Heparin ist ein im Organismus von Säugetieren vorkommendes, saures Polysaccharid, welches neben anderen physiologischen Aufgaben, eine Schlüsselfunktion in der Regulierung der Blutgerinnung ausübt.
Im Organismus liegt Heparin in verschiedenen polymeren Formen unterschiedlicher Molekülgrösse vor. Heparin verbindet sich mit den Plasmaproteinen Heparin-Cofaktor II und Antithrombin III zu hochwirksamen Inhibitoren für die Gerinnungsfaktoren IIa (Thrombin), VIIa, IXa, Xa, XIa und XIIa.
Aufgrund dieser Eigenschaften werden Heparin, Heparinderivate und synthetische Heparinanaloge häufig zur Behandlung und Verhütung thromboembolischer Erkrankungen in der Humanmedizin eingesetzt.
In Form seines Natriumsalzes wird Heparin als intravenöse Dauertropfinfusion oder intravenöse Injektion in hohen Dosen verabreicht. Zur Erzielung einer Depotwirkung wird es vorwiegend als Calciumsalz intracutan injiziert und für eine prophylaktische Behandlung wird Heparin meist über längere Zeiträume, in kleinen Dosen, intracutan oder subcutan verabreicht. In Form von niedermolekularen Fragmenten kann Heparin nicht nur parenteral sondern auch peroral zur Erzielung einer Thromboseprophylaxe gegeben werden.
Verschiedene molekulare Formen von Heparin hemmen die genannten Gerinnungsfaktoren nach einer unterschiedlichen Prioritätsordnung. Hochmolekulare Formen hemmen vorzugsweise Thrombin, während niedermolekulare Heparinderivate vorzugsweise Faktor Xa hemmen.
Aufnahme, Verteilung und Verweildauer im Organismus der verschiedenen Heparinpräparate, welche in unterschiedlichen Arzneiformen und über mehrere verschiedene Verabreichungswege angewendet werden, sind sehr verschieden und erfordern darum eine häufige, möglichst einfach und rasch durchführbare Therapiekontrolle. Eine Überwachung der durch Heparin verursachten Antikoagulation im Blut ist besonders wichtig, weil einerseits eine Heparin-Überdosis zu bedrohlichen Blutungen, und andererseits eine zu niedrige Dosierung bei thrombosegefährdeten Patienten zu thromboembolischen Zwischenfällen führen kann.
Eigenschaften, Wirkungen und medizinische Anwendung von Heparin sind bei J. FAREED, Seminars in Thrombosis and Haemostasis 11, Teile 1 und 2, Seiten 1-248 (1985) ausführlich beschrieben.
Die Überwachung der Heparintherapie kann dadurch erfolgen, dass man das in einer durch Hitze defibrinierten Plasmaprobe vorliegende Heparin auf eine vorgelegte, definierte Thrombinmenge einwirken lässt, die verbleibende, ungehemmte Thrombinaktivität mit einem geeigneten synthetischen, chromogenen Substrat bestimmt und daraus die Heparinaktivität in der untersuchten Plasmaprobe errechnet. Eine entsprechende Methode, welche als chromogenes Substrat Carbobenzoxy-glycyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilid verwendet, wurde von M. Roth und M. Haarsma in I. Witt (ed.), Neue Methoden der Gerinnungsanalyse mit chromogenen Substraten, Seiten 91-104, Berlin: de Gruyter (1977), beschrieben.
Diese photometrische Methode ist arbeitsaufwendig, erfordert ein schwer zu beschaffendes, stabiles, standardisiertes Thrombinreagenz sowie eine grosse Plasmaprobe. Überdies ist die Bestimmungsgenauigkeit durch die schwer zu normierende Hitzedefibrinierung mit anschliessender Zentrifugation der Probe stark beeinträchtigt.
Der Nachteil der genannten Hitzedefibrinierung wurde in einer von H. Lill et al., in: Neue Aspekte der Gerinnungsdiagnostik, L. Roka und E. Spanuth (eds.), Seiten 129-137, Stuttgart: Schattauer-Verlag (1984), beschriebenen Methode durch den Einsatz des wesentlich empfindlicheren Thrombinsubstrates Tosyl-glycyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilid und einer geringeren Plasmamenge überwunden.
Dadurch konnte die thrombin-hemmende Wirkung von 0,01 bis 0,2 USP-Einheiten Heparin pro ml Plasma erfasst werden.
Da nun aber niedermolekulare Heparinpräparate zwar eine antithrombotische Wirkung ausüben, dabei jedoch vor allem den Gerinnungsfaktor Xa hemmen und Thrombin nur geringfügig oder gar nicht beeinflussen, sind die beschriebenen photometrischen Methoden zur Überwachung einer Therapie mit niedermolekularem Heparin nicht brauchbar.
Unter Einsatz geeigneter, durch Faktor Xa spaltbarer chromogener Substrate wurden mehrere Methoden zur Messung der heparinbezogenen Anti-Faktor Xa-Aktivität in Plasma entwickelt. So beschreiben Aiach und Roncato, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 11, 108-111 (1985) photometrische Methoden, welche die Anti-Faktor Xa-Aktivität in Plasma bestimmen, welche darin bestehen, dass man die Plasmaprobe mit einem Überschuss an menschlichem oder bovinem, gereinigtem Faktor Xa reagieren lässt und hierauf den ungehemmt verbleibenden Faktor Xa mit dem chromogenen Substrat Methylsulfonyl-D-leucyl-glycyl-L-arginin-p-nitroanilid oder mit dem Substrat S-2337 (Kabi-Vitrum, Stockholm) bestimmt.
Diese Methoden erfassen zwar die spezifische Anti-Faktor Xa-Wirkung von Heparin, vernachlässigen jedoch dessen Hemmwirkung auf andere Blutgerinnungsfaktoren. Ausserdem erfordern diese Techniken die Verfügbarkeit des nach aufwendigen Verfahren aus Plasma zu isolierenden Gerinnungsfaktors X, welcher im aktivierten Zustand eine geringe Stabilität aufweist, was sich wiederum nachteilig auf die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Methode auswirkt.
Alle eingangs beschriebenen photometrischen Methoden erfordern den Einsatz von chromogenen Peptidsubstraten, welche in aufwendigen, mehrstufigen Reaktionen racematfrei synthetisiert werden müssen und bedingen den Einsatz eines temperatur-konstanten Photometers.
Nun wurde auch versucht, die Heparinbehandlung anhand der sehr einfach zu bestimmenden Thrombinzeit zu überwachen. Bei diesem Test setzt man dem Plasma eine exakt dosierte Menge Thrombin zu und misst die Zeit bis zum Gerinnungseintritt. Mit Plasma von gesunden Probanden wird der Normalwert ermittelt. Bei Patienten unter Heparintherapie verlängert sich die Thrombinzeit proportional zu der vorliegenden Heparinkonzentration im Plasma. Die Normalwerte liegen für diesen Test bei 18 bis 22 Sekunden, bei einer Heparinkonzentration von 0,2 bis 0,3 USP-Einheiten per ml ist die Thrombinzeit auf 40 bis 60 Sekunden verlängert. Diese an sich einfache Methode ist nicht genügend empfindlich, um eine niedrig dosierte Heparintherapie zu überwachen, bei welcher Heparinaktivitäten von lediglich 0,02 bis 0,06 USP-Einheiten per ml Plasma angestrebt werden.
