifiziert worden. Dieses Antibiotikum, das von Streptomyces violaceoruber 2416 ge-

bildet wird, wird in J-. Antibiotics 21, 386 bis 392 (1974)

: beschrieben. ·

Zur Erfindung gehört weiter auch eine biologisch reine" Kultur von Streptomyces chromofuscus NRRL 15098> die zusätzlich zu den oben erwähnten züchtungstechnischen, 'morphologischen und physiologischen Eigenschaften auch die hierin beschriebenen ACE-Inhibitoren produziert.

. Die Faktoren A und B von A-58365 werden aus dem Fermenta- *Q tionsmedium isoliert und chromatographisch voneinander getrennt. Isolierung und Abtrennung dieser Faktoren werden wie folgt durchgeführt. Die gesamte Fermentationsbrühe wird auf etwa pH 2,0 angesäuert und zur Entfernung des Mycels und der anderen unlöslichen Bestandteile filtriert. Zur Ver- 5 besserung der .Filtrationsgeschwindigkeit wird zweckmäßi- , gerweise eine Filterhilfe verwendet. Nach erfolgter Filtration wird der pH-Wert der filtrierten Brühe mit einer Base wie Natriumhydroxid, auf etwa pH 7,0 eingestellt. Zur Ent-'fernung inaktiver neutraler Verunreinigungen wird die neutrale filtrierte Brühe mit einem nichtfunktionellen netzartigen polymeren Harz behandelt, beispielsweise einem Polystyrolharz, wie Diaion Ή.Ρ-20 (Mitsubishi Chemical Co.. ) , oder ' einem XÄD-Harz (Rohm und Haas, Philadelphia PA). Die neutrale Brühe kann durch eine mit dem Harz gefüllte Säule geschickt werden oder man kann das Harz wahlweise auch zur neutralen Brühe in einem geeigneten Gefäß geben und zur Adsorption der inaktiven Verunreinigungen mit der Brü-

. . ' - 32 - .

he rühren. Bei dieser vorläufigen Reinigung macht die Menge an verwendetem Harz etwa 1/10- des Volumens der Brühe aus. Vorzugsweise wird das Harz in der neutralen Brühe etwa 2 Stunden verrührt und dann durch Filtration abge-. trennt. Anschließend wird der pH-Wert der mit Harz behandelten Brühe mit einer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, auf etwa 2,0 bis 3,0 erniedrigt, worauf man die angesäuerte Brühe abkühlt und zur Entfernung irgendeines inaktiven Niederschlags filtriert.

Die saure.und geklärte Brühe wird dann über ein nichtfunktionelles Harz, vorzugsweise Diaion HP-20, chromatographiert. Hierzu wird die saure Brühe auf eine mit dem" Harz HP-20 gefüllte Säule gegossen und der Abstrom verworfen.

Dj__e säule wird mit einer verdünnten Säure, vorzugsweise

0,3 l-iger wäßriger Ameisensäure, gewaschen, und die Faktoren von A-58365 werden durch Gradientenelutxon unter An-' wendung eines.Gradienten aus Wasser und Ameisensäure (99,7 : 0,3 Vol.-%) bis Acetonitril : Wasser : Ameisensäure (20. ': 79 ,"' : 0,3 Vol.-%) eluiert.,Man sammelt eine

Reihe von Fraktionen, wobei der Faktor A in den frühen aktiven Fraktionen eluiert wird, während es zu einer EIu- '. tion der Faktoren B und C in den späteren aktiven Fraktionen kommt. Der Verlauf der Chromatographie wird in der be-

^5 reits beschriebenen Weise durch HPLC verfolgt.

