KR860001215B1 - 안지오텐신-전환 효소 억제제의 제조방법 - Google Patents

안지오텐신-전환 효소 억제제의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

안지오텐신-전환 효소 억제제의 제조방법
본 발명은 고혈압의 치료에 유효한 안지오텐신-전환 효소 억제제인 일반식(Ⅰ)화합물 또는 그의 약학적으로 무독한 염의 제조방법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
상기식에서
n은 1 또는 2이며
R 및 R1은 같거나 다르며, 각각 수소, C1-C6알킬, 인단 -5-일, 프탈리딜 또는 다음 일반식의 아실옥시메틸그룹이다.
Figure kpo00002
(여기서 R2는 C1-C4알킬, 페닐, 할로페닐 또는 메틸페닐이다.)
해마다 수십만명이 고혈압으로 인해 사망하고 있다. 이를 해결하기 위한 여러가지의 약제가 개발되었으나, 작용기전의 복합성 때문에 다른 생물학적 또는 생화학적 기능에 영향을 미침이 없이 고혈압만을 특이적으로 치료하기가 거의 불가능하였으며 바람직하지 못한 부작용이 빈번히 발생하였다. 따라서, 연구자들은 특이적 방법으로 작용하여 원하는 결과를 얻을수 있는 약제를 개발하고자 꾸준히 노력해오고 있다.(W.O. Faye, Principles of Medicinal Chemistry, Lea & Febiger, Philadelphia, 1974, pp. 377-398).
고혈압과 관련된 기전중 한가지는 레닌-안지오텐신 시스템이다. 예전에는 하이퍼텐신 및 안지오토닌이라 불리우던 데카펩타이드인 안지오텐신 Ⅰ은 ACE, 즉 안지오텐신-전환 효소에 의해 옥타 펩타이드인 안지오텐신 Ⅱ로 전환된다. 전환 효소인 ACE는 안지오텐신 Ⅰ의 C-말단 히스티딜 로이실 잔기를 떼어내어 안지오텐신 Ⅱ를 생성한다. 안지오텐신 Ⅱ는 강력한 혈관 수축제이며 부신에 직접 작용하여 알도스테론의 방출을 자극한다. (M. Bodanszky, M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1966, pp.215-223, and Pumpus, "Angiotensin, " Renal Hypertension, I . page, J. McCubbin, eds.(Yearbook Medical Publishers, Chicago, IL. 1968), pp. 62-68) 안지오텐신 I 은 기질인 안지오텐시노겐에효소인 레닌이 작용하여 생성된다. 고혈압의 병인으로써 레닌-안지오텐신 시스템의 역할에 대해 많은 연구가 행해져 왔다. 이에 대한 참조문헌으로는 J. Med. Chem., 24(4), 355-361(1981) 및 그에 인용된 참고문헌을 들수 있다.
ACE의 작용을 억제하여 혈압 강하 작용을 나타내는 합성 화합물은 선행 기술에서 설명 되었다. 미합중국특허 제4,316,904호 및 제4,316,906호에는 치환된 프롤린의 멀캅토아실 유도체가 기술되었으며 ; 미합중국특허제4,154,936호에는 아미노산의 멀캅토-치환 유도체가 기술되었으며 ; 미합중국특허 제4,154,937호에는 피페콜산의 하이드록시 카바모일 유도체가 기술되었으며 ; 미합중국특허 제4,046,889호에는 아제티딘-2-카복실산의 멀캅토아실 유도체가 기술되었다.
본 발명은 유용한 혈압 강하제인 A-58365인자 A, B 및 C로 표시되는 안지오텐신-전환효소 억제제를 제공한다.
본 발명에 따라 일반식(Ⅰ)의 ACE억제인자는 액침 호기성 발효 조건하에 동화 가능한 탄소, 질소 및 무기염원을 함유하는 수성 영양배지 중에서 신규 균주인 스트렙토마이세스 크로모푸스커스 NRRL15098(기탁기관 : 한국 종균협회, 기탁일자 : 1983년 7월 28일, 기탁번호 : KFCC-10050)을 배양시켜 제조할수 있다. 여과한 발효 육즙으로부터 인자들을 분리하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함한 크로마토그래피 기술에 의해 각 인자로 분리 및 정제할 수 있다.
A-58365인자는 고혈압의 치료에 유용한 강력한 ACE 억제제이며 울혈성 심부전증의 치료에 특히 유용하다. 본 발명은 또한 액침 호기성 발효조건하에 동화가능한 탄소, 질소 및 무기염원을 함유하는 영양 배지에서 스트렙토마이세스 크로모푸스커스 NRRL15098(기탁번호 : KFCC-10050)을 배양시켜 A-58365인자 A, B 또는 C를 제조하는데 있어 발효 배지에 배지 l당 약 1 내지 6g의 프롤린을 보충함을 특징으로 하여 A-58365인자 A를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 액침 호기성 발효조건하에 동화가능한 탄소, 질소 및 무기염원을 함유하는 영양배지에서 스트렙토마이세스 크로모푸스커스 15098(기탁번호 : KFCC-10050)을 배양시켜 A-58365인자 A, B 또는 C를 제조하는데 있어 발효 배지에 배지 l당 약 1 내지 6g의 프롤린 및 1 내지 3g의 리신을 보충함을 특징으로하여 A-58365인자 B를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 ACE억제 화합물은 화학적, 물리적, 및생물학적으로 서로 밀접한 관련을 가진것으로 보인다. 다음 물리화학적 데이타는 본 발명 방법에 의해 수득된 각 인자의 특성을 나타낸다.
A-58365인자 A
인자 A는 후술된 바와 같이, 백색 무정형 분말로 분리되며 물 및 메틸알콜, 에틸알콜, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드 같은 극성유기 용매에 용해도가 크며, 아세톤에는 약간 밖에 녹지 않고, 벤젠 및 헥산 같은 탄화수소 용매에는 불용성이다.
인자 A는 자외부에서 흡수를 나타내며, 다음 인자 A의 자외부 흡수 스펙트럼은 Varian Cary 분광광도계 모델 118에 의해 중성, 산성 및 알칼리성 조건하에 인자 A의 수용액에 대해 구한 것이다.
중성 및 산성
λmax232nm ε=6,000(MW267을 기준), 325nm ε=7,600(MW267을 기준).
알칼리성
λmax243nm ε=7,200, 353nm ε=7,400
인자 A는 특징적인 형광 패턴을 보인다.
다음 인자 A의 형광스펙트럼은 Amino-Bowman 분광 형광 광도계에 의해 산성, 중성 및 알칼리 pH조건하에 인자 A의 수용액에 대해 구한 결과이다.
산성
여기 (excitation) 극대 : 327nm
방출 (emission) 극대 : 398nm
중성 알칼리성
여기극대 : 324nm 여기극대 : 350nm
방출극대 : 396nm 방출극대 : 424nm
인자 A의13C NMR스펙트럼은 Bruker Model WM270 NMR분광계로 구한 것으로, 스펙트럼의 특징적 시그날은 다음과 같다 :
13C NMR(67.9 MHz, D2O) : δ 25.66(1C, t), 26.76(1C, t), 27.66(1C, t), 33.19(1C, t), 63.80(1C, d), 128.52(1C, s), 134.72(1C, d), 135.20(1C, s), 136.06(1C, s), 159.86(1C, s), 174.42(1C, s), 177.89(1C, s).
적외부 흡수 스펙트럼은 다음의 흡수 피크를 나타낸다.
Figure kpo00003
1/br=브로드 : m=중 : s=강 : w=약; vw=매우 약; m-s=중정도 내지 강; m-w=중정도 내지 약; shd=쇼울더
1H NMR 스펙트럼의 특징적 시그날은 다음과 같다.
1H NMR(360(MHz, D2O) : δ 2.30(1H, m), 2.57(1H, m), 2.64(2H, t), 2.74(1H, dt), 2.81(1H, dt), 3.05 (1H,dd), 3.15(1H,ddd), 5.01(1H, dd), 7.33(1H, s).