Ausserdem spricht die Thrombingerinnungszeit nur auf thrombinhemmende, hochmolekulare Heparinpräparate an, ist jedoch gegenüber der Anti-Faktor Xa-Wirkung von niedermolekularen Heparinderivaten unempfindlich.
Es wurde auch versucht, einen weiteren, einfach durchzuführenden Globaltest der Blutgerinnungsanalytik, die sogenannte aktivierte Partialthromboplastinzeit (APTT = activated partial thromboplastin time), zur Therapiekontrolle bei Heparinpatienten einzusetzen. Die Bestimmung der APTT erfolgt dadurch, dass man einer Plasmaprobe ein geeignetes, dem menschlichen Plättchenfaktor 3 in Bezug auf seine gerinnungsfördernde Wirkung möglichst gleichwertiges Phospholipid und einen Kontaktaktivator für die Faktoren XII, XI und Präkallikrein zusetzt, nach einer angemessenen Inkubationszeit das Gerinnungssystem durch Zugabe von Calciumionen aktiviert und die Zeit bis zum Gerinnungseintritt misst.
Dieses Vorgehen stützt sich auf die Eigenschaft mehrerer Gerinnungsfaktoren, sich in Anwesenheit von Calciumionen, auf Phospholipidmembranen zu einem optimalen Reaktionsgemisch zu vereinen, welches den Gerinnungsablauf bei grösstmöglicher Geschwindigkeit bewirkt. Die Wechselwirkung zwischen Phospholipid und Blutgerinnungsfaktoren ist art- und sogar organspezifisch. Phospholipide aus einem bestimmten Organ verschiedener Tierarten oder aus verschiedenen Organen einer einzigen bestimmten Tierart bewirken an menschlichem Plasma eine unterschiedliche Gerinnungsaktivität. Eine Beschreibung der APTT-Methodik und ihrer diagnostischen Bedeutung findet sich bei K. Lechner, Blutgerinnungsstörungen, Seiten 157-164, Berlin, Springer-Verlag (1982).
Für einen allgemein brauchbaren Ansatz zur Bestimmung der APTT werden 0,1 ml Reagenz und 0,1 ml Patienten- oder Normalplasma in einem Reagenzglas gemischt. Die Mischung wird genau 2 Minuten bei 37 DEG C inkubiert und hierauf mit 0,1 ml 0,025 M Calciumchloridlösung versetzt. Als aktivierte Partialthromboplastinzeit (APTT) wird die Zeit von der Calciumzugabe bis zum Gerinnungseintritt gemessen.
Da die aktivierte Partialthromboplastinzeit von der Wechselwirkung aller Gerinnungsfaktoren des endogenen Gerinnungssystems, einschliesslich der Wirkung von Faktor Xa und Thrombin, abhängt, ist diese einfach durchführbare Globalmethode dazu geeignet, die Hemmwirkung von Heparin und Heparinderivaten auf sowohl Faktor Xa als auch auf Thrombin zu messen.
Die im Handel befindlichen APTT-Reagenzien weisen jedoch aufgrund ihrer verschiedenen Zusammensetzung eine unterschiedliche Heparinempfindlichkeit auf. Ausserdem weisen alle APTT-Reagenzien eine von der Herkunft, der Struktur der Fettsäurereste und vom Anteil von der in der Phospholipidkomponente enthaltenen Menge an Phosphatidylethanolamin und an Phosphatidylserin abhängige, unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber dem sogenannten Lupus-Antikoagulans auf. Unter "Lupus Antikoagulans" oder "Lupusinhibitoren" versteht man Antikörper, die gegen Phospholipide, insbesondere gegen Phosphatidylserin, gerichtet sind. Diese Antikörper wurden zuerst im Plasma von Patienten mit Lupus erythematodes entdeckt und später im Verlaufe verschiedener Infektionskrankheiten und allergischer Erkrankungen nachgewiesen. In Anwesenheit von Lupus Antikoagulans ist die APTT mehr oder weniger verlängert.
Eine ausführliche Beschreibung der Lupusinhibitoren findet sich bei D. Green, In: Hämostasis and Thrombosis, A.L. Bloom and D.P. Thomas (Eds.), Seiten 542-553, Churchill Livingstone, London (1987).
Im allgemeinen enthalten APTT-Reagenzien ein Phospholipid oder ein Phospholipidgemisch tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sowie einen wasserunlöslichen, partikelförmigen oder kolloidal löslichen Aktivator der Kontaktphase der Blutgerinnung. Als partikelförmige Aktivatoren werden Suspensionen von anorganischen Stoffen wie z.B. Kaolin, Glas, Erdalkalisilikate oder Kieselsäure eingesetzt; als kolloidal lösliche Aktivatoren werden z.B. Dextransulfat oder kolloidale Kieselsäure verwendet. Nach US-Patent 3 486 981 wird als Kontaktaktivator Ellagsäure verwendet. Nach DOS 3 311 287 A1 werden Sulfatide als Kontaktaktivatoren für eine photometrische APTT-Bestimmung mittels eines chromogenen Substrates eingesetzt. Sulfatide sind im tierischen Organismus weit verbreitete, saure Glycolipide, welche als physiologische Kontaktaktivatoren an der Blutstillung beteiligt sind.
Mit Reagenzien, welche partikelförmige anorganische Stoffe, kolloidale Kieselsäure oder Ellagsäure als Kontaktaktivatoren enthalten, bewirkt eine Plasma-Heparin-konzentration von 0,15 USP-Einheiten per ml eine messbare Verlängerung der aktivierten Partialthromboplastinzeit von ursprünglich ca. 30 Sekunden auf ca. 35 Sekunden, also eine Verlängerung der Gerinnungszeit um Faktor 1,17. Da aber zur Thromboseprophylaxe häufig ein Plasmaspiegel von nur 0,02 bis 0,06 USP-Einheiten eingestellt werden muss, genügt die Heparinempfindlichkeit dieser APTT-Reagenzien nicht.
Die partikelförmigen Aktivatoren, einschliesslich der kolloidalen Kieselsäure, üben ausserdem eine Adsorptionswirkung auf Plasmaproteine und Heparin aus, was Empfindlichkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der betreffenden Tests beeinträchtigt. Ein weiterer Nachteil von partikelförmigen anorganischen Kontaktaktivatoren besteht darin, dass das Testgemisch getrübt wird und sich daher nicht für photometrische Messungen eignet. Ferner neigen die eine hohe Dichte aufweisenden Aktivatorpartikel zur Sedimentation, was vor jedem Pipettiervorgang ein Aufrühren oder Schütteln solcher APTT-Reagenzien nötig macht.
