SK48793A3 - Agent for determination aptt, process for its preparation and its use - Google Patents
Agent for determination aptt, process for its preparation and its use Download PDFInfo
- Publication number
- SK48793A3 SK48793A3 SK487-93A SK48793A SK48793A3 SK 48793 A3 SK48793 A3 SK 48793A3 SK 48793 A SK48793 A SK 48793A SK 48793 A3 SK48793 A3 SK 48793A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- agent
- plasma
- reagent
- aptt
- clotting
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
- G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Oblasť: techniky
Vynález sa týka iniciátora vnútorného zrážania, činidla pre stanovenie aktivovanej parciálnej tromboplastínóvej doby (aPTT) ako i spôsobu výroby tohto činidla a prípadne stanovenia aPTT.
Doterajší stav techniky
Aktivovaná parciálna tromboplastínová doba vzorky plazmy slúži ako screening-test pre celkové zistenie aktivít zrážacích faktorov vnútorného zrážania. Poruchy v priebehu zrážania podmieňujú doby zrážania, ktoré ležia mimo normálnej oblasti. Predĺžená aPTT ako k nej dochádza u hemofílie A, manifestuje napr. nedostatok zrážacieho faktoru VIII. Naviac sa aPTT test často uskutočňuje pri sledovaní heparínovej terapie.
Činidlo pre stanovenie aPTT obsahuje aktivátor pre inciáciu vnútorného zrážania až po tvorbu aktivovaného faktoru IX. Ďalej budú potrebné pre aktiváciu faktoru X a protrombínu fosfolipidy, preto sú tieto prípadne obsiahnuté v aPTT-činidle. Činidlo sa uvedie do kontaktu so vzorkou plazmy, kam sa pridá po definovanom, pokial možno najkratšom čase vápnik a meria sa doba až do vytvorenia fibrínového zhluku.
Na testovací systém a PTT je kladených mnoho požiadaviek. Pre rutinné pokusy je jednoduché zaobchádzanie s aPTT-činidlom potrebným predpokladom. Rovnako stabilita obsiahnutých látok musí byt velmi vysoká, aby bola zaistená konštantná doba zrážania počas dlhšieho časového obdobia. To umožňuje tiež nenákladné použitie činidla. Pre aPTT ako celkový test je tiež nutná vhodná citlivosť ku všetkým zahrnutým parametrom.
Bežné činidlá pre stanovenie aPTT obsahujxí ako iniciátor vnútorného zrážania povrchovo aktívnu pevnú látku. Použitím povrchovo aktívnej matrice sa najprv aktivuje faktor XII porovnateľne s fyziologickými podmienkami. Ako pevné látky - aktivátory sa používajú napríklad kaolín, celit a sklo. Kaolín je na trhu dostupný napr. v reagenciách pre stanovenie aPTT ako suspenzia (PathromtínR, fa Behringerwerke (1990) alebo ako PTT reagens, fa Boehringer Mannheim (1986)). Ako fosfolipid sa používa lyofilizovaný kefalín. Fosfolipidy sa však priemiešavajú najprv po uskutočnení stanovenia s kaolínom k činidlu pripravenému na použitie. Oddelené skladovanie kaolínu a fosfolipidov je potrebné najmä zo stabilizačných dôvodov.
Pri lyofilizácii lipidov kaolínom sa lipidy z väčšej časti inaktivujú. Dochádza tak napríklad pri výrobe PTT-IMMUNO (fa Immuno) pri spoločnej lyofilizácii kaolínu a fosfolipidov (extrahovaných z mozgu prasaťa) k strate až 50 % aktivity fosfolipidov.
aktivátorom je možné tiež kyselina ellagová a jej
Alternatívne k pevným látkam — použiť kvapalné aktivátory ako je deriváty alebo rozpustené sulfatidy. Citlivosť testu na heparín za prítomnosti kvapalných aktivátorov je však ohrozená a boli navrhnuté rôzne prísady pre zlepšenie citlivosti. Podľa WÔ 91/16453 obsahuje činidlo na bázi kyseliny ellagovej citlivé na heparín ako prísadu dextransulfát.
Nevýhodou kaolínu prípadne pevných látok - aktivátorov všeobecne a kyseliny ellagovej prípadne ich derivátov je dlhá doba aktivácie prvej fázy vnútorného zrážania, čím je pre aktiváciu nutná relatívne dlhá inkubačná doba najmenej 4 minút. Ďalšou nevýhodou je relatívne dlhá doba zrážania za prítomnosti kaolínu. Vyššia koncentrácia kaolínu v činidle však môže dobu aktivácie skrátiť. Kaolín, ktorý sa usádza zo suspenzie môže ďalej viesť k predĺženej dobé zrážania prípadne k chybným výsledkom pri stanovení bodu zrážania pomocou bežného koagulometra. Je nutné snažiť sa o to, aby koncentrácia pevnej látky-aktivátora bola udržovaná čo najnižšia.
-. . .,·,jsl ' <<
Podstata vynálezu ' •“'ŕ.
:··>·'/.