인자 A의 분자량은 그의 질량 스펙트럼분석에 의해 구한 결과 267이다. 고속 원자 포격 (Fast Atom Bombardment, FAB) : m/e 268 장탈착(Field desorption) : m/e 267, 223.
고분해능 FAB : m/e 268.081890 : C12H14NO6(M＋H+)의 계산치 268.08211.
인자 A 샘플에 대한 원소분석 결과 실험식 C12H13NO6을 기준해서 각원소 성분의 퍼센트는 다음과 같다.
계산치 C 53.93; H 4.90; N 5.24
실측치 C 53.72; H 5.10; N 5.16
인자 A의 선광도 :
Figure kpo00004
(C=1%, H2O)-199.5°
66% 디메틸포름아미드 중에서 인자 A를 전기 적정하여 적정 가능한 세개의 그룹이 존재함을 확인했다 :
pk=5.7, 7.5, 12.3
A-58365 인자 B
A-58365인자 B의 물리적 및 분광학적 특성이 다음 항에 주어져 있다. 다음 데이타가 나타내는 바와 같이, 인자 B는 인자 A와 밀접하게 관련된 것으로 보이며 구조상 메틸렌 유니트 한개가 차이난다.
인자 B의 적외부 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 흡수 피크를 나타낸다.
Figure kpo00005
1/약자는 인자 A의 IR에서 전술된 바와 같다.
인자 B의 프로톤 자기 공명 스펙트럼(1H NMR)결과는 다음과 같다.
1H NMR(360(MHz, D2O) : δ 1.67 (1H, m), 1.86(1H, m), 2.08(1H, m), 2.35(1H, m), 2. 66(2H, t), 2.76(1H, m)2.78(2H, m), 2.98(1H, m),5.10(1H, dd), 7.35(1H, s).
인자 B의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 결과는 다음과 같다 :13C NMR(67.9MHz, D2O) : δ 16.08(1C, t), 23.43(1C, t), 26.07(1C, t), 26.36(1C, t), 33.44(1C, t), 58.03(1C, d), 126.60(1C, s), 132.88(1C, s), 133.06(1C, d), 137.14 (1C, s)161.73(1C, s), 176.97(1C, s), 178.57(1C, s).
인자 B는 인자 A와 마찬가지로 스펙트럼의 자외부에서 흡수를 나타내며, 증성 및 산성 조건하에서 염기를 가하면 흡수 극대가 장파장쪽으로 이동한다. 인자 B수용액에 대해 구해진 흡수극대는 다음과 같다.
중성 및 산성 : λmax232nm(ε=3,800), λmax 333nm(ε=5,600).
염기 첨가시, 232nm의 λmax는 244nm로 λmax 333nm는 360nm로 이동된다.
인자 B는 인자 A와 마찬가지로 장파장자외선 하에 청색 형광을 발한다.
인자 B의 분자량은 질량 스펙트럼 분석에 의하면 281이다.
장 탈착 질량스펙트럼 : m/e 281(M+)
인자 B의 물리적 및 분광학적 특성에 근거할때, 실험식은 C13H15NO6이다. 인자 A 및 B의 스펙트럼데이타를 비교 분석한 결과 인자 B가 인자 A의 고급 동족체이다.
인자 B는 인자 A와ㅡ 유사한 용해도 특성을 보인다. 인자 B는 물 및 메틸알콜, 에틸알콜 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드 같은 극성 유기 용매에 대해 용해도가 크며, 아세톤에는 약간만 용해되며 벤젠 및 헥산 같은 탄화수소 용매에는 불용성이다.
A-58365 인자 C
에스. 크로모프스커스 NRRL15098 (기탁번호 KFCC 83-10050) 발효육즙으로부터 인자 A 및 B보다 소량으로 수득되는 또다른 인자를 A-58365인자 C로 표시한다. 이제까지 밝혀진 이 인자의 특성에 근거할때, 인자 C는 인자 A 및 B와 유사하다. 즉 전술된 인자와 마찬가지로, 인자 C도 장파장 자외선 중 청색형광을 발한다.
인자 C의 분자량은 질량스펙트럼 분석에 의하면 295이다.
장탈착 질량스펙트럼 : m/e295(M+) 인자 C의 실험식 : C14H17NO6A-58365인자는 서로 유사하지만, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 각각 특징적인 체류 시간을 보인다. HPLC에 의해 인자를 개별적으로 분리할수 있다. 인자의 분리를 위한 HPLC계에 사용되는 고정상은 Waters Associates μ Bonda-pak C18, 4mm×300mm 칼럼이다. 유동상은 6% 아세토니트릴 /0.3포름산/93.7%물이며 유출속도는 2.5ml/분이다. 각 인자의 형광특성을 이용하여 그 존재를 탐지한다. Schoeffel FS 970분광 광도계로 형광을 측정한다.
상기 HPLC계에서 각 인자의 체류시간은 다음과 같다.
Figure kpo00006
A-58365인자 A 및 B의 구조는 다음 구조식으로 나타낸다.
Figure kpo00007
본 발명은 또한 A-58365인자 A 및 B를 염형태뿐 아니라 에스테르 형태로 제공한다.
상기 식에서 "C1-C6알킬"은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급-부틸, t-부틸, n-아밀, 이소아밀, n-헥실, 1,1-디메틸부틸 등 같은 직쇄 및 측쇄 탄화수소라디칼을 말한다. "C1-C4알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급부틸, t-부틸 등을 포함한다. "할로페닐"은 4-클로로페닐, 3-클로로페닐, 2-클로로페닐, 3,4-디클로로페닐, 3-브로모페닐, 4-브로모페닐, 2-플루오로페닐, 4-플루오로페닐, 3-요도페닐 등 같은 모노-또는 디할로페닐 그룹을 말하며 ; "메틸페닐"은 4-메틸페닐, 3-메틸페닐, 2-메틸페닐, 2,6-디메틸페닐, 2,4-디메틸페닐 같은 모노 및 디메틸페닐그룹을 나타낸다.
A-58365인자는 통상적인 에스테르화방법에 의해 에스테르화되어 모노 및 디에스테르를 생성한다. 예를들어, R 및 R1이 C1-C6알킬인 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 산촉매 존재하에 이산을 C1-C6알콜과 반응시키는 피셔 에스테르화법에 의해 제조한다. 사용될 수 있는 대표적인 산촉매는 브른트리플루오라이드에테레이트, 무수 염화수소, 또는 p-톨루엔설폰산이 있다. 에스테르화는 불활성 용매중에서 이루어지는데, 용매는 C1-C6알콜 자체이거나 디에틸 에레르 같은 다른 용매일 수 있다. 에스테르화의 한 예로, 인자 A를 메틸알콜에 용해하고 이 용액에 약 1내지 3% 무수염화수소를 통해준다. 산성용액을 약 1내지 2시간 교반하고 디메틸 에스테르를 회수한다.
또는 A-58365인자를 적절한 디아조알칸으로 에스테르화 하여 본 발명 에스테르를 수득할수 있다.
상기 일반식으로 표시되는 인단-5-일에스테르는 목적 A-58365인자를 인단-5-올로 에스테르화 하여, 예를들어 카보디이미드(예, 디사이클로헥실카보디이미드) 같은 탈수제 존재하에 산과 알콜을 축합시켜, 제조한다.
A-58365인자 A 및 B의 프탈리딜 에스테르는 인자의 알칼리 금속염과 브로모프탈리드를 반응시켜 제조한다. 이 반응은 디메틸프롬아미드 또는 디메틸아세트아미드 같은 적절한 용매중에서 염 및 브로모프탈리드를동 물로 반응시켜 이루어질수 있다.
R 또는 R1이 아실옥시메틸 그룹인 상기 일반식(Ⅰ)의 에스테르는 나트륨 또는 칼륨염으로써의 A-58365인자와 다음 일반식의 아실옥시메틸 할라이드를 반응시켜 제조한다.
