CZ81997A3

CZ81997A3 - Pharmaceutical preparation for treating disorders connected with blood clotting, process of its preparation and use

Info

Publication number: CZ81997A3
Application number: CZ97819A
Authority: CZ
Inventors: Peter Dr Turecek; Hans-Peter Prof Schwarz; Johann Dr Eibl
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 1997-10-15
Also published as: US5866122A; AU763466B2; AU1645197A; EP0796623B1; HU9700603D0; AU7185600A; JPH1045620A; US6224862B1; DK0796623T3; US6165974A; EP0796623A3; AU2003204479B2; ATE296109T1; DE59712322D1; CA2200394A1; EP0796623A2; US6099837A; SI0796623T1; HUP9700603A3; AU725442B2

Description

(57) Anotace:

Popisu je se farmaceutický preparát k ošetřování poruch srážlivosti krve, který jako aktivní složky obsahuje čištěné faktory protrombinázy, obzvláště čištěný protrombin a případně čištěný faktor Xa.

CZ 819-97 A3

-1#14'^

^oopbahaí^2, KůBwW*4

Farmaceutický preparát pro ošetření poruch srážlivosti krve, způsob jeho výroby a jeho použití

Oblast techniky

Předložený vynález se týká farmaceutického preparátu, obzvláště k ošetřování poruch srážlivosti krve, obsahující faktory srážlivosti, které jsou součástí protrombinázy případně pro-protrombinázy.

Dosavadní stav techniky

Protrombináza je komplex enzymových substrátů, který se tvoří na povrchu fosfolipidů a umožňuje aktivaci protrombinu. Protrombináza sestává podle definice z faktoru II (protrombin), aktivovaného faktoru X (faktor Xa), kofaktoru V případně Va, fosfolipidů a iontů vápníku. Tyto faktory se vyskytují in vivo jako přechodové komplexy k aktivaci protrombinu a tvorbě trombinu.

Odpovídající protrombináza je definována jako komplex faktorů, které jsou nejméně částečně modifikovány nebo aktivovány ke tvorbě protrombinázy. Pro-protrombinázu je proto třeba chápat jako předstupeň protrombinázy a jako komplex, ve kterém se jedna nebo více složek vyskytuje ve svých předstupních, jako zymogeny nebo jako proformy a který se tvoří na základě vzájemné afinity složek.

Hemofilie A vzniká na základě X-chromozomálního recesi vně dědičného nedostatku faktoru VIII a manifestuje se

co<

o

-2těžkými poruchami krevní srážlivosti. K zastavení aktuálního krváceni se většinou nasazují proteinové koncentráty plazmy aktivní z hlediska srážení, převážně koncentráty faktoru VIII. Při klasickém ošetřování pacientů s hemofilií A pre- pařáty s faktorem VIII dochází však přibližně ve 20 % případů ke tvorbě protilátek proti faktoru VIII, které vedou k inhibici účinku podaného faktoru VIII. Hovoří se o tom, že pacient vytvořil funkční inhibitor proti faktoru VIII a vyvinula se tak zvaná hemofilie inhibovaného faktoru VIII nebo získaná hemofilie.

K terapii pacientů s hemofilií A s hemofilií inhibovaného faktoru VIII se v současnosti používá více metod :

1. Ošetření vysokými dávkami preparátu faktoru VIII :

Tím se in vivo neutralizují protilátky orientované proti faktoru VIII a přebytečný faktor VIII může rozvinout svojí hemostatickou aktivitu kofaktoru. Opakovaným podáváním po delší časové období se dotčený pacient desenzibiluje proti faktoru VIII a v mnoha případech se může následně podrobit obvyklé terapii koncentrátem faktoru VIII. Tento postup vyžaduje mimořádně velká množství faktoru VIII, je časově náročný a může být z počátku ošetřování spojen s masivními anafylaktickými vedlejšími účinky.

2. Ošetření pacientů s inhibici faktoru VIII imunoglobulinovými preparáty, obsahujícími antiidiotypické protilátky faktoru VIII :

Tento způsob terapie je v současné době předmětem intenzivního výzkumu. Z hlediska účinnosti takového ošetřování dnes ještě neexistuje možnost konečného

-3posouzení.

3. Imunoadsorpce :

Další nákladná metoda k odstranění inhibitorů faktoru VIII je extrakorporální imunoadsorpce buďto na lektiny, které váží imunoglobuliny (protein A, protein G) nebo na imobilizovaný faktor VIII, na kterém se váží protilátky vytvořené proti faktoru VIII. Tato metoda je pro pacienta náročná, protože pacient je přitom vázán na aferezní přístroj , nemusí stejně jako výše uvedené způsoby vést k zastavení akutního krvácení a kromě toho je drahá.

4. APCC a deriváty :

Variantní terapií je v současné době podávání aktivovaných koncentrátů protrombinových komplexů (APCC), FEIBA , n _z

AUTOPLEX , které se mohou použít k zastavení akutního krvácení u pacientů také s vysokým titrem inhibitorů (viz příkladně DE-PS 31 27 318 (2)).

Na základě aktivovaných koncentrátů protrombinových komplexních faktorů byla navržena složka, která je v nich mezi jiným také obsažena, totiž aktivovaný faktor Vila, jako terapeutický princip pro pacienty s inhibicí faktoru VIII cestou vnějšího srážení. Odpovídající preparát, totiž rekombinantní faktor Vila, se toho času klinicky zkouší (Hedner et al., Transfusion Medicine Reviews 7 (2): 78-83 (1993)). Preklinická vyšetření, příkladně na psech s hemofilií A, však ukázala, že ošetřování s rekombinantním faktorem Vila není efektivní. Podobně také úspěšnost při použití na lidech je jen kolísající. Další nevýhoda rekombinantního faktoru Vila spočívá v tom, že se na základě jeho

-4krátkého poločasu in vivo musí podávat ve vysokých denních dávkách, aby se, pokud vůbec, zvládla velká krvácení. V takových případech se zkouší podávat faktor Vila s antifibrinolytiky k podpoře účinku.

V literatuře (příkladně DE 44 16 180 Al) se také navrje použít terapeuticky k ošetření pacientů s inhibici hemofilie A kombinaci faktoru Xa a fosfolipidu. Pokusy in vivo na psech s deficitním faktorem VIII ukázaly, že taková kombinace při vhodném dávkování je schopna utišit akutní krvácení. Terapeutická šíře takového preparátu je však poměrně malá, protože efektivní a trombogenní dávka, což se může prokázat příkladně modelem podle Vesslera na králících, spolu těsně souvisejí, takže obzvláště fofsfolipidy představují zvýšené riziko trombogenicity.

Předložený vynález si klade za úkol odstranit nevýhody citovaných metod a poskytnout k dispozici terapeutický princip k ošetřování poruch krvácivosti, obzvláště k ošetřování hemofilie inhibovaného faktoru VIII, který umožní jednoduché použití, efektivní nástup účinku, prodlouženou dobu poločasu a zabránění vedlejších trombogenních účinků.

Podstata vynálezu

Tento úkol se řeší způsobem podle vynálezu farmaceutickým preparátem k ošetřování poruch krvácivosti, který obsahuje jako aktivní složku nejméně dva faktory srážlivosti, které jsou součástí protrombinázy nebo pro-protrombinázy, obzvláště preparátem obsahujícím čištěný protrombin a čištěný faktor Xa jako aktivní složky, přičemž s výhodou je jeden z faktorů s výjimkou protrombinu aktivován. Slož-5ky jsou s výhodou vyčištěny nejméně tak, že neobsahují endogenní, to znamená z výchozího materiálu pocházej ící fosfolipidy, ale také obzvláště fosfolipidovesikula.

Tím se na jedné straně podchytí předčasná tvorba trombinu a zaručí se stabilita farmaceutického přípravku a na druhé straně se minimalizuje riziko tromboembolických vedlejších účinků.

Směs, případně komplex z nejméně dvou složek se podle vynálezu rozumí jako parciální protrombináza.

Vedle složek protrombinázy případně pro-protrombinázy jsou s výhodou obsaženy další faktory krevní srážlivosti a fibrinolyzy, aby se dosáhlo snižujícího účinku, obzvláště posílení, zeslabení, urychlení nebo zpoždění hemostázy.

Z toho vyplývá, že mohou být dále obsaženy aktivátory nebo proaktivátory srážlivosti krve, mezi nimi faktory vnitřní nebo zevní srážlivosti krve, jako zymogeny nebo jako aktivované faktory, a jejich agonisté nebo antagonisté případně inhibitory. Vedle toho jsou jako preparáty také možné odpovídající kombinace, které se jinak používají samostatně. K nim patří kombinace s fibrinogenem, které jsou vhodné především pro lokální aplikace.

Podle jedné výhodné formy provedení však sestává farmaceutický preparát v podstatě z parciální protrombinázy, přičemž složky protrombinázy případně pro-protrombinázy jsou vázány jako komplex. Tento komplex se může jednoduchým způsobem čistit a zpracovávat, obzvláště zpracovávat chemicky a/nebo fyzikálně k inaktivaci molekulových, mikrobiálních nebo virových patogenů.

-6Faktory farmaceutických preparátů podle vynálezu jsou obsaženy ve formě, která umožňuje aktivaci nejméně jednoho faktoru, případně ve které je nejméně jeden faktor již aktivován. Jako faktory se s výhodou použijí lidské faktory, které jsou ve farmaceutických preparátech podle vynálezu voleny s výhodou ze skupiny sestávající z faktorů II, V, Va, X a Xa.

Jako preparáty podle vynálezu parciální protrombinázy případně pro-protrombinázy jsou k dispozici s výhodou kombinace faktorů II a V případně Va a dále X a V případně Va. Přitom je obzvláště výhodné, že preparáty podle vynálezu sestávají v podstatě z těchto kombinací. Stejně tak je výhodnou formou provedení předloženého vynálezu také proprotrombináza sestávající z faktorů II a X, případně v kombinaci s faktorem V případně Va.

Přitom se mohou použít přirozené faktory, třeba proteiny nebo jejich ekvivalenty získané z plazmy nebo z některé frakce plazmy, které jsou příkladně kódovány rekombinantními nukleovými kyselinami. Dále jsou ale také vhodné odpovídající deriváty, které zahrnují modifikované proteiny nebo fragmenty, pokud jsou aktivovatelné případně vykazují odpovídající aktivitu, aby mohly modulovat generaci trombinu.

Preparát podle vynálezu má výhodu, že přes vysokou stabilitu in vitro i in vivo je tak dlouho stabilní, dokud se jeho účinnost neprojeví aktivací protrombinu a vznikem trombinu v místě zranění případně krvácení. Kontaktem s celulárními součástmi krevního oběhu, příkladně s krevními buňkami nebo cévními stěnami, obzvláště s povrchy obsahujícími fosfolipidy se generuje trombin in šitu a podporuje hemostázu. Na základě lokální účinnosti se zabrání

-Ίsystematickým vedlejším účinkům, jako příkladně tromboembolickým komplikacím.

K řízenému ovlivňování hemostázy je výhodné použít vysoce čisté faktory, které neobsahují rušivé nečistoty, obzvláště trombinové aktivity. K tomu se v podstatě hodí faktory, které jsou vyčištěny chromatografickými postupy, jako je výměnná iontová chromatografie, hydrofobní chromatograf ie, afinitní chromatografie a/nebo molekulová vylučovací chromatografie. Jimi je možné vždy dosáhnout specifické aktivity nejméně 50 % teoretické čistoty, obzvláště nejméně 70 %, s výhodou nejméně 90 % teoretické čistoty jednotlivých faktorů. Rovněž je ale také výhodné používat faktory, které v podstatě neobsahují denaturované produkty a proto jsou k dispozici jako vyčištěné aktivní faktory, enzymy případně aktivovatelné zymogeny.

Dále je také výhodné zpracování k inaktivaci infekčních choroboplodných zárodků, příkladně zpracováním chemikáliemi a/nebo fyzikální ošetření, jako tepelné zpracování, ozařování případně filtrace, obzvláště nanofiltrace. Podle jedné výhodné varianty jsou faktory farmaceutických preparátů podle vynálezu ošetřeny detergenčními činidly, což jednak vede k inaktivaci virů a jednak k solubilizaci případně přítomných fosfolipidů.

Fosfolipidy, obsažené v preparátech faktorů krevní srážlivosti mohou pocházet příkladně z plazmy nebo z nějaké frakce plazmy případně z nějaké buněčné kultury. Specielní zpracování faktorů k oddělení přirozeně se vyskytujících fosfolipidů zahrnuje na jedné straně jejich solubilizaci a na druhé straně oddělení fosfolipidů zmíněnými čisticími postupy.