Úlohou vynálezu je poskytnúť štandardizované činidlo / í s vysokou stabilitou pre stanovenie aPTT, s ktorým je jednoduchá 'J, manipulácia a ktoré je nenákladné a možno jeho pomocou dosiahnuť ' - l krátke aktivačné doby ako i vysokú citlivosť k jednotlivým .?j faktorom zrážacej kaskády. | k', . ' 1;
Riešenie tejto úlohy je podlá vynálezu umožnené iniciátorom vnútorného zrážania krvi, plazmy alebo krvných derivátov, ktorý obsahuje zmes sulfatidov a pevnej látky - aktivátora, výhodne / kaolínu. / ‘&
Činidlo podlá vynálezu obsahuje ako iniciátor vnútorného i zrážania zmes sulfatídu (napríklad od firmy Pentapharm) a pevnej . .. ·?
látky - aktivátora. Ďalej sú v ňom obsiahnuté fosfolipidy. Len velmi krátka doba aktivácie, ktorá je zaznamenaná pri použití ’···-M . : ‘ ‘' . ‘Λ' sulfatidov na aktiváciu faktora XII o niečo predĺži. Použitím >’ činidla podlá vynálezu sa tak umožní krátka inkubačná doba pre predbežné spracovanie pri rutinných pokusoch. Súčasne sa ale tiež zlepší použitím pevnej látky - aktivátora citlivosť k heparínu.
Použitie iniciátora podlá predloženého vynálezu v aPTT činidle umožňuje tiež prekvapujúcu kombináciu výhod oboch jednotlivých aktivátorov, ale nie ich nevýhod.
Toto sa nepredpokladalo. Skôr sa predpokladalo, že kombinácia sulfatídu s kaolínom ako iniciátor vnútorného zrážania v činidle, vedie k zníženiu aktivity.' Podlá doterajšieho mienenia odborníkov, že by mohli vznikať potiaže pri kombinácii aktivátorov s rôznym reakčným méchanizmom, bolo prekvapujúce, že činidlo podlá vynálezu je dobre štandardizovatelné. Toto je predpoklad pre vysokú reprodukovatelnosť spôsobu stanovenia.
· & t*
r
V činidle podľa vynálezu sa udržuje nízke množstvo kaolínu. Zabráni, sa zvýšenému usadzovaniu kaolínu a odstráňujú sa ťažkosti v prevádzke detekčných prístrojov.
Iniciátor podľa vynálezu môže byť bez potiaží lyofilizovaný spolu s fosfolipidmi na nenákladné činidlo. Prípadné negatívne vedľajšie pôsobenie jednotlivých komponentov je bezvýznamné.
Vynález sa tak tiež týka činidla pre stanovenie aPTT v krvi, plazme alebo krvných derivátoch, ktoré sa vyznačuje tým, že obsahuje zmes sulfatidov a pevnej látky - aktivátora, výhodne kaolínu, ako iniciátor vnútorného zrážania a ďalej fosfolipidy.
Koncentrácia kaolínu, prípadne sulfatidov v činidle je pre kaolín medzi 0,1 až 0,6 % hmotn., výhodne 0,1 až 0,3 % hmotn. a pre sulfatidy 0,001 až 0,03 % hmotn., výhodne 0,002 až 0,01 % hmôt.
Činidlo obsahuje výhodne chemicky čisté fosfolipidy v štandardizovanej zmesi. Ukázalo sa, že sa tým dosiahne neočakávane vysoká reprodukovateľnosť skúšobného postupu. Zmes fosfolipidov obsahuje napríklad fosfatidylserín, fosfatidylcholín a cholesterol.
Zmes sa výhodne skladá z 5 až 50 % fosfatidylserínu, 15 až 60 % fosfatidylcholínu, 15 až 60 % fosfatidyletanolamínu, 0 až 20 % cholesterolu a 5 až 20 % fosfatinidovej kyseliny, vzťahujúce sa na celkový obsah fosfolipidov. Ako štandardizovaná zmes sa napríklad používa 0,2 mg fosfatidylserínu, 0,85 g fosfatidylcholínu, 0,65 mg fosfatidyletanolamínu, 0,15 mg cholesterolu a 0,15 mg kyseliny fosfatinidovej, na ml, prípadne riedená.
Fosfolipidy sa výhodne prečistia, takže nežiadúce zrážacie reakcie, ku ktorým by mohlo dochádzať za prítomnosti polybrénu, sa vylúčia.
Výhodná forma prípravy činidla sa vyznačuje tým, že obsahuje ďalšiu látku potlačujúcu oxidáciu a látku zlepšujúcu citlivosť. Ako látky potlačujúce oxidáciu pre zvýšenie doby skladovatelnosti činidla v lyofilizovanom alebo kvapalnom stave sa napríklad používajú cysteín, močovina, vitamín C alebo vitamín E. Prísady ako soli alkalických kovov, prípadne spolu s aminokyselinami, zvyšujú citlivosť testu k jednotlivým faktorom. Ukázalo sa, že činidlo, obsahujúce chlorid cézny (5 až 25 mg/ml) a arginín (2,5 až 20 mg/ml), výhodne 16,8 mg CsCl/ml a 10,5 mg arginín/ml, je po zodpovedajúcom zriedení zvlášť výhodné pre stanovenie aPTT vzorky plazmy s nedostatkom jednotlivých faktorov (faktor VIII).
Ďalšia výhodná forma prípravy činidla sa vyznačuje tým, že obsahuje ďalší chromogénny substrát, vďaka ktorému je prípadne možné stanoviť dobu zrážania fotometrický vývojom zafarbenia. Zhodnotenie konečného produktu je ale tiež možné fotometrickým stanovením zmeny priepustnosti svetla.
Výhodne obsahuje činidlo ďalej stabilizátory, výhodne albumín alebo pufrovacie substancie.
Spôsob výroby tohto činidla je jednoduchý. Sulfatidy sa zmiesia vo vodnej suspenzii pevnej látky - aktivátora s fosfolipidmi a prípadne s ďalšími prísadami a prípadne sa lyofilizujú.