Figure kpo00008
여기에서 X는 바람직하게는 클로로 또는 브로모이고 R2는 전술한 바와 같다. 사용될수 있는 아실옥시메틸클로라이드 및 브로마이드의 예로는 클로로메틸아세테이트, 브로모메틸 아세테이트, 브로모메틸, 프로피오네이트, 클로로메틸, 피발로에이트, 클로로메틸벤조에이트, 브로모메틸 4-클로로벤조 에이트등이 있다.
인자 A 또는 인자 B의 디에스테르를 제조한 데이어, 모노에스테르가 존재 한다면, 약 pH 7에서 용매추출에 의해 디에스테르로 부터 분리할수 있다. 예를들어, 모노에스테르를 함유하는 디에스테르를 메틸렌클로라이드 같은 수불혼화성 유기 용매에 용해하고 묽은 염기 용액으로 세척한다. 중성 내지 염기성 세척에 의해 모노에스 테르는 그의 수용성염형태로 분리된다.
상기 일반식으로 나타내지는 개별적 모노에스테르는 A-58365인자를 1당량의 알콜로 에스테르화하여 수득할수 있다. 함께 생성되는 디에스테르는 전술한 바와 같이 조절한 pH에서 용매 추출에 의해 모노에스테르와 분리할 수 있다. 에스테르화에서 수득되는 혼합모노에스테르는 통상적 크로마토그래프 방법, 예를들어 실리카겔상 제조용 박층크로마토그래피 또는 바람직하게는HPLC에 의해 분리한다.
A-58365인자는 두개의 카복실산 작용그룹을 갖는 산성 화합물이다. 대부분의 카복실산과 마찬가지로, 인자들은 적절한 염기와 염을 생성할수 있다. 그런 염에는 고혈압 치료에 유용한 약학적으로 무독한 염뿐아니라 각 인자의 분리 및 정제에 유용한 염도 포함된다. "약학적으로 무독한"염은 온혈 동물의 화학요법에 유용한 염을 말한다. 알칼리금속 및 알칼리 토금속 염기와 생성된 나트륨염, 칼륨염 및 칼슘염 같은염은 각 인자의 수용액을 화학량론적 양의 염기로 중화시킨뒤 염수용액을 동결 건조시켜 생성할 수 있다. 적절한 염기로는 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 수산화나트륨, 탄산칼륨, 중탄산칼륨, 수산화칼륨 및 수산화칼슘 같은 알칼리 금속 탄산염, 중탄산염 및 수산화물이 포함된다. 인자의 염은 또한 메틸아민, 에틸아민, 이소프로필아민, n-부틸아민, 디메틸아민, 사이클로헥실아민, 디사이클로헥실, 벤질아민, 디벤질아민, 아비틸아민, 프로카인 등 같은 1급 및 2급 아민 및 유사한 염기성 아민등의 적절한 아민에 의해서도 생성될 수 있다. 인자의 암모늄염 또한 통상적 방법으로 수득할 수 있다. 아민염은 수 혼화성 용매중 목적 아민의 용액을 인자의 수용액에 가해 수득할수 있다. 대부분의 아민 염은 수용액으로부터 침전되며, 혼합물중에 가용성인 경우에는, 염용액의 동결 건조에의해 수득할수 있다.
본 발명의 A-58365인자는 안지오텐신 Ⅰ전환효소를 억제하는데, 이는 기니아 픽의 적출 회장에 대한 시험관내 시험으로 입증된다. 시험관내시험 방법은 다음과 같다. 기니아픽 회장 분절(2내지 3cm)을 다음조성의 크랩스 용액을 함유하는 10ml적출 조직욕내에 길이로 고정시킨다. 조성(밀리몰농도) : 염화나트륨 : 염화칼륨, 118.2; 염화칼슘, 4.6; 염화칼슘 이 수화물, 2.5; 황산마그네슘, 1.2; 덱스트로스 10.0; 및 중탄산나트륨 24.8 조직을 37℃로 유지시키고 95%산소 및 5% 이산화탄소를 통해준다. 스텐레스 강철봉(바닥) 및 환상 백금선(상부)으로 이루어진 두개의 전극에 회장을 고정시킨다. Grass S44자극기로 극대전압 40V의 구형파(square wave) 펄스(0.1Hz)를 0.7msec지속시킨다. 조직을 적용장력 1g으로 대략 1시간 평형화시킨다. 둥장성 반응을 Beckman Dynograph에 기록한다.
안지오텐신 Ⅰ의 3 또는 4가지 농도에 대해 농도-반응곡선을 구한다. 이어서 조직을 A-58365인자(10-6내지 10-5M)와 평형화시키고 안지오텐신 Ⅰ의 농도-반응곡선을 재측정한다. 각 조직은 인자의 한가지 농도에 관한 것이다.
모든 경우에, 안지오텐신 Ⅰ에 대한 수축반응에서 현저한 변화가 나타났다. 기니아픽에서 ACE의 억제는 상경적이다. 상술한 시험에서 인자 A 및 B의 경우에 얻어진 데이타는 또한 인자 A 및 B가 아세틸콜린의 방출을 억제하거나 콜린효능 수용체를 차단하지 않는다는 것을 설명해준다. 시험관내 시스템에서, A-58365인자 A 및 B는 ACE억제에 대해 약리학적 특이성을 보인다.
본 발명의 A-58365인자는 혈압강하제로 유용한데, 포유류 조직에서 안지오텐신 Ⅰ의 승압제인 안지오텐신 Ⅱ로의 효소적 전환을 억제하는 능력을 갖고 있기 때문이다. 본 발명의 ACE억제 인자가 혈압을 낮추는 능력은 나트륨을 고갈시킨 쥐에서 인자 A를 사용하여 입증된다.
본 발명화합물은 고혈압 포유류에서 혈압을 낮추는데 유용하다. 인자 또는 그의 약학적으로 무독한 염은 각각 또는 조합을 이루어 투여될 수 있는데, 이를 들어 인자 A의 경우, 이를 단독으로 또는 인자 B와 함께 투여할 수 있다. 실제에 있어, A-58365인자 또는 그의 약학적으로 무독한 염을 경구, 근육내, 정맥내 또는 피하경로로 투여한다. 비경구 투여를 위해, A-58365인자 또는 그의 약학적으로 무독한 염을 생리학적으로 무독한 주사용 액체에 용해한다. 주사용수, 0.9% 생리식염수, 5% 글루코스 또는 다른 통상적 희석제 같은 적절한 생리학적 희석제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위해, A-58365인자 또는 그의 약학적으로 무독한 염을 캅셀제, 정제 또는 액제 현탁제로 제형화할 수 있다. A-58365인자 또는 그의 약학적으로 무독한 염은 체중 kg당 약 100mg 내지 2,000mg의 1일 용량을 1회 투여할 수 있다. 또는 1일 용량을 수회로 나누어 투여할 수도 있는데, 정확한 용법은 환자의 고혈압 정도 및 개인의 약물내성등과 같은 인자에 좌우된다.
본 발명에 따른 A-58365인자의 에스테르는 유리산과 비슷한 ACE억제활성을 갖는다. 인자의 아실옥시메틸에스테르뿐 아니라 인다닐 및 프탈리딜에스테르는 경구용 인자제형의 제조에 잠재적으로 유용한 프로(pro)-약물형태이다. 또한, C1-C6알킬디에스테르는 크로마토그래프 방법에 의한 인자의 분리 및 정제에 유용하다.