Nach Bock et al., Biochemistry 20, 7258-7266 (1982), besitzt nicht Ellagsäure selbst, sondern ein unlöslicher, durch zufällige Verunreinigung entstandener Ellagsäure-Metallkomplex die eigentliche Kontaktaktivator-Wirkung. Deshalb weisen Ellagsäure enthaltende Reagenzien von Charge zu Charge grosse Qualitätsunterschiede auf und lassen sich nur schwer standardisieren.
Nach der Europäischen Patentanmeldung 85 102 281.4 kann die Heparinempfindlichkeit von APTT-Reagenzien durch Zusätze von Aryl-, Alkyl-, Cycloalkyl- oder Alkylarylsulfonaten erhöht werden.
Solche Substanzen, wie zum Beispiel Natriumlaurylsulfat oder Dodecylbenzolsulfonsäure-Natriumsalz sind jedoch chaotrope Agenzien, welche Proteine denaturieren, dadurch in die Reaktionen der Plasmagerinnung eingreifen und auf diese Weise das Testergebnis beeinflussen.
Mischt man z.B. Rinderhirn-Sulfatide mit Kaninchenhirn-Kephalin, so erhält man ein APTT-Reagenz, welches bereits empfindlich auf einen Plasma-Heparingehalt von nur 0,01 USP-Einheiten per ml reagiert.
Im Vergleich mit APTT-Reagenzien, welche anorganische, partikelförmige Aktivatoren oder Ellagsäure enthalten, ergeben jedoch sulfatidhaltige Reagenzien sowohl mit normalem als auch mit heparinhaltigem Plasma verhältnismässig lange Gerinnungszeiten. Dieser Umstand wirkt sich besonders dann nachteilig aus, wenn die Heparinkonzentration im Plasma mehr als 0,1 USP-Einheiten per ml beträgt. Mit dem nach DOS 3 311 287 A1 für einen photometrischen chromogenen Substrattest hergestellten Sulfatid-Kephalinreagenz zeigt normales Plasma eine APTT von 170 Sekunden.
In einem Gerinnungstest konnte mit einer wässrigen Sulfatid-Kephalinsuspension an Normalplasma eine Gerinnungszeit von 45 Sekunden, in Plasma mit 0,15 USP-Einheiten Heparin per ml eine Zeit von 428 Sekunden gemessen werden, während Plasma mit 0,2 USP-Einheiten und mehr per ml erst in einer ausserhalb des Messbereiches von 999 Sekunden liegenden Zeit gerann.
Diese langen Gerinnungszeiten erfordern eine für einen Routinetest unerwünscht lange Beobachtungszeit und sind schlecht reproduzierbar. Ausserdem sind die meisten halbautomatischen und automatischen Apparate zur Gerinnungszeitbestimmung gar nicht für derart lange Messperioden eingerichtet.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die Heparinempfindlichkeit von sulfatid- und kephalinhaltigen APTT-Reagenzien durch Zusatz von Aminobenzoesäureestern der allgemeinen Formel 1 und/oder von Aniliden oder substituierten Aniliden aliphatischer Dialkylaminocarbonsäuren der allgemeinen Formel 2 und/oder Aniliden oder substituierte Aniliden von Piperidincarbonsäurederivate der allgemeinen Formel 3, je nach Art und Konzentration der Zusatzstoffe, entweder erhöht oder vermindert wird.
Es wurde ferner gefunden, dass unter Verwendung von Sulfatiden, Kephalinen und mindestens einem Zusatzstoff gemäss Formel 1, 2 oder 3 in einer Konzentration von ca. 0,1 bis 2 mg per ml Lösung, APTT-Reagenzien hergestellt werden können, die mit Normalplasma eine Gerinnungszeit von 20 bis 40 Sekunden, mit 0,15 USP-Einheiten Heparin per ml enthaltendem Plasma jedoch eine um Faktor 2 bis 3,5 verlängerte Gerinnungszeit ergeben.
Um diesen günstigen Zeitmessbereich zu erreichen, werden vom Zusatzstoff Benoxinat ca. 0,1 bis ca. 1 mg per ml, und vom Zusatzstoff Lidocain ca. 0,3 bis 2 mg per ml Reagenzlösung benötigt.
Es wurde schliesslich gefunden, dass man aus Sulfatid-Kephalinsuspensionen, welche Substanzen der Formeln 1, 2 oder 3 enthalten, durch Zusatz von Puffern wie zum Beispiel HEPES-Puffer (Salze der (N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N min -(2-ethansulfonsäure)) sowie von Aminosäuren, Aminosäuregemischen oder Aminosäure-Peptidgemischen wie zum Beispiel Gelatinehydrolysat, und durch Lyophilisation haltbare Reagenzien gewinnen kann. Diese Reagenzien ergeben nach Auflösung in destilliertem Wasser, gebrauchsfertige, optisch transparente Lösungen mit gewünschter Heparinempfindlichkeit und/oder Empfindlichkeit auf Lupus-Antikoagulans. Diese Lösungen eignen sich für mechanische, photometrische, manuelle und automatische Testsysteme zur Bestimmung der aktivierten Partialthromboplastinzeit, insbesondere zur Überwachung einer Behandlung mit Heparin oder Heparinderivaten.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein zur Bestimmung der Heparinaktivität in menschlichem Blutplasma geeignetes Reagenz, welches mindestens ein Kephalin und mindestens ein Sulfatid enthält und dadurch gekennzeichnet ist, dass es zusätzlich mindestens einen, die Heparin- und Lupusantikoagulans-Empfindlichkeit modifizierenden Zusatzstoff der allgemeinen Formel 1, 2 oder 3 enthält:
EMI9.1
wobei in Formel 1 R<1> einen Alkylrest mit einer Kettenlänge von C1 bis C4 oder einen Mono- oder Dialkylaminomethyl-, -ethyl- oder -propylrest, in welchem die Alkylketten 1-4 Kohlenstoffatome enthalten, bezeichnet und R<2> Wasserstoff, Chlor oder einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder einen N-Mono- oder N-Dialkylaminoacylrest, dessen N-Alkylgruppen eine Kettenlänge von C1 bis C4 aufweisen und dessen Acylrest 1-3 Kohlenstoffatome enthält, bezeichnet,
EMI9.2
wobei in Formel 2 R<1 min > einen N-Mono- oder N-Dialkylaminoacylrest, dessen Alkylketten je 1-4 Kohlenstoffatome enthalten und dessen Acylrest 1-3 Kohlenstoffatome enthält, bezeichnet und R<2 min >, R<3 min > und R<4 min > Wasserstoff, Chlor oder einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen bezeichnen,
EMI10.1
wobei in Formel 3 R<1 min min >, R<2 min min > und R<3 min min > je Wasserstoff oder einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen bezeichnen.
Das erfindungsgemässe Reagens kann als Sulfatidkomponente mindestens eine Verbindung der folgenden Formel 4 enthalten:
EMI10.2
In der Formel 4 bezeichnet R einen gesättigten oder einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäurerest mit einer Kettenlänge von C12 bis C22.