Výroba činidla sa ale tiež môže uskutočňovať tak, že sa sulfatidy, pevná látka - aktivátor a fosfolipidy, prípadne po lyofilizácii, prípadne spolu s ďalšími prísadami zmiesia v pevnom stave.
činidlo podlá vynálezu je vhodné i na sledovanie heparínovej terapie, ako i na stanovenie jednotlivých faktorov i zrážacích faktorov prípadne inhibítorov vnútorného zrážania.
Vynález sa ďalej týka spôsobu stanovenia parciálnej trombop.lastínovej doby (aPŤT) vzorky krvi, plazmy alebo krvných derivátov, ktorý sa vyznačuje tým, že sa vzorka uvedie do kontaktu s činidlom podlá vynálezu, po vopred stanovenej dobe aktivácie sa pridajú vápnikové ióny a stanoví sa doba zrážania.
Prídavkom substancií neutralizujúcich heparín môže byť nedostatok zrážacích faktorov tiež stanovený v heparinizovanej vzorke. Polybrén napríklad neutralizuje prítomný heparín a robí tak činidlo podlá vynálezu necitlivým k obsahu heparínu vo vzorke.
Ďalšia vhodná forma uskutočnenia spôsobu podlá vynálezu sa tiež vyznačuje tým, že sa vzorka pred prídavkom činidla podlá vynálezu zmiesi so substanciou neutralizujúcou heparín ako je polybrén, protamínsulfát atď.
Ďalej sa vynález týka použitia spôsobu podlá vynálezu pre stanovenie aktivity faktorov vnútorného zrážania a ich inhibítorov, kde sa vzorka plazmy uvedie do kontaktu s činidlom podlá vynálezu, po stanovenej dobe aktivácie sa pridajú vápnikové ióny a stanoví sa doba zrážania. Získaný výsledok sa porovná so štandartnou vzorkou so známou aktivitou faktorov.
Bolo ďalej vynájdené, že stanovenie aPTTv prípadne heparín alebo heparinoid - obsahujúcej krvi, plazme alebo krvných derivátoch je možné tiež uskutočňovať bez použitia zmesi a pevnej látky - aktivátora, ak v činidle pre aPTT popri iniciátore vnútorného zrážania bude len aktivátor alebo kvapalný aktivátor alebo ich sulfatidov stanovenie pevná látka kombinácia, činidlo neutralizujúce heparín a fosfolipidy.
Ako činidlá neutralizujúce heparín sa používajú najmä polybrén, protamín (sol protamínu) alebo heparináza v činidle podlá vynálezu.
Koncentrácia činidiel pre neutralizáciu heparínu sa riadi podlá koncentrácie heparínu v skúmanej vzorke a obyčajne sa pohybuje napríklad v prípade polybrénu v irozsahu medzi 1 a 500 mg/ml. V štandartných spôsoboch sa používa medzi 2 až 100 mg/ml
polybrénu. Γ
- ň·
S ' tf ľ
Výhodou činidla, obsahujúceho heparín neutralizujúce činidlo í je najmä skutočnosť, že stanovenie aPTT a jednotlivých faktorov vo vzorke krvi alebo plazmy je možné uskutočniť nezávisle na tom, ;
či vzorka obsahuje heparín alebo heparinoidy.
Vynález sa ďalej týka setu, ktorý pozostává z a) činidla pre stanovenie aPTT, obsahujúceho iniciátor vnútorného zrážania P
... ''..'r a fosfolipidy a b) činidla neutralizujúceho heparín.
Napriek tomu sa aPTT často používa pre sledovanie t heparínovej terapie, kde je požadovaná citlivosť k heparínu, je mnoho prípadov, v ktorých bude nutné skúmať intaktný vnútorný ľ
L· systém alebo faktory vnútorného systému nezávisle na obsahu heparínu.
Pokial by mal byť vo vzorke obsiahnutý heparín a tým aPTT pri meraní činidlami podľa známeho stavu techniky predĺžená, pripadá len menší podiel na zrážacie faktory. j
Vynález je bližšie osvetlený následujúcimi príkladmi. ' · ;:4 ·· '·.··. 'ŕ-6 • ' r' ‘ · P
Príklady uskutočnenia vynálezu 4
i. Porovnanie aPTT pri použití rôznych činidiel
Skúšané činidlá pre stanovenie aPTT obsahujúce ako iniciátor vnútorného zrážania sulfatidy (firma Pentapharm) a kaolín v rôznych vzájomných pomeroch v 200 mM Hepes-glycín-pufru (pH 6,8). Ďalej bola pripravená zmes 4,8 μ9 fosfatidylserínu, 20,7 μ9 fosfatidylcholínu, 15,9 μ9 fosfatidyletanolamínu, 3,7 μg cholesterolu a 3,7 μg fosfatidínovej kyseliny na ml činidla.
0,1 ml normálnej plazmy (NP) (Reference Plazma 100 %, firma Immuno) prípadne abnormálnej plazmy (AP) (Immunocontrol Plazma
v jt ?!
Abnormal, firma Immuno) sa zmiesi s 0,1 ml činidla. Po
2-minútovej inkubačnej dobe pri 37 °C sa pridá 0,1 ml 0,025 M
CaCl2-roztoku a meria sa doba až do bodu zrážania pomocou
Schnitger-Gross-koagulometra (firma Amelung).
S Z tabuľky 1 je zrejmé, že prítomnosťou sulfatidov v činidle sa skracuje doba zrážania normálnej plazmy (NP). Kaolín v činidle zlepšuje ale tiež citlivosť, vyjadrené ako pomer dôb zrážania AP a NP (viď tabulka 2).
