CZ87993A3 - aPTT DETERMINATION AGENT - Google Patents

Description

(57) Iniciátor vnitřního srážení krve a činidlo pro stanovení aktivované parciální tromboplastinové doby (a PTT) krve nebo krevních derivátů obsahuje směs sulfatidů a pevné látky aktivátoru, výhodně kaolinu a dále fosfolipidy, které mohou být ve standardizované směsi. Činidlo může obsahovat látku, potlačující oxidaci, látku zlepšující citlivost, chromogenní substrát pro fotometrické stanovení doby srážení, dále stabilizátory, např. albumin a nebo pufrovací substance. Způsob výroby činidla spočívá v tom, že se sulfatidy ve vodné suspenzi pevné látky - aktivátoru smísí s fosfolipidy, popřípadě dalšími látkami a popřípadě se lyofiluzují. Způsob stanovení a PTT vzorků krve a krevních derivátů spočívá v tom, že se vzorek uvede do kontaktu s činidly, po stanovené době se přidají ionty vápníku a stanoví se doba srážení.

Ή ίΠ ~ 13

advokát ,20 00 PRAHA 2, Hálkova 2

fs«

Činidlo pro stanovení áPTT

O o

'O* o

Oblast techniky

Vynález se týká iniciátoru vnitřního srážení, činidla pro stanovení aktivované parciální tromboplastinové doby (aPTT) jakož i způsobu výroby tohoto činidla popř· stanovení aPTT*

Dosavadní stav- techniky

Aktivovaná parciální tromboplastinová doba vzorku plasmy slouží jako sereening-test pro celkové zjištění aktivit srážecích faktorů, vnitřního srážení. Poruchy v průběhu srážení podmiňují doby sráženi, které leží mimo normální oblasti. Prodloužená áPTT ták k ní dochází u hemofilie A, manifestuje např. nedostatek srážecího faktoru VIII· Navia se aPTT testt často provádí při sledování heparinové terapie*

Činidlo pro stanovení aPTT obsahuje aktivátor* pro iniciaci vnitřního srážení až po tvorbu aktivovaného faktoru IX.

Dále budou potřebné pro aktivací faktoru X a protrombinu fosfolipidý, proto jsou tyto popřípadě obsaženy v aPTT-činidle» Činidlo se uvede do kontaktu: se vzorkem plasmy, kam se přidá po definovaném, co možná nejkratším čase vápník a měří se doba až do vytvoření fibrinovéhc shluku* ^iMa testovací systém a PTT je kladeno mnoho požadevků*

Pro rutinní pokusy je jednodluché zacházení s aPTT-činidlem nezbytným předpokladem. Rovněž stabilita obsažených látek musí být velmi vysoká, aby byla zajištěna konstantní doba srážení během, delšího časového období. To umožňuje také nenákladné použití činidla. Pro aPTT jako celkový testáké nutná vhodná citlivost ke všem zahrnutým parametrům.

-2Běžnó činidla pro stanoveni aPTT obsahují jako iniciátor· vnitřního srážení povrchově aktivní pevnou látku· Použitím povrchově aktivní matrice* se nejprve aktivuje řnk-. tor* XII srovnatelně s fyziologickými podmínkami. Jako pevná* látky-aktivátory se používají například: kaolit, oelit a sklo. Kaolin je na trhu dostupný např. v reagenciích pro stanovení aPTT jako suspenze (Pathromtin®, fa Behrlngerwerke (1990) nebo jako PTT reagens, fa Boehringer Mannheim (1986)).

Jako fosfolipiď se používá, lyafilizováný lipiďový extrakt z lidské placenty popř. lyofilizovaný kefalin. Fosfollpidy se však přimíchávají teprve po provedení stanovení s kaolinem k činidlu: připravenému k použití. Oddělené skladování kaolinu a fosfolipidů. je potřebné zejména ze stabilizačních důvodů.

^řři lyofilizaci- lipidů kaolinem se lipidy- z větší části inaktivují. Dochází tak nepř. při výrobě PTT-IMMUNO (fa Immuno) při společné lyofilizaci kaolinu a fosfolipiďů (extrahovaných z mozku prasete) ke ztrátě až 50 % aktivity fosfolipidů.