Die den Faktor A von Ä-58365 enthaltenden Fraktionen werden zusammengefaßt und durch Verdampfung eingeengt. Das, Konzentrat wird dann zu einem sauren Harz gegeben, bei-

spielsweise einem Polystyrolsulfonsäureharz in der sauren Form, wie dem Harz Dowex. 5OW (Dow Chemical Co.). Der Fak-. tor A wird mit deionisiertem Wasser in einer Reihe von Fraktionen vom Harz abgewaschen. Die den Faktor A enthaltenden Fraktionen werden¹ vereinigt und durch, Verdampfung/

konzentriert. .

S . . '

.Das saure (pH 2 bis .3) Konzentrat des Faktors A wird fil-

> - 33 - ^:

triert und dann einer präparativen Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von C,«-Siliciümdioxidgel unterzogen, wie beispielsweise dem octadecylsilanylierten Siliciumdioxidgeld LP-I von Whatman oder dem C,Q-Siliciumdioxidgel von Water's Associates. Die Säule wird zuerst mit wäßriger Ameisensäure (0,3 : 99,7 Vol.-%), dann.mit einem Gemischaus Acetonitril, Ameisensäure und Wasser (1,0: 0,3 : 98,7 Vol.-%) und schließlich mit einem Gemisch aus Acetonitril, Ameisensäure und Wasser (2,5 :^: 0,3 : 97,2 Vol.-%) ' entwickelt. Die den Faktor A enthaltenden Fraktionen werden zusammengefaßt und durch Verdampfung konzentriert.

Das aus der HPLC-Säule erhaltene Konzentrat des Faktors A wird über ein Anionenaustauscherharz chromatographiert;

15-, wie beispielsweise das in der Chloridförm befindliche Harz BioRex 5 mit einer Korngröße von 0,075 bis 0,15 mm (BioRad Laboratories, Richmond, CA, V.St.A.j^. Die Säule wird mit etwa 0,2 bis etwa 0,5 molarem Natriumchlorid eluiert, wobei die den reinen Faktor A enthaltenden Fraktionen zusammengefaßt werden. Die zusammengefaßten Fraktionen werden mit einer Säure, beispielsweise mit In Chlorwasserstoffsaure, auf einen pH-Wert von etwa 2,2 bis 2,5 angesäuert und dann über das Harz Diaion HP-20 geführt, um auf diese Weise die in den bei der Ionenaustauschchromatographie erhaltenen Fraktionen vorhandenen Salze abzutrennen. Das Harz HP-20 wird vor seiner. Verwendung in 0,01n Chlorwasserstoff säure zubereitet. Zur Elution des Faktors A wird die Säule zuerst mit verdünnter Säure (pH 2,3), dann mit Wasser und schließlich mit wäßrigem Acetonitril (15 :

85 Vol.-%) gewaschen. Die den Faktor A enthaltenden Fraktionen werden zusammengefaßt und durch Verdampfung konzentriert, und durch Lyophilisierung des Konzentrats gelangt man zum reinen Faktor A in Form eines amorphen weißen Pulvers. . ' . ' .

Die vereinigten Fraktionen, die die Faktoren B und C enthalten, welche in der oben beschriebenen Weise durch Gra-

dientenelution der durch Chromatographie mit HP-20 geklärten Brühe erhalten worden sind, werden durch Verdampfung auf ein kleineres Volumen eingeengt. 'Das Konzentrat der-, /Faktoren B oder C wird dann über ein Polystyrolpolysul- ° fonsäure-Harz, wie Dowex 5OW (H ) (Dow Chemical Co.) chromatographiert. Die Faktoren B oder C werden vom Harz mit deionisiertem Wasser ausgewaschen. Die den Faktor B ent-' . haltenden Fraktionen werden vereinigt und eingeengt. In .· ähnlicher Weise werden auch die den Faktor C enthaltenden Fraktionen vereinigt und eingeengt. . '

Die Konzentrate der Faktoren B und C werden getrennt durch Umkehrphasen-HPLC unter-Verwendung von C₁₀ Siliciumdioxid-