Tabuľka 1
aPTT (s) | |||||||
kaolín | (S) | 0 | 0,15 | 0,30 | |||
sulfatid ( | %) | ||||||
NP | 0 | x | 78,1 | 70,1 | |||
NP | 0,005 | 34,4 | 38,4 | 38,6 | |||
NP | 0,01 | 39,1 | 41,1 | 41,8 | |||
Tabuľka 2 | |||||||
pomer aPTT | |||||||
(AP/NP) | |||||||
kaolín | (0) | 0 | . 0,15 | 0,30 | |||
sulfatid ( | %) | < | |||||
0 | X | 2,20 | 2,12 | ||||
0,005 | 2,00 | 2,11 | 2,21 | ||||
0,01 | 2,01 | 2,15 | 2,23 |
2. Citlivosť, k heparínu
Za použitia činidiel z 1. sa skúša normálna plazma (vid 1.) a heparinizovaná normálna plazma (0,37 j heparínu/ml). pomer aPTT
heparinizovanej normálnej plazmy k normálnej plazme je činidlá uvedený v tabulke 2. Citlivosť voči heparínu | pre rôzne sa zlepší | |||
vyšším obsahom Tabulka 3 | kaolínu v činidle. | |||
pomer aPTT | ||||
( +/- | heparín) | |||
kaolín (%) | 0 | 0,15 | 0,30 | |
sulfatidy (%) | ||||
0 | X | 1,50 | 1,66 | |
0,005 | 1,18 | 1,28 | 1,37 | |
0,01 | 1,23 | 1,31 | 1,41 |
3. Citlivosť k faktoru VIII
Za použiti činidiel z 1. sa skúša normálna plazma (vid 1.) a kontrolná plazma (firma Immuno, obsahuje < 30 % faktora VIII vzťahujúce sa na obsah faktoru VIII v normálnej plazme (= 100 %)). Pomer aPTT kontrolnej plazmy k normálnej plazme je pre rôzne činidlá uvedený v tabulke 4. Citlivosť k faktoru VIII sa zlepší obsahom sulfatidov v činidle, obsahujúcim kaolín.
Tabuľka 4
kontrolná plazma | pomer aPTT (< 30 % faktora | VlII/normálna | plazma) |
kaolín (%, | 0 | 0,15 | 0,30 |
sulfatidy (%) | |||
0 | X | 1,48 | 1,51 |
0,005 | 1,66 | 1,75 | 1,74 |
0,01 | 1,71 | 1,72 | 1,70 - J |
4. Faktor VIII - kalibračná krivka
Pre stanovenie kalibračnej krivky pre faktor VIII sa referenčná plazma 100 % (firma Immuno) zriedi 1:5 imidazolovým pufrom (3,4 g/1 imidazolu, 5,85 g/1 NaCl, pH 7,4). 0,1 ml tohto riedenia sa zmiesi s 0,1 ml činidla fosfolipid-kaolín-sulfatid (zloženie fosfolipidov ako v príklade 1, 0,3 % kaolínu a 0,01 % sulfatidov v 200 mM Hepes-glycín-pufre, pH 6,8) a 4 min sa inkubuje pri 37 °C. Súčasne s prídavkom 0,1 ml chloridu vápenatého (25 mM) sa uvedú do chodu stopky a stanoví sa doba až do bodu vyzrážania pomocou Schin-Gross-koagulometra (firma Amelung)
1:5 riedená plazma zodpovedá 100 % faktoru VIII. Ďalšie riedenia uskutočnené v geometrickom rade (1:1 = 100 % až 1:128 = 0,78%) boli testované. V tabulke 5 sú uvedené výsledky merania.
Tabuíka 5
Faktor VIII (%) | doba zrážania (%) | |
100 | 78,5 | |
50 | 91,0 | |
25 | 101,7 | |
12,5 | 115,3 | |
6,25 | 128,9 | |
3,13 | 139,9 | |
1,56 | 148,6 | |
- 0,78 | 159,4 |
5. aPTT stanovenie s činidlami PTT rozdielneho zloženia a s prídavkom a bez prídavku polybrénu
V uvedených príkladoch bolo použitých pät rozdielnych činidiel ako s prídavkom tak bez prídavku heparín-neutralizujúcich činidiel pre stanovenie aPTT.
Tieto činidlá majú následujúce zloženie (% sú % hmotnostné):
Činidlo A: 0,075 kaolínu a 0,01 % sulfatidu (firma Pentapharm) ako iniciátor, vysokočistené fosfolipidy (17 % fosfatidylserínu, 44 % fosfatidylcholínu, % fosfatidyletanolamínu, 5 % cholesterolu a 5 % fosfatidínovej kyseliny).
Pre použitie sa činidlo pripraví rekonštitúciou s 2 ml dest. vody (koncentrácia fosfolipidov: 65 μά/π»1).
Činidlo B: ako činidlo A, ale len 0,0017 % sulfatidu Činidlo C: 0,5 % kaolínu, lipidový extrakt z mukózy ošípaných (TachostyptanR, firma Hormonochemie).
Pre použitie sa činidlo pripraví rekonštitúciou s 2 ml destilovanej vody.
Činidlo D: Aktín FSR firmy Baxter (obsahuje kyselinu ellagovú ako iniciátor a fosfolipidy zo sójových bôbov)
Činidlo E: PathrombínR firmy Behring ( obsahuje 0,5 % kaolínu v kvapalnej suspenzii ako iniciátor a lipidový extrakt z lipidovej placenty [lyo]).
Pre použitie sa činidlo vyrobí rozpustením lipidového extraktu v kaolínovej suspenzii.