-8Ačkoliv se preparát může použít v kombinaci s exogenními fosfolipidy, neobsahují podle další výhodné varianty preparáty podle vynálezu další fosfolipidy a obsahují méně než 0,01 mg fosfolipidu/j. protrombin, což na základě možného trombogeního účinku fosfolipidů vede k dalšímu značnému snížení rizika trombogenicity. Podle jedné zvlášť výhodné formy provedení neobsahují preparáty prokazatelné fosfolipidy .

Podle další formy provední obsahují dále preparáty podle vynálezu ionty hořčíku. Tyto ionty působí kompetitivně na ionty vápníku a mohou ionty vápníku v protrombináze případně pro-protrombináze potlačit. Tím se podchytí předčasná tvorba trombinu v roztoku preparátu podle vynálezu a stabilizuje se tím natolik, že zůstává v roztoku stabilní i po hodinách.

Ukázalo se, že farmaceutické preparáty se mohou připravit k dispozici dokonce jako stabilní infuzní roztoky, především, jestliže se zaručí, že neobsahují žádné volné ionty vápníku. Ke tvorbě komplexů s ionty vápníku je vhodný také obsah farmaceuticky přijatelné chelatotvorné látky, příkladně EDTA, a podobných struktur, jako citráty.

Komplex, sestávající nejméně ze dvou faktorů srážlivosti, které jsou součástí protrombinázy nebo pro-protrombinázy, obzvláště ve vysoce čisté formě, má jako parciální komplex protrombinázy zásadní význam. Aktivita preparátu na bázi tohoto komplexu se může několikanásobně urychlit přidáním iontů vápníku, jako je chlorid vápenatý.

Preparát podle vynálezu vykazuje na zvířecích modelech

-9η srovnatelnou biologickou účinnost FEIBA a je schopný výrazně snížit dobu srážení plazmy s inhibici faktoru VIII. Prodloužená doba krvácení a sklon ke krvácení u králíků s inhibici faktoru VIII a králíků s inhibici Villebrandova faktoru se může úplně normalizovat. Tím, že jsou k dispozici čisté faktory krevní srážlivosti, příkladně čištěného protrombinu a čištěného faktoru Xa, se výrazně redukuje toxicita preparátu podle vynálezu ve srovnání s FEIBA . Tak se příkladně ukázala být efektivní kombinace faktoru Xa a protrombinu ve Vesslerově modelu trombózy (J.Appl.Phys.

14, (1959), 943- 946) jako negativní, to znamená, že pro tyto kombinace se ani při vyšších dávkách než v případě aktivovaných komplexů protrombinu nedá prokázat trombogenní efekt ve Vesslerově modelu.

V případě tohoto modelu trombogenity se králíci narkotizují pentobarbitalem, potom se za dodatečné lokální anestezie vypreparuje Véna juglaris a opatří se volnými ligaturami ve vzdálenosti 2 cm. Nakonec se injikuje testovaná substance do ušní vény ležící proti Véna juglaris v průběhu 15 sekund. Po dalších 25 sekundách se ligatury stáhnou a čeká se 10 minut, pak s podvázaný kousek vény odebere a na Petriho misce naplněné citrátovým pufrem se nařeže a může se hodnotit. Kriteria hodnocení, modifikovaná podle Vesslera, jsou : žádná tvorba trombů = 0, malý počet malých trombů = 0,5 - 1, malý počet středně velkých a mnoho malých trombů = 2, mnoho středně velkých trombů = 3, malý počet velkých trombů = 3,5, souvislý trombus = 4.

Složky farmaceutických preparátů podle vynálezu se s výhodou vyčistí až do takového stupně čistoty, že dokonce i při dávce nejméně 150 j. protrombinu/kg nedochází k trombo embolickým vedlejším účinkům, vyjádřeno stupnicí Vesslerova

-10modelu trombózy nejvýše 3, s výhodou nejvýše 2, obzvláště méně než 2 body. Protrombin je obsažen v kombinovaném preparátu podle vynálezu, s výhodou se specifickou aktivitou nejméně 5 j./mg proteinu, ještě výhodněji nejméně 6, obzvláš tě nejméně 7, což odpovídá 50, 60 nebo 70 % teoretické čistoty. Použitý faktor X případně Xa preparátu by měl s výhodou vykazovat specifickou aktivitu nejméně 100 j./mg proteinu, přičemž faktor Xa je s výhodou obsažen převážně jako faktor XaP. Faktor V případně Va se použije jako kofaktor v přibližně ekvimolekulárním poměru k faktoru srážlivosti parciální protrombinázy. Poměr činí s výhodou (0,01 - 2) : 1 (mol/mol), nejvýhodněji (0,5 - 2) : 1.

Použitý preparát by pokud možno neměl obsahovat trombin, přičemž nepřítomnost trombinu se může prokázat vhodnými, s výhodou chromogenními testy (příkladně s chromogenním substrátem TH-1 firmy IMUNO AG).

Ukázalo se, že jestliže faktory srážlivosti, jako příkladně protrombin a faktor Xa jsou obsaženy v preparátu podle vynálezu jako komplex, vykazuje preparát zvýšenou stabilitu oproti obvyklým preparátům a komplex se může ještě navíc podrobit dalšímu zpracování k vyčištění od virů a/nebo jejich inaktivaci. Při jedné výhodné formě provedení preparátu podle vynálezu zahrnuje dále tento preparát antitrombin III ve stabilizujícím množství, případně společně s heparinem, přičemž se ale také u takového preparátu může prokázat neexistence tromboembolických vedlejších účinků testem podle Vesslera v nepřítomnosti, případně také po demaskování heparinu, to znamená neutralizace a/nebo oddělení heparinu, ve smyslu, že se nedosáhne hodnota 3 bodů.

Komplex, sestávající nejméně ze dvou faktorů sráž-11livosti, které jsou součástí protrombinázy nebo pro-protrombinázy, obzvláště ve vysoce čisté formě, má jako parciální komplex protrombinázy základní význam. Aktivita preparátu na bázi tohoto komplexu se může mnohonásobně urychlit přítomností iontů vápníku, jako chlorid vápenatý. Ukázalo se, že preparát obsahující tento komplex a další ionty vápníku, se může použít k výrobě reagencie pro diagnostické účely. Reagencie, která dále obsahuje trombinovou aktivitu a případně fosfolipidy je příkladně vhodná ke stanovení aktivity faktoru V - kofaktoru. Diagnostický postup za použití této reagencie s nebo bez aktivovaného proteinu C, proteolytickým inaktivátorem faktoru V, umožňuje navíc ještě ohodnocení rozsahu inaktivace faktoru V případně mutací podmíněné rezistence vůči aktivovanému proteinu C.

Překvapivě se v rámci předloženého vynálezu také zjistilo, že farmaceutický preparát obsahující čištěný protrombin jako jedinou aktivní složku, vykazuje při ošetřování poruch srážlivosti in vivo srovnatelný účinek jako kombinovaný preparát podle vynálezu a to i přesto, že s protrombinem samotným se in vitro nemůže dosáhnout žádného zkrácení doby srážlivosti plazmy inhibované faktorem VIII.

Tak se poprvé objevuje medicínská indikace pro farmaceutický preparát, který obsahuje protrombin jako jedinou složku účinné látky, odhlédne-li se od heraditerního nedostatku protrombinu.

Předmětem předloženého vynálezu je proto farmaceutický preparát, obzvláště k ošetřování poruch krvácivosti, který obsahuje protrombin jako jedinou aktivní složku.

S výhodou se protrombin čistí až do stupně, že dokonce při dávce nejméně 150 j. protrombin/kg nedochází k trombo-12embolickým vedlejším účinkům, vyjádřeno hodnocením podle Vesslerova modelu trombózy nejvýše 3, s výhodou nejvýše 2, obzvláště méně než 2 body.

Kombinovaný preparát podle vynálezu případně protrombinový preparát obsahuje výhodně méně než 0,1 j. faktoru VIII : C nebo faktoru VIII : Ag/j. protrombin případně méně než 0,1 j. faktoru IX/j. protrombin případně méně než 0,1 j . faktoru X/j . protrombin. Tím se může účinně potlačit nežádoucí tvorba případných reakcí s protilátkami proti těmto proteinům a snížit riziko vedlejších účinků.

Ačkoliv se protrombinový preparát může používat v kombinaci s fosfolipidy, neobsahují podle další výhodné varianty preparáty podle vynálezu přidané fosfolipidy a obsahují méně než 0,01 mg fosfolipidů/j. protrombinu.

Podle zvlášť výhodné formy provedení neobsahují protrombinové preparáty podle vynálezu prokazatelný fosfolipid.

Dávkování preparátů podle vynálezu se řídí podle dávn kování ekvivalentních složek ve FEIBA . Factor Eight Inhibitor Bypassing-Aktivitát (FEIBA^) se definuje jako každá aktivita preparátu takového druhu, která redukuje dobu srážlivosti plazmy s inhibicí faktoru VIII při testu srážlivosti, jaký se popisuje v AT 350726, na 50 % srovnávací hodnoe R ty. Výhody preparátů podle vynálezu ve srovnání s FEIBA jsou především ve sníženém zatížení pacientů proteiny plazmy, což je podmíněno vysokou čistotou složek. Obzvláště se absencí faktoru VII:Ag vyloučí anafylaktický vedlejší účinek. Proto je možné podávat preparáty podle vynálezu koncentrovat do takového stupně, že může být podávána dávka, která činí příkladně nejméně 50 j. protrombinu/kg tělesné hmotnosti, přičemž se tato dávka na základě neexistence

-13vedlejších účinků poprvé u tohoto druhu preparátů může podávat dokonce jednorázovou injekcí, čímž se může zabránit jinak zdlouhavému podávání vysokých dávek takového druhu.

Obvykle se preparáty podle vynálezu podávají v dávce příkladně 50 až 150 j. protrombinu/kg tělesné hmotnosti, přičemž však maximální dávky mohou činit také daleko nad 150 j./kg tělesné hmotnosti (příkladně až 300 případně 500), aniž by mohlo dojít k tromboembolytickým vedlejším účinkům.

Předmětem předloženého vynálezu jsou proto také lékové formy farmaceutických preparátů podle vynálezu, které obsahují dávku nejméně 50 j. protrombinu/kg tělesné hmotnosti, s výhodou mezi 50 a 500 j./kg tělesné hmotnosti.

Tyto lékové formy mohou být ampule, injekce předpokládané k přímému použití, nebo podobné přímo nebo nepřímo aplikovatelné formy. K tomu patří zásobníky vhodné k infuzi, intramuskulárnímu nebo subkutánnímu použití nebo soupravy, sestávající ze zásobníku s účinnou látkou jako lyofilizátem a zásobníku s farmaceuticky přijatelným roztokem, vhodným k rekonstituci lyofilizátu. Obvykle obsahuje farmaceuticky přijatelný roztok případně farmaceutický preparát soli, konzervační látky, pufry a podobně ve vodném roztoku (viz Remington s Pharmaceutical Sciences, 15. vydání, Easton : Mack Publishing Co., strana 1405-1412 a 1461-1487 (1975) a The National Formulary XIV., 14. vydání, Washington : American Pharmaceutical Association (1975)). Příklady nevodných roztoků j sou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje a injikovatelné organické estery, jako ethyloleát. Vodné nosiče jsou příkladně voda, případně smíchaná s alkoholem, roztoky soli (NaCl), dextroza Ringer, a tak dále. Jako konzervační látky se mohou používat anti-14mikrobiální látky, antioxidanty, chelatotvorné látky nebo inertní plyny.

Preparáty podle vynálezu jsou vhodné také k lokálnímu ošetření, přičemž se volí aplikační formy, které se stanou účinnými na místě krvácení. K nim patří pevné látky nebo kapaliny, s výhodou ve formě pudru, náplasti nebo bandáže, masti, čípku, kapslí, obzvláště kapslí rezistentních proti žaludečním šfávám, ale také kapky nebo spreje.

Použité faktory srážlivosti mohou být jak plazmatického původu tak i proteiny vyrobené rekombinantní technologií DNA. Podstatné v obou případech je, že jsou ve farmaceutických preparátech obsaženy v čištěné formě, obzvláště ve formě neobsahující endogenní a exogenní fosfolipidy.