Io

gel, beispielsweise dem octadecylsilylierten Siliciumdioxidgel LP-I von Whatman, gereinigt. Die Elution des Fak- :' ' tors B erfolgt unter Verwendung von zuerst einem Gemisch aus Ameisensäure und Wasser (0,3 : 99,7 VoIi-%), dann einem Gemisch aus Apetonitril, Ameisensäure und Wasser (β,0 : 0,3: 9 3,7 VoI.-%) und schließlich einem.Gemisch aus Acetonitril, Ameisensäure und Wasser (15,0 : 0,3 : 8'4,7 Vol.-%). Der Faktor C läßt sich unter Verwendung ähnlicher Lösungsmittelsysteme eluieren, die im Lösungsmittelgemisch jedoch eine höhere Konzentration an Acetonitril enthalten. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und konzentriert.

Die Konzentrate der Faktoren B.-und C können unter Anwendung der oben für den Faktor A beschriebenen Verfahren . weiter gereinigt werden. .Hierzu chromatographiert man beispielsweise jedes Konzentrat über ein Anionenaustauscherharz, säuert die jeweiligen Eluate an, entsalzt sie über ein ni.chtfunktionelles Harz und lyophilisiert die entsalzten Eluate schließlich. . . ·

Der Faktor A wird in reicherem Vorkommen produziert als die Faktoren B und C,;.und er stellt^ den bevorzugten erfindungsgemäßen ACE-Inhibitor dar. Der Faktor B wird wiederum \ .· in größeren Mengen produziert als der Faktor C.

Das Antibiotikum Asukamycin und ein weiterer antibiotischer Metabolit (möglicherweise Methylenomycin) werden, wie bereits erwähnt, in geringeren Mengen zusammen mit den ACE-Hemrnfaktoren produziert. Während der oben beschriebenen

' Isolierung und Reinigung der Faktoren von A-58365 gehen

die antibiotischen Metaboliten verloren. Ausführungsbeispiele:

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert. ,

Beispiel 1

Herstellung und Isolierung der Faktoren von A-58365

Unter Verwendung eines lyophilisierten Pellets von Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 beimpft man 50 ml eines sterilisierten vegetativen Mediums aus 3 %-iger Trypticase-.

sojabrühe, die 1 % Glucose enthält. Das beimpfte Medium ⁱ wird ui^ter Schütteln 48 Stunden bei 30°C bebrütet. Mit diesem vegetativen Medium inokuliert man dann ein sogenanntes Stoßmed'ium. Hierzu beimpft man zwei jeweils 2000 ml fassende Kolben, die jeweals 400 ml einer 3 %-igen Trypticase- ^l 2£> .sojabrühe enthalten, welche mit- 1 % Glucose versetzt worden.ist, mit jeweils 10 ml des vegetativen Mediums. Die Stoßkulturen werden dann 24 Stunden bei einer Temperatur von 30 C bebrütet. . \ -.

Unter Verwendung beider Stoßkulturen beimpft man dann 100 1 eines Produktionsmediums, das folgende Zusammensetzung hat:

Bestandteile Konzentration -(g/l)

Antischaummittel '(Dow-Corning

Antifoam A) ' '-. ' ' . 0,2

•Kartoffeldextrin 35

Hefe . ' . 0,25

: OM-Pepton . 20

CoCl₂-OH₂O 0,01

LrProlin . . 4

N-Z-Amin A² ' . . . 4

Deionisiertes Wasser q.s. auf 100 Liter

OM P'epton ist ein lösliches Fleischpepton von Amber Laboratories, Juneau, WI, V.St.A.

2 ' ' '

N-Z-Amin A ist ein Enzymhydrolysat von Casein von Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ, V.St,A.

Der pH-Wert des Mediums wird vor der Sterilisation mit 5n Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Nach erfolgter Sterilisation beimpft man das ^Medium mit den oben be-

• ' '.

schriebenen Stoßmedien und läßt die Produktionsfermentation über eine Zeitdauer von 90 Stunden bei einer Temperatur von 25°C ablaufen. Während der Fermentation leitet man durch das Medium unter Rühren sterile Luft mit solcher Strömungsgeschwindigkeit, daß der gelöste Sauerstoffgehalt des Mediums auf etwa 30 bis 40 % Luf^Sättigung gehalten wird.