Normálna plazma (NP, Immunocotrolplazma Normál firmy Immuno), prípadne heparinizovaná normálna plazma sa 0,4 j heparínu/ml (HP1) alebo 1,0 heparínu/ml (HP2) sa použijú ako vzorky plazmy. 0,1 ml vzorky plazmy sa zmiesi s 0,1 ml činidla. Po 2-minútovej inkubačnej dobe pri 37 °C sa pridá 0,1 ml 0,025M roztoku CaCl2 a meria sa čas po dobu vyzrážania Schnitger-Gross-koagulometrom (firma Amelung).
V tabulke 6 sú uvedené získané výsledky, pričom v riadku 1 je uvedená doba zrážania ( v sekundách) normálnej plazmy (NP), v riadkoch 2 a 3 doba zrážania heparinizovanej plazmy (HP1 a HP2) a v riadkoch 4 a 5 medzi dobami zrážania heparinizovaných plaziem ä normálnej plazmy.
Tabulka 6
Činidlo A | činidlo C | činidlo D | činidlo E | |||||
b. pol | . 25mg/ 1 P· | b. pol | . 25mg/ 1 P- | b. pol | . 25mg/ 1 p. | b. pol | . 50mg/ 1 p. | |
NP (s) | 34,0 | 32,4 | 52,4 | 68,0 | 43,1 | 65,9* | 34,1 | 46,6 |
HP (S) | 52,9 | 36,1 | 123,1 | 75,8 | 99,8 | 67,6 | 76,1 | 50,9 . |
HP 2 (s) | 214,1 | 39,1 | 253,4 | 80,3 | 283,4 | 59,1 | 210,1 | 96,2 |
HP1/NP | 1,56 | 1,11 | 2,35 | 1,11 | 2,32 | 1,03 | 2,23 | 1,09 |
HP2/NP | 6,30 | 1,21 | 4,84 | 1,18 | 6,58 | 0,90 | 6,16 | 2,06 |
b.pol = bez polybrénu p. = polybrén
Výsledky zreteľne ukazujú, že aPTT u heparinizovanej plazmy bez prítomnosti polybrénu sa výrazne predlžuje a tým sa skresľuje prípadne je chybná. Prítomnosť polybrénu umožňuje pomocou všetkých testovaných · činidiel stanoviť tiež aPTT. v heparinizovaných plazmách. Pomer medzi dobou zrážania heparini-> zovaných plaziem a normálnej plazmy, ktorý je v ideálnom prípade rovný 1 (t.j. doba zrážania je presne rovnaká), sa v testoch s činidlami bez polybrénu úplne odchyľuje od ideálnej hodnoty 1, naprot i, tomu pomer dôb zrážania za prítomnosti polybrénu je bližší 1.
6. Faktor VIII - kalibračná krivka s činidlami rozdielneho zloženia s prídavkom a bez prídavku polybrénu.
Pre stanovenie týchto vzťahových kriviek sa použije referenčná plazma (Reference Plasma 100 % firmy Immuno). Táto referenčná plazma sa rozpustí v 1 ml dest. vody, obsahujúcej 1 j/ml heparínu (firmy Immuno) (HP).
Plazmy sa vopred zriedia 1:5 imidazolovým pufrom (3,4 g/1 imidazol, 5,85 g/1 NaCl, pH 7,4, to zodpovedá 100 % faktoru VIII; Ďalšie zriedenia boli realizované v geometrickom rade (1:1=100 % až 1:128 = 0,78 %). 0,1 ml vzorky sa zmiesi s 0,1 ml činidla a 4 minúty sa inkubuje pri 37 °C. Potom sa pridá 0,1 ml 0,025 M roztoku CaCl2 a meria sa čas až do bodu vyzrážania Schnitger-Gross-koagulometrom.
Výsledky sú uvedené v tabuľkách 7 až 10.
Tabuľka 7 Činidlo A bez polybrénu 25 mg/ml polybrénu
F Vín: (%) RP HP RP HP
100 | 54,7 | 82,0 | 40,0 1 | 42,2 |
50 | ‘65,2 | 78,6 | 48,6 | 47,6 |
25 | 73,5 | 82,1 | 52,0 | 52,1 |
12,5 | 81,7 | 86,6 | 58,3 | 58,0 |
6,25 | 90,7 | 92,6 | 64,5 | 64,6 |
3,13 | 98,1 | 104,1 | 70,6 | 71,6 |
1,56 | 107,2 | 108,6 | 78,6 | 78,6 |
0,78 | 115,1 | 117,6 | 83,6 | 83,6 |
Tabuľka 8 Činidlo C
F VIII (%) | bez polybrénu | 12,5 mg/ml polybrénu | ||
RP | HP | RP | HP | |
100 | 81,6 | 129,1 | 90,1 | 87,6 |
50 | 91,3 | 105,6 | 99,6 | 99,6 |
25 | 104,5 | 102,1 | 113,1 | 110,6 |
12,5 | 110,6 | 109,1 | 123,1 | 127,6 |
6,25 | 121,5 | 120,1 | 138,1 | 134,6 |
3,13 | 130,5 | 13 2,1 | 150,1 | 151,1 |
1,56 | 141,6 | 143,1 | 163,1 | 163,1 |
0,78 | 150,5 | 151,6 | 177,5 | 175,1 |
í f
Tabuľka 9 Činidlo D bez polybrénu 25 ng/ml polybrénu
F VIII (%) RP HP RP HP
100 | 60,6 | 107,2 | 70,1 | 65,6 |
50 | 71,7 | 84,1 | ||
25 | 79,0 | 82,6 | 100,1 | 93,6 |
12,5 | 88,1 | 89,6 | ||
6,25 | 98,1 | 100,1 | ||
3,13 | 109,1 | 109,6 | 140,6 | 138,6 |
1,56 | 118,1 | 118,2 | ||
0,78 | 127 | 126,6 | 164 | 160,5 |
Tabuľka 10 Činidlo E
F VIII (%) | bez polybrénu | 50 mg/ml polybrénu RP HP | ||
RP | HP | |||
100 | 54,9 | 127,5 | 72,1 | 68,1 |
50 | 61,2 | 98,5 | 78,4 | 75,1 |
25 | 67,4 | 96,4 | 87,9 | 82,6 |
12,5 | 74,2 | 102,4 | 94,9 | 92,1 |
6,25 | 83,4 | 112,6 | 106,2 | 105,1 |
3,13 | 89,9 | 120,6 | 113,2 | 115,6 |
1,56 | 97,1 | 131,6 | 121,1 | 125,5 |
0,78 | 102,4 | 140,9 | 127,6 | 131,6 |
Výsledky | ukazujú, že | v normálnom | prípade | (plazma bez |
heparínu, RP, činidlá bez polybrénu) vzniká jednoznačný vztah medzi dobou zrážania a koncentráciou faktora VIII: čím nižšia koncentrácia faktora VIII, tým dlhšia doba zrážania.