XLternativně k pevným látkám-aktivátorům je možno také použít kapalné aktivátory jako je kyselina ellagová a její deriváty nebo rozpuštěné sulfatidy. Citlivost testu na heparin za přítomnosti kapalných aktivátorů je však zhoršena a byly navrženy různé přísady pro zlepšení citlivosti. Podle WO 91/16453 obsahuje činidlo na bázi kyseliny ellagové citlivá na heparin jako přísadu dextraksulfát.

Nevýhodou kaolinu popřípadě pevných látek-aktivátorů obecně a kyseliny ellagové popř. jejích derivátů je dlouhá doba aktivace první fáze vnitřního srážení, čímž je pro aktivaci nutná relativně dlouhá inkubační doba nejméně 4 minut. •Jalší nevýhodou je relativně dlouhá doba srážení za přítomnosti

-3kaolinu. Vyšší koncentrace kaolinu v činidle však může dobu aktivace zkrátit. Kaolin, který se usazuje ze suspenze může ale vést. k prodloužené době! srážení popř. k chybným výsledkům při stanovení bodu srážení pomocí běžného koagulometru. Je nutno snažit se o to, aby koncentrace pevné látjpy-aktivátoru byla udržována oo nejnižšl. Podstata vynálezu úkolem, vynálezu je poskytnout standardizované činidlo s vysokou stabilitou pro stanoveni aPTT, se kterým je jednoduché? zacházeni a které je nenákladné a lze jeho pomocí dosáhnout krátkých aktivačních dob jakož i vysoké citlivosti k jednotlivým faktorům srážecí kaskády* lišení tohoto úkolu je podle vynálezu umožněno; iniciátorem vnitřního srážení krve?, plasmy nehet krevních derivátů, který obsahujme směs sulfatidů a pevné látky-aktivátoru, výhodně kaolinu.

Činidlo podle vynálezu obsahuje jako iniciátor vnitřního srážení směs sulfatidu (např. od fy Pentapharm) a pevné látky-aktivátoru. Dále jsou v něm obsaženy fosfolipidy. Jen velmi krátká doba aktivace^ které je zaznamenána při použití sulfatidů k aktivaci faktoru XII o něco prodlouží. Použitím činidla podle vynálezu se ták umožní krátká inkubační doba pro předběžné zpracování při rutinních pokusech. Současně se ale také zlepší použitím pevné látky-aktivátoru citlivost k heparinu.

Použití iniciátoru podle předloženého vynálezu v aPTT činidle umožňuje také překvapující kombinaci výhod obou jednotlivých aktivátorů, ale ne jejich nevýhoď.

-4Toto nebylo předpokládáno. Dříve se předpokládalo,že kombinace sulfatidu s kaolinem jako iniciátor vnitřního srážení v činidle:, vede ke snížení aktivity. Podle dosavadního mínění odborníků,že by mohly vznikat obtíže při kombinaci aktivátorů s různým reakčním mechanismem, bylo překvapujíqí, že činidlo podle vynálezu je dobře standardizovatelné. Toto je předpoklad pro vysokou reprodukovatelnost způsobu stanovení ·

V činidle podle vynálezu se udržuje nízké množství kaolinu· Zabrání se zvýšenému usazování kaolinu a odstraňují se těžkosti v provozu detekčních přístrojů·.

Iniciátor podle vynálezui může být bez obtíží lyofilizován spolu s fosfolipidy na nenákladné činidlo· Případné negativní vedlejší působení jednotlivých komponent je bezvýznamné ·

Vynález, se tak také týká činidla pro stanovení aPTT v krvi, plasmě nebo krevních derivátech,které se vyznačuje tím, že obsahuje směs sulfatidů. a pevné látky-aktivátoru, výhodné kaolinu, jako iniciátor vnitřního srážení a dále fosfolipidy·

Koncentrace kaolinu popř· sulfatidů v činidle činí pro kaolin mezi 0,1 a 0,6 % hmotn·, výhodné 0,1 až 0,3 % hmotn· a pro sulfatidy 0,001 až 0,03 % hmotn·, výhodně 0,002 až 0,01 % hmotn·

Činidlo obsahuje výhodně chemicky čisté fosfolipidy ve standardizované směsí. Ukázalo se, že se tím dosáhne neočekávaně vysoké reprolúkovatelnosti zkušení ho postupu. Směs fosfolipidů obsahuje například fosf atidyl šeřin, fosfatidylcholin a cholesterol.