Die Kephalinkomponente des erfindungsgemässen Reagenzes kann ein tierisches, pflanzliches oder synthetisch hergestelltes Phosphatidylethanolamin (Synonym: Colaminkephalin) der Formel 5:
EMI11.1
und/oder ein Phosphatidylserin (Synonym: Serinkephalin) der Formel 6 sein:
EMI11.2
In den Formeln 5 und 6 bezeichnen R<1> und R<2> gesättigte oder einfach oder mehrfach ungesättigte Alkylreste mit Kettenlängen von C11 bis C21.
Durch Auflösung des erfindungsgemässen Reagens in Wasser erhält man Reagenzlösungen, die sich zur Bestimmung der aktivierten Partialthromboplastinzeit eignen. Durch Zusatz dieser Reagenzlösungen zu menschlichem Blutplasma, welches Heparinkonzentrationen von 0 bis 0,3 USP-Einheiten per ml enthält, werden aktivierte Partialthromboplastinzeiten im Bereich von ca. 20 bis ca. 500 Sekunden erhalten. In Anwesenheit von 0,01 USP-Einheit Heparin pro ml menschlichem Blutplasma ist die mit den genannten Reagenzlösungen bestimmte, aktivierte Partialthromboplastinzeit gegenüber an einem an heparinfreiem Plasma bestimmten Zeitwert noch signifikant verlängert. Je nach der Natur und der Konzentration der erfindungsgemäss zugesetzten Stoffe der Formeln 1, 2 oder 3 erhält man Reaktionslösungen, die gegen Lupusantikoagulans besonders empfindlich oder besonders unempfindlich reagieren.
Bei der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Bestimmung der aktivierten Partialthromboplastinzeit von menschlichem Blutplasma kann der durch Fibrinbildung im Reaktionsgemisch bewirkte Gerinnungseintritt manuell, mechanisch oder durch photometrische Trübungsmessung ermittelt werden. Das erfindungsgemässe Verfahren kann aber auch unter Verwendung eines synthetischen chromogenen Thrombinsubstrates, wie zum Beispiel Tosyl-glycyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilid ausgeführt werden, indem man anstelle der Gerinnungszeit, die Zeit bis zum Auftreten einer bestimmten Thrombinaktivität im Reaktionsgemisch photometrisch, über freigesetztes Chromophor misst.
Beispiel 1
Herstellung eines heparinempfindlichen APTT-Reagens
1,5 g Glycin, 238,3 mg HEPES und 1 g Gelatinehydrolysat wurden in 100 ml dest. Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit NaOH auf 7,2 gestellt. In 50 ml dieser Lösung wurden 8 mg Rinderhirn-Sulfatide unter Rühren suspendiert; in den übrigen 50 ml der gepufferten Glycin-Gelatinelösung wurden 60 mg Kaninchenhirn-Kephalin gelöst. Die Sulfatidsuspension und die Kephalinlösung wurden vermischt und mit 50 mg Benoxinat-HCl versetzt. Der pH-Wert der Mischung wurde auf 7,2 eingestellt. Diese Lösung wurde in Portionen zu je 2,00 ml in Flaschen abgefüllt und lyophilisiert. Der Inhalt einer Flasche, in 2,00 ml dest.
Wasser aufgenommen, lieferte ein gebrauchsfertiges APTT-Reagenz mit einer aus Tabelle 1 ersichtlichen Heparinempfindlichkeit.
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Title: Tabelle 1:
Heparinempfindlichkeit
<tb>Head Col 01 AL=L: Heparinkonzentration
<tb>Head Col 02 AL=L: Gerinnungszeit
<tb>SubHead Col 01 AL=L>(USP-Einheiten/ml):
<tb>SubHead Col 02 AL=L>(Sekunden):
<tb> <SEP>0 <SEP>31,0
<tb> <SEP>0,02 <SEP>32,8
<tb> <SEP>0,04 <SEP>36,2
<tb> <SEP>0,08 <SEP>46,7
<tb> <SEP>0,2 <SEP>100,1
<tb> <SEP>0,4 <SEP>314,1
<tb></TABLE>
Beispiel 2
Empfindlichkeit gegenüber niedermolekularen Heparinderivaten
Mit dem gemäss Beispiel 1 hergestellten Reagenz wurde die aktivierte Partialthromboplastinzeit von Plasmaproben bestimmt, welche zuvor mit je 3 mu g/ml je eines niedermolekularen Heparinderivates verschiedener Provenienz versetzt wurden. Die Dosis von 3 mu g Heparinderivat per ml Plasma entspricht der therapeutisch angestrebten Blutkonzentration.
Die Empfindlichkeit des Reagenzes auf niedermolekulare Heparinvarianten ist aus Tabelle 2 ersichtlich.
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Title: Tabelle 2:
Einfluss von niedermolekularen Heparin-Präparaten auf die mit dem erfindungsgemässen Reagenz bestimmte APTT
<tb>Head Col 01 AL=L: Heparinderivat
<tb>Head Col 02 to 04 AL=L: Zusammensetzung (%) nach Molekülgrösse (kDa)
<tb>Head Col 05 AL=L:
APTT
<tb> <SEP>(3 mu g/ml Plasma)
<tb>SubHead Col 02 AL=L><2,5:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>2,5-7,5:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>>7,5:
<tb>SubHead Col 05 AL=L>(Sek.):
<tb> <SEP>ohne Zusatz <SEP>- <SEP>- <SEP>- <SEP>28,9
<tb> <SEP>Cy 222, Choay/Sanofi (F) <SEP>37,5 <SEP>58,5 <SEP>4 <SEP>33,5
<tb> <SEP>Fraxiparin< TM >, Choay/Sanofi (F) <SEP>4 <SEP>85 <SEP>11 <SEP>38,3
<tb> <SEP>Fragmin< TM >, Kabi-Vitrum (S) <SEP>3 <SEP>73 <SEP>24 <SEP>57,6
<tb> <SEP>Logiparin< TM TM >, Novo (DK) <SEP>19 <SEP>47 <SEP>34 <SEP>57,0
<tb> <SEP>Fluxin< TM TM >, Opocrin (I) <SEP>7 <SEP>56 <SEP>30 <SEP>61,6
<tb> <SEP>RD 11 885, Hepar Ind.
(USA) <SEP>10 <SEP>63 <SEP>27 <SEP>60,0
<tb> <SEP>Enoxaparin< TM TM >, Pharmuka (F) <SEP>14 <SEP>62 <SEP>24 <SEP>39,0
<tb> <SEP>Heparin (unfraktioniert) <SEP>2 <SEP>- <SEP>98 <SEP>>300
<tb></TABLE>
Beispiel 3
Einfluss verschiedener Zusatzstoffe gemäss Formeln 1, 2 oder 3 auf die APTT von normalem und von heparinhaltigem, menschlichem Plasma
Proben einer wässrigen, mittels HEPES auf pH 7,2 gepufferten Suspension von 0,6 mg Kaninchenhirn-Kephalin und 0,08 mg Rinderhirn-Sulfatid per ml, wurden in einer Konzentration von 1 mg pro ml Lipidsuspension, mit je einer der in Tabelle 3 aufgeführten Substanzen versetzt. Im Vergleich zu einer Kontrollprobe ohne Zusatz, wurde die APTT von normalem und heparinhaltigem (0,15 USP-Einheiten/ml) bestimmt. Zur Messung der APTT wurden 0,1 ml Plasma und 0,1 ml Reagenz gemischt, während 2 Minuten auf 37 DEG C erwärmt und hierauf mit 0,1 ml vorgewärmter 0,025 M Calciumchloridlösung versetzt.