S výhodou jsou farmaceutické preparáty podle vynálezu k dispozici v lyofilizované formě, což sebou přináší známé výhody při přepravě, skladování a aplikaci. Jako rekonstituční roztoky se nabízí farmaceuticky přijatelné roztoky, které případně obsahují ATIII, případně heparin. V důsledku vysokého stupně čistoty složek preparátů podle vynálezu se mohou tyto preparáty rekonstituovat po minimální době rozpouštění, s výhodou méně jak 5 minut při teplotě místnosti, obzláště méně jak 1 minutu, na opticky čirý roztok s příkladně nejméně 10 j. protrombinu/ml, přičemž se dokonce může dosáhnout koncentrací až 200 j . protrombinu/ml roztoku. Opticky čirý roztok je přitom definován maximální extinkcí při 600 nm 0,1 (pro roztok s obsahem proteinu nejméně 5 % hmotnostních, při síle vrstvy 1 cm), vztaženo na čistý (pufr) roztok jako referenční látku. Alternativně k tomu se považuje za čirý také roztok s méně než 70 Light Scattering Units (LSU), zjištěno měřením v nefelometru při 340 nm

-15a síle vrstvy 1 cm.

Preparáty podle vynálezu jsou na rozdíl od dosud známých preparátů mimořádně stabilní pro ošetřování poruch krevní srážlivosti, to znamená, že se mohou po delší dobu před podáváním nechat stát. Příkladně by se FEIBA ve stavu připraveném k podávání neměl podle informace výrobce nechat stát déle než 1 hodinu, oproti tomu preparáty podle vynálezu jako roztok připravený k použití nevykazují ani po časovém období 3 hodiny nebo déle při teplotě místnosti žádné aktivování srážlivosti případně trombogenicitu, takže preparáty podle vynálezu mohou být k dispozici také jako infužni roztoky, které se mohou podávat i po časové prodlevě několika hodin. Ze stejných důvodů je také možné podávat preparáty podle vynálezu po delší časové období jako infuzní roztok. Ukázalo se ale, že s ohledem na tromboembolické vedlejší účinky neexistuje žádný podstatný rozdíl mezi jednorázovou injekcí a pomalou infuzí preparátů podle vynálezu.

Podle výhodné formy provedení předloženého vynálezu se připravují farmaceutické preparáty do vhodných aplikačních zařízení, s výhodou jako lyofilizát do injekcí, které umožňují rekonstituci in šitu s farmaceuticky přijatelnými roztoky. U kombinovaného preparátu se doporučuje aplikační zařízení, které je znázorněno na obrázku 1, kde se lyofilizát příkladně protrombinu a faktoru Xa s výhodou uchovává odděleně a v případě potřeby se po rekonstituci in sítu může podávat pomocí stříkačky s dvojitou komorou.

V případě preparátů čistého protrombinu stačí připravovat protrombin v jednoduché injekční stříkačce, s výhodou

-16v lyofilizované formě, případně s farmaceuticky přijatelným roztokem pro rekonstituci (viz obrázek 2) .

Preparát protrombinu však také může být k dispozici jako kapalný preparát případně v kapalné hluboce zmrazené formě.

Farmaceutické preparáty podle předloženého vynálezu, obzvláště pokud se získají z plazmatických proteinů nebo buněčných kultur, se mohou podrobit jednomu nebo několika zpracování k inaktivaci virů případně zpracování k odstranění virů, příkladně chemickému nebo chemicko-fyzikálnímu zpracování, tepelnému zpracování a/nebo detergenčnímu zpracování podle EP 0 159 311, EP 0 519 901 nebo EP 0 674 531 nebo fyzikálnímu zpracování, jako je nanofiltrace.

Preparáty podle vynálezu umožňují jistější a jednodušší ošetřování poruch srážlivosti krve, kdy je možné pozorovat efektivnější nástup účinnosti v průběhu kratší doby.

Ukazuje se, že k efektivnímu nástupu účinnosti při podání komplexu faktoru II a faktoru Xa dochází rychleji, než u preparátu, který obsahuje výhradně faktor II. Při ošetřování poruch krvácivosti u pacienta s inhibovanou hemofilií je proto výhodné, ošetřit krvácivý případ zpočátku podáním komplexu faktoru II/Xa a tak dosáhnout rychlého zastavení krvácení a v terapii k zastavení dalšího krvácení pokračovat udržovacími dávkami preparátu, který obsahuje výhradně faktor II.

Navíc umožňuje dlouhá doba poločasu preparátů podle vynálezu a nepřítomnost jejich trombogenních vedlejších

-núčinků případně nepřítomnost anafylaktické reakce, které vedou k posílení titru inhibitoru, výrazně lepší ošetření pacientů s poruchami krevní srážlivosti oproti známým způsobům. Pacient může vysokou koncentrací případně dávkami preparátu podle vynálezu dostat zásobu účinné látky, což snižuje potřebu opakovaného ošetření. Pacient může tedy po delší časové období několika dnů zůstat neošetřován a případně se ambulantně ošetřovat vlastními injekcemi případně subkutánně.

Předmětem předloženého vynálezu je dále způsob výroby čištěných farmaceutických protrombinových preparátů, který se vyznačuje tím, že se koncentrát komplexu protrombinu podrobí chromatografickému čištění a frakce, obsahující protrombin, se zpracují na farmaceutický preparát. Způsobem podle vynálezu se poskytuje k dispozici preparát protrombinu, který zcela splňuje požadavky na čistotu pro farmaceutické preparáty podle vynálezu, obzvláště pokud se týká nepřítomnosti vedlejších účinků zjištěných testem podle Vesslera.

Způsob podle vynálezu je obzvláště charakterizován kombinací následujících kroků :

příprava komplexního protrombinového preparátu v pevném stavu nebo jako roztok obsahující protrombin, zpracování vedoucí k inaktivaci virů, s výhodou tepelné zpracování, obzvláště v pevném stavu, případně rozpuštění komplexního protrombinového preparátu, přičemž se získá roztok obsahující protrombin,

-18případně zpracování roztoku obsahuj ícho protrombin se solí alkalických zemin jako pevným nosičem, přičemž se protrombin adsorbuje a následně desorbuje, případně jednorázová nebo opakovaná koncentrace, s výhodou precipitací nebo ultra-/diafiltrací, a gelová filtrace roztoku obsahujícího protrombin, zpracování roztoku obsahujícího protrombin iontoměničem, přičemž se protrombin adsorbuje a následně se selektivně desorbuje, zpracování roztoku obsahujícího protrombin hydrofobním chromatografickým materiálem a konečné zpracování roztoku obsahuj ícího protrombin na farmaceutický preparát.

Jako soli alkalických zemin se přitom mohou s výhodou použít fosforečnan vápenatý, síran barnatý nebo hydroxid hlinitý. Jako iontoměniče přicházejí v úvahu v zásadě všechny iontoměniče, které vykazují afinitu k protrombinu, jako příkladně DEAE-Sephacel^, DEAE-Sephadex^, DEAE-Sepharose CL6B^, DEAE-Sepharose Fast Flow^, QAE-Sephadex^, n

Q-Sepharose Fast Flow , Q-Sepharose High Performance, Q-Sepharose Big Beads^ (všechny firma Pharmacia), DEAETris-Acryl^, DEAE-Sphgerodex^, Q-Hyper-D^ (všechny firma Sepracor);

R p

Macroprep DEAE , Macroprep Q (všechny firma BioRad); DEAE-Toyopearl^, QAE-Toyopearl^, Toyopearl Super-Q^ (všechny firma Tosohaas), protein PAK DEAE& (Vaters);

-19Fractogel EMD-TMAE^F, Fractogel EMD-DEAE^F, Fractogel

EMD-DMAE^F, Licrospher 1000 TMAE^F, Licrospher 1000 DEAE^Fa Licrospher 4000 DMAE^F (všechny firma Merck).

Jako gely k hydrofobní interaktivní chromatografii se s výhodou použije Phenyl-Sepharose High Performance^ (firma

Pharmacia), ale také další chromatografické gely jako příR R kladně Butyl-Sepharose , Octy1-Sepharose , Phenyl-Sepharose^F, Phenyl-Sepharose Fast Flow High Sub^F, Phenyl-Sepharose Fast Flow Low Sub^F (všechny firma Pharmacia),

Fractogel TSK-Butyl^F (firma Merck),

Macroprep-Methyl-HIC-Support , Macroprep-t-Butyl-HICSupport^F (všechny firma BíoRad);

TSK-Gel Butyl Toyopearl^F, TSK-Gel Phenyl Toyopearl^ a TSK-Gel Ether Toyopearl^F (všechny firma Tosohaas) .

Možná forma provedení způsobu podle vynálezu je znázorněna na obrázku 3.

Protrombinové preparáty, které se mohou vyrábět způsobem podle vynálezu, se vyznačují nejenom mimořádně vysokou čistotou, která se blíží teoreticky možné čistotě 10 j./mg, nýbrž také tím, že dokonce i při dávce nejméně 150 j. protrombinu/kg nedochází k tromboembolickým vedlejším účinkům, vyjádřeno stupnicí podle Vesslerova modelu trombózy nejvýše 3 body, s výhodou nejvýše 2 body, obzvláště méně než body, a navíc je ho jako lyofilizát možné rekonstituovat při době rozpouštění nejvýše 1 minuta na čirý roztok s aktivitou nejméně 10 j. protrombinu/ml až k hodnotě 200 j. protrombinu/ml. Biologická aktivita protrombinového preparátu se rozumí jako enzymatická aktivita, která se vyvine po aktivaci protrombinu.

-20Podle dalšího aspektu se týká předložený vynález použití čištěných faktorů protrombinázy, obzvláště čištěného protrombinu a případně čištěného faktoru Xa k výrobě farmaceutických preparátů k dosažení mimořádné koncentrace protrombinu v krvi pacientů případně k dosažení normální koncentrace protrombinu v krvi při stavech se sníženou hladinou protrombinu.

Ukázalo se, že se s preparáty podle vynálezu může dosáhnout takové mimořádné hladiny faktoru II dokonce trvale, to znamená po delší časové období, což vyplývá na jedné straně z toho, že protrombin jako léčivo vykazuje pro faktory krevní srážlivosti velmi vysoký poločas, na druhé straně preparáty podle vynálezu nemají vedlejší účinky, takže je dokonce možné subkutánní podávání formou depotního podávání. Mimořádné koncentrace protrombinu, které je možné dosáhnout v krvi podáváním čištěného protrombinu a případně čištěného faktoru Xa případně dalších faktorů protrombinázy činí nejméně 150 %, s výhodou dokonce nejméně 200 %, což odpovídá aktivitě nejméně 1,5 j. protrombinu/ml krve, s výhodou nejméně 2,0 až 10 j. protrombinu/ml.

Konečně se týká vynález také použití čištěných faktorů protrombinázy, obzvláště čištěného protrombinu a případně čištěného faktoru Xa k výrobě farmaceutického preparátu k ošetřování stavů s inhibici faktoru VIII, hemofilie A nebo B a Villebrandovy nemoci. Ukázalo se, že na zvířecích modelech je možné preparáty podle vynálezu pro všechny tyto indikace rychlé a účinné ošetření bez vedlejších účinků.

Preparáty podle vynálezu se dodávaj i s výhodou v roztoku s fyziologickým pH, přičemž s výhodou nejsou obsaženy žádné volné ionty vápníku. Je ale také možné použít

-21příkladně kyselý pufr vzdálený od aktivity faktoru Xa v oblasti pH 4,5 - 6,5, s výhodou 5-6, kterým se může ještě dále zvýšit aktivita protrombinu a stabilita kombinovaného preparátu. Je zřejmé, že se mohou používat veškeré, pro faktory II, V, Va X a Xa vhodné farmaceutické přísady a roztoky k výrobě preparátů podle vynálezu připravených k použití.

Dále se překvapivě ukázalo, že se s preparáty podle vynálezu může účinně ošetřovat také u nehemofilních pacientů akutní krvácení, zvýšený sklon ke krvácení případně zvýšené riziko krvácení. Preparáty podle vynálezu je možné použít vedle již uvedených indikací pro různé formy hemofilie, to znamená hemofilie A a B a inhibované hemofilie také pro nehemof ilní pacienty. K nehemofilním pacientům patří takoví, u nichž se projevují poruchy krevní srážlivosti na základě inhibitorů působících proti krevním faktorům, které nejsou faktory VIII nebo faktor IX. Dále se mohou ošetřovat pacienti, trpící narušenou generací trombinu, způsobenou nepřítomností nebo funkčním defektem jednoho nebo více faktorů zevní nebo vnitřní srážlivosti nebo při tvorbě protilátek proti jednomu nebo několika těmto faktorům nebo nepřítomností celulárního receptoru pro jeden nebo několik těchto faktorů. Po podání preparátu podle vynálezu dochází in vivo případně k účinku podporujícím srážlivost, čímž je umožněno ošetřování, totiž profylaktické případně terapeutické podávání.

Předložený vynález se tak podle dalšího aspektu týká použití nejméně 2 faktorů srážlivosti, které jsou součástí protrombinázy případně pro-protrombinázy, případně použití preparátů podle vynálezu k výrobě farmaceutického preparátu k ošetřování akutních krvácení, zvýšeného sklonu ke krvácení

-22případně zvýšeného rizika krvácení u nehemofilních pacientů.