Směs se výhodně skládá z 5 až 50 % fosfatidylserinu, 15 až 60 % fosfatidylcholinu, 1 5 až 60 % fosf atidylethanol·

-5aminu, O až 20 % oholeaterolu a 5 až 20 % fosf atidinové kyseliny, vztaženo na celkový obsah fosfolipidů. Jako. standardizovaná směs se například, používá 0,2 mg fosfatidylserinu,

0,85 mg fosfatidylcholinu, 0,65 mg fosfatidylethanolaminu,

0,15 mg cholesterolu a 0,15 mg kyseliny fosfatidinové^ na ml, popřípadě ředěná·

Fosfolipidy se výhodně přečistí, takže nežádoucí srážecí reakce, ke kterým by mohlo docházet za přítomnosti polybrenu, se vyloučí»

Výhodná forma provedení činidla se vyznačuje tím, že: obsahuje dalií látku potlačující oxidaci, a látku zlepšující citlivost. Jako látky, potlačující oxidaci pro zvýšení doby skladovatelnosti činidla v lyofilizovaném nebo kapalném stavu se například! používají! cystein, močovina, vitamin lf nebavit amin E. Přísady jako soli alkalických kovů, popřípadě spolu s aminokyselinami, zvyšují citlivost testu k jednotlivým faktorům» Ukázalo se, že činidlo, obsahujíc! chlorid česný (5 až 25 mg/ml.) a arginin (2,5 až 20 mg/ml), výhodně 16,8 mg CsCl/ml a 10,5 mg argininu/ml, je po odpovídajícím zředění zvláště vhodné pro stanoveni aPTT vzorku plasmy a nedostatkem jednotlivých faktorů (faktor VIII).

alší výhodná forma provedení činidla se vyznačuje tím, že obsahuje další chromogenní substrát, díky kterému je popřípadě možno stanovit dobu srážení fotometricky vývojem zabarvení· Zhodnoceni konečného produktu je ale také možná fotorné trickým stanovením změny propustnosti světla·

Výhodně obsahuje činidlo dále stabilizátory, výhodně albumin a/nebo pufrovací substance.

—é—

Způsob výroby tohoto činidla je jednoduchý· Sulfatidy se smísí ve vodné suspenzi pevní látky-aktivátoru s fosfolipidy a popřípadě s dalšími, přísadami a popřípadě se lyofilizují.

Výroba činidla se ale také může provádět; tak, že se sulfatidy, pevná látka-aktivátor a fosfolipidy, popřípadě po lyofilizaci, popřípadě spolu s dalšími přísadami smísí v pevném stavu·

Činidlo podle vynálezu je vhodné i pro sledování heparinové terapie jakož i pro- atanovenl jednotlivých faktorů i srážecích faktorů popř. inhibitorů; vnitřního srážení·

Vynález: se dále týká způsobu stanovení parciální tromboplastinové doby (aPTT) vzorku krve, plasmy nebo krevních derivátů, který se vyznačuje tím,že se vzorek uvede do kon>taktu s činidlem podle vynálezu;, po předem stanovené době’ aktivace se př^ají vápníkové ionty a stanová se doba srážení·

Přídavkem substanci neutralizujících heparin může být nedostatek: srážecích faktorů také stanoven v heparinizovaném vzorku·. Polybren například neutralizuje přítomný heparin a činí tak činidlo podle vynálezu necitlivými k obsahu heparinu ve vzorku.

Další výhodná forma provedení způsobu podle vynálezu se také vyznačuje tím, že se vzorek před přídavkem, činidla podle vynálezu, smísí se substancí neutralizující heparin jako je polybren, protaminsulfát atd.