i
Pri meraní vzoriek, obsahujúcich heparín (HP, činidlo bez polybrénu) sa neukazuje žiadny jednoznačný vzťah, meranie poskytuje nepoužitelnú krivku vzťahu faktora VIII, ktorá neumožňuje žiadne lineárne priradenie doby zrážania a koncentrácie faktora VIII.
Až prítomnosť polybrénu v činidle umožňuje stanovenie koncentrácie faktora VIII vo vzorkách obsahujúcich heparín (HP, činidlo s 12,5/25/50 mg/ml polybrénu). Výsledky merania použitia činidiel podlá vynálezu. Toto sa prejavuje ako pri porovnávaní s meraniami RP s činidlami s polybrénom a béz polybrénu, ale i pri porovnávaní dôb zrážania RP a HP za prítomnosti polybrénu, ktorých podiel je vždy celkom blízky 1.
7. aPTT-stanovenie s činidlom B s prídavkom a bez prídavku heparinázy f
Immunocontrolplazma Normál (firma Immuno) sa rozpustí v 1 ml dest. vody, ktorá obsahuje 0, 0,5 alebo 1 j/ml heparínu.
Činidlo sa rozpustí v 1 ml destilovanej vody, ktorá obsahuje 0, 0,74, 0,22, 0,07 a 0,02 j/ml heparinázy (firmy IBEX, Kanada).
Realizuje sa stanovenie PTT ako v príklade 5.
Výsledky realizácie merania sú uvedené v tabulke 11.
Tabulka 11
heparín v plazme (j/ml) | 0 | 0,02 | heparináza j/ml | ||
0,07 | 0,22 | 0,74 | |||
0,0 | 33,6 | 33,6 | 33,1 | 3 3,6 | 38,3 |
0,5 | 52,4 | 45,8 | 41,8 | 37.7 | 41,4 |
1,0 | 85,8 | 65,6 | 50,8 | 4 7,3 | 42,3 |
Výsledky ukazujú, že sa tiež činidlo, obsahujúce heparinázu, i
výborne hodí pre aPTT-stanovenie heparinizovanej plazmy
Claims (19)
- PVPATENTOVÉ NÁROKY1. Iniciátor vnútorného zrážania krvi, plazmy alebo krných derivátov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zmes sulfatidov a pevnej látky-aktivátora, výhodne kaolínu.
- 2. Činidlo pre stanovenie aPTT, plazmy alebo krvných derivátov, vyznačujúce sa tým, že obsahuje zmes sulfatidov a pevnej látky-aktivátora, výhodne kaolínu, ako iniciátora vnútorného zrážania'a ďalej fosfolipidy.
- 3. Činidlo podlá nároku 2, vyznačujúce sa tým, že obsiahnuté fosfolipidy sú chemicky čisté fosfolipidy v štandardizovanej zmesi.
- 4. činidlo podlá nároku 3, vyznačujúce sa tým, že zmes fosfolipidov obsahuje, vztiahnuté na celkový obsah fosfolipidov, '
- 5 až 50 % fosfatidylserínu, 15 až 60 % fosfatidylcholínu, 15 až60 % fosfatidyletanolamínu, 0 až 20 % cholesterolu a 5 až 20 % kyseliny fosfatidínovej.5. Činidlo podlá jedného alebo viacerých nárokov 2 až 4, vyznačujúce sa tým, že ďalej obsahuje látku potláčajúcu oxidáciuÝ ’ ' -- · a/alebo látku zlepšujúcu citlivosť.
- 6. Činidlo podlá nároku 5, vyznačujúce sa tým, že obsahuje sol alkalického kovu, prípadne spolu s aminokyselinami.
- 7. Činidlo podlá jedného alebo viacerých nárokov 2 až 6, vyznačujúce sa tým, že ďalej obsahuje chromogénny substrát, s ktorým je prípadne možné stanoviť dobu zrážania fotometrický vývojom zafarbenia.0. činidlo podlá jedného alebo viacerých nárokov 2 až 7, vyznačujúce sa tým, že obsahuje ďalej stabilizátory, výhodne albumín a/alebo pufrovacie substancie. ' ·' . ’Z-“ :..ú
- 9. Činidlo podlá jedného alebo viacerých nárokov 2 až 8, vyznačujúce sa tým, že je y lyofilizovanej forme.
