KR20220111307A

KR20220111307A - 프로-트롬빈 정제

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Publication number: KR20220111307A
Application number: KR1020227022601A
Authority: KR
Inventors: 아이빈 유; 지안핑 유; 이스라엘 누르; 리오르 와이즈만; 이타이 포돌러
Original assignee: 옴릭스 바이오파머슈티컬스 리미티드; 광저우 바이오실 바이오테크 캄파니 리미티드
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2022-08-09
Also published as: WO2021108976A1; EP4069835A1; CN115066497A; EP4069835A4; AU2019477041A1; US20220411776A1

Abstract

흡착제 및 관심 단백질로 구성된 매질로부터 단백질을 정제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 특히 흡착제 내에/상에 적어도 부분적으로 흡착된 단백질의 매질을 제공하는 단계, 및 흡착제-흡착된 단백질을 세척하고/하거나 흡착제로부터 단백질을 용출하여 단백질을 적어도 부분적으로 정제하도록 압력 여과를 수행하는 단계를 포함한다.

Description

프로-트롬빈 정제

본 발명은 특히 단백질 정제 방법, 예를 들어, 필터 프레스를 사용한 혈장으로부터의 프로트롬빈의 정제 방법에 관한 것이다.

트롬빈은 피브리노겐의 피브린으로의 전환을 촉매함으로써 혈액 응고를 용이하게 하는 세린 프로테아제이다. 트롬빈은 또한 혈소판 활성화를 담당하며, 다수의 단백질 분해 피드백 메커니즘을 통한 그의 생성 및 억제의 조절을 간접적으로 담당한다. 트롬빈은 또한 인자 VIII, 인자 V, 인자 XI, 인자 XIII 및 단백질 C의 활성화에 관여한다. 트롬빈은 피브리노겐의 피브린으로의 전환에 의해 상처의 출혈을 멎게 하는 응고 인자로서 임상 응용에서 널리 사용되며, 외과용 드레싱의 일반적인 성분이고, 피브린 글루, 접착제 및 밀봉제와 같은 2-성분 지혈 시스템에서 피브리노겐 및 다른 응고 단백질과 조합하여 사용되어 왔다.

트롬빈은 전구체(자이모겐) 프로트롬빈의 단백질 분해 활성화에 의해 생성된다. 트롬빈을 생성하기 위해서는, 프로트롬빈을 두 부위에서 절단하여 중간 생성물을 생성하여야 한다. 체내에서 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환은, 활성화된 인자 X 및 인자 V를 포함하고 칼슘 이온의 존재 하에 음으로 하전된 인지질 막에 조립되는 프로트롬비나아제 복합체에 의해 촉매된다.

트롬빈은 프로트롬빈의 공급원(예컨대, 혈장 또는 혈액 분획)을, 프로트롬빈을 프로트롬빈의 공급원으로부터 흡착할 수 있는 고체 흡착제, 예를 들어 황산바륨(BaSO₄)과 접촉시킴으로써 프로트롬빈으로부터 제조될 수 있다. 고체 흡착제는 전형적으로 미결합 단백질과 같은 오염물을 제거하기 위해 세척 용액을 사용하여 세척되고, 후속적으로, 용출 용액을 사용하여 그로부터 프로트롬빈이 용출된다. 추가적인 선택적 정제 및 가공 단계에 후속하여, 용출된 프로트롬빈은 활성화제, 예를 들어, 칼슘 이온을 사용한 활성화에 의해 트롬빈으로 전환될 수 있다.

황산바륨 결합을 사용한 프로트롬빈의 현재의 ("수동" 또는 "비-필터 프레스"로 지칭되는) 정제 공정은 불순물을 제거하기 위한 3회의 수동 세척, 황산바륨으로부터 프로트롬빈을 용출하기 위한 5회의 수동 용출을 포함한다. 각각의 세척 및 용출 단계는 손으로 황산바륨을 파쇄하는 것, 황산바륨을 완충액으로부터 분리하기 위한 원심분리, 및 원심분리 병으로부터 황산바륨을 파내는 것을 필요로 한다.

본 발명은 특히, 필터 프레스를 사용하여 혈장으로부터 단백질, 예를 들어 프로트롬빈을 정제하는 방법에 관한 것이다.

혈장으로부터 관심 단백질을 결합하기 위해, 예를 들어, 황산바륨 상에 흡수된 프로트롬빈으로부터 프로트롬빈을 수득하기 위해 현재 사용되는 공정은 수동 작업, 낮은 생산 효율, 높은 오염 위험 부담, 시간 소모적인 원심분리기의 반복적인 사용과 같은 몇몇 단점을 갖는다. 또한, 현재의 공정은 규모를 확장하기 어렵다. 본 발명의 방법의 실시 형태에서, 필터 프레스는, 수동 세척, 용출 및/또는 원심분리 대신에, 선택적으로 자동 공정으로서 사용되며, 원심분리가 필요하지 않고, 규모 확장이 용이하고, 시간을 절감하고, 오염 위험을 줄이므로, 이러한 단점을 적어도 부분적으로 극복한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 불용성 흡착제(예를 들어, 황산바륨(BaSO₄) 또는 수산화알루미늄) 시약 및 단백질을 포함하는 매질로부터 관심 단백질을 정제하는 방법이 제공되며, 이 방법은 흡착제(예를 들어, 불용성 염, 예컨대 BaSO₄ 또는 수산화나트륨) 내에/상에 적어도 부분적으로 흡착된 단백질을 포함하는 매질을 제공하는 단계, 및 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 또는 수산화나트륨)-흡착된 단백질(이는 잔류물(retentate)임)을 세척하고/하거나 흡착제로부터 단백질을 용출하여 단백질을 적어도 부분적으로 정제하도록 압력 여과를 수행하는 단계를 포함한다.