-7Dále se vynález týká použití způsobu podle vynálezu pro stanovení aktivity faktorů vnitřního srážení a jejich inhibitorů, kde se vzorek plasmy uvede: do kontaktu s činidlem podle vynálezu, po stanovené době aktivace se přidají vápníkové ionty- a stanoví se doba srážení♦Získaný výsledek se porovná se standardním vzorkem se známou aktivitou faktorům

Eýlo dále nalezeno, že stanovení aPTT popřípadě heparinnebo heparinoiď-obsahující krvi, plasmě nebo krevních derivátech. je možno také provádět, bez použití směsi sulfatidů a pevné látky-aktivétoru, jestliže v činidle pro stanovení aPTT vedle iniciátoru vnitřního srážení bude jen pevná látkaaktivétor* nebo kapalný aktivátor nebo jejich kombinace,, činidlo neutralizující heparin a fosfolipidý#

Jako činidla neutralizující heparin se používají zejména polybren, protamin (sůl protaminu) nebo heparinása v činidle podle vynálezu#

Koncentrace činidel pro neutralizací heparinu se řídí podle koncentrace heparinu ve zkoumaném vzorku a obvykle se pohybuje např· v případě polybrenu v rozsahu mezi 1 a 500 mg/ml# Ve. standardních, způsobech se používá mezi 2 a 100 mg/ml polybrenu#

Výhodou činidla, obsahujícího heparin neutralizující činidle je zejména skutečnost, že stanovení aPTT a jednotlivých faktorů ve vzorku krve nebo plasmy je možno provést nezávisle na tom, zde vzorek obsahuje heparin nebo heparinoidy·

Vynález se dále týká setu, který sestává z a) činidla pro stanovení aPTT, obsahujícího iniciátor vnitřního srážení a fosfolipidy a b) činidla neutralizujícího heparin#

-8Ačkoliv se aPTT často používá pro sledování heparinové terapie, kdy' je požadována citlivost k heparinu, je mnoho případů, ve kterých bude nutno zkoumat intaktní vnitřní systém, nebo faktory vnitřního systému nezávisle na obsahu heparinu·

Pokud by měl. být ve vzorku obsažen heparin a tím. aPTT při měřeni činidly podle známého stavu techniky prodloužena, připadá jen menáí podíl, na srážecí faktory·

Vynález je blíže osvětlen následujícími příklady·

Příklady provedení vynálezu

1· Porovnání aPTT při použiti různých činidel

Zkoušená činidla pro stanoveni aPTT obsahují jako iniciátor· vnitřního srážení sulfatidy (fa.Pentapharm) a kaolin v různých, vzájemných poměrech ve 200 mtt Ěepes-glycim-pufmx (pH 6,8)· Dále byla připravena směs 4,8 ^ug fosfatidylserinu,

20.7 /Ug fosfatidylcholinu, 15,9 /Ug fosf atidyle thanol aminu,

3.7 /Ug cholesterolu: a 3,7 /Ug fosf atidinové kyseliny na ml činidla·

0,1 ml normální plasmy (NP) (Reference Plasma 100 %,fa. Immuno) popř· abnormální plasmy (AP) (Imounocontrol Plasma Abnormal, fa· Immuno) se smísí s 0,1 ml činidla· Po 2-minutové inkubační době při 37 se přidá 0,1 ml 0,025 M CaClgroztokix. a měří se dofla až do bodu sraženi pomocí Schnitger— Gross-koagulometrvt (fa.Amelung)·

Z tabulky 1 je zřejmé, že přítomností sulfatidů v činidla se zkracuje doba srážení normální plasmy (NP)· Baolin v činidle zlepšuje ale také citlivost, vyjádřeno jako poměr dob srážení AP a NP (viz tabulka 2)·

-9Tabulka 1

	aPTT (s)
	kaolin. (%)	0	0,15	0,30
	sulfatiď (%)
NP	0	Z	78,1	70,1
NP	0,005	34,4	38,4	38,5
NP	0,01	39,1	41,1	41,8

Tabulka 2

kaolin (0) sulfatiď (%)	poměr aPTT (JP/NP)
0	0,15	0,30
0	X	2,20	2,12
0,0Q5	2,00	2,11	2,21
0,01	í,01	2,15	2,23
2· Citlivost k heparinu
2a použití činidel z	1 · se zkouší	normální	plasma

1.) a heparinizovaná normální plasma (0,37 j heparinu/ml)· poměr aPTT heparinizovaná normální plasmy k normální plasmě je pro různá činidla uveden v tabulce 2. Cillivost vůči hepa řinu se zlepší vyšším obsahem kaolinu v činidle·

-10Tabulka 3 poměr aPTT ( +/- heparin)

kaolin. (%) sulfatidy (% )	0	0,15	0,30
0	X	1,50	1,66
0,005	1,18	1,28	1,37
0,01	1,23	1,31	1,41