본 발명에 의해 제공되는 ACE억제인자는 액침호기성 발효조건하에 동화가능한 탄소, 질소 및 무기염원을 함유한 수성영양배지에서 스트렙토마이세스 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 ; KFCC-10050)을 배양시켜 제조한다. 발효에 사용되는 배양배지는 여러가지 일 수 있는데 미생물은 다양한 영양원으로부터 에너지를 이용할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 당류 및 전분을 포함한 여러가지의 탄수화물을 배양배지에 함유시켜 미생물의 탄소요구를 충족시킬 수 있다. 마찬가지로, 아미노산, 증류추출물, 육류, 펩톤 및 카제인 가수분해물 같은 여러가지 질소원을 배양배지에 가할 수 있다. ACE인자 생산의 경제성, 최적수율, 및 분리용이성을 고려할 때, 특정한 배양배지가 바람직하다. 예를 들어, 바람직한 탄소원중의 하나는 감자덱스트린인데, 글루코스 또는 프락토스 같은 다른 당류도 사용할 수 있다. 바람직한 질소원은 펩톤 및 카세인의 가수분해물이다. 통상, 미생물의 발효에서, 영양무기염류를 ACE인자 생성을 위해 배양배지에 첨가할 수 있다. 그런 무기염류는 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 포스페이트, 클로라이드, 카보네이트등의 이온을 생성할 수 있는 통상적 염을 포함한다. 미량원소 또한 발효배지에 가할 수 있다. 그러나 이들은 통상 배지에 가한 다른 성분에 포함된 양으로 충족된다.
A-58365인자를 제조하기 위해 에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)을 발효시킬 때, 코발트(Ⅱ) 이온 또는 다른 2가 양이온을 발효배지에 가한다. 염화코발트는 이가 코발트의 편리한 공급원이다. 코발트(Ⅱ) 이온같은 2가 양이온은 소량 가하는데, 예를 들어 배지 1l당 약 15mg의 염화코발트 6수화물을 가하면 충분하다.
에스. 크로모푸스커스에 의한 A-58365인자 A의 생성은 발효배지에 대한 프롤린 첨가로 크게 증대된다. 일반적으로, 발효육즙 1l당 약 1g 내지 약 6g의 프롤린이면 충분하다. 프롤린 외에도 배양배지에 리신, 바람직하게는 L-리신을 보충한 경우에는 A-58365인자 B의 수율이 증가되어 생성되는 인자중 가장 풍부한 인자가 된다. 인자 B의 생성을 위해 바람직하게는 배양배지 1l당 약 1g 내지 약 6g의 프롤린 및 약 1g 내지 약 3g의 리신을 보충한다.
A-58365 ACE억제인자 A은 액침호기성 발효조건하에 프롤린이 첨가된 수성영양 배양배지에서 에스.크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)을 배양하므로써 그 생성량을 놀라울 정도로 증가시킬 수 있다.
생산용 배지에 가할 수 있는 아미노산 프롤린은 D-프롤린, L-프롤린 또는 D, L-프롤린이다. 그중에서 L-프롤린이 바람직한데 D- 또는 D, L형 어느 것보다도 단가가 낮기 때문이다. 배지에 첨가하는데 사용되는 프롤린 또한 시판되는 단백가수분해물, 아미노산의 효소적 분해물 또는 다른 공급원의 한 성분일 수 있다.
본 공정을 수행함에 있어, 배양배지 1l당 약 1g 내지 약 6g의 프롤린을 사용한다. A-58365인자의 생성에 가장 만족스런 결과 및 경제성을 고려해, 배양배지 1l당 약 3g 내지 약 4g의 프롤린을 사용한다.
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050) 배양배지에 프롤린 또는 프롤린원을 가하면 발효로 생성되는 인자 A의 양은 적어도 10배 증가된다. 프롤린을 가하지 않고 수행된 에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098발효결과 여과육즙 ml당 약 1mcg이하의 A-58365인자 A가 생성되며, 본 발명에 따라 프롤린을 보강한 배양배지에서 발효시키면 여과한 발효육즙 ml당 약 10-12mcg의 인자 A가 생산된다.
프롤린을 보충하여 배양시킨 결과, A-58365인자 A가 주인자, 즉 가장 다량 생성되며, 인자 B 및 C가 부인자이다. 부인자인 A-58365 B 및 C도 본 발명의 개선된 공정에 의해 생성량이 증가되나, 생성된 인자 A와 양을 비교할 때 역시 부인자이다.
발효는 약 23℃ 내지 약 30℃에서 이루어질 수 있으며, 25℃에서 최고 수율이 얻어진다. 발효도중에 배지의 pH가 증가된다. 일반적으로, 육즙의 초기 pH는 약 7로 맞추는데, 최종 pH는 약 8 내지 8.3로 높아진다.
A-58365인자 B의 수율을 개선하기 위해, 액침호기성 발효조건하에 배지 l당 약 1g 내지 약 6g의 프롤린 및 약 1g 내지 약 3g의 리신을 첨가한 수성영양배지에서 신규 균주인 스트렙토마이세스 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)을 배양시킨다. 사용된 영양배지는 전술한 바와 동일한 탄소, 질소 및 무기염원을 함유하며, 이외에도 아미노산인 프롤린 및 리신을 함유한다.
본 공정에서, 발효는 약 25℃ 내지 약 35℃에서 이루어질 수 있으며, 약 30℃에서 발효시킨 경우 인자 B의 분석치가 최고에 이르므로 약 30℃가 바람직한 온도이다.
본 발명에서, 아미노산 프롤린 및 리신은 L-형, D-형 또는 D, L-형으로 이용될 수 있다. 프롤린 및 리신을 함유하는 단백가수분해물 및 효소적 분해물같은 아미노산의 다른 공급원을 배양배지에 가해 아미노산을 공급할 수 있다. 비용을 고려할 때, L-프롤린 및 L-리신이 바람직한 아미노산 형태이다. 두가지 아미노산인 프롤린 및 리신 모두 배양배지중에 존재해야 인자 B의 생산이 증대된다. 즉 프롤린만을 첨가하여 발효시키면 A-58365인자 A의 수율만이 놀라울 정도로 증가되며, 리신만을 첨가한 배지에서 발효시키면 두 인자 모두 그 수율에는 거의 변화가 없다.
바람직하게는, 본 공정에서 배양배지 l당 약 3g 내지 약 4g의 프롤린 및 약 2g의 리신을 사용한다.
본 공정에 의해 인자 B의 수율을 개선시킬 수 있게 되기 이전에는, 프롤린을 첨가한 에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098발효배지에서 발효시켜 약 10-12mcg/ml의 인자 A 및 약 2-3mcg/ml의 부인자 B를 생성하였다. A-58365인자 C는 인자 B보다도 적은양 생성되었다. 리신을 첨가하는 본 발명 공정에 따라 에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098을 배양시키면, 약 5mcg/ml의 인자 B가 생산되는 반면에 <약 1mcg/ml 내지 약 2mcg/ml의 인자 A가 생성된다.
따라서, 본 발명은 A-58365인자 B를 가장 풍부한 안지오텐신 전환요소 억제제로써 수득하게 되는 공정을 제공한다.
인자 B는 여과한 발효육즙으로부터 회수되어 후술된 분리공정에 의해 인자 A와 분리 및 정제된다.
어느 경우에나, 발효는 호기성 조건하에 이루어진다. 발효도중에 교반하면서 멸균공기를 발효매질에 통해준다. 가장 만족스런 결과를 위해, 발효매질중 용존산소량은 공기포화도의 약 30 내지 40%로 유지시켜야 한다.
소포제는 일반적으로 과도한 포말을 방지하는데 유용하며 실리콘 소포제 같은 통상 사용되는 소포제를 발효에 사용할 수 있다.
발효도중 ACE억제인자의 생성에 관해 때때로 육즙 분취액을 취해 고성능 액체 크로마토그래피 분석을 실시한다. 일반적으로 발효가 시작된지 약 70 내지 약 90시간 후 생성량이 최고에 이른다. 분석을 위해 고정상으로는 4mm×3mm μ Bondapak C18칼럼(waters Associates)을, 유동상으로는 아세토니트릴 : 포름산 : 물(6 : 0.3 : 93.7, V : V : V)을 사용하며, 유속은 2.5ml/분이다. 인자의 탐지는 파장 λexc=327nm, 및 370nm 방출차단필터를 이용하여 Schoeffel모델 FS 970 스펙트럼플루오로메터에 의한다.