Zvláště se mohou ošetřovat stavy způsobené porušeným agregačním chováním krevních destiček nebo trombopatií, příkladně defekty Storage-Pool, nebo podmíněné nedostatkem nebo disfunkcí proteinů asociovaných destičkami, ale také stavy krvácení způsobené nedostatkem destiček (trombocytopenie) . Vedlejší účinek terapie antikoagulancii spočívá v trombocytopenii indukované heparinem, která rovněž představuje indikaci pro preparáty podle vynálezu .

Podle výhodné formy provedeni se předložený vynález proto týká použití nejméně 2 faktorů srážlivosti, které jsou součástí protrombinázy případně pro-protrombinázy k výrobě farmaceutického preparátu k ošetřování krvácení na základě trombocytopenie, obzvláště k ošetřování trombocytopenie indukované heparinem.

V této souvislosti je výhodné, že farmaceutické preparáty vyrobené podle vynálezu vykazují podle okolností primární hemostatickou aktivitu. Vyrobené farmaceutické preparáty se mohou posílit kombinací s proteiny s primární hemostatickou aktivitou. K tomu je vhodný především některý z proteinu Villebrandova faktoru přípádně frakce Villebrandova faktoru s definovanou aktivitou tvorby kolagenu.

Další indikace k ošetřování pacientů s poruchami srážlivosti krve spočívá v zabránění případně ošetřování krvácení, ke kterému dochází v souvislosti s Villebrandovou diseázou. Tato nemoc s prevalencí a bez prevalence inhibitorů faktorů srážlivosti přináší zvýšený sklon ke krvácení nebo riziko krvácení a v mnoha případech vede k těžko zvládnutelným krvácením. S pomocí preparátů podle vynálezu je možné

-23takové krvácení rychle utišit.

Tak je způsobem podle vynálezu dána k dispozici souprava k ošetřování pacientů s poruchami srážlivosti krve, která obsahuje následující složky :

a) farmaceutický preparát, obsahující nejméně dva faktory srážlivosti, které jsou součástí protrombinázy případně pro-protrombinázy a neobsahují lipidy a

b) protein s primární hemostatickou aktivitou, obzvláště VF.

K těžko zvládnutelným krvácením může případně docházet jako vedlejšímu účinku při terapii syntetickými, polosyntetickými a biologickými inhibitory srážlivosti případně antikoagulancii nebo inhibitory funkce trombocytů. Tyto substance zasahují bezprostředně případně zprostředkovaně do systému srážlivosti a mohou přirozený proces sráženi nežádoucím způsobem narušit. Proto vzniká potřeba antagonistů pro tyto substance. Podle stavu techniky je známé používání protrombinového komplexu nebo preparátu FEIBA k ošetřeni krvácení, které je způsobeno antikoagulační terapií. K tomu viz Irani M S et al., The American Journal of Cardiology, Vol. 75, 15. únor 1995, strana 422; Fareed J et al., Haemostasis 1991, Vol. 21 (suppl. 1) strany 64-72; a Fareed J et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis 1991, Vol. 17, č. 2, strana 137.

Podle další formy provedení předloženého vynálezu se používají jmenované faktory srážlivosti k výrobě farmaceutických preparátů podle vynálezu k ošetřování krvácení v rámci antikoagulační terapie, obzvláště k výrobě farmaceutického preparátu jako antidota pro inhibitor srážlivosti případně pro antikoagulans nebo pro inhibitory funkce trombocytů. Podstatné přitom je, že se odstraní riziko trombózy

-24spojené s přítomností fosfolipidů. Právě u pacientů, u kterých byla prováděna terapie antikoagulancii, vzniká zvýšené riziko trombózy. Způsobem podle vynálezu je však možné zříci se použití fosfolipidů, čímž se překvapivě stává antidotový účinek ještě specifičtější.

Použití podle vynálezu se týká především antagonizace inhibitoru srážlivosti případně antikoagulancia, které zprostředkovaně nebo bezprostředně inhibuj i faktor Xa nebo trombin. Způsobem podle vynálezu se s výhodou antagonizuje substance, která je vybrána ze skupiny sestávající z APAP (pentahydrát hydrochloridu kyseliny ((2S)-2-[4-[[(3S)-1acetimidyl-3-pyrrolidinyl]oxy]fenyl]-3-(7-amidino-2-naftyl) propionové), deriváty benzamidinu, hirudin, heparin, hepari nová analoga, obzvláště pentasacharidy, komplex heparin-AT III, AT III, antistasin, Tick-Anticoagulant Peptide, inaktivní faktory srážlivosti, obzvláště faktory srážlivosti inhibované active site, TFPI, kompetitivní ligandy pro membránové povrchové receptory trombocytů, obzvláště protilátky proti GP Ilb/IIIa a jejich analoga vyrobená genovými technikami nebo synteticky, obzvláště peptidy, a orální antikoagulancia. K inaktivním faktorům srážlivosti patří především derivatizované, mutované, fragmentované, chemicky nebo fyzikálně ínaktivované případně inhibované faktory vnitřní případně zevní srážlivosti krve, které mohou kompetitivním způsobem vystupovat ve vzájemném účinku s přirozeným faktorem.

Antagonizace funkce inhibitoru trombocytů se indikuje především v případě ticlopidinu nebo kyseliny acetylsalicylové.

Akutní krvácení jsou především v oblasti mozku velmi

-25kritická. Proto existuje potřeba zabránění případně ošetření intrakraniálních krvácení, příkladně intravertikulární hemorhegie (IVH). Zvýšené riziko intrakraniálních krvácení existuje především u pacientů s poškozením krevních cév případně při narušené tvorbě trombinu. Preparáty podle vynálezu jsou vhodné také specielně pro tyto indikace, přičemž je umožněno především zlepšené ošetření předčasných porodů.

V rámci používaní způsobem podle vynálezu při jmenovaných indikacích jsou vždy k dispozici odpovídající soupravy, které jako jednu složku obsahují farmaceutické preparáty podle vynálezu. Dále mohou obsahovat substance, které posilují hemostatický efekt, jako příkladně protein s primární hemostatickou aktivitou, obzvláště vVF. Vedle toho obsahuje souprava k antikoagulační terapii přirozeně odpovídající antikoagulans a farmaceutický preparát podle vynálezu jako antidotum.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález je blíže vysvětlen pomocí následujících příkladů a příslušných obrázků, není však omezen pouze na ně.

Obrázky ukazuj í :

Obrázek 1 a obrázek 2 možné formy podávání preparátů podle vynálezu;

Obrázek 3 postupový diagram formy provedení výrobního procesu;

-26Obrázek 4 průkaz parciálního komplexu protrombinázy;

Obrázek 5 spektroskopickou analýzu příkladu preparátu podle vynálezu (A) ve srovnání se standardními preparáty [aktivovaný protrombinový komplex (B) , protrombinový komplex (C)];

Obrázek 6 účinek preparátu faktoru II in vivo na králíka inhibovaného faktorem VIII;

Obrázek 7 a obrázek 8 účinek preparátu podle vynálezu in vivo v inhibičním modelu Villebrandův faktor/faktor VIII.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba faktoru X a faktoru II z virově inaktivované frakce plazmy pomocí výměnné iontové chromatografie

Metodou podle Brummelhuis, H.G.J., Preparation of the Prothrombinkomplex, v Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, J.M.ed., 117-128, Academie Press, New York, (1980) se vyrobí lyofilizovaný preparát komplexních faktorů protrombinu, který obsahuje faktory II, IX, X a protein C a protein Sak inaktivaci virů se tepelně zpracuje podle EP 159 311. Odpovídajícím způsobem se lyofilizát (1000 j. Faktoru X/g, 1200 j. faktoru II/g) rozpustí v destilované vodě, takže tato voda obsahuje 50 000 j. faktoru X/l, a pH se

-27nastaví na 7,0. Po přidání 12 % (v/v) TVEEN 80 se míchá 1 hodinu při teplotě místnosti. Následně se zředí 1 : 5 pomocí 20 mM pufru Tris-HCl, pH 7,0 a frakce komplexu proteinů protrombinu se adsorbuje na fosforečnan vápenatý [Ca^ (ΡΟ,ψ^] o koncentraci 30 g Ca^ ^()4)2 na litr roztoku protrombinového komplexu jednohodinovým mícháním při teplotě místnosti. Následně se pevná fáze oddělí centrifugací po dobu 20 minut při 5000 otáčkách za minutu a sraženina se dvakrát promyje 20 mM pufru Tris-HCl, pH 7,0, obsahujícím 10 % síranu amonného tak, že se provede resuspendace a nová centrifugace. Třetí promytí se provádí analogickým způsobem 20 mM pufru Tris-HCl, pH 7,0, obsahujícím 150 mM NaCl. Eluce frakce komplexu protrombinu se provádí 1 M roztokem fosforečnanu sodného, pH 7,0, přičemž se 25 ml tohoto roztoku na g fosforečnanu vápenatého míchá 1 hodinu při teplotě místnosti a následně se zbývající sraženina oddělí centrifugací, jak je uvedeno výše. Zbytek se následně podrobí srážení síranem amonným s použitím 366 g síranu amonného na 1 po dobu 15 hodin při teplotě 4 °C za míchání. Precipitát, obsahující frakce komplexu protrombinu se centrifuguje, jak je uvedeno výše. Sraženina se převede do 25 mM trinatriumcitrátdihydrátového pufru, obsahujícího 100 mM NaCl, mM hydrochloridu benzamidinu, pH 6,0, a zpracuje se na sloupci, plněném Sephadexem G-25 při teplotě 4 °C s lineárním průtokem 1 cm/min proti 25 mM trinatriumcitrátdihydrátového pufru, obsahujícího 100 mM NaCl, 1 mM hydrochloridu benzamidinu, pH 6,0, k oddělení síranu amonného. Přitom se v proudu eluátu měří UV absorpce při 280 nm a elektrická vodivost. Frakce obsahující protein se spoji a následně se podrobí iontové výměnné chromatografii přes DEAE Sepharosu FF^, firma Pharmacia. Frakce se nanesou na sloupec (vnitřní průměr : výška gelového lože =1 : 1,3) s objemem gelu 8,2 1, 0,55 g proteinu/l gelu, při lineárním

-28průtoku 0,36 cm/min. Chromatografie se provádí při teplotě 22 °C. Před nanesením proteinu se sloupec ekvilibruje 25 mM trinatriumcitrátdihydrátového pufru, obsahujícího 100 mM NaCl, 1 mM hydrochloridu benzamidinu, pH 6,0. Eluce frakcí proteinu se provádí v několika stupních s pufrem 1 (25 mM trinatriumcitrátdihydrátu, 1 mM hydrochloridu benzamidinu, 245 mM NaCl, pH 6,0), pufrem 2 (25 mM trinatriumcitrátdihydrátu, 1 mM hydrochloridu benzamidinu, 270 mM NaCl, pH 6,0) a pufrem 3 (25 mM trinatriumcitrátdihydrátu, 1 mM hydrochloridu benzamidinu, 400 mM NaCl, pH 6,0). Eluce pufrem 1 se provádí 2,4 objemy sloupce, přitom se oddělí inertní protein. Eluce pufrem 2 se provádí 5,6 objemy sloupce, přičemž se shromažďují frakce, které se analyzují na obsah faktoru II, faktoru X, proteinu C a faktoru IX. Frakce obsahující faktor X, které neobsahují faktor II, IX a protein C se spojí. Elucí pufrem III (1,9 objemu sloupce) se desorbuje faktor II, přičemž se frakce opět spojí a analyzují se na obsah faktoru X, faktoru IX a faktoru II. Frakce obsahující faktor II se poolují. Pool obsahující jak faktor II, tak i faktor X se mohou případně podrobit za přídavku 1 M KSCN a inkubaci při teplotě 22 °C po dobu několika hodin dodatečnému zpracování k inaktivaci patogenních nečistot.