Als APTT wurde die Zeit von der Calciumchloridzugabe bis zum Gerinnungseintritt gemessen.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>Title: Tabelle 3:
Einfluss verschiedener Substanzen gemäss Formel 4, 5 und 6 auf die APTT von Plasma mit und ohne Heparin
<tb>Head Col 01 AL=L: Zugesetzte Substanz
<tb>Head Col 02 AL=L: Trivialname
<tb>Head Col 03 to 04 AL=L:
Gerinnungszeit (Sek.)
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Normal-
plasma:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Heparin-
plasma:
<tb> <SEP>ohne Zusatz <SEP>44 <SEP>428
<tb> <SEP>4-Aminobenzoesäure-2-(diethylamino)-ethylester <SEP>Procain <SEP>25 <SEP>60
<tb> <SEP>4-Aminobenzoesäureethylester <SEP>Benzocain <SEP>25 <SEP>61
<tb> <SEP>4-Amino-3-butoxybenzoesäure(diethylamino)ethylester <SEP>Benoxinat <SEP>21 <SEP>60
<tb> <SEP>2-(Dimethylamino)-N-(2,6-dimethylphenyl)-acetamid <SEP>Lidocain <SEP>24 <SEP>60
<tb> <SEP>N(2,6-Dimethylphenyl)-1-methyl-2-piperidincarboxamid <SEP>Mepivacain <SEP>23 <SEP>54
<tb> <SEP>DL-N-Butylpipecolinsäure-2,6-xylidid <SEP>Bupivacain <SEP>23 <SEP>57
<tb></TABLE>
Beispiel 4
Einfluss verschiedener Zusatzstoffe gemäss Formel 1, 2 oder 3 auf die APTT von normalem und Lupus-Antikoagulans enthaltendem, menschlichem Plasma
Proben einer wässrigen, mittels HEPES auf pH 7,2 gepufferten Suspension von 0,6 mg Kaninchenhirn-Kephalin und 0,08 mg Rinderhirn-Sulfatid wurden in einer Konzentration von 1 mg pro ml Lipidsuspension mit je einem der in Tabelle 4 aufgeführten Zusatzstoffe versetzt. Mit jeder Reagenzprobe wurde die APTT von normalem, menschlichem Blutplasma und von Plasma eines Patienten mit Lupusantikoagulans (LAK) bestimmt.
Die Präsenz von LAK im Patientenplasma wurde durch den Nachweis von Anti-Phosphatidylantikörpern, sowie durch verschiedene Blutgerinnungstests verifiziert.
Die Resultate, welche eine unterschiedliche LAK-Empfindlichkeit der verschiedenen Proben nachweisen, sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>Title: Tabelle 4
<tb>Head Col 01 AL=L: Zusatzstoff
<tb>Head Col 02 to 04 AL=L: Gerinnungszeit (Sekunden)
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Normalplasma:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>LAK-Plasma:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Ratio:
<tb> <SEP>ohne Zusatz <SEP>42 <SEP>105 <SEP>2,5
<tb> <SEP>Benzocain <SEP>34,6 <SEP>54,0 <SEP>1,5
<tb> <SEP>Procain <SEP>36,4 <SEP>59,7 <SEP>1,6
<tb> <SEP>Lidocain <SEP>38,1 <SEP>56,9 <SEP>1,5
<tb> <SEP>Mepivacain <SEP>36,6 <SEP>55,2 <SEP>1,5
<tb> <SEP>Bupivacain <SEP>31,6 <SEP>51,5 <SEP>1,6
<tb></TABLE>
Heparin is an acidic polysaccharide that occurs in the mammalian organism and, among other physiological functions, plays a key role in regulating blood clotting.
In the organism, heparin is present in various polymeric forms of different molecular sizes. Heparin combines with the plasma proteins heparin cofactor II and antithrombin III to form highly effective inhibitors for the coagulation factors IIa (thrombin), VIIa, IXa, Xa, XIa and XIIa.
Because of these properties, heparin, heparin derivatives and synthetic heparin analogs are often used in the treatment and prevention of thromboembolic disorders in human medicine.
In the form of its sodium salt, heparin is administered as an intravenous drip or intravenous injection in high doses. To achieve a depot effect, it is mainly injected intracutaneously as calcium salt and for prophylactic treatment, heparin is usually administered over long periods, in small doses, intracutaneously or subcutaneously. In the form of low molecular weight fragments, heparin can be given not only parenterally but also orally to achieve thrombosis prophylaxis.
Different molecular forms of heparin inhibit the coagulation factors mentioned according to a different order of priority. High molecular forms preferentially inhibit thrombin, while low molecular heparin derivatives preferentially inhibit factor Xa.
The uptake, distribution and length of stay in the organism of the various heparin preparations, which are used in different dosage forms and over several different administration routes, are very different and therefore require frequent, easy and quick therapy control. Monitoring the anticoagulation in the blood caused by heparin is particularly important because, on the one hand, an overdose of heparin can lead to threatening bleeding, and, on the other hand, a too low dosage can lead to thromboembolic incidents in patients at risk of thrombosis.
Properties, effects and medical use of heparin are described in detail in J. FAREED, Seminars in Thrombosis and Haemostasis 11, parts 1 and 2, pages 1-248 (1985).
The heparin therapy can be monitored by allowing the heparin present in a heat sample that is defibrinated by heat to act on a defined, defined amount of thrombin, determining the remaining, uninhibited thrombin activity with a suitable synthetic, chromogenic substrate and calculating the heparin activity in the plasma sample under investigation . A corresponding method, which uses carbobenzoxy-glycyl-L-prolyl-L-arginine-p-nitroanilide as the chromogenic substrate, was described by M. Roth and M. Haarsma in I. Witt (ed.), New Methods of Coagulation Analysis with Chromogenic Substrates , Pages 91-104, Berlin: de Gruyter (1977).
This photometric method is labor-intensive, requires a difficult to obtain, stable, standardized thrombin reagent and a large plasma sample. In addition, the accuracy of determination is severely impaired by the heat defibrination, which is difficult to standardize, followed by centrifugation of the sample.
The disadvantage of the heat defibrination mentioned was described in one of H. Lill et al., In: New Aspects of Coagulation Diagnostics, L. Roka and E. Spanuth (eds.), Pages 129-137, Stuttgart: Schattauer-Verlag (1984) Method overcome by using the much more sensitive thrombin substrate tosyl-glycyl-L-prolyl-L-arginine-p-nitroanilide and a smaller amount of plasma.