3· Citlivost k faktoru ¥111

2a použiti činidel z 1. se zkouší normální plasma (viz:

1·) a kontrolní plasma (fa· Immuno, obsahuje < 30 % faktoru VIH vztaženo na obsah faktoru: VIII v normální plasmě (= 100 %))♦ Poměr aPTT kontrolní plasmy k normální plasmě, je pro různá činidla ufredem. v tabulce 4· Citlivost k faktoru VIII se zlepší obsahem sulfatidů v činidle, obsahujícím kaolin*

Tabulka 4 poměr aPTT kontrolní plasma (\ 30 % faktoru VlII/normální plasma)

kaolin (%)	0	0,15	0,30
sulf atidy (%) 0	X	1,48	1,51
0,005	1,66	1,75	1,74
0,01	1,71	1,72	1,70

4. Faktor VIII - kalibrační křivka

Pro stanovení kalibrační křivky pro faktor VIII se referenční plasma 100 %(fa Immuno) zředí 1:5 imidazolovým pufrem (3,4 g/1 imidazolu, 5,85 g/1 NaCl, pH 7,4). 0,1 ml tohoto

-11ředěnl se smísí s 0,1 ml činidla fosfolipid-kaolin-sulfatid (složení fosfolipidů jako v příkladu 1, 0,3 % kaolinu a 0,01 % sulfatidů ve 200 mlí Hepes-glycin-pufru, pH 6,8) a 4 min se inkubuje při 37 ^aC. Současně s přídavkem 0,1 ml chloridu vápenatého (25 mM) se uvedou do chodu stopky a stanoví se doba až do bodu vysráženl pomocí Schnitger-Gross-koagulometru (fa· Anelung).

1:5 ředěná plasma odpovídá 100 % faktoru VIII· Další čedění' provedená v geometrické řadě (1:1 = 100 % až 1 :128' » 0,78 %) byla testována· V tabulce 5 jsou uvedeny výsledky měřeni.

labulka 5

Faktor VHI (%)	doba srážení
100	78,5
50	91,0
25	101,7
12,5	115,3
6,35	128,9
3,13	139,9
1,56	148,6-
0,78	159,4

5· aPTT stanovení s činidly PTT rozdílného složení a s a bez přídavku polybrenu uvedených příkladech bylo použito pět rozdílných činidel jak; s tak také bez. přídavku heparin-neutralizujících činidel pro stanoveni aPTI· ²ato činidla mají následující složení (% jsou % hmotnostní ):

-12Činidlo At 0,075 % kaolinu a 0,01 % sulfatidu (fa. Pentapharm) jako iniciátor*, vysocečištěn^ fosfolipidy (17% fosfatidylserinu, 44 % fosfatidylcholinu, 29 % fosfatidylethanolaminu, 5 % chlolesterolu a 5 % fosfatidinové kyseliny).

Pro použití se činidla připraví rekonstitucí se 2 ml dest.vody (koncentrace fosfolipidů: 65 /Ug/ml).

Činidlo Bt jako činidlo A, ale jen 0,0017 % sulfatidu

Činidlo Ct 0,5 % kaolinu, lipiďový extrakt z prasečí mukosy _t T?

(Tachastyptan. , fa. Hormonchemie).

Pro použití se činidlo připraví rekonstituci se 2 ml dest. vody.

Činidlo D: Aktiu FS® fý ^Baxter (obsahuje kyselinu ellagovou jako iniciátor a fosfolipidy ze sojových bobů).

Činidlo E: Pathrombin^ fý Behring (obsahuje 0,5 % kaolinu v kapalné suspenzi jako iniciátor a lipidivý extrakt z lidské placenty (lyo)).

Pro použití se činidlo vyrobí rozpuštěním lipidového extraktu v kaolinové suspenzi.

Normální plasma (NP, Immunocotrolplasma Normál fy Immuno), popř. heparinizovaná normální plasma se 0,4 j heparinu/ml (HP1) nebo 1,0 j heparinu/ml. (HP2) se použijí jako vzorky plasmy.

0,1 ml vzorku plasmy se smísí s 0,1 ml činidla. Po 2minutové inkubační době při 37 °C se přidá 0,1 ml 0,025M roztoku CaClg a měří se čas so bodu vysrážení Scnitger-Gross-koagulometrem (fa. Anelungj.