- 10. Spôsob výroby činidla podlá jedného alebo viacerých nárokov 2 až 9, vyznačujúci sa tým, že sa sulfatidy vo vodnej suspenzii pevnej látky - aktivátora zmiesia s fosfolipidmi a prípadne ďalšími látkami a prípadne sa lyofilizujú.
- 11. Spôsob výroby činidla podlá jedného alebo viacerých nárokov 2 až 9, vyznačujúci sa tým, že sa sulfatidy, pevná látka - aktivátor a fosfolipidy, prípadne po lyofilizácii, prípadne s ďalšími prísadami zmiesia v pevnom stave.
- 12. Spôsob stanovenia parciálnej trojmboplastínovej doby (aPTT) vzoriek krvi, plazmy alebo krvných derivátov, vyznačujúci sa tým, že sa vzorka uvedie do kontaktu s činidlom podlá jedného alebo viacerých nárokov 2 až 9, po stanovenej dobe sa pridajú ióny vápnika a stanoví sa doba zrážania.
- 13. Spôsob podlá nároku 12, vyznačujúci sa tým, že sa vzorka pred prídavkom činidla podlá jedného z nárokov 2 až 9 zmiesi so substanciou neutralizujúcou heparín.
- 14. Použitie spôsobu podlá nároku 12 alebo 13 pre stanovenie aktivity faktorov vnútorného zrážania a ich iňhibítorov, vyznačujúci sa tým, žé sa vzorka plazmy uvedie do kontaktu s činidlom podlá jedného z nárokov 2 až 9, po vopred stanovenej dobe aktivácie sa pridajú vápnikové ióny a stanoví sa doba zrážania, a získaný výsledok sa porovná so štandartnou vzorkou só známou aktivitou faktorov. ! .
- 15. Činidlo pre stanovenie aPTT prípadne heparín alebo heparinoidy obsahujúcej krvi, plazmy1 alebo krvných derivátov, obsahujúce iniciátor vnútorného zrážania, vyznačujúce sa tým, že obsahuje heparín - neutralizujúce činidlo a fosfolipid.
- 16. činidlo podľa nároku 15, vyznačujúce sa tým, že ako heparín - neutralizujúce činidlo obsahuje polybrén, protamínovú soľ, alebo heparinázu.
- 17. Činidlo podľa nároku 15 alebo 16, vyznačujúce sa tým, že fosfolipidová zložka obsahuje, vztiahnuté na celkový obsah fosfolipidov, 5 až 50 % fosfatidylserínu, 15 až 60 % fosfatidylcholínu, 15 až 60 %; fosfatidyletanolamínu, 0 až 20 % cholesterolu a 5 až 20 % kyseliny fosfatidínovej.
- 18. Spôsob stanovenia parciálnej tromboplastínovej doby (aPTT) vzoriek, obsahujúcich pripadne heparín - alebo heparinoid, krvi, plazmy alebo krvných derivátov, vyznačujúci sa tým, že sa vzorka uvedie do kontaktu s činidlom podľa jedného alebo viacerých nárokov 15 až 17, po vopred stanovenej dobe aktivácie sa pridajú vápnikové ióny a určí sa doba zrážania.1 , jr‘ ·
- 19. Použitie spôsobu podlá nároku 18 pre stanovenie aktivity faktorov vnútorného zrážania a ich inhibítorov, vyznačujúce sa tým, že sa vzorka plazmy, obsahujúca prípadne heparín alebo heparinoid, uvedie do kontaktu s činidlom podľa jedného z nárokov 15 až 17, po vopred stanovenej dobe aktivácie sa pridajú ióny vápnika a určí sa doba zrážania a získaný výsledok sa porovná so štandartnou vzorkou so známou aktivitoú faktorov.
- 20. Set, pozostávajúci za) činidla pre stanovenie aPTT, obsahujúceho iniciátor vnútorného zrážania a fosfolipidy ab) činidlo, neutralizujúce heparín
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT99892A AT398983B (de) | 1992-05-15 | 1992-05-15 | Reagens zur bestimmung der aptt |
AT84193A AT402074B (de) | 1993-04-30 | 1993-04-30 | Reagens zur bestimmung der aptt |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK48793A3 true SK48793A3 (en) | 1993-12-08 |
Family
ID=25594074
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK487-93A SK48793A3 (en) | 1992-05-15 | 1993-05-14 | Agent for determination aptt, process for its preparation and its use |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0570356B1 (sk) |
JP (1) | JPH0643169A (sk) |
AT (1) | ATE176822T1 (sk) |
CA (1) | CA2096212A1 (sk) |
CZ (1) | CZ87993A3 (sk) |
DE (1) | DE59309374D1 (sk) |
DK (1) | DK0570356T3 (sk) |
ES (1) | ES2130244T3 (sk) |
FI (1) | FI932195A (sk) |
HU (1) | HU216882B (sk) |
MX (1) | MX9302831A (sk) |
NO (1) | NO310126B1 (sk) |
SK (1) | SK48793A3 (sk) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4337278C2 (de) * | 1993-11-02 | 1996-09-05 | Wolf Dr Bertling | Kit zur individuellen Kontrolle einer Antikoagulantientherapie |
GR1002776B (el) * | 1996-12-02 | 1997-09-26 | . | Εξουδετερωση της αντιπηκτικης δρασης του συμπλεγματος της αντιθρομβινης-ιιι/ ηπαρινης, νεα δοκιμασια αποκαλυψης θρομβοφιλικων καταστασεων |
AT405692B (de) * | 1997-03-27 | 1999-10-25 | Immuno Ag | Reagens zur bestimmung der aptt |
ATE268477T1 (de) * | 1999-09-03 | 2004-06-15 | Roche Diagnostics Corp | Verfahren, reagenz und messkartusche zur bestimmung der gerinnungszeit |
US6448024B1 (en) | 2000-10-03 | 2002-09-10 | Roche Diagnostics Corporation | Method, reagent, cartridge, and device for determining fibrinogen |