발효를 수행함에 있어, 소량의 증식성 배지를 에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050) 동결건조펠렛으로 접종시켜 약 30℃로 배양하여, 충분한 증식이 이루어지면(이는 일반적으로 2일 정도가 소요된다), 증식성 배지 또는 그 일부를 사용하여 "범프(bump)"배지로 알려진 보다 큰 규모의 배지를 접종한다. "범프"배지는 대규모 발효탱크를 위한 다량의 접종물로 사용되는 중간-규모 배지이다. 일반적으로, "펌프"배지는 증식성 배지와 동일하거나 거의 비슷한 조성을 갖는다. 초기의 소-용적 증식성 배지는 미생물 배양에 사용하는 고영양 배지일 수 있다. 에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)이 만족스럽게 증식되는 적절한 증식성 배지는 트립티카제 대두육즙과 약 1% 글루코스로 이루어진다. 트립티카제 대두육즙은 카제인의 췌장분해물, 대두텝튼(대두의 분해물), 염화나트륨, 디포라슘 포스페이트 및 글루코스를 함유하는 시판 대두-카제인 분해물이다.
또는, 에스. 크로모푸스커스의 동결건조 펠렛을 처음에 한천 사면상에서 증식시킨 뒤, 이로부터 포자를 멸균조건하에 증식성 배지로 이식하고 이어서 증식시킨 증식성 배지를 상술한 바와 같이 중간규모 "범프"배지접종에 사용할 수도 있다.
본 발명의 ACE억제제 생산공정에 사용되는 미생물은 스트렙토마이세스 크로모푸스커스(Preobrashens-kaya, Blinov and Ryabova 1975)의 신규 균주로 확인되었다. (Pridham, Hessetine and Benedict, "A guide for the classification of Streptomyctes According to Selected Groups", Appl. Microbiol. 6 : 52-59(1957)).
에스, 크로모푸커스의 신규 균주는 기탁번호 NRRL 15098로 관계기관(Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center, Department of Agriculture, 1815 North Univerisity Street, Peoria, IL 61604)의 영구 콜렉션에 1982년 6월 23일자로 기탁되었으며 상기 기탁번호로 이용할 수 있다.
신규 균주를 선택해낸 모배양물은 남아메리카 브라질에서 채취한 토양샘플로부터 분리하였다.
다음 단락 및 표에는 표준방법으로 측정한 신규 균주의 계통학적 특성을 그와 유사한 스트렙토마이세스속의 공지된 계통학적 특성과 비교하여 기술하고 있다.
스트렙토마이세스종의 특성화 방법으로는 International Streptomyces Project(ISP)에서 권장한 방법을 따랐으며 이와 함께 몇가지 추가시험(Shirling, E.B. and Gottleb, D., 1966, "Methods of Characterization of Streptomyces Species." Int.J. Syst. Bacteriol. 16(3), 313-340)을 실시하였다.
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098의 배양특성
다음 표 1은 여러가지 배양배지상에서의 신규 균주의 증식을 설명하고 있다. 표의 색명은 ISCC NBS Centroid Color Charts, 표준샘플 No 2106(U.S. Department of Commerce, National Bureau of Stan-dards, 1958) ; Tresner, H.D. and Backus, E.J., 1956, "System of Color wheels for Streptomycete Taxonomy", Appl. Microbiol., 11, 335-338; Color Harmony Manual, 4th ed., Color Standards Department, Container Corporation of America, Illinois, (1958)을 참조하였다. 에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)은 요약해서, 포자괴의 색이 그레이(GY)계열에 속하는 풍부한 연속균사체를 생성한다. Tresner and Backus System에서 가장 근사한 색을 고른다면 2dc황색을 띤 회색 내지 2fe중간정도의 회색이다. ISCC-NBS시스템에서, 가장 적합한 색은 112, 밝은 올리브 그레이 및 93, 황색을 띤 회색이다. 이러한 배양상 특성은 효모-맥아즙 한천(ISP NO.2), 오우트밀한천(ISP NO.3), 글리세롤-아스파라긴 한천(ISP NO.5), 쟈페크 용액한천 및 토마토 페이스트 오우트밀 한천상에서 나타난다. 이러한 증식상태 및 색은 무기염류-전분한천(ISP NO.4)상에서 증식시킬 때 가장 명확히 관찰된다. 뒷면의 색은 황-갈색이며, 이 색은 pH에 의해 영향받지 않는다. ISP NO.5 배지에서는 연황색 색소가 생성되는데 그외의 배지상에서는 가용성 색소가 생성되지 않는다.
[표 1]
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)의 배양특성
Figure kpo00009
1/뒷면의 색을 나타내는데 사용된 숫자 및 문자는 ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106(U.S. Department of Commerce, National Bureau of Standards)의 색도를 참고하였다.
기중균사체의 색을 나타내는데 사용된 밑줄친 숫자 및 문자는 Tresner, H.D. and Backus, E.J. 1956, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy", Appl, Microbiol. 11 : 335-338을 참고하였다. (GY)는 회색계열을 나타낸다.
2/ISP=인터내셔날 스트렙토 마이세스 프로젝트 배지(International Streptomyces Project Media).
3/TPO=토마토 스페이스트 우오트밀한천.
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC 10050) 형태학적 특징
에스. 크로모푸스커스의 신규균주는 풍부하게 증식되고 비-세분성인, 단축성으로 분지된 균사체를 생성하며, 포자체는 4-5회전의 나선상 기중 균사상에 형성되고, 일부 나선은 포자체 말단에 매우 단단한 구(ball)를 생성한다. 이 구는 보속균체(sclerotio)로 잘못 판단할 수 있다. 포자는 장방향으로 표면에는 가시가 있다. 신규 균주는 Pridham등의 스피랄레스(S)절에 속한다(Pridham, T,G., Hesseltine, C.W., and Benedict. R.G., 1957, "A Guide for the Classification of Streptomycetes According to Selected Groups", Appl. Microbiol 6 : 52-79).
형태학적 특징은 광학현미경으로 조사하였으며, 포자표면 및 구조에 대해서는 스캐닝 전자현미경(SEM)을 사용하였다.
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)의 생리학적특징
에스. 크로모푸스커스 균주의 가수분해된 전세포를 분석하면 LL-디아미노피멜산의 존재를 알 수 있다. 메소이성체는 확인되지 않는다. 가수분해된 전 세포의 당류분석하에 글루코스, 만노스, 리보스 및 람노스의 존재를 확인하게 되며, 이러한 결과는 균주의 세포벽이 Ⅰ형 세포벽이며 당류 패턴에 어떤 특징도 보이지 않음을 보여주며 스트렙토마이세스속에 포함됨을 시사해 준다(Buchanan, R.E. and Gibbons, N.E. (eds) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, MD).
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)의 탄소이용패턴이 다음 표 2에 보여진다. 멸균탄소원을 가해 최종농도를 1.0퍼센트로 한 ISP염기성 배지를 사용하여 탄소이용도를 측정하였다. 배양온도는 30℃이며 14일 후에 결과를 기록하였다.
[표 2]
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)의 탄소이용도
Figure kpo00010
1/－=이용하지 못함 ＋=이용함 ±=확실치 않음
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)은 전분을 가수분해하고 탈자유를 부분적으로 가수분해한다. 탈지유상에 암갈색 증식환이 생성된다. 신규 균주는 젤라틴은 가수분해하지 못한다. ISP NO.8, 유기나이트레이트 육즙에서, 균주는 나이트레이트를 나이트라이트로 환원화지 못한다. 신규 균주는 7%까지의 염화나트륨에 내성을 보인다.
신규 균주는 약 15℃ 내지 약 40℃에서 증식한다.
[표 3]
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)의 멜라닌양 색소생성
Figure kpo00011
본 발명에 따른 A-58365-생성미생물의 형태학적, 배양 및 생리학적 특징을 유사종의 공지기술내용고 비교할 때, 이는 에스. 크로모푸스커스와 가장 유사하다. (Shirling, E.B. and Gottlieb, D, 1968, "Coo-perative, Description of type Cultures of Streptomyces", Int.J. Syst. Bacteriol, 18(4); 279-392).