As a result, the thrombin-inhibiting effect of 0.01 to 0.2 USP units of heparin per ml of plasma was recorded.
However, since low molecular weight heparin preparations exert an antithrombotic effect, but above all inhibit the coagulation factor Xa and influence thrombin only slightly or not at all, the photometric methods described for monitoring therapy with low molecular weight heparin cannot be used.
Using suitable chromogenic substrates that can be cleaved by factor Xa, several methods for measuring heparin-related anti-factor Xa activity in plasma have been developed. Aiach and Roncato, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 11, 108-111 (1985), describe photometric methods which determine the anti-factor Xa activity in plasma, which consist in that the plasma sample is treated with an excess of human or bovine, purified factor Xa can react and then the uninhibited factor Xa with the chromogenic substrate methylsulfonyl-D-leucyl-glycyl-L-arginine-p-nitroanilide or with the substrate S-2337 (Kabi-Vitrum, Stockholm) determined.
Although these methods record the specific anti-factor Xa effect of heparin, they neglect its inhibitory effect on other blood coagulation factors. In addition, these techniques require the availability of the coagulation factor X, which has to be isolated from plasma by complex processes, which has a low stability in the activated state, which in turn has a disadvantageous effect on the reproducibility and accuracy of the method.
All of the photometric methods described at the outset require the use of chromogenic peptide substrates, which have to be synthesized in complex, multistage reactions without racemate and require the use of a temperature-constant photometer.
Attempts have now also been made to monitor the heparin treatment using the thrombin time, which is very easy to determine. In this test, an exactly metered amount of thrombin is added to the plasma and the time taken for the clot to occur is measured. The normal value is determined with plasma from healthy volunteers. In patients receiving heparin therapy, the thrombin time increases in proportion to the heparin concentration in the plasma. The normal values for this test are 18 to 22 seconds, with a heparin concentration of 0.2 to 0.3 USP units per ml the thrombin time is extended to 40 to 60 seconds. This method, which is simple in itself, is not sufficiently sensitive to monitor a low-dose heparin therapy in which heparin activities of only 0.02 to 0.06 USP units per ml of plasma are aimed for.
In addition, the thrombin coagulation time only responds to thrombin-inhibiting, high-molecular-weight heparin preparations, but is insensitive to the anti-factor Xa effect of low-molecular-weight heparin derivatives.
An attempt was also made to use a further, easy-to-perform global test for blood coagulation analysis, the so-called activated partial thromboplastin time (APTT = activated partial thromboplastin time), for therapy control in heparin patients. The APTT is determined by adding a suitable phospholipid, equivalent to human platelet factor 3 in terms of its coagulation-promoting effect and a contact activator for factors XII, XI and precallikrein, to a plasma sample, after a suitable incubation period by adding calcium ions activated and measures the time to coagulation.
This procedure is based on the property of several coagulation factors to combine in the presence of calcium ions on phospholipid membranes to form an optimal reaction mixture which causes the coagulation process to take place at the greatest possible speed. The interaction between phospholipid and blood coagulation factors is species and even organ specific. Phospholipids from a specific organ of different animal species or from different organs of a single specific animal species cause a different coagulation activity on human plasma. A description of the APTT methodology and its diagnostic importance can be found in K. Lechner, Blood Coagulation Disorders, pages 157-164, Berlin, Springer-Verlag (1982).
For a general approach to determining APTT, 0.1 ml of reagent and 0.1 ml of patient or normal plasma are mixed in a test tube. The mixture is incubated for exactly 2 minutes at 37 ° C. and 0.1 ml of 0.025 M calcium chloride solution are then added. The activated partial thromboplastin time (APTT) is the time from the addition of calcium to the onset of coagulation.
Since the activated partial thromboplastin time depends on the interaction of all coagulation factors in the endogenous coagulation system, including the effects of factor Xa and thrombin, this easy-to-use global method is suitable for measuring the inhibitory effect of heparin and heparin derivatives on both factor Xa and thrombin.
However, the commercially available APTT reagents have different heparin sensitivity due to their different composition. In addition, all APTT reagents have a different sensitivity to the so-called lupus anticoagulant, depending on the origin, the structure of the fatty acid residues and the proportion of the amount of phosphatidylethanolamine and phosphatidylserine contained in the phospholipid component. “Lupus anticoagulant” or “lupus inhibitors” means antibodies which are directed against phospholipids, in particular against phosphatidylserine. These antibodies were first discovered in the plasma of patients with lupus erythematosus and later detected in the course of various infectious and allergic diseases. In the presence of lupus anticoagulant, the APTT is more or less prolonged.
A detailed description of the lupus inhibitors can be found in D. Green, In: Haemostasis and Thrombosis, A.L. Bloom and D.P. Thomas (Eds.), Pp. 542-553, Churchill Livingstone, London (1987).
In general, APTT reagents contain a phospholipid or a phospholipid mixture of animal or vegetable origin and a water-insoluble, particulate or colloidally soluble activator of the contact phase of the blood coagulation. Suspensions of inorganic substances such as e.g. Kaolin, glass, alkaline earth silicates or silica used; as colloidally soluble activators e.g. Dextran sulfate or colloidal silica is used. According to US Pat. No. 3,486,981, ellagic acid is used as the contact activator. According to DOS 3 311 287 A1, sulfatides are used as contact activators for a photometric APTT determination using a chromogenic substrate. Sulfatides are widespread, acidic glycolipids in the animal organism, which are involved as physiological contact activators in hemostasis.
With reagents containing particulate inorganic substances, colloidal silica or ellagic acid as contact activators, a plasma heparin concentration of 0.15 USP units per ml results in a measurable increase in the activated partial thromboplastin time from originally approx. 30 seconds to approx. 35 seconds, an extension of the clotting time by a factor of 1.17. However, since a plasma level of only 0.02 to 0.06 USP units often has to be set for thrombosis prophylaxis, the heparin sensitivity of these APTT reagents is not sufficient.
The particulate activators, including the colloidal silica, also exert an adsorption effect on plasma proteins and heparin, which affects the sensitivity, accuracy and reproducibility of the tests in question. Another disadvantage of particulate inorganic contact activators is that the test mixture becomes cloudy and is therefore not suitable for photometric measurements. Furthermore, the high-density activator particles tend to sediment, which makes it necessary to stir or shake such APTT reagents before each pipetting process.
According to Bock et al., Biochemistry 20, 7258-7266 (1982), it is not ellagic acid itself, but an insoluble ellagic acid-metal complex formed by accidental contamination that has the actual contact activator effect. For this reason, reagents containing ellagic acid show great differences in quality from batch to batch and are difficult to standardize.
According to European patent application 85 102 281.4, the heparin sensitivity of APTT reagents can be increased by adding aryl, alkyl, cycloalkyl or alkylarylsulfonates.