Příklad 2

V příkladu 1 získaný pool faktoru II se nastaví přídavkem chloridu sodného na 1,8 M NaCl a hodnota pH se upraví na pH 7,0. Tento roztok se následně adsorbuje hydrofobní n interakcí na gel, Phenylsepharose High Performance , firma Pharmacia, přičemž se váží 3 g proteinu/l gelu. Na sloupci s poměrem vnitřní průměr : výška gelového lože =1 : 1,9) se při lineárním průtoku 0,25 cm/min adsorbuje proteinová

-29frakce a následně se zbaví inertního proteinu promytím pufrem (25 mM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7,4). Gradientovou elucí s 11,5 objemy sloupce 3 M - 0,9 NaCl za současného sbírání frakcí se ze sloupce eluuje faktor II, přičemž se pooluje každá frakce, která obsahuje aktivitu faktoru II, ale neobsahuje faktor X a faktor IX. Spojené frakce faktoru II se následně desetinásobně koncentrují ultra-diafiltrací přes ultrafiltrační membránu s cut-off 30 kD a přepufruje se proti pufru obsahujícímu 4 g trinatriumcitrátdihydrátu/ 1,8 g NaCl/1, pH 7,0. Tak vyrobený preparát faktoru II vykazuje specifickou aktivitu 6,9 j./mg proteinu. Stanovení aktivity faktoru II se provádí jednostupňovou metodou, založené na době tromboplastinu, za použití plazmy s chybějícím faktorem II proti mezinárodnímu standardu faktoru II za použití kombinace reagencií firmy IMUNO, Vien. Ostatní faktory srážlivosti byly při analýzách srážlivosti prokazatelné ve stopách nebo nebyly prokazatelné (faktor VII < 0,00002 j./j. faktor II, faktor IX 0,0002 j./j. faktor II, faktor X 0,004 j./j. faktor II, protein C 0,003 j./j. faktor II a faktor VIII < 0,0002 j./j. faktor II).

Příklad 3

Čištění faktoru II pomocí hydrofobní interaktivní chromatograf ie a hydroxylové apatitové chromatografie.

Jako alternativní způsob výroby vysoce čistého faktoru II se používá také způsob, při kterém se z lyofilizovaného preparátu protrombinových komplexních faktorů (viz příklad 1) nejprve hydrofobní chromatografii oddělí faktor IX, následně se izoluje faktor II a ten se potom vyčistí do vysokého stupně čistoty na hydroxylovaném apatitu.

-30Preparát protrombinových komplexních faktorů se rozpustí stejně jako v příkladu 1 a inkubuje se detrgentem po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Následně se iontovou výměnp nou chromatografií na DEAE Sepharose FF , firma Pharmacia, izolují stejně jako v příkladu 1 frakce obsahující faktor II, IX a X. Z těch se následně interakcí pomocí ButylToyopearl^B, firma Toso Haas, oddělí frakce obsahující faktor IX. Zbytek po adsorbpci se následně čistí na Phenyl-Sepharose High Performance , firma Pharmacia, další hydrofobní interaktivní chromatografií, přičemž se mohou adsorbovat 4 g proteinu/l gelu. Na sloupci s poměrem vnitřní průměr : výška gelového lože =1 : 1,9 se při lineárním průtoku 0,25 cm/min adsorbuje proteinová frakce a následně se zbaví inertního proteinu promytím 20 mM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7,4 a konečně se stupňovitou elucí izoluje frakce obsahující faktor II, která se při klesající vodivosti desorbuje při 1,9 M NaCl od gelu. Frakce obsahující faktor II se následně

D adsorbuje přímo na Ceramik-Hydroxylapatit , firma Biorad. To se provádí na sloupci s poměrem vnitřní průměr : výška gelového lože = 1 : 4,8. Eluce se provádí při lineárním průtoku 3 cm/min. Elucí se solným gradientem se může ze sloupce desorbovat faktor II. Frakce obsahující faktor II se spojí a koncentrují se ultra-/diafiltrací přes polysulfonové membrány při cut-off 30 kD dokud koncentrace faktoru II nedosáhne 50 - 100 j./ml. Takto vyrobený preparát faktoru II vykazuje specifickou aktivitu nejméně 7 j./mg proteinu. Jiné faktory srážlivosti, obzvláště faktor IX a faktor VIII, byly prokazatelné pouze ve stopách nebo vůbec ne, jako v preparátu z příkladu 2. Volbou vhodného diafiltračního pufru se preparát faktoru II převede do farmaceuticky přijatelného pufru (příkladně 4 g trinatriumcitrátdihydrátu/ 1,8 g NaCl/1, pH 7,0).

-31Příklad 4

Příprava faktoru Xa

Frakce faktoru X vyrobené stejně, jako se popisuje v přikladu 1, se následně zpracují na faktor Xab způsobem popsaným v DE 43 25 872, přičemž se takto získaný vysoce čistý preparát faktoru Xa lyofilizuje v přítomnosti 1 g/100 ml lidského albuminu. Preparát neobsahuje jiné faktory srážlivosti; získaný faktor Xa vykazuje specifickou aktivitu 120 j-/mg proteinu před přidáním k albuminu.

Příklad 5

Sušení faktoru II vymrazováním

Preparát popsaný v příkladu 3, obsahující vysoce čistý faktor II se bez přídavku stabilizátorů vysuší vymrazováním, přičemž se po lyofilizaci zachová více jak 80 % výchozí aktivity.

Příklad 6

Kolyofilizace faktoru II a faktoru Xá

Preparát faktoru II vyrobený stejně jako v příkladu 3 se plní s koncentrací 100 j./ml po 20 ml do 50 ml lahviček a mžikově se zchladí při teplotě -80 °C. Následně se v množství 30 μΐ nadávkuje na zmražený faktor II roztok vysoce čistého faktoru Xa, který byl vyroben podle DE 43 25 852 a který má koncentraci 500 j./ml. Okamžitým zmražením malého objemu se zabrání smíchání faktoru II a faktoru Xa. Následně se suší vymražováním. K přípravě infuzního

-32roztoku se lyofilizát rekonstituuje 20 ml aqua destilata, promíchá se a je okamžitě připraven k podávání.

Příklad 7

Farmaceutické přípravky faktoru II, faktoru Xa a antitrombinu III a/nebo komplexu antitrombin-heparin

Vysoce čistý faktor II v kombinaci s faktorem Xa a antitrombinem III nebo komplexem antitrombin III - heparin se zředí na uživatelskou koncentraci pufrem, obsahujícím 4 g trinatriumcitrátdihydrátu/l a 8 g chloridu sodného/1, pH 7,0. Tyto roztoky se mohou vysušit vymražením, přičemž zůstává zachována aktivita každé složky nejméně 80 %.

Příklad 8

Průkaz parciální protrombinázy

Tvorba komplexu faktoru II a faktoru Xa za vzniku parciální protrombinázy byla prokázána následujícím experimentem :

j. faktoru II z příkladu 3 a 1,2 j.’ faktoru Xa z příkladu 4 se rozpustí ve 20 mM pufru Tris-HCl, obsahujícího 150 mři NaCl, pH 7,4 a 15 minut se inkubuje při teplotě místnosti za tvorby komplexu. Následně se alikvot roztoku chromatografuje gelovou permeační chromatografií přes Superose 12 (HR10/30) (firma Pharmacia) při průtoku 0,25 ml/min. Nanesený objem činí 200 μΐ. Průtok sloupcem se měří pomoci UV-spektrometrie při 280 nm a shromažďují se frakce po 0,5 ml. Následně se ve frakcích kvantitativně měří faktor Xa, který se určí fotometrickým testem s chromogením substrátem

-33metodou popsanou v DE 43 25 872. Stejně tak se jako v příkladu 2 určí v jednotlivých frakcích aktivita faktoru II. Výsledek je znázorněn na obrázku 4. Faktor Xa [Obrázek 4 :

- - aktivita Xa (FII/Xa)] a faktor II [Obrázek 4 : - - aktivita II x 10 (FII/Xa)] eluované společně s proteinovou frakcí [Obrázek 4 : - A280 nm (FII/Xa)]. Za identických podmínek se nyní na sloupec nanese pouze samotný faktor Xa, eluční profil se stanoví za gelovou pasáží měřením absorpce

UV při 280 nm [Obrázek 4 : ...... A280 nm (FXa) ] a ve frakcích se prokazuje aktivita faktoru Xa [Obrázek 4 : - aktivita Xa x 10 (FXa)]. Proteinové piky odpovídající faktoru Xa jsou výrazně odsazeny od faktoru Xa v komplexu s faktorem II. Redukcí retenční doby faktoru Xa v komplexu na sloupci a s tím spojeným posunem ke zřetelně vyšší molekulové hmotnosti je podán důkaz tvorby komplexu faktoru II a faktoru Xa (parciální protrombináza).

Příklad 9

Příprava preparátu ve dvoukomorovém injekčním systému

Ke zjednodušenému používání vícesložkových systémů, jako příkadně směsí faktoru II a faktoru Xa nebo faktoru II, faktoru Xa a antitrombinu III, se může jako zařízení k aplikaci používat zdvojené těleso injekční stříkačky se dvěma komorami, jaké se popisuje v AT 382 783. Při klinickém používání lyofilizovaných vícesložkových systémů se před tím, než se mohou podat pacientovi, musí rekonstituovat a smísit spolu v definovaném poměru. Plnění odpovídajícího lyofilizátu do systému dvoukomorové injekční stříkačky umožňuje přesné dávkování na předem stanovitelnou aktivitu preparátu k ošetření inhibované hemofilie, příkladně na konvenční jednotky FEIBARR, které se může zjistit podle AT

-34350 726. Při použití takového systému se připraví in sítu účinná směs pro injekční podání. Při jedné formě provedení jsou v obou komorách dvojitého tělesa injekční stříkačky lyofilizáty účinných látek, faktoru II a faktoru Xa, které přídavkem rozpouštědla, aqua destilata, na základě snadné rozpustnosti vysoce čistých proteinů, okamžitě přecházejí v roztok a bezprostředně se dalším tlakem na píst stříkačky po promísení v mísící hlavě infudují pacientovi (viz obrázek 1).

Na základě vysoké stability faktoru II v roztoku je tento vhodný také jako rozpouštědlo pro faktor Xa při způsobu podávání dvoukomorovou injekční stříkačkou. Roztok vysoce čistého faktoru II, příkladně vyrobeného podle příkladu 2, ve fyziologicky přijatelném citrátovém pufru (4 g trinatriumcitrátdihydrátu/l,8 g NaCl/1, pH 7,0) o koncentraci 100 j. faktoru ΙΙ/ml se smísí s antitrombinem III, Imuno Vien (1 mj. antitrombinu ΙΙΙ/j. faktor II). Ve dvoukomorové injekční stříkačce (viz obrázek 2) se tento roztok použije jako rozpouštědlo pro lyofilizovaný prášek vysoce čistého faktoru Xa.

Příklad 10

Stabilita vysoce čistého faktoru II

Faktor II se stejně jak se popisuje v příkladu 2 vyčistí a uskladní se jako roztok o koncentraci 60 j./ml v pufru, který obsahuje 4 g trinatriumcitrátdihydrátu, 8 g NaCl/1, pH 7,0 při teplotách 5 °C, 22 C, 37 °C a 50 °C.

V případě skladovacích teplot 5 °C a 22 °C se odebírají

-35vzorky každých 24 hodin, v případě teplot 37 °C a 50 °C se v průběhu 24 hodin odebírají vzorky vždy v době 1 hodina, hodiny, 4 hodiny, 8 hodin a 24 hodin. Ve vzorcích se stanoví aktivita faktoru II.

Při teplotě 5 °C byla ještě po 86 dnech po počátku skladování zjištěna aktivita více jak 80 % výchozí hodnoty. Při teplotě 22 °C bylo po 14 dnech nalezeno více jak 80 % výchozí aktivity; při teplotě 37 °C bylo 24 hodin po počátku skladování opět nalezeno 95 % výchozí aktivity. Dokonce i při teplotě 50 °C bylo 8 hodin po počátku skladování nalezeno ještě 94 % původní aktivity.

Příklad 11

Autoaktivace a stabilita preparátů podle vynálezu

Preparáty podle vynálezu podle příkladu 5 (faktor II) a příkladu 6 (komplex faktoru II/Xa) se vyšetřují testem in vitro z hlediska jejich protrombotických vlastností obzvláště extrinsinního systému srážlivosti ve srovnání se dvěma běžnými obchodními komplexními koncentráty protrombinu. Před nasazením v testu se v komplexním preparátu protrombinu neutralizuje přítomný heparin podle jeho koncentrace protaminsulfátem, aby se vytvořily trombogenní součásti, které by byly heparinem maskovány.