그러나, A-58365 생성미생물은 공지된 종과는 차이가 있으므로 그의 신규 균주로 분류한다. 공지된 에스. 크로모푸스커스 균주는 본 발명에 의해 제공되는 A-58365 균주와 많은 유사점을 갖고 있으나, 당류인 라피노스를 이용하지 못하며 ISP No.7 한천상에서 멜라닌 양 색소를 생성치 못하는 점에서 명백히 구별 지어진다.
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)은 본 명세서에서 기술된 ACE 억제제를 생성하는 이외에도 항생물질 아주카마이신, AM 1042 및 메틸레노마이신일수 있는 다른 항생물질 대사산물을 소량 생산한다. 아주카마이신은 오무라의 미합중국특허 제4,226879호에 기술되었으며 스트렙토마이세스 노도수스 NRRL 8185에 의해 생성된다. 배양상 특성에 있어 에스. 노도수스는 에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)과 특색있는 뒷면과 가용성 색소 생성에 있어 차이가 난다. 형태학적 차이는 포자체 생성이 보잘것 없으며 포자쇄가 짧고, 포자표면이 매끈한 점이다. 에스. 노도수스는 본 발명의 신규 균주와 ISP No. 1 육즙 중에서 또는 ISP No. 6 및 ISP No. 7 한천 사면상에서 멜라닌양 색소를 생성치 않는 점에서 생리학적으로 차이가 난다. 이러한 차이는 에스. 노도수스가 본 명세서에서 기술된 미생물과는 별개의 종이라는 것을 보여준다.
에스. 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC-10050)의 배양에서 생성되는 다른 항생물질 대사산물은 메틸레노마이신으로 추정된다. 스트렙토마이세스 바이올라세오루버 2416에 의해 생성됨이 이미 보고된 이 항생물질은 Haneishi, T, et aI, J. Antibiotics, 27, 386-392(1974)에 기술되었다.
본 발명은 또한 전술한 배양상, 형태학적 및 특생리학적 특성을 보이는 이외에 본 명세서에서 기술된 ACE 억제제를 생성하는 에스, 크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 KFCC-10050)의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다.
A-58365인자 A 및 B는 발효배지로부터 분리하여 크로마토그래피에 의해 단리시킨다. 인자의 분리 및 단리는 후술한 바와 같이 이루어진다. 전 발효육즙을 대략 pH2.0으로 산성화하여 여과하여 균사체 및 다른 불용성 물질을 분리한다. 바람직하게는, 필터 에이드를 사용하여 여과속도를 증가시킨다. 여과한뒤, 여과한 육즙의 pH를 수산화나트륨 같은 염기에 의해 대략 pH7.0으로 조절한다. 불활성의 중성불순을 제거하기 위해, 중성인 여과육즙을 Diaion HP-20(Mitsubishi chemical Co.) 또는 XAD 수지 (Rohm and Hass, Philadelphia PA) 같은 폴리스티렌 수지등의 비작용성 풀리머성망상수지로 처리한다. 중성 육즙을 수지가 충진된 칼럼에 통과시키거나, 적절한 용기내에 함유된 중성 육즙에 수지를 가해 교반하여, 불활성 불순물을 흡착시킨다. 이러한 예비정제 과정에서, 사용된 수지의 양은 육즙 용적의 약
Figure kpo00012
에 해당한다. 바람직하게는 수지를 중성육즙과 약 2시간 교반한뒤 여과하여 분리시킨다. 수지-처리육즙의 pH를 염화수소산 같은 산으로 2.0 정도로 낮추고, 산성화 육즙을 냉각시켜 여과하여 불활성 침전물을 제거한다.
이어서 정제한 산성 육즙을 비작용성수지, 바람직하게는 Diaion HP-20상에서 크로마토그래프한다. 산성육즙을 HP-20 수지가 충진된 칼럼상에 붓고 용출물은 폐기한다. 칼럼을 회산, 바람직하게는 0.3% 수성 포름산으로 세척한뒤, 물 : 포름산(99.7 : 0.3% V/V)에서 아세토니트릴 : 물포름산(20 : 79.7 : 0.3, % V/V)로 구배용출시키면 A-58365인자가 용출된다. 여러분획이 수집되는데, 인자 A는 초기 활성 분획으로 용출되며인자 B 및 C는 후기 활성분획으로 용출된다. 크로마토그래피의 진행은 전술된 HPLC분석으로 추적한다.
A-58365인자 A를 함유하는 분획을 모아 증발농축시킨다. 농축물을 Dowex 50W 수지(Dow Chemical Co.) 등의 폴리스티렌설폰산 수지(신사이클) 같은 산성 수지에 적용시킨다. 인자 A는 탈이온수에 의해 수지로부터 여러 분획에 걸쳐 씻겨져 나온다. 인자 A를 함유하는 분획을 합해 증발 농축시킨다.
인자 A의 산성(pH 2-3)농축물을 여과하여 옥타데실실란화 Whatman LP-1 또는 Waters' Assoc. C18실리카겔상 역상 제조용 HPLC에 적용한다. 칼럼을 포름산수용액(0.3 : 99.7% V/V), 아세토니트릴 : 포름산 : 물(1.0 : 0.3 : 98.7% V/V)및 아세토니트릴 : 포름산 : 물(2.5 : 0.3 : 92.7% V/V)의 순서로 용출시킨다. 인자 A를 함유하는 분획을 합해증발 농축시킨다.
HPLC 칼럼으로부터 수득한 인자 A 농축물을 클로라이드 사이클의 100-200메쉬 BioRex 5수지(BioRad Laboratories, Richmond, CA)와 같은 음이온 교환 수지상에 크로마토그래프한다. 약 0.2M 내지 약 0.5M의 염화나트륨으로 칼럼을 용출시키고 순수한 인자 A를 함유하는 분획을 합한다. 모든 분획을 1N 염산등의 산으로 pH 2.2-2.5로 산성화시켜 Diaion HH-20 수지를 통과시켜 음이온 교환크로마토그래피로부터의 분획에 존재하던 염을 분리한다. 사용하기 전에 HP-20 수지는 0.01N 염산으로 처리한다. 인자 A는 칼럼을 회산(pH 2.3)물 및 수성아세토니트릴 (15 : 85% V/V)로 세척하므로써 용출된다. 인자 A를 함유하는 분획을 모아 증발농축시키고, 농축물을 동결 건조하여 인자 A를 무정형 백색분말로 생성한다.
예비 정제한 육즙의 HP-20 크로마토그래피로부터 구배 용출시켜 수득한 인자 B 및 C를 함유하는 분획을 합해 증발 농축시켜 소용적이 되도록 한다. 인자 B 또는 C의 농축물을 Dowex 50W(H+)(Dow Chemical Co.) 같은 폴리스티렌폴리스티렌폴리설폰산 수지상에서 크로마토그래피한다. 인자 B 또는 C는 탈이온수에 의해 수지로부터 씻겨나온다. 인자 B를 함유하는 분획을 합해 농축시킨다. 마찬가지로 인자 C를 함유하는 분획을 합해 농축시킨다.
인자 B 및 C의 농축물을 C18실리카겔(예, 옥타데실릴란화 와트만 LP-1 실리카겔)을 사용한 역상 HPLC로 각각 정제한다. 인자 B는 포름산 : 물(0.3 : 99.7용량%), 아세토니트릴 : 프롬산 : 물(6.0 : 0.3 : 93.7%) 및 아세토니트릴 : 포름산 : 물(15.0 : 0.3 : 84.7용량%)의 순서로 용출시킨다. 인자 C는 유사한 용매계를 사용해 용출시킬수 있는데 단 용매 혼합물중 아세토니트릴의 농도가 보다 높다. 활성분획을 합해 농축시킨다.