Während der Fermentation erhöht sich der. pH-Wert des Mediums bis zu einem pH-Endwert von 8,3.

' .,. . . · .

Während der Fermentation untersucht man das Medium unter Anwendung des bereits früher beschriebenen HPLC-Systems .: bezüglich seines Gehalts an Faktoren von· A-58365. Die Detektion der .Faktoren erfolgt durch Fluoreszenz unter Ver-Wendung eines Spektrofluorometers von Schoeffel Modell

FS97O bei der Wellenlänge λ '= 327 nm mit einem 370 nm ^: . . exe

Grenzfilter. Nach einer Fermentationsdauer von 90 Stunden.

ergibt sich hiernach im Produktionsmedium ein Wert von etwa 11,5,ug pro ml. '

Drei in der oben beschriebenen Weise durchgeführte 100 1-Fermentationen werden getrennt in den Fermentern mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2/0 angesäuert. Die angesäuerten Gesamtbrühen werden vereinigt und unter Zusatz von 2 % Filterhilfe (Hyflo) filtriert. Der. pH-Wert der filtrierten Brühe wird mit 5n Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Die neutrale' Brühe wird mit dem nichtfunktionellen Harz Diaion HP-20 in einer. (') « Menge.versetzt, die einem Zehntel des Volumens der filtrierten Brühe entspricht, und das Gemisch aus Harz und Brühe wird 2 Stunden gerührt. Die Brühe wird vom Harz abgetrennt und mit 5n Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 ange-.-. säuert. Die angesäuerte Brühe wird abgekühlt und zur Abtrennung inaktiver Niederschlage filtriert. Die angesäuerte Brühe wird auf eine mit 20 1 Diaion HP-20 gefüllte Säule gegeben, die 6,1 m lang ist und einen Innendurchmesser vbn

^AU 10,2 mm aufweist, und der Säulenab'strom wird verworfen. . Die Säule wird dann mit 60 1 0,3 %-iger wäßriger Ameisensäure gewaschen und der Abstrom wird wiederum verworfen. Sodann eluiert man(die Faktoren von A-58365 mit einem 100 1-Gradienten^xaus einem Gemisch.aus Wasser und Ameisensäu-. -·· ° re (99,7 : 0,3,, Vol:Vol) bis zu einem Gemisch aus Acetonitril, Wasser und Ameisensäure (20 : 79,7 : 0,3, VoI : VoI: VoI), wobei man 2 !-Fraktionen auffängt. Die ,den Faktor A enthaltenden Fraktionen 27 bis 48 werden zusammengefaßt und unter Vakuum auf ein Volumen von 750 ml eingeengt. Die EIution wird mit 2.0 1 eines Gemisches aus Acetonitril, Wasser und. Ameisensäure (20 : 79,7 : 0,3) fortgeführt. Die den Faktor B enthaltenden Fraktionen 56 bis 63 werden zusammengefaßt und auf ein. Volumen von 350 ml eingeengt.

Das den Faktor A enthaltende Konzentrat -gibt man auf eine mit Dowex 5OW χ 2. (H ) gefüllte und 9,3 χ 80 cm messende Säule (5 1) auf, und die Säule wird mit etwa 17 1 deioni-

siertem Wasser eluiert. 1 1-Fraktionen von 9 bis 15 1 an eluiertem Volumen, die den Faktor A enthalten, werden gesammelt, zusammengefaßt und auf etwa 200 ml eingeengt. ·