Z Z R

Analyzovaná nasada sestává z 250 μΐ Thrombotest (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norsko), preparátu obsahujícího tromboplastin z hovězího mozku a adsorbované hovězí plazmy, který se předběžně inkubuje 3 minuty při teplotě 37 °C. Následně se přidá 50 μΐ vzorku a pomocí kulového koagulometru (KC4, Amelung) se stanovuje doba srážení. Hovězí

-36tromboplastiny se považují za obzvláště citlivé pro aktivované faktory srážlivosti. Tomu odpovídajícím způsobem může testovaný systém podat výpověď o trombogenitě in vitro zkoumaných preparátů. V tomto testu se jako kontrola použije neředěná lidská normální plazma. Ta vykazuje dobu srážení 74 sekund. Oba zkoumané preparáty podle vynálezu vykazují při použití v neředěném stavu doby srážení více jak 100 sekund, přičemž koncentrace odpovídá možné uživatelské koncentraci 30 j. faktorΙΙ/ml. Běžný obchodní komplexní koncentrát protrombinu, rovněž rozpuštěný na uživatelskou koncentraci a zředěný na 30 j./ml se musel dále zředit pufrem 1 : 32, aby se dosáhlo doby srážení normální plazmy (74 sekund). Jiný běžný obchodní aktivovaný komplexní koncentrát protrombinu se dokonce musel zředit pufrem 1 : 216, aby se dosáhlo doby srážení normální plazmy (74 sekund). Následně se preparáty podle vynálezu skladují rozpuštěné až 4 hodiny při teplotě místnosti a jednou za hodinu se odebíD ráji vzorky a stanovuje se doba srážení pomocí Trombotestu . Nedochází přitom k žádným změnám, to znamená, že i po 4 hodinách vykazují použité nezředěné vzorky stále doby srážení nad 100 sekund. Z těchto pokusů je zřejmé, že preparáty podle vynálezu oproti běžným obchodním komplexním koncentrátům protrombinu vykazují výrazně nižší potenciál trombogenity.

Příklad 12

Chování preparátu podle vynálezu při rozpouštění

Preparát obsahující vysoce čistý faktor II se vyrobí stejně, jako se popisuje v příkladu 5 a vysuší se vymražením. Lyofilizát se nastaví tak, aby objemová aktivita po

-37rekonstituci destilovanou vodou činila 50 j./ml. To je typická uživatelská koncentrace. Na základě vysoké čistoty preparátu se však může dosáhnout také objemové koncentrace 100 a více jednotek faktoru II v ml. Stanoví se doba rozpouštění preparátu, definovaná jako doba od přidání rozpouštědla (destilovaná voda) až do úplného rozpuštění prášku. Ve srovnání k tomu se podle údajů výrobce rekonstituují přídavkem vody do uživatelské koncentrace lyofilizáty dvou běžných obchodních preparátů, protrombinového komplexu a aktivovaného protrombinového komlexu a rovněž se stanovuje doba potřebná k rozpuštění. Doba rozpouštění zkoumaných preparátů je uvedena v následující tabulce :

	Preparát podle vynálezu	APCC¹	PCC²
Doba rozpouštění (s)	< 30	240	300

APPC = aktivovaný koncentrát komplexu protrombinu

PCC = koncentrát komplexu protrombinu

Po provedeném rozpuštění daného preparátu se měří jeho UV/VIS spektrum mezi 280 a 750 nm proti pufru citrát - kuchyňská sůl. Spektra jsou uvedena na·obrázcích 5a, bac (a : preparát podle vynálezu, b : aktivovaný komplex protrombinu, c : komplex protrombinu). Porovnání spekter ukazuje, že preparát podle vynálezu ve viditelné oblasti do 700 nm vykazuje výrazně nižší absorpci světla, než srovnávací preparáty. Preparát podle vynálezu se tedy vyznačuje vynikající rozpustností a je v rozpuštěné formě v podobě čirého, nezabarveného roztoku, jaký je charakteristický pro zlepšený farmaceutický preparát.

-38Příklad 13

Účinek preparátu v plazmě s inhibitorem faktoru VIII

Plazma s inhibitorem faktoru VIII s vysokým titrem (55 BU/ml) se předem ochladí v ledové lázni a inkubuje se po dobu 1 minuty při teplotě 37 °C s reagencií PTT (IMUNO,

Vien) a testovaným vzorkem, oběma rovněž předem ochlazenými v ledové lázni v poměru 1+1+1. Následně se přidá 1 díl roztoku 0,05 M CaCl2 a stanovuje se doba srážení testované násady s pomocí kulového koagulometru firmy Amelung, model KC-4. Testované preparáty se dále zředí v poměru 1 : 10 pufrem, obsahujícím 7 g NaCl/1 a 6 g trinatriumcitrátdihydrátu/l a s touto koncentrací se použije v testech. Za těchto podmínek se testuje vysoce čistý faktor II, samotný a v kombinaci s vysoce čistým faktorem Xa, v kombinaci s antitrombinem III a heparinem. Doby srážení jsou uvedeny v následující tabulce.

	Testovaná substance		Doba srá-
	(koncentrace)		žení (s)
Faktor II	Faktor Xa	Antitrombin III	Heparin
10 j·/ml	-	-	•	147
10 j./ml	0,1 j./ml	-	-	63
10 j./ml	0,1 j./ml	1 j·/ml	-	55
10 j./ml	0,1 j./ml	1 j·/ml	6 j./ml	49

Jako kontrola se stanoví doba srážení testované násady s čistým pufrem trinatriumcitrát - chlorid sodný. Ta činí 148 sekund. Tak se může pouze přídavkem faktoru II/Xa

-39s nebo bez antitrombinu III nebo heparinu výrazně snížit doba srážení plazmy s inhibitorem. Měřením standardního preparátu FEIBA^R (FEIBA^R STIM 4, Imuno), který představuje konvenční preparát k ošetřování pacientů s inhibicí faktoru VIII, v různých koncentracích při stejných testech bylo zjištěno, že FEIB aktivita preparátu, obsahujícího 10 j./ml faktoru II a 0,1 j. faktoru Xa/ml odpvídá asi 25 j. FEIBA^R/ml.

Příklad 14

Účinek in vivo při hemofilii s inhibicí faktoru VIII

K testování účinnosti in vivo preparátů podle vynálezu se používá model králíků s hemofilii s inhibicí faktoru VIII. Asi 2 kg těžcí, bílí novozélandští králíci se narkotizují. Po nastoupení narkózy se vždy preparuje pravá Véna femoralis a vytvoří se trvalý venozní přístup. Tím se infuduje 0,5 ml/kg tělesné hmotnosti lidské plazmy inhibované faktorem VIII (1500 BU/ml) po dobu 10 minut. 30 minut po ukončení infuze se určuje charakteristika krvácení za použití modifikované metody podle Giles et al., Blood 60: 727-730 (1982). K tomu se vyholí kůže okolo pazouru zadní pracky králíka, aby při pozdějším krvácení nebyla vystupující krev absorbována kožkou. Kůže u nehtů se poraní pomocí kleštiček na pazoury; bezprostředně nato se pod ránu umístí filtr tak, aby krev mohla kapat přímo na filtr, aniž by byla filtrem odsávána kapilárním účinkem, aby se zabránilo, že by byla vznikající krevní sraženina porušena. Filtrační papíry se mění každé 2 minuty, vystupující krev se shromažďuje ve frakcích. Shromažďování krve trvá 30 minut, potom se, pokud se krvácení nezastaví, rána ošetří. Ke kvantifikaci charakteristiky krvácení se filtry extrahují

-40vždy 0,04 %-ním roztokem hydroxidu amonného po dobu 5 hodin, přitom lyžují erytrocyty, které se s krví shromáždily na filtru. 10-ti minutovým zpracováním ultrazvukem se hemoglobin extrahuje a kvantitativně se stanoví fotometricky při 416 nm proti kalibrační křivce. Ta se získá tak, že se králičí krev v objemu mezi 10 μΐ a 1 ml pipetuje na filtr, ten se extrahuje, jak je uvedeno výše a hemoglobin se stanoví fotometricky při 416 nm. Charakteristika krvácení řezu se zjistí tak, že se graficky vynáší množství krve z frakcí po 2 minutách proti času. K posouzení se zjišťuje kumulovaná ztráta krve, přičemž objem jednotlivých krevních frakcí se vynáší graficky proti času. Jako kriterium významné pro krvácení bylo zvoleno kumulované krvácení mezi 10 a 20 minut. Tato hodnota je nezávislá na počátečním množství krve, které kolísá od králíka ke králíkovi podle řezu na pazouře. Vzestup charakteristiky krvácení v 10 až 20 minutových intervalech pozorování slouží jako měřítko pro intenzitu krvácení. Vzestup rovnající se nule znamená, že se krvácení zastavilo, vzestup > 0 s korelačním koeficientem > 0,8 znamená, že krvácení je konstantní. Zdraví králíci vykazuj í za podmínek testu intenzitu krvácení < 2 μΐ krve/ minuta. Králíci s inhibicí faktoru VIII vykazují intenzitu krvácení asi 50 μΐ krve/minutu (viz obrázek 6). Králíci s inhibicí faktoru VIII, kteří byli ošetřeni preparátem s faktorem II podle příkladu 3 v dávkování 75 j./kg tělesné hmotnosti infuzí po dobu 30 minut, vykazují v průměru (n =

6) intenzitu krvácení 9,3 μΐ/rninutu a tím významné snížení oproti neošetřeným inhibovaným zvířatům.

-41Příkladl5

Účinek in vivo inhibitoru Villebrandův faktor/faktor VIII

Analogicky jako v příkladu 14 se použije model inhibice Villebrandův faktor/faktor VIII, kdy se králíkům infuduje antiplasma Vilebrandova faktoru/faktoru VIII z kozy, které bylo získáno imunizací koz čištěným faktorem VIII z preparátu Villebrandova faktoru, v dávce 1 ml/kg tělesné hmotnosti. Takto předem ošetřená zvířata vykazují zvýšený sklon ke krvácení (viz obrázek 7) . Charakteristika krvácení se měří řezem na pazouře u těchto zvířat zároveň s infuzí testované látky. Podáním faktoru II jako bolus 2,5 ml v dávce 75 j./kg bylo možno redukovat počáteční zvýšenou intenzitu krvácení ze 77 μΐ/rninutu na 31 μΐ/rninutu (1. řez na pazouře) případně 12 μΐ/rninutu (2. řez na pazouře). Kombinací faktoru II (75 j./kg) s faktorem Xab (vyrobeného podle příkladu 4) v dávce 0,55 j./kg jako bolus při injekčním objemu 2,5 ml bylo možné snížit sklon ke krvvácivosti z výchozí hodnoty na 18 μΐ/rninutu při 1. řezu na pazouře a 5 μΙ/minutu při 2. řezu na pazouře. Tím se normalizuje mimořádně zvýšené krvácení inhibovaných zvířat na úroveň zdravých srovnávacích zvířat (4 μΐ/minuta).

Navíc se na stejném modelu zkoumá také kombinace faktoru II (75 j./kg), faktoru Xa (0,55 j./kg) a antitrombinu III, Imuno Vien (75 mj./kg). Přitom se dosáhne při 1. řezu na pazouře snížení na 35 μΐ/rninutu a při 2. řezu na pazouře snížení na 7 μΙ/minutu (viz obrázek 8). Přídavek antitrombinu III má zabránit generaci trombinu z protrombinu enzymem z faktoru Xa v podávaném roztoku.

-42Příklad 16

Trombogenicita preparátu podle vynálezu

Jednotlivé složky a jejich směsi preparátů podle vynálezu se testují na jejich trombogenní aktivitu za použiti metody popsané Vesslerem, J.Appl.Phys. 14:943-946 (1959) při stáze venozní krve králíků.

Králíci se podrobí narkóze pentobarbitalem, vypreparuje se Véna juglaris a opatří se volnými ligaturami ve vzdálenosti 1-2 cm. Testované látky se injikují do ušní vény ležící proti Véna juglaris. Injekce se provádí v průběhu 15 sekund. Po době čekání 10 - 15 sekund se kousky vény uvolní z klemy. Po dalších 10 minutách se uvolněné kousky vény odeberou a nařežou v citrátovém pufru na Petriho misce a získané tromby se hodnotí pomocí stupnice mezi 0 a 4 (viz tabulka) .

Stupeň trombózy	Hodnocení
Žádná tvorba trombů	0
Malý počet malých trombů	0,5 - 1
Malý počet středně velkých a mnoho malých trombů	2
Mnoho středně velkých trombů	3
Malý počet velkých trombů	3,5
Souvislý trombus	4

Látky se testují vždy na šesti zvířatech, která obdrží

-43po 75 j. faktoru Il/kg, 0,55 j. faktoru Xa/kg a 75 mj . antitrombinu ΙΙΙ/kg buň samotných nebo v kombinaci. Následuj ící tabulka udává střední hodnotu Vesslerovy stupnice vždy šesti testovaných zvířat. Jako kontrola se použije čistý citrátový pufr, který se použije také jako pufr ke zředění.

Testovaná substance (koncentrace)
Faktor II	Faktor Xa	Antitrombin III	Stupeň Vessler
+	-	-	0,17
-	+	-	0,17
-	-	+	0,08
+	+	-	0,25
+	-	+	0,08
-	+	+	0,17
+	+	+	0,17
(Pufr)	(Pufr)	(Pufr)	0,2

Ukazuje se, že žádná z použitých složek, samotná ani v kombinaci, nevykazuje trombogenní aktivitu na králících.