-13V tabulce 6 jsou uvedeny získané výsledky, přičemž ve ř.á<k«c; 1 je uvedena doba srážení (v sekundách) normální plasmy (NP), v řádcích 2 a 3 doba srážení heparinizované plasmy (HP1 a HP2) a v řádcích 4 a 5 poměr mezi dobami srážení heparinizováných plasem a normální plasmy·

Tabulka 6 činidlo A činidlo C činidlo S činidlo^ E

	b.pol.	25mg/	b.pol.	25mg/ b.pol.	25mg/	b.pol.	50mg/
		1 p.		I. p.	I p.		1 p.
NP (s)	34,0	32,4	52,4	68,0 43,1	65,9	34,1	46,6
HP1 (s)	52,9	36,1	123,1	75,8 99,8	67,6	76,1	50,9
HP2 (s)	214,1	39,1	253,4	80,3 283,4	59,1 ;	210,1	96,2
HP1/NP	1,56	1,11	2,35	1,11 2,32	1,03	2,23	1,09
HP2/NP	6,30	1,21	4,84	1,18 6,58	0,90	6,16	2,06
b.pol. s	bez polybrenu		p. = polybren

Výsledky zřetelně ukazuji, že aPTT u heparinizované plasmy bex přítomnosti polybrenu se výrazně prodlužuje a tím. se zkresluje popř. je chybná. Přítomnost polybrenu umožňuji® pomocí všech testovaných činidel stanovit také aPTT v heparinizovaných plasmách. Poměr mezi dobou sráženi heparinizovaných plasem a normální plasmy, který je v ideálním případě roven 1 (tj. doba srážení je přesně stejná), se v testech s činidly bez polybrenu úplně odchyluje od ideální hodnoty 1, naproti tomu poměr dob srážení za přítomnosti polybrenu je bližší 1·

6. Faktor VIII -kalibrační křivka s činidly rozdílného složení s a bez přídavku polybrenu

Pro stanovení těchto vztahových křivek se použije referenční plasma (Heference Plasma 100 % fy Imrnuno). Tato refe-14renční plasma se rozpustí v 1 ml dest.vody (HP) popř· v 1 ml dest vody, obsahující 1 j/ml heparinu (fy Immuno) (HP)·

Plasmy se předem zředí 1:5 imidazolovým pufrem (3,4 g/I imidazol, 5,85 g/1 Nad, pff 7,4, to odpovídá 100 % faktoru VIII. Další zředění byla provedena v geometrické řadě (1:1» 100 % až 1:128 » 0,7θ %)· 0,1 ml vzorku se smísí s 0,1 ml ěi nidla a 4 minuty se ínkubuje při 37 °C. Potom se přidá 0,1 qlL 0,025 M roztoku Cadg a měří se Sas až do bodu vysréžení Schnitger-Gross-koagulometrém.

Výsledky jsou uvedeny v tabulkách. 7 až 10·

Tabulka 7

Činidlo A bez polybrenu 25 mg/ml polybrenu

F VIII (%)	HP	HP	HP	HP
100	54,7	82,0	40,0	42,2
50	65*2	78,6	48,6	47,6
25	73,5	82,1	52,0	52,1
12,5	81,7	86, &	58,3	58,0
6,25	9M	92,6	64,5	64,6
3,13	98, T	194,1	7°,6	71,6
1,56	107,2	108,6	78,6	78,6
0,78	115,1	117,6	83,6 .	83,6

-15Tabulka 8

Činidlo 3 bez polybrena 12,5 mg/ml polybrenu

F VIII (%)	RP	HP	RP	HP
100	81,6	129,1	90,1	87,6
50	91,3	105,6	99,6	99,6
25	104,5	102, T	113,1	110, σ-
12,5	1 TO,6	109,1	123,1	ι 27,6
6,25	121,5	120,1	138,1	134,6
3,13	130,5	132,1	150,1	151,1
1,56	141,6	143,1	163,1	163,1
0,78	150,5	151,6	177,5	175,1

Tabulka 9

Činidla D

F VIII (%)	bez RP	polybrenu HP	25 mg/ml polybrenu
RP	HP
100	6Q,6	107,2	70,1	65,6
50	71,7	'84,1
25	79,a	82,6	100,1	93,6