Das Konzentrat des Faktors A (pH 2 bis 3) wird filtriert ' und durch Umkehrphäsen-HPLC in einer 8 cm χ 1 m messenden Säule (Jobin Yvon Chromatospac Prep Instrument) chromatographiert, die etwa 2,5 kg (4 bis 4,5 1) octadecylsilyliertes Siliciumdioxidgel LP-1·von Whatman enthält. Die Säule wird .zuerst mit 2 1 eines Gemisches aus Ameisensäure und. Wasser (0,3 : 99,7, Vol:Vol), dann mit 5 1 eines Gemisches aus Acetonitril, Ameisensäure und Wasser (1,0 : 0,3.: 98,7, Vol:Vol:Vol) und schließlich mit 20. 1 eines Gemisches aus Acetonitril, Ameisensäure und. Wasser (2,5 : 0,3 : 97,2, VoI:Vol:VoI) entwickelt. Es werden Fraktionen von jeweils 500 ml gesammelt. Die den Faktor A enthaltenden Fraktionen 32 bis 44 werden zusammengefaßt und durch Verdampfung auf ein Volumen von 200-ml eingeengt.

Das bei der HPLC erhaltene Konzentrat des Faktors A wird auf eine 2,5 χ 30 cm messende Säule (.180 ml) gegeben, die mit dem Harz BiöRex 5 (Cl") mit einer Korngröße von 0,075 bis 0,15 mm gefüllt ist (BioRad Laboratories, Richmond, CA, V.St.Α.). Das Harz wird mit deionisiert.em Wasser gewasehen, wobei man sowohl die Waschflüssigkeit als auch- den Abstrom verwirft. Die Säule wird zuerst mit 400 ml 0,20 molarem Natriumchlorid und dann mit 2 200 ml 0,35 molarem Natriumchlorid entwickelt. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils .20 ml gesammelt, wobei die den reinen Faktor A enthaltenden Fraktionen 106 bis 140 zusammengefaßt werden. Der pH-Wert der zusammengefaßten Fraktionen, wird mit 1n Chlorwasserstoffsäure auf 2,3 eingestellt, und die. angesäuerte Sammlung wird.auf eine 2,8 x. 19 cm messende Säule (120 ml) gegeben, die mit .Diaion HP-20 in 0,01n Chlorwasserstoffsäure gefüllt ist. Die Säule wird zuerst mit 100 ml deionisiertem Wasser, das mit verdünnter Chlorwasserstoff säure auf pH 2,3 angesäuert ist, und dann mit

. 220 ml deionisiertem Wasser (pH 5>9) gewaschen, worauf man sie.mit 340 ml eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser (15 : 85, VoI : VoI) e.luiert. Nach Sammeln einer Reihe

von Fraktionen mit einem Volumen von insgesamt etwa 180 ml

werden die Fraktionen, die einem Eluat von O bis 180 ml entsprechen, gesammelt,'vereinigt, durch Verdampfung eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zu 1,31 g reinem Faktor A gelangt. ·. .

Das Konzentrat der gesammelten., den Faktor B enthaltenden Fraktionen/ das in der oben beschriebenen Weise von der mit Diaion HP-20 gefüllten Säule eluiert worden ist, wird auf eine 9,3 χ 8o cm messende Säule (5 1) gegeben,, die mit dem Harz Dowex 5OW χ 2 (H ) gefüllt ist. Die Säule wird mit 32 1 deionisiertem Wasser eluiert, wobei der Faktor B jeweils in T !^Fraktionen gesammelt wird, die dem zwischen 10 und 14 1 kommenden Eluat entsprechen. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf ein Volumen von'etwa ,250 ml

eingeengt. . · .

Das den Faktor B von A-58365 enthaltende Konzentrat unterzieht man dann der gleichen Umkehrphas^Nen-HPLC wie bei der oben beschriebenen Reinigung des Faktors A'. Die Säule wird zuerst mit 2 I eines Gemisches aus Ameisensäure und Wasser ° . (0,3 : 99,7, Vol-%), dann mit einem Gemisch aus Acetonitril, Ameisensäure und Wasser (6,0 : 0,3 : 93,7 Vol.-%) und schließlich mit einem Gemisch aus Acetonitril, Ameisensäure und Wasser (15,0 : 0,3 : 84,7 Vol.-%) entwickelt. Es wird eine Reihe von Fraktionen mit jeweils etwa 500 ml ge-30. sammelt. Die den Faktor B enthaltende Fraktion 24 wird durch' Verdampfung auf ein Volumen von 100 ml eingeengt.