JP2011133396A (ja) * | 2009-12-25 | 2011-07-07 | Sysmex Corp | 活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬、活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法、及び血液凝固抑制物質の有無の判定方法 |
CN107356769A (zh) * | 2017-06-23 | 2017-11-17 | 宁波艾科生物科技有限公司 | 一种液体即用型活化部分凝血活酶时间的检测试剂 |
CN107356768A (zh) * | 2017-06-23 | 2017-11-17 | 宁波艾科生物科技有限公司 | 一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1213198A (en) * | 1982-09-29 | 1986-10-28 | James E. Hughes | Diagnostic activated partial thromboplastin reagent |
DE3311287A1 (de) * | 1983-03-28 | 1984-10-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur fotometrischen bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit und reagenz dazu |
CH678892A5 (en) * | 1989-04-04 | 1991-11-15 | Pentapharm Ag | Heparin-sensitive reagent for measuring activated thromboplastin - contains cephalin, sulphate and additive, e.g. lidocaine, modifying sensitivity to heparin or lupus anticoagulant |
DE69120674T2 (de) * | 1990-04-17 | 1996-11-07 | Analytical Control Syst Inc | Koagulationsassays und reagenzien |
US5314695A (en) * | 1990-11-13 | 1994-05-24 | Corvas International, Inc. | Tissue factor based prothrombin time reagent |
-
1993
- 1993-05-12 DE DE59309374T patent/DE59309374D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-12 CZ CZ93879A patent/CZ87993A3/cs unknown
- 1993-05-12 DK DK93890099T patent/DK0570356T3/da not_active Application Discontinuation
- 1993-05-12 EP EP93890099A patent/EP0570356B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-12 ES ES93890099T patent/ES2130244T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-12 AT AT93890099T patent/ATE176822T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-05-13 CA CA002096212A patent/CA2096212A1/en not_active Abandoned
- 1993-05-14 FI FI932195A patent/FI932195A/fi unknown
- 1993-05-14 HU HU9301400A patent/HU216882B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 JP JP5112783A patent/JPH0643169A/ja active Pending
- 1993-05-14 NO NO931774A patent/NO310126B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 MX MX9302831A patent/MX9302831A/es unknown
- 1993-05-14 SK SK487-93A patent/SK48793A3/sk unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2096212A1 (en) | 1993-11-16 |
NO931774D0 (no) | 1993-05-14 |
DE59309374D1 (de) | 1999-03-25 |
NO310126B1 (no) | 2001-05-21 |
HU216882B (hu) | 1999-09-28 |
MX9302831A (es) | 1994-05-31 |
FI932195A0 (fi) | 1993-05-14 |
EP0570356A1 (de) | 1993-11-18 |
NO931774L (no) | 1993-11-16 |
ATE176822T1 (de) | 1999-03-15 |
ES2130244T3 (es) | 1999-07-01 |
CZ87993A3 (en) | 1994-02-16 |
EP0570356B1 (de) | 1999-02-17 |
DK0570356T3 (da) | 1999-09-20 |
HUT75667A (en) | 1997-05-28 |
HU9301400D0 (en) | 1993-09-28 |
JPH0643169A (ja) | 1994-02-18 |
FI932195A (fi) | 1993-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA1258221A (en) | Reagent for the determination of the prothrombin time | |
US5721140A (en) | Stable coagulation controls | |
AU705596B2 (en) | Method for specifically detecting a coagulation factor V which has an increased stability toward activated protein C in the activated state | |
JP4999613B2 (ja) | 血液凝固測定用試薬及び血液凝固時間測定方法 | |
US5726028A (en) | Method for detecting disturbances of the protein c/protein s system | |
SK48793A3 (en) | Agent for determination aptt, process for its preparation and its use | |
US5506112A (en) | Reagent used for determining factor VIII activity | |
US7220553B2 (en) | Use of Russell's viper venom-induced plasma factor Xa activity to monitor the activity of factor Xa inhibitors | |
AT405692B (de) | Reagens zur bestimmung der aptt | |
CA2065370C (en) | Factor viii:ca chromogenic assay | |
US6100050A (en) | Factor VIII:Ca chromogenic assay | |
US5753510A (en) | Calibrator for use in test methods for detecting a defective coagulation factor V | |
AU652737B2 (en) | Functional assay for determining the protein S activity | |
CA2039173C (en) | Factor ix chromogenic assay | |
EP0677171B1 (en) | Tetrahydroxyquinone as an activator component for activated partial thromboplastine time test of blood coagulation and as a detector of blood coagulation disorders | |
JPH0646898A (ja) | フィブリノーゲンの分析方法およびそのための試薬 | |
CA2329476C (en) | Ready-to-use ristocetin cofactor test reagent possessing long-term stability | |
JP6033084B2 (ja) | 血漿に基づく参照材料を用いた第xiii因子の測定方法 | |
JP7473282B1 (ja) | 凝固第xii因子欠乏血液検体の血液凝固時間短縮剤 | |
JP2024095611A (ja) | フィブリノゲンを決定する方法 | |
WO1996038585A1 (en) | Reagent for measuring blood coagulation activity |