T2,5 88,1 89,5

6,25	98,1	100,1
3,13	109,1	109,6	140,6
1,56	118,1	118,2
0,78	127	126,6	164

160,5

-16—

Tabulka 10

Činidla E

fvhi (%)	RP
100	54,9
50	61,2
25	67,4
12,5	74,2
6,25	83,4
3,13	89,9
1,56	97,1
0,78	102,4

bez polybrenu HP ’ mg/ml polybrena HP HP

127,5	72,1	68,1
98,5	78,4	75,1
96,4	87,9	82,6
102,4	04,9	92,1
112,6	106,2	105,1
120,6	113,2	115,6
131,6	121,1	125,5
140,9	127,6	131,6

Výsledky ukazují, Že v normálním, případě (plasma bez heparinu, HP, činidla bez polybrenu) vzniká jednoznačný vztah mezi dobou srážení a koncentrací faktoru VlIIt čím nižší koncentrace faktoru VIII, tím delší doba srážení.

Při měření vzorků, obsahujících, heparin (HP, činidla bez polybrenu) se neukazuje žádný jednoznačný vztah, měření poskytuje nepoužitelnou křivku vztahu k faktoru VIII, která neumožňuje žádné lineární přiřazení doby srážení a koncentrace faktoru. VIII.

Teprve přítomnost polybrenu v činidlu umožňuje stanovení koncentrace faktoru VIII ve vzorcích, obsahujících heparin (HP, činidla s 12,5/25/50 mg/mi polybrenu). Výsledky měření nebyly zkresleny přítomností heparinu ani polybrenu při použití činidel podle vynálezu. Toto se projevuje jak při srovnání s měřeními HP s činidly s a bez polybrenu,ale i při porovnání dob srážení HP a HP za přítomnosti polybrenu, jejichž podíl je vždy zcela blízký 1.

7. aPTT-Stanovení s činidlem B s a bez přídavku heparinásy

-17Immunocontrolplasma Normál (fa.Immuno) se rozpustí v 1 ml dest.vody, které obsahuje 0, 0,5 nebo 1 j/ml heparinu.

Činidlo se rozpustí v 1 ml dest.vody, která obsahuje 0, 0,74, 0,22, 0,07 a 0,02 j/ml heparinásy (fy.IBEX, Kanada)·

Provede se stanovení PTT jako v příkladu 5·

Výsledky provedených měření jsou uvedeny v tabulce

11·

Tabulka heparin plasmě (j/ml)

0,0

0,5

T,0 v heparinás>_ j/ml

0	0,02	0,07	0,22	0,74
33,6	33,6	33,1	33,6	38,3
52,4	45,8	41,8	37,7	41,4
85,8	65,6;	50,8	47,3	42,3

Výsledky ukazují, že se také činidlo, obsahující hepari násu, výborně hodí pro aPTT-stanovení heparinizované plasmy.

Claims (19)