Das Konzentrat des Faktors B wird dann mit einem Anionen- ' austauscherharz weiter gereinigt. Hierzu beschickt man eine mit dem Anionenaustauscherharz BioRex 5 (Cl ) gefüllte und 2,0 χ 25 cm messende Säule mit dem Konzentrat . und eluiert die Säule zuerst mit 200 ml 0,2 molarem Na-

triumchlorid und anschließend mit 1600 ml 0,35 molarem Natriumchlorid. Man sammelt eine Reihe von' Fraktionen mit einem Volumen von 10 ml und faßt die Fraktionen 193 bis zusammen. Der pH-Wert der zusammengefaßten Fraktionen wird mit 1n Chlorwasserstoffsäure auf 2,3 eingestellt, und die angesäuerte Sammlung gibt man dann auf eine 8 mm χ 20 cm messende Säule (10 ml), die mit Diaion HP-20 in 0,01n Chlorwasserstoffsäure gefüllt ist. Die Säule wird zuerst mit 300 ml deionisiertem Wasser (auf pH 2,3 eingestellt) und dann mit 14 ml deiönisiertem Wasser (pH 5,9) gewaschen. Ab strom und Waschflüssigkeit werden verworfen, und der Faktor B "wird mit 44 ml eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser ("1.5..:. 85 Vol-%) eluiert. Man sammelt eine Reihe von Fraktionen mit einem Volumen von 2 ml. Die Fraktionen .8 bis 11 werden zusammengefaßt und auf ein Volumen von 1 ml eingeengt. Durch -Lyophilisierurig des Konzentrats gelangt man zu 2,9 mg reinem Faktor B. . .

Beispiel 2

Herstellung der/Faktoren A und B von A-58365 unter Veraendung eines durch Prolin und Lysin ergänzten Kulturmediums

Man züchtet Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 .in einem vegetativen Medium, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und gezüchtet worden ist, und verwendet des Kulturmedium dann zur Beimpfung eines, Produktionsmediums mit folgerider Zusammensetzung. . .

30 Bestandteile

Konzentration (g/l)

Kartoffeldextrin N-Z Amin A^{1 :} Hefe L-Prolin Rinderextrakt .

L-Lysin . Deionisiertes Wasser

: 25

0,25

' ' 3 · . . 1

0,01

. 2 - , q. s .'. auf 1000 ml

- 41 -

* Enzymhydrolysat von Casein von Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ, V.St.A. - . , · .

Der -pH-Wert des Mediums wird vor der Sterilisation mit 5n Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Nach erfolgter Sterilisation wird das Medium beimpft und 9 6 Stunden bei einer Temperatur von 30°C gezüchtet. Das Fermentationsmedium wird während der Fermentation unter Anwendung des früher beschriebenen HPLC-Systems bezüglich seines Gehalts an.· !0 den gewünschten Faktoren untersucht. ...

f~'\ Der Faktor B wird aus der filtrierten Fermentationsbrühe gewonnen, ißoliert und durch, die chromatographischen Verfahren gereinigt, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist.

. ' ' . · · >.; .

Beispiel .3 ' .'·..