Příklad 17

Účinek preparátů podle vynálezu v závislosti na formě podání

Preparát obsahující faktor II a faktor Xa podle pří-44kladu 6 se testuje z hlediska účinnosti vždy na 6 králících s inhibovanou hemofilií indukovanou faktorem VIII (viz příklad 14). Pokusné dávky jsou stejné, jaké se popisují v příkladu 15. Jako kontrola se zvířatům infunduje čistý puf r.

V prvním pokusu se infuze testovaných látek provádí po dobu 30 minut, odpovídající asi 15 minut/kg tělesné hmotnosti pomocí automatické infuzní pumpy při rychlosti infuze 1 ml/minuta. Ve druhém pokusu se zvířatům podává stejná dávka, avšak jako bolus v průběhu 30 sekund v malém injekčním objemu 2,5 ml/kg tělesné hmotnosti zvířat. Stejně jako se popisuje v příkladu 14 se měří intenzita krvácení během podání látky a po uskutečněném podání. Ukazuje se, že jak při pomalé infuzi s velkými infuzními objemy, tak také při rychlé injekci malé objemové dávky, avšak se stejnými dávkami vztaženo na tělesnou hmotnost, bylo možné normalizovat patologicky prodlouženou intenzitu krvácení ze 67 μΐ/rninutu na asi 5 μΐ/minutu, odpovídající stupni krvácení zdravých srovnávacích zvířat. Podáním pufru, rovněž oběma způsoby infuze nebyla nalezena žádná změna intenzity krvácení. Přes rychlou injekci jako bolus nebyla při injekci pozorována žádná reakce nesnášenlivosti, stejně jako při pomalé infuzi. U běžných obchodních preparátů se srovnatelnou indikací (aktivovaných) komplexních preparátů protrombinu se doporučuje infuzní rychlost v rozsahu méně než 0,05 ml/minuta/kg tělesné hmotnosti, aby se zabránilo akutním tromboembolickým vedlejším účinkům a nežádoucím reakcím. Jak pokus ukazuje, může se preparát podle vynálezu na základě jeho vysoké čistoty poodávat rychlostí 5 ml/minuta/kg tělesné hmotnosti, tedy se 100-násobnou injekční rychlostí bez vedlejších účinků.

-45Příklad 18

Účinek parciální protrombinázy na krysách s defektem destiček

Jako trombocytopatický model se použijí krysy chocholaté, jak popisuje T.B.Tschopp a M.B.Zucker (Hereditary Defect in Platelet Function in Rats, Blood 1972, 40:

217-226). Tento kmen krys, který blíže charakterizoval S.L.Raymond a V.J.Dodds (Characterization of the FawnHooded Rats as a Model for Hemostatic Studies, Thrombos Diathes haemorrh. 1975, 33: 361-369), se vyznačuje abnormálně zvýšenou dobou krvácení a sníženou agregací destiček, zatímco protrombinová doba, parciální tromboplastinová doba, faktor plazmy VIII a hladina fibrinogenu v plazmě a počet destiček leží ve stejné oblasti, jako u zdravých krys. Trombopatie u krys chocholatých vyplývá z redukovaného uvolňování ATP a ADP indukovaného trombinem a z redukovaného uvolňování serotoninu, a proto se charakterizuje jako Storage-Pool Defizienz, která je obdobou Storage-Pool Defizienz u lidí.

Krysy chocholaté se narkotizují pomocí ketamin-xylazinu (100 mg/kg + 5 mg/kg) i.m. Do juglární vény se zavede katetr, pomocí kterého se infundují testované látky. Následně se stanoví doba krvácení, k čemuž se použije Simplate R-Einmalschnápper (Organon, Technica). Ve vzdálenosti asi 1,5 cm od kořene ocasu se provede vždy jeden dorsální a potom ventrální podélný řez a měří se vždy doba krvácení. Střední hodnota z obou jednotlivých měření se bere jako doba krvácení. Potom se provede aplikace testované substance (pufr, faktor II podle příkladu 2, faktor Xa podle příkladu 4 a parciální protrombináza podle příkladu 6); o 30 minut

-46později se opět stanoví doba krvácení. Jako kontrola se použijí zdravé krysy Sprague-Dawley (Charles River).

Testování se provádí ve skupinách po 10 zvířatech, přičemž se podává komplex parciální protrombinázy ve 2 dávkách, 75 j./kg tělesné hmotnosti (KG) protrombinu a 0,55 j . /kg KG faktoru Xa a dále 150 j . /kg tělesné hmotnosti (KG) protrombinu a 1,1 j./kg KG faktoru Xa. Jako kontrola se podávají jednotlivé složky a pufr. Střední doby krvácení naměřené v jednotlivých pokusných skupinách uvádí následující tabulka. Zdravé krysy vykazují za stejných pokusných podmínek dobu krvácení 185 ± 5 sekund, zaatímco krysy s trombopatií mají prodlouženou dobu krvácení 335 ± 10 sekund. Podáním parciální protrombinázy se může tato mimořádně zvýšená doba krvácení redukovat na asi 270 sekund.

Tabulka

Doba krvácení (sekund) Střední hodnota 10 zvířat	Faktor II (j./kg)
0	75	150
0	335±10	296±13^ns	307±llⁿ
FXa 0,55	n. b.	273±13*	n. b.
(j·/kg)
1,1	320±13^ns	n. b.	268±11*

Statistické vyhodnocení :

Data jsou uvedena jako střední hodnoty ± standardní odchylka. Střední hodnoty skupiny se porovnávají pomocí Studentova T-testu.

-Mη.b. nestanoveno

ns	rozdíl oproti a 0 j·/kg FXa)	kontrolní	skupině	(0	j · /kg	FII
*	rozdíl oproti	kontrolní	skupině	(0	1 · /kg	FII
	a 0 j./kg FXa)	významný	s p ž 95	%
* ♦	rozdíl oproti	kontrolní	skupině	(0	j - /kg	FII
	a 0 j-/kg FXa)	významný	s p 99,9	%

Příklad 19

Účinek parciální protrombinázy u psů s deficitním

Villebrandovým faktorem

Pes s vrozenou deficiencí Villebrandova faktoru s neměřitelnou hladinou aktivních faktorů a antigenu v plasmě a s koncentrací faktoru VIII v plasmě sníženou o 50 % se ošetřuje parciální protrombinázou v dávce 100 j ./kg KG. K tomu účelu se pes narkotizuje a následně se jako bolus intravenózně podává parciální protrombináza vyrobená podle příkladu 6. Bezprostředně po podání testované substance a dále 15 minut, 30 minut, 1 hodina, 2 hodiny, 3 hodiny, 24 hodin a 48 hodin po infuzi se odebírají vzorky krve, vyrobí se z nich plazma a ve vzorcích plazmy se stanovuje koncentrace protrombinu, trombinu a faktoru VIII.

Před podáním parciální protrombinázy a 3 a 24 hodin po injekci se stanovuje charakteristika krvácení na kůži u nehtů. Postupuje se metodou, kterou popsal A.R.Giles, S.Tinlin a R.Greenwood, A Canine Model of Hemophilic (Factor VIII:C Deficiency) Bleeding, Blood 1982; 60, v upravené podobě. K tomu se vyholí kůže okolo pazouru zadní pracky králíka, aby při pozdějším krvácení nebyla vystupující krev

-48absorbována kožkou. Kůže u nehtů se poraní pomocí kleštiček na pazoury. Bezprostředně nato se pod ránu umístí filtr (Pipetman P5000-Schutzfilter, Gilson) tak, aby krev mohla kapat přímo na filtr, aniž by byla filtrem odsávána kapilárním účinkem, aby se zabránilo porušení vznikající krevní sraženiny. Filtrační papíry se mění každé 2 minuty, vystupující krev se shromažďuje ve frakcích. Shromažďování krve trvá 30 minut. Potom se, pokud se krvácení nezastaví, rána ošetří. U stejného zvířete se mohou používat různé pazoury.

Kvalifikace charakteristiky krvácení se provádí extrakcí krve shromážděné ve frakcích na filtrech vždy 5 ml 0,04 %-ního roztoku hydroxidu amonného po dobu 5 hodin. Přitom lyžují erytrocyty, které se s krví shromáždily na filtru. 10-ti minutovým zpracováním ultrazvukem (Sonorex RK 100, Bandelin electronic, Berlin) se hemoglobin extrahuje a kvantitativně se stanoví fotometricky při 416 nm proti kalibrační křivce. Ta se získá tak, že se psí krev v objemu mezi 10 μΐ a 1 ml pipetuje na filtr, ten se extrahuje, jak je uvedeno výše a hemoglobin se stanoví fotometricky při 416 nm. Odpovídajícím způsobem se nechají získat lineární cejchovací křivky, které umožňují přímý přepočet koncentrace hemoglobinu na množství krve v každém jednotlivém filtru. Charakteristika krvácení řezu se zjistí tak, že se graficky vynáší množství krve z frakcí po 2 minutách proti času. K posouzení charakteristiky krvácení se zjišťuje kumulovaná ztráta krve, přičemž se objem jednotlivých krevních frakcí vynáší graficky proti času. Jako kriterium významné pro krvácení byl zvolen vzestup kumulovaného krvácení mezi 10 a 20 minutami. Tato hodnota je nezávislá na počátečním množství krve, které může kolísat v důsledku špatně standardizovatelných technik řezu na pazouře. Vzestup této

-49charakteristiky krvácení v 10 až 20 minutových intervalech pozorování slouží jako měřítko pro intenzitu krvácení a udává se v ml krve/minuta. Vzestup rovnající se nule, odpovídající 0 ml/minuta, znamená, že se krvácení zastavilo; vzestup větší než nula s korelačním koeficientem > 0,8 znamená, že krvácení j e konstantní.

U normálních psů, kteří se testují za těchto podmínek, nedochází v pozorovaném období ke krvácení, to znamená, že krvácení se již dříve zastavilo (intenzita krvácení :

0,0 ml/minuta.

Intenzita krvácení činí před podáním parciální protrombinázy 1,05 ml/minuta a po 3 hodinách poklesá na 0,35 ml/minuta a dále po 24 hodinách na 0,47 ml/minuta.

Hladina faktoru VIII v plazmě zůstává po celou dobu pozorování konstantní, antigen Villebrandova faktoru zůstává pod hranicí prokazatelnosti, protrombin má před podáním substance hodnotu 0,7 j./ml a stoupá po injekci parciální protrombinázy na 2,4 j./ml a při poločase asi 24 hodin se eliminuje z cirkulace. 1 hodinu po podání testované substance bylo možné zjistit významnou generaci trombinu s chromogenním substrátem pro trombin, Thl (immuno). Injekci parciální protrombinázy snesl pes bez vedlejších účinků.

Příklad 20

Účinek parciální protrombinázy a Villebrandova faktoru u psů s deficitním Villebrandovým faktorem

-50Analogicky jako v příkladu 19 se pes ošetřuje parciální protrombinázou v dávce 100 j./kg KG a vyčištěným Villebrandovým faktorem v dávce 60 RCoF j./kg KG. Podáním této kombinace dojde u psů s deficitním Villebrandovým faktorem po 24 hodinách k úplné normalizaci mimořádně zvýšené krvácivosti, přičemž parametry plazmy z hlediska protrombinu a trombinu jsou srovnatelné s parametry podle příkladu 19. Navíc dojde ke vzestupu endogenního faktoru VIII na asi 200 % výchozí hodnoty a tato zůstává po dobu více jak 48 hodin konstantní a následně se během doby asi 120 hodin vrací na výchozí hodnotu. Villebrandův faktor s dobou polo času 20 hodin se eliminuje. Z literatury (L.Drouet, J.Roussi, M.Bonneau, G.A.Pignaud, P.L.Turecek, F.Dorner, U.schlokat, F.G.falkner, B.Fischer, A.Mitterer a H.P. Schwarz, The effect of recombinant human von Villebrand Factor in pigs with severe vo Villebrand Disease. Blood 1995: 86; 612a-AbsNo2435. (abs)) je známo, že podání samotného Villebrandova faktoru vede pouze k parciální normalizaci krvácivosti.