인자 B 및 C의 농축물을 인자 A에 관해 상술한 과정에 따라 더 정제할 수 있다. 예를들어 각 농축물을 음이온 교환수지상에서 크로마토그래프하고 용출물을 산성화하여 비작용성 수지상에서 탈염화시키고, 탈염화용출물을 동결 건조시킨다.
인자 A는 인자 B 및 C 보다 다량생성되며 본 발명의 바람직한 ACE 억제제이다. 인자 B 및 C중 인자 B가 더 다량 생성된다.
언급한 바와 같이 ACE 억제인자와 더불어, 항생물질 아주카마시신 및 다른 항생물질 대사산물(메틸레노마이신으로 추정) 이 소량 생산된다. A-58365인자의분리 및 정제중에 항생물질 대사산물은 손실된다.
다음비-제한 실시예는 본 발명을 더 상세히 설명한다.
[실시예 1]
A-58365 인자의 생성 및 분리 에스.
크로모푸스커스 NRRL 15098(기탁번호 : KFCC 10050)의 동결건조 펠렛을 사용하여 멸균 증식성 배지인 1% 글루코스를 함유하는 3% 트립티카제 대두 육즙 50ml를 접종한다. 접종 배지를 30℃에서 48시간동안 진탕 배양시킨다. 이 증식성 배지를 사용하여 다음 방법으로 범프(bump) 배지를 접종시킨다. 각각 1% 글루코스를 함유하는 3% 트립티카제 대두육즙 400ml가 담긴 2l용 플라스크 두개를 각각 10ml를 증식성 배지로 접종한다. 범프 배지를 30℃에서 24시간 배양한다.
두가지 범프 배양물을 이용하여 다음 조성의 생산용 배지 100l를 접종한다.
Figure kpo00013
탈이온수 적당량을 가해 100l로 한다.
1/OM 펩톤은 가용성 육류 펩톤 이다(Amber Laboratories, Juneau,.WI).
2/N-Z 아민 A는 카세인의 효소적 가수분해물이다. (Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ)
배지를 멸균하기 전에 5N 수산화나트륨으로 pH7.0으로 맞춘다. 멸균후, 배지를 상술한 펌프배지로 접종하고 생산용 발효 공정을 25℃에서 90시간 진행시킨다. 발효 공정중에 배지를 교반하면서 멸균 공기를 통해주는 데 배지의 용존 산소량이 공기 포화도의 약 30 내지 40%로 유지되도록하는 속도로 통해준다.
배지의 pH는 발효가 진행되면서 상승하여 최종 pH는 8.3이 된다.
발효도중 배지의 A-58365인자 함량을 전술한 HPLC 시스템에 의해 분석한다. Schoeffel Model FS 970분광 형광 광도계를 이용하여 파장 λexc=327nm 에서 370nm 차단 필터를 사용하여 형광으로 인자를 확인한다. 생산용 배지의 분석결과 발효시작 90 시간후에는 인자의 함량이 약 11.5mcg/ml이다.
상술한 바와 같이 하여 수득한 100l 발효액 세가지를 발효기에서 별도로 농염산에 의해 pH 2.0으로 산성화한다. 산성화한 전 육즙을 합해 2% 하이플로필터 에이드에 의해 여과한다. 여과한 육즙의 pH를 5N 수산화나트륨으로 7.0으로 조절한다. 중성육즙에 비작용성수지 Diaion HP-20을 여과육즙 용적의
Figure kpo00014
에 해당하는 양 가하고 수지-육즙 혼합물을 2시간 교반한다. 육즙을 수지로부터 분리하여 5N 염산으로 pH 2.0으로 산성화한다. 산성화육즙을 냉각시켜 여과하여 불활성 침전물을 분리해낸다. 산성화 육즙을 20l의 Diaion HP 20을 함유하는 20'×4" 내경의 칼럼에 적용하고 유출물은 버린다. 칼럼을 60l의 0.3% 수성포름산으로 세척하고 용출물은 버린다. A-58365인자를 물-포름산(99.7 : 0.3 V : V)에서 아세토니트릴 물-포름산(20 : 79.7 : 0.3, V : V : V)의 구배로 100l를 용출시켜 2l 분획을수집한다. 인자 A를 함유하는 분획 27 내지 48을 합해 진공 농축시켜 750ml로 한다. 201의 아세토니트릴 물-포름산(20 : 79.7 : 0.3)으로 계속 용출시킨다. 인자 B를 함유하는 분획 56 내지 63을 합해 350ml 용적으로 응축시킨다.
인자 A를 함유하는 농축물을 9.3cm×80cm(5l) 크기의 Dowex 50w 2(H+) 칼럼에 적용하고 17l의 탈이온수로 칼럼을 용출시킨다. 용출용적 9 내지 15l 중 인자 A를 함유하는 1-l분획을 합해 약 200ml로 농축시킨다.
인자 A 농축물 (pH 2-3)을 여과하여 약 2.5kg(4-4.5l)의 옥타데실실란화 whatman LP-1 실리카겔을 함유하는 8cm×1m 칼럼 (Jobin Yvon Chromatospac Prep instrument) 상 역상 HPLC로 크로마토그래프한다. 칼럼은 2l의 포름산-물(0.3 : 99.7, V : V), 5l의 아세토니트릴-포름산-물(1.0 : 0.3 : 98.7 V : V : V), 및 20l의 아세토니트릴-포름산-물(2.5 : 0.3 : 97.2, V : V : V)의 순서로 용출시킨다. 500ml 용적으로 분획을 모으고, 인자 A를 함유하는 분획 32 내지 44를 모아 증발농축시켜 200ml 용적이 되도록한다.
HPLC로부터 얻은 인자 A 농축물을 2.5×30cm(180ml), 100-200 메쉬 BioRex 5(CI-) 수지 (BioRad Laboratories Richmond, CA) 칼럼에 적용한다. 수지를 탈이온수로 세척하고, 세척액 및 유출은 모두 버린다. 칼럼을 400ml의 0.20M 염화나트륨에 이어 2200ml의 0.35M 염화나트륨으로 용출시킨다. 20ml용적분획을 모으고 순수한 인자 A를 함유하는 분획 106 내지 140을 합한다. 합한 분획의 pH를 1N 염산으로 2.3으로 조절하고 이를 0.01N 염산중 2.8cm×19cm(120ml)의 Diaion HP 20 칼럼에 적용한다. 칼럼을 희염산에 의해 pH2.3으로 산성화한 탈이온수 100ml, 이어서 220ml의 탈이온수(pH 5.9), 340ml의 아세토니트릴-물(15 : 85, V : V) 순서로 용출시킨다. 분획의 총 용적이 약 180ml에 이르면, 이 분획을 합해 증발 농축시키고 동결 건조하여 1.31g의 순수한 인자 A를생성한다.
상술한 바와 같이 Diaion HP-20 칼럼으로부터 용출시킨 B인자를 함유하는 분획을 합해 농축시킨 농축물을 9.3cm×80cm(5l)의 Dowex 50w×2 (H+사이클)수지 컬럼에 적용하고, 32l의 탈이온수로 용출시키는데 10 내지 14l의 용출액으로부터 인자 B를 1l 분획으로 수집한다. 활성 분획을 합해 약 250ml용적으로 농축시킨다.
A-58365인자 B를 함유하는 농축물을 인자 A의 정제에 관해 상술한 바와 동일하게 역상 HPLC 처리한다. 칼럼을 먼저 2l의 포름산-물(0.3 : 99.7 V/V), 이어서 아세토니트릴-포름산-물(6.0 : 0.3 : 93.7 V/V), 아세토니트릴-포름산-물(15.0 : 0.3 : 84.7% V/V)의 순서로 용출시킨다. 약 500ml 분획을 수집한다. 인자 B를 함유하는 분획 24를 증발 농축시켜 100ml 용적이 되도록 한다.