Herstellung des Dimethylesters des Faktors A von A-58355

Man versetzt eine Lösung von 31-9 mg des Faktors A von V A-58365 in 7,5 ml Methylalkohol mit 2,5 ml Methylalkohol, der 4 Gew.-% Chlorwasserstoff enthält ,und rührt die 'Lo--

25. sung 140 Minuten bei Raumtemperatür. Das Veresterungsgemisch wird dann zur Trockne eingedampft und der Rückstand in etwa 20 bis 25 ml Wasser gelöst. Man. stellt den pH-Wert

ί . der Lösung auf 6,8'ein und läßt das Ganze über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Sodann wird der pH-Wert der wäßri- gen Lösung von 6,2 auf 7,1 eingestellt, worauf man die Lösung dreimal mit jeweils. 100 ml Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Extrakte ergeben, etwa 151 mg Dimethylester des Faktors A.

.35 Y§rfahren_B . ."., .

Eine Lösung von 35 mg des Faktors A in 4,5 ml einer Lösung von Bortrifluorid in Methylalkohol (14 % BF, in was-'

j '

serfreiem Methylalkohol, erhältlich von Pierce Chemical Co., Rockville, IL, V.St.A.) wird unter Rühren 2,5 Stunden auf eine Temperatur von etwa 65°C erhitzt. Während der Umsetzung wird Luft vom Reaktionsgefäß ausgeschlossen. Sodann wird das Reaktionsgemisch durch Verdampfung auf ein. Volumen' von etwa 1,5 ml eingeengt und das'Konzentrat in 10 ml Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wird fünfmal mit' gleichen Volumina Methylenchlorid extrahiert, wobei man die Extrakte zusammenfaßt, mit 5 ml Wasser wäscht, über Natriumsulfat trocknet, filtriert und zur.Trockne eindampft. Auf diese Weise gelangt man zu 24,4 mg Dimethylester von Faktor A. .

Bei s. piel 4 . ' . ^! ' . . ' .

Herstellung des Diethylesters und der Monoethylester des Faktors A von A-58365

Eine Lösung von 507 mg des Faktors A in 15 ml absolutem '.. Ethylalkohol: wird in einem Eisbad gekühlt und unter Rühren mit 10 ml absolutem Ethylalkohol versetzt, der 3 Gew.-% Chlorwasserstoff enthält. Der Reaktionskolbe'n wird mit Stickstoff gespült, mit einem Stopfen verschlossen.und bei Raumtemperatur stehengelassen. Der. Verlauf der Veresterung wird durch hochleistungsflüssigkeitschromatographische 'untersuchung kleiner Teilmengen des Reaktipnsgemisches verfolgt , die man von Zeit zu Zeit, entnimmt.. Nach 8 Stunden wird das Reaktionsgemisch mit 50 ml Wasser verdünnt und der pH-Wert der .wäßrigen Lösung mit verdünntem Natriumhydroxid auf 6,9 eingestellt. Die Lösung wird zur Entfernung des Ethylalkohols eingedampft und das wäßrige Konzentrat, wird mit.Wasser auf ein Volumen von 40 ml.verdünnt und mit verdünntem Natriumhydroxid behandelt, um den pH-Wert auf 7,09 einzustellen. Die Lösung wird dann viermal mit jeweils 50 ml Methylenchlorid extrahiert, und die Extrakte werden vereinigt/..mit 20 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Auf

diese Weise gelangt man zu 222 mg des Diethylesters des Faktors A. ·

Der pH-Wert der aus obiger Extraktion des Diethylesters zurückbehaltenen wäßrigen Phase wird mit,Chlorwasserstoffsäure auf 1,95 eingestellt, worauf man das Ganze fünfmal mit jeweils 50 ml Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, mit verdünnter Säure gewaschen und beiseite gestellt. Die saure wäßrige. Phase wird viermal mit jeweils 50 ml Ethylacetat extrahiert, und die Extrakte werden vereinigt und mit verdünnter Säure gewaschen,. Der Ethylacetatextrakt und der Methylenchloridextrakt wer-. den vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Auf diese Weise gelangt man zu 257 mg eines Gemisches aus den Monoethylestern des Faktors A.

Durch analytische HPLC und durch das NMR-Spektrum (360 MHz) ergibt sich, daß es sich hierbei um ein 9 : 1-Gemisch der Monoethylester handelt.