1. PATENTOVÉ N A*R 0 K Ί

   1« In.iciótorr vnitřního srážení krve, plasmy nebo krevních derivátů, vyznačující setím, že obsahuje směs sulfatidů a pevné látky-aktivátorui, výhodně kaolinu·
2. 2· Činidlo pro stanovení aPTT krve, plasmy nebo krevních derivátů, vyznačující se tím, že obsahuje směs sulfatidů a pevné látky-aktivátoru, výhodně kaolinu, jako iniciátoru vnitřního srážení a dále fosfolipidy·
3. 3. Činidlo podle nároku 2, vyznačující se t í m, Že obsažené fosfolipidy jsou chemicky čisté fosfclipidý ve standardizované' směsi.
4. 4. Činidlo podle nároku 3,vyznačující se tím, Že směs fosfolipidů obsahuje, vztaženo na celkový obsah fosfolipidů, 5 g& 50 % fosfatidylserinu, 15 až 60 % fosfatidylcholinu, 15 až. 60 % fosfatidylethanolaminu, 0 až Í0 % cholesterolu a 5 až 20 % kyseliny fosfatidinové·
5. 5· Činidlo podle jednoho nebo více z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že dále obsahuje látku potlačující oxidaci a/nebo látku, zlepšující citlivost.
6. 6. Činidlo podle nároku 5,vyznačující se t í m, že obsahuje sůl alkalického kovu, popřípadě spolu a aminokyselinami.
7. 7· Činidlo podle jednoho nebo více z nároků 2 až 6, vyznačující setím, že dále obsahuje ohromo-19genní substrát, se kterým je popřípadě možno stanovit dobu srážení fotometricky vývojem zabarvení·
8. 8. Činidlo podle jednoho nebo vícez nároků 2 až 7, v y z n. a Čující a e t í m, že obsahuje dále stabilizátory, výhodně albumin a /nebo pufrovací substance·
9. 9. Činidla podle jednoho nebo více z nároků 2 až 8, vyznačující se tím, že je v lyofilizované formě·
10. 10· Způsob výroby činidla podle jednoho nebo vícez; nároků 2až 9, vyznačující se tím, že se sulfatidy ve vodné suspenzi pevné látky-aktivátoru smísí s fosfolipidy a popřípadě dalšími látkami a popřípadě se lyofilizují
11. 11· Způsob výroby činidla podle jednoho nebo více z; nároků 2 až 9, v y z n a č u j í c í s e t í m, že se sulfatidy, pevná látka-aktivátor a fosfolipidý', popřípadě pa lyofilizaci, popřípadě s dalšími přísadami, smísí v pevném stavu·
12. 12· Způsob) stanovení parciálníXřf tromboplastinové doby (aPTT) vzorků krve, plasmy nebo krevních ddrivátů, vyzná čující se tím, že se vzorek uvede do kontaktu a; činidlem podle jednoho nebo více z nároků 2 až 9, po stanovené době' se přidají ionty vápníku a stanoví se doba sražení·
13. 13· Způsob podle nároku 12,vyznačující se tím, že se vzorek před přídavkem činidla podle jednoho z nároků 2 až 9 smísí ae substancí neutralizující heparin·

    -2014? Použití způsobu podle nároku 12 nebo 13 pro stanovení aktivity faktorů vnitřního srážení a jejich inhibitorů, vyznačující se tím, že vzorek plasmy uvede do kontaktu s činidlem podle jednoho z nároků. 2 až 9, po předem stanovené době aktivace se přidají vápníkové ionty a stanoví se doba srážení, a získaný výsledek se porovná se standardním vzorkem se známou aktivitou faktorů#
14. 15# Činidlo pro stanovení aPTT popřípadě heparin?- nebo heparinoidy obsahující krvfc, plasmf· nebo krevních derivátů, obsahující iniciátor vnitřního srážení, vyznačující ae t í m, že obsahuje heparin-neutralizující činidlo a fosfolipiď#
15. 16# Činidlo: podle nároku 15, vyzn. ačující s e t í m, že jako heparin-neutralizující činidlo obsahuje polybren, protaminovou sůl, nebo heparinásu·
16. 17# Činidlo podle nároku 15 nebo 16, vyznačují ní se fe í m, že fosfolipidová slojEka obsahuje, vztaženo na celkový obsah fosfolipidů, 5 až 50 % fosfatidylserinu, 15 až 60 % fosf atidylcholinu, 15 až 60 % fosf atidylethanolaminu,

    0 až 20 % cholesterolu a 5 až 20 % kyseliny fosfatidinové#
17. 18# Způsob stanovení parciální tromboplastinové doby (aPTT) vzorků, obsahujících popřípadě heparin?- nebo heparinoiď, krve, plasmy nebo krevních derivátů, vyznačující se tím, že se vzorek uvede do kontaktu s činidlem podle jednoho nebo více nároků 15 až 17, po předem stanovené době aktivace se přidají vápníkové ionty a stanoví se doba srážení·
18. 19# Použití způsobu podle nároku 18 pro stanovení aktivity faktorů vnitřního srážení a jejich inhibitorů, vyzná-21Sující se t í m, že se vzorek plasmy, obsahující popřípadě heparin nebo heparinoid, uvede do kontaktu· s činidlem, podle jednoho z nároků 15 až 17, po předem stanovené době aktivace se přidají ionty vápníku a stanoví se doba sraženi a získaný výsledek se porovná se standardním vzor>kem se známou aktivitou faktorů·
19. 20· Sgfc, sestávající z

    a) činidla pro stanovení aPTT, obsahujícího iniciátor vnitřního srážení a fosfolipidy a

    b) činidlo, neutralizující heparin·