However, such substances as sodium lauryl sulfate or sodium dodecylbenzenesulfonic acid are chaotropic agents which denature proteins, thereby interfering with the reactions of plasma coagulation and in this way influencing the test result.
If you mix e.g. Bovine brain sulfatide with rabbit brain cephalin, an APTT reagent is obtained which is already sensitive to a plasma heparin content of only 0.01 USP units per ml.
Compared with APTT reagents that contain inorganic, particulate activators or ellagic acid, however, sulfatide-containing reagents with both normal and heparin-containing plasma give relatively long clotting times. This fact is particularly disadvantageous if the heparin concentration in the plasma is more than 0.1 USP units per ml. With the sulfatide-cephaline reagent prepared according to DOS 3 311 287 A1 for a photometric chromogenic substrate test, normal plasma shows an APTT of 170 seconds.
In a coagulation test, a clotting time of 45 seconds could be measured with an aqueous sulfatide cephaline suspension on normal plasma, in plasma with 0.15 USP units of heparin per ml a time of 428 seconds, while plasma with 0.2 USP units and more per ml only clot in a time outside the measuring range of 999 seconds.
These long clotting times require an undesirably long observation time for a routine test and are difficult to reproduce. In addition, most of the semi-automatic and automatic devices for determining the clotting time are not set up for such long measuring periods.
Surprisingly, it has now been found that the heparin sensitivity of sulfate and cephalin-containing APTT reagents by adding aminobenzoic acid esters of the general formula 1 and / or anilides or substituted anilides of aliphatic dialkylaminocarboxylic acids of the general formula 2 and / or anilides or substituted anilides of piperidinecarboxylic acid derivatives of the general derivatives 3, depending on the type and concentration of the additives, either increased or decreased.
It has also been found that using sulfatides, cephalins and at least one additive according to formula 1, 2 or 3 in a concentration of approximately 0.1 to 2 mg per ml of solution, APTT reagents can be prepared which with a normal plasma Clotting time of 20 to 40 seconds, but with 0.15 USP units of heparin per ml of plasma, the clotting time is increased by a factor of 2 to 3.5.
To achieve this favorable time measurement range, about 0.1 to about 1 mg per ml of the additive benoxinate and about 0.3 to 2 mg per ml of the reagent solution of the additive lidocaine are required.
It was finally found that from sulfatide cephaline suspensions containing substances of the formulas 1, 2 or 3, by adding buffers such as HEPES buffers (salts of (N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N min - ( 2-ethanesulfonic acid)) and of amino acids, amino acid mixtures or amino acid-peptide mixtures such as gelatin hydrolyzate, and can obtain durable reagents by lyophilization, which, after being dissolved in distilled water, give ready-to-use, optically transparent solutions with the desired heparin sensitivity and / or sensitivity to lupus Anticoagulant These solutions are suitable for mechanical, photometric, manual and automatic test systems for determining the activated partial thromboplastin time, in particular for monitoring treatment with heparin or heparin derivatives.
The present invention now relates to a reagent which is suitable for determining the heparin activity in human blood plasma and which contains at least one cephalin and at least one sulfatide and is characterized in that it additionally comprises at least one additive of the general formula 1 which modifies the sensitivity to heparin and lupus anticoagulants, 2 or 3 contains:
EMI9.1
where in formula 1 R 1 denotes an alkyl radical with a chain length from C1 to C4 or a mono- or dialkylaminomethyl, ethyl or propyl radical in which the alkyl chains contain 1-4 carbon atoms and R 2 denotes hydrogen, Denotes chlorine or an alkyl radical with 1-4 carbon atoms or an N-mono- or N-dialkylaminoacyl radical, the N-alkyl groups of which have a chain length from C1 to C4 and the acyl radical contains 1-3 carbon atoms,
EMI9.2
where in formula 2 R <1 min> denotes an N-mono- or N-dialkylaminoacyl radical, the alkyl chains of which each contain 1-4 carbon atoms and the acyl radical contains 1-3 carbon atoms, and R <2 min>, R <3 min> and R <4 min> denote hydrogen, chlorine or an alkyl radical with 1-4 carbon atoms,
EMI10.1
where in formula 3 R <1 min min>, R <2 min min> and R <3 min min> each denote hydrogen or an alkyl radical with 1-4 carbon atoms.
The reagent according to the invention can contain at least one compound of the following formula 4 as sulfatide component:
EMI10.2
In formula 4, R denotes a saturated or mono- or polyunsaturated fatty acid residue with a chain length of C12 to C22.
The cephaline component of the reagent according to the invention can be an animal, vegetable or synthetically produced phosphatidylethanolamine (synonym: colamine kephalin) of the formula 5:
EMI11.1
and / or a phosphatidylserine (synonym: serine cephalin) of the formula 6:
EMI11.2
In formulas 5 and 6, R 1 and R 2 denote saturated or mono- or polyunsaturated alkyl radicals with chain lengths from C11 to C21.
By dissolving the reagent according to the invention in water, reagent solutions are obtained which are suitable for determining the activated partial thromboplastin time. By adding these reagent solutions to human blood plasma, which contains heparin concentrations of 0 to 0.3 USP units per ml, activated partial thromboplastin times in the range from approximately 20 to approximately 500 seconds are obtained. In the presence of 0.01 USP unit of heparin per ml of human blood plasma, the activated partial thromboplastin time determined with the reagent solutions mentioned is still significantly extended compared to a time value determined on heparin-free plasma. Depending on the nature and the concentration of the substances of the formulas 1, 2 or 3 added according to the invention, reaction solutions are obtained which are particularly sensitive or particularly insensitive to lupus anticoagulant.
When the method according to the invention for determining the activated partial thromboplastin time of human blood plasma is carried out, the coagulation caused by fibrin formation in the reaction mixture can be determined manually, mechanically or by photometric turbidity measurement. However, the process according to the invention can also be carried out using a synthetic chromogenic thrombin substrate, such as, for example, tosyl-glycyl-L-prolyl-L-arginine-p-nitroanilide, by instead of the clotting time, the time until a certain thrombin activity occurs in the reaction mixture measures photometrically via released chromophore.
example 1
Preparation of an APTT reagent sensitive to heparin
1.5 g glycine, 238.3 mg HEPES and 1 g gelatin hydrolyzate were in 100 ml dist. Water dissolved. The pH of the solution was adjusted to 7.2 with NaOH. 8 mg of bovine brain sulfatides were suspended in 50 ml of this solution with stirring; 60 mg of rabbit brain cephaline were dissolved in the remaining 50 ml of the buffered glycine gelatin solution. The sulfatide suspension and the cephaline solution were mixed and 50 mg of benoxinate HCl were added. The pH of the mixture was adjusted to 7.2. This solution was bottled in 2.00 ml portions and lyophilized. The contents of a bottle, in 2.00 ml of dist.
When taken up in water, it gave a ready-to-use APTT reagent with a heparin sensitivity shown in Table 1.