X-59 72M

Formelblatt

OH

ROOC-CH₀-CK

-

.11 ' ·

Il J

0 . .· COOR₁

Claims (5)

Erfindungsansprüche:

1 tor A, den Faktor -B oder den Faktor C isoliert und das Produkt gewünschtenfalls verestert und/oder in ein Salz überführt.

1. Verfahren zur Herstellung von Paktoren
von Ä-58365 auf der Grundlage der Formell

OH

ROOG-CH₂-CH₂-, _X/_N/" (I)

ίο . . , j: ι

O COOR

worin η für 1 oder 2 steht, R und R. gleich oder verschieden sein können und jeweils Wasserstoff, C^-Cg-Alkyl, Indan-5-yl, Phthalidyl oder eine Acyloxymethy!gruppe der
Formel

.·.'... R₂-C-O- CH₂ - ;

. ' . ' : ' . ' · .. .-.

, . bedeuten, worin R₂ für C..-C ,-Alkyl, Phenyl, Halogenphenyl oder Methylphenyl steht, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon, dadurch ge ken n,-zeichnet, daß man Streptomyces chromofuscus NRRL ^° . 15098,in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält,
unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen züchtet.

2. Verfahren nach Punkt 1, d a d u r c h g e -

k. e η η. ζ eich η e t , daß man eine Verbindung der Formel II

' ^; OH ' - -

' ROOC-CH₂-CH ₂4 A -J» (H)''

worin R und R. die in Punkt 1 angegebenen Bedeutungen haben, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon herstellt. ,

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, ,daß man den Faktor A von A-58365 der Formel III .

OE

!

>

HOOC-CH₉-CH₀ _|

0 COOH :

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon her- \ stellt. · ' ';

4. . Verfahren nach Punkt 1, dadurch g e -

kennzeichnet , daß man eine Verbindung der Formel IV

." . ROOC-CH₂-CH₂-*, A s^{s (ϊν)}

0 COOR

worin R und R^ die in Punkt 1 angegebenen Bedeutungen haben, oder ein pharmazeutisch, unbedenkliches Salz hiervon herstellt. <

5.. Verfahren nach Punkt 1, d a d u.r c h g e k e η η· ζ e ic h n'e t , daß man den Faktor B von A-58365 der Formel V _:

OH

^<V>

HOOC-CH₀-CH₉-=

ΊΙ ^; I'

0 COOH,

oder.ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon her-, stellt.

. 6. Verfahren nach Punkt. 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Faktor C von A-58355, der

(a) ein Molekulargewicht von 295 hat, , , . · (b) im Felddesorptionsmassenspektrum einen m/e-Wert

von 295 /M*7 zeigt, ' ,

(c) die empirische Formel C₁-H₁TNO₁. hat,

(d) nach Umkehrphasenhochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer mobilen Phase aus ' 6 % Acetonitril, .0,3 % Ameisensäure und 93,7 % Wasser eine Retentionszeit von etwa 18,2 Minuten ergibt,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon herstellt.

7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3 zur Herstellung des Faktors A von A-58365, d a du r c h. g e k e η nze ic hn et, daß man das, Kulturmedium mit

etwa 1 und 6g Prolin pro Liter Medium ergänzt.

8/ Verfahren nach einem, der Punkte 1, 4 oder 5 zur Herstellung des Faktors B von A-58'365, dadurch ge k en η ze ich η et , daß man das Kulturmedium mit etwa T bis 6 g Prolin und mit 1 bis 3 g Lysin pro Liter Medium ergänzt.

' ' ' . ..:.· Ζ . ' . ' ·. .. .' . · ' -. ; - 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, d a -

durch gekennzeichnet , daß man den Fak-

5 10. Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Punkt 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es den Mikroorganismus Streptomyces chromofuscus NRRL 15098 . und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff

und anorganische Salze enthält. 10

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