인자 B의 농축물을 다음과 같이 하여 음이온 교환 수지상에서 더 정제한다. BioRex 5(Cl-)음이온 교환수지를 충진한 2.0cm 내경×25cm 칼럼에 농축물을 채우고, 200ml의 0.2M 염화나트륨, 1600ml의 0.3M 염화나트륨의 순서로 용출시킨다. 10ml 분획을 수집하고 분획 193-210을 합한다. 그 pH를 1N 염산에 의해 pH 2.3으로 조절하고 이를 0.01N 염산중 8mm(내경)×20cm(10ml)의 Diaion HP-20 칼럼에 적용한다. 칼럼을 먼저 300ml의 탈이온수(pH 2.3으로 조절됨), 이어서 14ml의 탈이온수(pH 5.9)로 세척하고, 용출물 및 세척액을 버리고, 인자 B는 44ml의 아세토니트릴-물(15 : 85% V/V)로 용출시킨다. 2ml 분획을 수집해, 분획 8 내지 11을 합해 1ml 용적으로 농축시키고, 농축물을 동결 건조시켜 2.9mg의 순수한인자 B를 생성한다.
[실시예 2]
플로린 및 리신을 보충한 배양배지를 사용한 A-58365인자 A 및 B의 생산
에스. 크루모푸스커스 NRRL15098(기탁번호 : KFCC-10050)을 실시예 1로 기술된 바와 같이 제조한 증식성 배지에서 실시예 1과 같은 방법으로 배양시킨다. 그 배양물을 다음 조성의 생산용 배지에 접종한다.
Figure kpo00015
탈이온수 적당량을 가해 1000ml로 한다.
1/ 카세인의 효소적 가수분해물, Humko Sheffield, Chemical, Lyndhurst, NJ.
배지를 멸균하기 전에 배지의 pH를 5N 수산화나트륨으로 7.0으로 조절하고, 배지를 멸균한후, 접종시켜 30℃에서 96시간배양한다.
전술한 바와 같은 HPLC계를 이용하여발효 도중의 배지중 인자함량을 분석한다.
여과한 발효 육즙으로부터 인자 B를 회수하여 실시예 1에 기술된 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제한다.
[실시예 3]
A-58365인자 A 디메틸에스테르 방법 A 7.5ml의 메틸알콜중 319mg의 A-58365인자 A의 용액에 4중량%의 염화수소를 함유하는 2.5ml의 메틸알콜을 가하고 이를 실온에서 140분 교반한다. 에스테르화 혼합물을 증발건고시키고 그 잔사를 약 20 내지 25ml의 물에 용해한다. 용액의 pH를 6.8로 조절하고 실온에서 밤새방치한 다음 수용액의 pH를 6.2에서 7.1로 조절하고 매회 100ml의 메틸렌클로라이드로 3회 추출한다. 추출물을 합해 이로부터 약 151mg의 인자 A 디메틸에스테르를 수득한다.
방법 B
삼불화붕소의 메틸알콜용액(무수메틸알콜 중 14% BF3, Pierce Chemical Co., Rockville,IL) 4.5ml에 35mg의 인자 A를 용해한 용액을 교반하면서 약 65℃로 2.5시간 가열한다. 반응중에 공기를 반응용기로부터 구축시킨다. 반응 혼합물을 증발 농축시켜 약 1.5ml 용적으로 하고, 이 농축물을 10ml의 물에 용해한다. 수용액을 동 용적의 메틸렌 클로라이드로 5회 추출하고, 추출물을 합해 5ml의 물로 세척하고 황산나트륨상에서 탈수시켜 여과하고 증발 건고시켜 24.4mg의 인자 A 디메틸에스테르를 생성한다.
[실시예 4]
A-58365인자 A의 디에틸에스테르, 모노에틸에스테르 15ml의 무수 에틸알콜에 507mg의 안자 A를 용해한 용액을 빙욕에서 냉각하고 3중량%의 염화수소를 함유한 10ml의 무수 에틸알콜을 교반하며 가한다. 반응플라스크를 질소로 플러시시키고, 밀폐시켜 실온에 정치시킨다. 때때로 반응 혼합물로부터 소량을 분취하여 HPLC 분석으로 에스테르화의 진행을 조사한다. 8시간후에 반응 혼합물을 50ml의 물로 희석하고 희수산화나트륨에 의해 수용액의 pH를 6.9로 조절한다. 용액을 증발시켜 에틸알콜을 제거하고 수성 농축물을 물로 40ml로 희석하고 희 수산화나트륨으로 처리하여 pH 7.09로 조절한다. 이어서 매회 50ml의 메틸렌 클로라이드로 4회 추출하고 추출물을 합해 20ml의 물로 세척하여 황산나트륨 상에서 탈수 시키고 진공에서 증발 건고시켜 222mg의 인자 A 디에틸에스테르를 생성한다.
디에스테르의 상술한 추출 과정에서 남겨둔 수층의 pH를 염산에 의해 1.95로 조절하고 매회 50ml의 메틸렌 클로라이드로 5회 추출한다. 추출물을 합해 희산으로 세척하여 보류해 둔다. 산성수층을 매회 50ml의 에틸아세테이트로 4회 추출하고, 추출물을 합해 희산으로 세척한다. 에틸 아세테이트 추출물 및 메틸렌 클로라이트 추출물을 합해 황산나트륨 상에서 탈수하여 증발 건고시킨다. 이로부터 인자 A의 모노에틸에스테르의 혼합물 257mg을 수득한다. 분석용 HPLC 및 nmr(360MHz)에 의하여 모노에틸 에스테르의 9 : 1 혼합물이다.

Claims (9)

  1. 스트렙토마이세스 크로모푸스커스 NRRL 15098 (기탁번호 : KFCC-10050)을 액침 호기성 발효조건하에 탄소, 질소 및 무기염의 동화원을 함유한 영양배지 중에서 배양함을 특징으로하여 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 그의 약학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.
    Figure kpo00016
    상기식에서, n은 1 또는 2이며, R 및 R1은 같거나 다르며, 각각 수소, C1-C6알킬, 인단-5-일, 프탈리딜, 또는 다음 일반식의 아실옥시 메틸그룹을 나타내며
    Figure kpo00017
    여기서 R2는 C1-C4알킬, 페닐, 할로페닐 또는 메틸페닐이다.
  2. 제1항에 있어서, R 및 R1이 제1항에서 정의된 바와 같은 일반식(Ⅱ)의 화합물 또는 그의 약학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.
    Figure kpo00018
  3. 제1항에 있어서, 구조식(Ⅲ)의 A-58365 인자 A 또는 그의 약학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.
    Figure kpo00019
  4. 제1항에 있어서, R 및 R1이 제1항에서 정의된 바와 같은 일반식(Ⅳ)의 화합물 또는 그의 약학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.
    Figure kpo00020
  5. 제1항에 있어서, 구조식(Ⅴ)의 A-58365 인자 B 또는 그의 약학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.
    Figure kpo00021
  6. 제1항에 있어서, (a)분자량이 295이며 (b) 장 탈착 질량스펙트럼에서 m/e 295[M+]를 보이고, (c) C14H17NO6이란 실험식으로 나타내지며, (d) 6% 아세토니트릴, 0.3% 포름산 및 93.7%물을 유동상으로 사용한 역상 고성능 액체 크로마토그래프에서 체류시간이 약 18.2분인 A-58365인자 C 또는 그의 약학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항의 어느 하나에 있어서, 배지 1l당 약 1 내지 6g의 프롤린을 배지에 첨가함을 특징으로 하여 A-58365인자 A를 제조하는 방법.
  8. 제1항, 제4항 또는 제5항의 어느 하나에 있어서, 배지 1l당 약 1 내지 6g의 프롤린 및 1 내지3g의 리신을 첨가함을 특징으로하여 A-58365인자 B를 제조하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항의 어느 하나에 있어서, 계속하여 인자 A, 인자 B, 또는 인자 C를 분리하고, 임의로는 생성물을 에스테르화하고/하거나 염으로 전환시키는 방법.
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