Příklad 21

Účinek parciální protrombinázy jako antagonisty peptidových antikoagulancii

Parciální protrombináza se složením 57 j. faktoru II 1,2 j. faktoru Xa se rozpustí ve 20 mM pufru Tris-HCl, obsa huj ícího 150 mM NaCl, pH 7,4 a 15 minut se inkubuje při teplotě místnosti za tvorby komplexu. Následně se odebere alikvot 50 μΐ a inkubuje se 90 sekund při teplotě 37 °C s 50μ1 tris-imidazolového pufru, pH 8,4. Následně se přidá 100 μΐ roztoku chromogenního substrátu, methoxykarbonyl-Dcyklohexylalanyl-glycyl-L-arginin-p-nitroanilidhydroacetát,

-51takže koncentrace chromogenního substrátu činí 1 mmol/1. Následně se fotometricky při 405 nm určuje kinetika štěpení chromogenního substrátu po dobu 3 minuty při teplotě 37 °C. Chromogenní substrát, který se hydrolyzuje jak trombinem tak i faktorem Xa, vykazuje při inkubaci parciální protrombinázou delta OD/minuta 0,084. Jako srovnání se v tomto testu použije faktor Xa ve stejné koncentraci, avšak bez protrombinu a zjišťuje se stupeň reakce chromogenního substrátu 0,064 delta OD/minutu. K parciální protrombináze se přidá rekombinantní hirudin (Rhein-Biotech) v koncentraci 0,0025 j./ml a rovněž se zjišťuje stupeň reakce chromogenního substrátu. Ukazuje se, že po snížení stupně přeměny substrátu čšistého faktoru Xa ( 0,064 delta OD/minutu) není měřitelná další reakce substrátu, což je důsledkem úplné neutralizace hirudinu.

Vedle specifického a účinného inhibitoru trombinu, hirudinu, se použil také selektivní inhibitor faktoru Xa, rekombinantní Tick-antikoagulant peptid, rekombinantní ekvivalent inhibitoru proteázy šeřinu z Ornithodoros moubata, jehož antikoagulační účinnost in vivo popsali G.P.Vlasuk, D.Ramjit, T.Fujita et al., v Comparison of the In Vivo Anticoagulant Properties od Standard Heparin and the Highly Selective Factor Xa Inhibitors Antistasin and Tick Anticoagulant Peptide (TAP in a Rabbit Model of Venouš Thrombosis. Thrombos Haemostas 1991; 65 25V-262. Již 30 minut po přídavku rekombinantního Tick-antikoagulant peptidu nebyla již chromogenním substrátem měřitelná žádná aktivita enzymu. Pokus ukazuje, že parciální protrombináza je účinným antagonistou peptidových antikoagulancií, hirudinu a Tick-antikoagulant peptidu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

L 6 ΛΙ ;S L oi§oa

1. Farmaceutický preparát k ošetřování poruch sráž^L JvbsttrS 0 krve, obsahující nejméně 2 faktory srážlivosti,é jsou součástí protrombinázy nebo pro-protrombinázy a kterc™.-.............—.....— neobsahují fosfolipidy.
2. Preparát podle nároku 1, vyznačující se tím, že nejméně jeden z faktorů je aktivován.
3. Preparát podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje nejméně dva faktory srážlivosti vybrané ze skupiny sestávající z faktorů II, V, Va a Xa.
4. Preparát podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že sestává v zásadě z faktorů II a V případně Va.
5. Preparát podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že sestává v zásadě z faktorů X a V případně Va.
6. Preparát podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že sestává v zásadě z faktorů II a X případně Xa, případně v kombinaci s faktorem V případně Va.
7. Preparát podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že faktory srážlivosti

-53jsou ve formě komplexu.
8. Preparát podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje ionty hořčíku.
9. Preparát podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že neobsahuje volné ionty vápníku.
10. Preparát podle nároku 9, vyznačující se tím, že obsahuje chelatotvornou látku ke tvorbě komplexů volných iontů vápníku.
11. Preparát podle některého z nároků 1 až 3 a 6 až 10, vyznačující se tím, že obsahuje protrombin a čištěný faktor Xa jako aktivní složky a neobsahuje fosfolipidy .
12. Preparát podle nároku 11, vyznačující se tím, že v podstatě sestává z protrombinu a faktoru Xa.
13. Preparát podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že při dávce nejméně 150 j./kg protrombinu nezpůsobuje vedlejší tromboembolické účinky, vyjádřeno ve stupních podle Vesslerova modelu trombózy nejvýše 3 body.
14. Preparát podle nároku 11 až 13, vyznačující se tím, že obsahuje protrombin se specifickou aktivitou nejméně 5 j./mg proteinu.

-5415. Preparát podle některého z nároků 11 až 14, vyznačujíc! se tím, že obsahuje faktor Xa se specifickou aktivitou nejméně 100 j./mg proteinu.
16. Preparát podle některého z nároků 11 až 15, vyznačující se tím, že obsahuje faktor Xa převážně jako faktor Xap.
17. Preparát podle některého z nároků 11 až 16, vyznačující se tím, že protrombin a faktor Xa jsou obsaženy jako komplex.
18. Preparát podle některého z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že dále obsahuje antitrombin III ve stabilizovaném množství, případně společně s heparinem.
19. Preparát obsahující čištěný protrombin jako jedinou aktivní složku, obzvláště v kapalné formě nebo v kapalné, hluboko zmrazené formě.
20. Preparát k ošetřování poruch srážlivosti obsahující biologicky aktivní čištěný protrombin..
21. Preparát podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že při dávce nejméně 150 j./kg protrombinu nezpůsobuje vedlejší tromboembolické účinky, vyjádřeno ve stupních podle Vesslerova modelu trombózy nejvýše 3 body.
22. Preparát podle některého z nároků 11 až 21, vyznačující se tím, že obsahuje méně než 0,1 j. faktoru VIII:C nebo faktoru VIII:Ag/j. protrombinu.

-5523. Preparát podle některého z nároků 11 až 22, vyznačující se tím, že obsahuj e méně než 0,1 j. faktoru IX/j. protrombinu.
24. Preparát podle některého z nároků 11 až 23, vyznačující se tím, že obsahuje méně než 0,1 j. faktoru VIII:C nebo faktoru VIII:Ag/j. protrombinu.
25. Preparát podle některého z nároků 11 až 24, vyznačující se tím, že obsahuje méně než 0,01 mg fosfolipidu/j. protrombinu.
26. Preparát podle některého z nároků 11 až 25 v aplikační formě v koncentraci, která umožňuje dávku nejméně 50 j. protrombinu/kg tělesné hmotnosti a případně umožňuje administraci jednorázovou injekci.
27. Preparát podle nároku 26 v aplikační formě, která obsahuje dávku 50 až 500 j. protrombinu/kg tělesné hmotnosti.
28. Preparát podle některého z nároků 1 až 27, vyznačující se tím, že se faktory srážlivosti vyrábějí rekombinantní technologií DNA.
29. Preparát podle některého z nároků 1 až 28, vyznačující se tím, že je připraven ve formě lyofilizátu, který se s výhodou může rekonstituovat na opticky čirý roztok.
30.

Preparát podle některého z nároků 1 až 29,

-56vyznačující se tím, že je připraven ve vhodném aplikačním zařízení, s výhodou jako lyofilizát v injekční stříkačce, která umožňuje rekonstituci in sítu pomocí farmaceuticky přijatelného roztoku.
31. Preparát podle některého z nároků 1 až 30, vyznačující se tím, že je virově inaktivní případně je v něm množství virů omezeno.
32. Komplex, sestávající z protrombinu, faktoru Xa a případně faktoru V případně Va.
33. Komplex, sestávající z protrombinu a faktoru

V případně Va.
34. Komplex, sestávající z faktoru X a faktoru V případně Va.
35. Preparát obsahuj ící komplex podle některého z nároků 32 až 34 a dále ionty vápníku.
36. Preparát podle nároku 35,vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje trombin a případně fosfolipidy, určený k diagnostickému použití.
37. Způsob výroby čištěného farmacetického preparátu protrombinu, vyznačující se tím, že se koncentrát protrombinového komplexu podrobí chromatografickému čištěni a frakce obsahující protrombin se zpracují na farmaceutický preparát.
38. Způsob podle nároku 37,vyznačuj ící se kombinací následujících kroků :

příprava komplexního protrombinového preparátu

-57v pevném stavu nebo jako roztok obsahující protrombin, zpracování vedoucí k inaktivaci virů, s výhodou tepelné zpracování, případně rozpuštění komplexního protrombinového preparátu, přičemž se získá roztok obsahující protrombin, případně zpracování roztoku obsahujícho protrombin se solí alkalických zemin jako pevným nosičem, přičemž se protrombin adsorbuje a následně desorbuje, případně jednorázová nebo opakovaná koncentrace, s výhodou precipitací nebo ultra-/diafiltrací, a gelová filtrace roztoku obsahujícího protrombin, zpracování roztoku obsahujícího protrombin iontoměničem, přičemž se protrombin adsorbuje a následně se selektivně desorbuje, zpracování roztoku obsahujícího protrombin hydrofobním chromatografickým materiálem, konečné zpracování roztoku obsahujícího protrombin na farmaceutický preparát.
39. Preparát protrombinu, připravený způsobem podle některého z nároků 37 nebo 38, vyznačující se tím, že při dávce nejméně 150 j. protrombinu/kg nezpůsobuje vedlejší tromboembolické účinky, vyjádřeno ve stupních podle Vesslerova modelu trombózy nejvýše 3 body a že lyofilizát je možné rekonstituovat s dobou rozpouštění nejvýše 1 minuta na čirý roztok s aktivitou nejméně 10 j. protrombinu /ml.
40. Použití čištěných faktorů protrombinázy, obzvláště čištěného protrombinu a případně čištěného faktoru Xa k výrobě farmaceutického preparátu k vytváření supranormálních koncentrací protrombinu v krvi pacienta.

-5841. Použití.podle nároku 40, přičemž supranormální koncentrace činí nejméně 1,5 j. protrombinu/ml krve, s výhodou nejméně 2 j./ml.
42. Použití čištěných faktorů protrombinázy, obzvláště čištěného protrombinu a případně čištěného faktoru Xa k výrobě farmaceutického preparátu k ošetřování stavů s inhibicí faktoru VIII, hemofilie A nebo B nebo Villebrandovy nemoci.
43. Použití nejméně 2 faktorů srážlivosti, které jsou součástí protrombinázy případně pro-protrombinázy k výrobě farmaceutického přípravku k ošetřování akutního krvácení, zvýšeného sklonu ke krvácivosti případně zvýšeného rizika krvácení u nehemofilních pacientů.
44. Použití podle nároku 43 k výrobě farmaceutického přípravku k ošetřování krvácení na základě trombopatie.
45. Použití podle nároku 43 nebo 44 k výrobě farmaceutického preparátu k ošetřování trombocytopenie indukované heparinem.
46. Použití podle některého z nároků 43 až 45, vyznačující se tím, že farmaceutický preparát vykazuje primární hemostatickou aktivitu.
47. Farmaceutický preparát k ošetřování pacientů s poruchami krevní srážlivosti, obsahující nejméně 2 faktory srážlivosti, které jsou součástí protrombinázy případně pro-protrombinázy a neobsahují fosfolipidy a dále protein s primární hemostatickou aktivitou, obzvláště vVF.

-5948. Souprava k ošetřování pacientů s poruchami srážlivost krve obsahuj ící složky :

a) farmaceutický preparát, obsahující nejméně dva faktory srážlivosti, které jsou součástí protrombinázy případně pro-protrombinázy a které neobsahují lipidy a

b) protein s primární hemostatickou aktivitou, obzvláště VF
49. Použití podle některého z nároků 43 až 45 k výrobě farmaceutického preparátu k ošetřování krvácení v rámci terapie antikoagulancii.
50. Použití podle nároku 49 k výrobě farmaceutického preparátu jako antidota pro inhibitor srážlivosti připadneš jako antikoagulační prostředek nebo jako inhibitior funkce trombocytů.
51. Použití podle nároku 50, vyznačující se tím, že inhibitor srážlivos ti případně antikoagulační prostředek se vybere ze skupiny sestávající z APAP, derivátů benzamidinu, hirudinu, heparinu, analogů heparinu, obzvláště pentasacharidy, komplex heparin-AT III, AT III, antistasin, Tick-Anticoagulant Peptide , inaktivní faktory srážlivosti, obzvláště faktory srážlivosti inhibované active site, TFPI, kompetitivní ligandy pro membránové povrchové receptory trombocytů, obzvláště protilátky proti GP Ilb/IIIa a jejich analoga vyrobená genovými technikami nebo synteticky, obzvláště peptidy, a orální antikoagulancia.
52. Použití podle nároku 50, vyznačující se tím, že inhibitorem funkce trombocytů je ticlopidin nebo kyselina acetylsalicylová.

-6053. Souprava k antikoagulační terapii pacientů zahrnující složky

a) inhibitor srážlivosti případně antikoagulační prostředek nebo inhibitor funkce trombocytů, a

b) farmaceutický přípravek podle některého z nároků 1 až 36
54. Použití podle nároku 43 k výrobě farmaceutického preparátu k ošetřování intrakraniálního krvácení, obzvláště při narušené tvorbě trombinu.
55. Použití podle nároku 54 k ošetřování předčasně narozených.