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> Title: Table 1:
Heparin sensitivity
<tb> Head Col 01 AL = L: heparin concentration
<tb> Head Col 02 AL = L: clotting time
<tb> SubHead Col 01 AL = L> (USP units / ml):
<tb> SubHead Col 02 AL = L> (seconds):
<tb> <SEP> 0 <SEP> 31.0
<tb> <SEP> 0.02 <SEP> 32.8
<tb> <SEP> 0.04 <SEP> 36.2
<tb> <SEP> 0.08 <SEP> 46.7
<tb> <SEP> 0.2 <SEP> 100.1
<tb> <SEP> 0.4 <SEP> 314.1
<tb> </TABLE>
Example 2
Sensitivity to low molecular weight heparin derivatives
The activated partial thromboplastin time of plasma samples was determined with the reagent prepared according to Example 1, to which 3 μg / ml each of a low molecular weight heparin derivative of different provenance had been added beforehand. The dose of 3 μg of heparin derivative per ml of plasma corresponds to the therapeutically targeted blood concentration.
The sensitivity of the reagent to low molecular weight heparin variants is shown in Table 2.
<tb> <TABLE> Columns = 5
<tb> Title: Table 2:
Influence of low molecular weight heparin preparations on the APTT determined with the reagent according to the invention
<tb> Head Col 01 AL = L: heparin derivative
<tb> Head Col 02 to 04 AL = L: composition (%) according to molecular size (kDa)
<tb> Head Col 05 AL = L:
APTT
<tb> <SEP> (3 μg / ml plasma)
<tb> SubHead Col 02 AL = L> & lt2.5:
<tb> SubHead Col 03 AL = L> 2.5-7.5:
<tb> SubHead Col 04 AL = L> & gt7.5:
<tb> SubHead Col 05 AL = L> (sec.):
<tb> <SEP> without addition <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 28.9
<tb> <SEP> Cy 222, Choay / Sanofi (F) <SEP> 37.5 <SEP> 58.5 <SEP> 4 <SEP> 33.5
<tb> <SEP> Fraxiparin <TM>, Choay / Sanofi (F) <SEP> 4 <SEP> 85 <SEP> 11 <SEP> 38.3
<tb> <SEP> Fragmin <TM>, Kabi-Vitrum (S) <SEP> 3 <SEP> 73 <SEP> 24 <SEP> 57.6
<tb> <SEP> Logiparin <TM TM>, Novo (DK) <SEP> 19 <SEP> 47 <SEP> 34 <SEP> 57.0
<tb> <SEP> Fluxin <TM TM>, Opocrin (I) <SEP> 7 <SEP> 56 <SEP> 30 <SEP> 61.6
<tb> <SEP> RD 11 885, Hepar Ind.
(USA) <SEP> 10 <SEP> 63 <SEP> 27 <SEP> 60.0
<tb> <SEP> Enoxaparin <TM TM>, Pharmuka (F) <SEP> 14 <SEP> 62 <SEP> 24 <SEP> 39.0
<tb> <SEP> heparin (unfractionated) <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 98 <SEP> & gt300
<tb> </TABLE>
Example 3
Influence of various additives according to formulas 1, 2 or 3 on the APTT of normal and heparin-containing human plasma
Samples of an aqueous suspension of 0.6 mg of rabbit brain cephaline and 0.08 mg of bovine brain sulfatide per ml, buffered to pH 7.2 by means of HEPES, were in a concentration of 1 mg per ml of lipid suspension, each with one of those in Table 3 listed substances added. In comparison to a control sample without additive, the APTT was determined to be normal and heparin-containing (0.15 USP units / ml). To measure the APTT, 0.1 ml of plasma and 0.1 ml of reagent were mixed, heated to 37 ° C. for 2 minutes and then mixed with 0.1 ml of prewarmed 0.025 M calcium chloride solution.
The time from the addition of calcium chloride to the onset of coagulation was measured as APTT.
<tb> <TABLE> Columns = 4
<tb> Title: Table 3:
Influence of various substances according to formulas 4, 5 and 6 on the APTT of plasma with and without heparin
<tb> Head Col 01 AL = L: added substance
<tb> Head Col 02 AL = L: trivial name
<tb> Head Col 03 to 04 AL = L:
Clotting time (sec.)
<tb> SubHead Col 03 AL = L> Normal
plasma:
<tb> SubHead Col 04 AL = L> heparin
plasma:
<tb> <SEP> without addition <SEP> 44 <SEP> 428
<tb> <SEP> 4-aminobenzoic acid 2- (diethylamino) ethyl ester <SEP> procaine <SEP> 25 <SEP> 60
<tb> <SEP> 4-aminobenzoic acid ethyl ester <SEP> benzocaine <SEP> 25 <SEP> 61
<tb> <SEP> 4-amino-3-butoxybenzoic acid (diethylamino) ethyl ester <SEP> benoxinate <SEP> 21 <SEP> 60
<tb> <SEP> 2- (dimethylamino) -N- (2,6-dimethylphenyl) -acetamide <SEP> lidocaine <SEP> 24 <SEP> 60
<tb> <SEP> N (2,6-dimethylphenyl) -1-methyl-2-piperidinecarboxamide <SEP> mepivacaine <SEP> 23 <SEP> 54
<tb> <SEP> DL-N-butylpipecolic acid-2,6-xylidide <SEP> bupivacaine <SEP> 23 <SEP> 57
<tb> </TABLE>
Example 4
Influence of various additives according to formula 1, 2 or 3 on the APTT of normal human plasma containing lupus anticoagulant
Samples of an aqueous suspension of 0.6 mg of rabbit brain cephaline and 0.08 mg of bovine brain sulfatide buffered to pH 7.2 by means of HEPES were mixed with one of the additives listed in Table 4 in a concentration of 1 mg per ml of lipid suspension. With each reagent sample, the APTT was determined from normal human blood plasma and from plasma from a patient with lupus anticoagulant (LAK).
The presence of LAK in the patient's plasma was verified by the detection of anti-phosphatidyl antibodies and by various blood coagulation tests.
The results, which demonstrate a different LAK sensitivity of the different samples, are summarized in Table 4.
<tb> <TABLE> Columns = 4
<tb> Title: Table 4
<tb> Head Col 01 AL = L: additive
<tb> Head Col 02 to 04 AL = L: clotting time (seconds)
<tb> SubHead Col 02 AL = L> normal plasma:
<tb> SubHead Col 03 AL = L> LAK plasma:
<tb> SubHead Col 04 AL = L> Ratio:
<tb> <SEP> without addition <SEP> 42 <SEP> 105 <SEP> 2.5
<tb> <SEP> Benzocaine <SEP> 34.6 <SEP> 54.0 <SEP> 1.5
<tb> <SEP> Procain <SEP> 36.4 <SEP> 59.7 <SEP> 1.6
<tb> <SEP> Lidocaine <SEP> 38.1 <SEP> 56.9 <SEP> 1.5
<tb> <SEP> Mepivacaine <SEP> 36.6 <SEP> 55.2 <SEP> 1.5
<tb> <SEP> Bupivacaine <SEP> 31.6 <SEP> 51.5 <SEP> 1.6
<tb> </TABLE>