본 명세서에서, 흡착제 내에/상으로 적어도 부분적으로 흡착된 단백질은 "흡착제-흡착된 단백질"로도 표시된다.

일부 실시 형태에서, 압력 여과를 수행하는 단계는 압력 필터, 예를 들어, 필터 프레스에 매질을 통과시킴으로써 수행된다.

일부 실시 형태에서, 흡착제는 불용성 염을 포함하였다. 일부 실시 형태에서, 불용성 염은 수산화알루미늄을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 불용성 염은 불용성 알칼리 토금속 염을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 불용성 알칼리 토금속 염은 BaSO₄ 시약이거나 이를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 매질은 단백질의 공급원을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 매질은 액체 매질이다. 일부 실시 형태에서, 단백질은 프로트롬빈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 매질은 프로트롬빈의 공급원을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 압력 여과를 수행하여, 흡착제(예컨대, 불용성 염(예를 들어, BaSO₄ 또는 수산화알루미늄))-흡착된 단백질을 세척하고 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 또는 수산화알루미늄)로부터 단백질을 용출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 또는 수산화알루미늄)-흡착된 단백질은 세척 완충액을 사용하여 세척된다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 (i) 매질을 원심분리하여 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 또는 수산화알루미늄) 시약 및/또는 단백질을 포함하는 침전물을 수득하는 단계; (ii) 흡착제 시약 내에/상에 적어도 부분적으로 흡착된 단백질을 세척 완충액으로 세척하여, 그로부터 불순물을 제거하는 단계; 및 (iii) 용출 완충액을 사용하여, 흡착제-흡착된 단백질로부터 단백질을 포함하는 분획을 용출하는 단계로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 전술한 단계 (ii) 및 단계 (iii)을 포함하며, 단계 (ii) 및 (iii) 중 적어도 하나의 단계는 압력 필터에 매질을 통과시키는 단계에 의해 또는 동시에 수행된다.

일부 실시 형태에서, 흡착제는 불용성 염을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 흡착제 시약은 분말의 형태이다.

일부 실시 형태에서, 압력 필터는 필터 프레스에 의해 수행된다. 일부 실시 형태에서, 단백질은 프로트롬빈이고, 프로트롬빈의 공급원은 혈장 또는 혈장 분획으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 혈장은 옥살레이트화 혈장을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈의 공급원은 포유류에서 채취한 혈장을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 포유류는 인간, 말, 소 및 돼지로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈의 공급원은 돼지 혈장을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 흡착제(예를 들어, 불용성 염(예컨대, BaSO₄)) 시약에 의한 프로트롬빈의 공급원으로부터의 프로트롬빈의 흡착을 허용하는 조건 하에서 흡착제(예를 들어, 불용성 염(예컨대, BaSO₄)) 시약과 프로트롬빈의 공급원을 접촉시켜 흡착제 내에/상에 프로트롬빈을 흡착시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 흡착제(예를 들어, 불용성 염(예컨대, BaSO₄)) 시약에 의한 프로트롬빈의 공급원으로부터의 프로트롬빈의 흡착을 허용하는 조건은 7.4 내지 8.6 범위의 pH를 갖는 매질을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 압력 여과를 수행하는 단계는 압력 하에서 여과 챔버를 통해 매질을 통과시키는 단계를 포함하고, 여과 챔버는 필터 막을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 압력은 1.5 내지 약 4 바의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 압력 여과를 수행하는 단계는 매질을 압력 필터에 통과시키고 막에 5 psi 내지 15 psi 범위의 배압(back pressure)을 가하여, 필터 막 내에/상에 흡착제(예를 들어, 불용성 염(예컨대, BaSO₄))-흡착된 단백질의 균일한 케이크를 수득하는 단계를 포함한다. 용어 "배압"은 매질의 유동 방향과 반대인 방향의 압력을 지칭한다.

용어 "균일한"은 변화, 두께 또는 다양성이 본질적으로 결여됨(즉, 전형적으로 10% 미만 또는 5% 미만임)에 관한 것이다.

일부 실시 형태에서, 필터 막은 1 m² 당 30 ㎏ 이상의 프로트롬빈의 공급원의 여과 용량을 특징으로 한다.

일부 실시 형태에서, 매질은 약 0.5 내지 3% (w/w), 선택적으로 약 1%의 흡착제, 예컨대 BaSO₄ 시약을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 세척 단계는 2 내지 6회 반복된다.

일부 실시 형태에서, 세척 시, 트롬빈 이외의 단백질(예를 들어, 피브리노겐)의 양은 감소된다.

일부 실시 형태에서, 세척 시, 매질은 0.5 mg/ml 미만, 0.4 mg/ml 미만, 0.3 mg/ml 미만, 0.2 mg/ml 미만, 0.1 mg/ml 미만의 피브리노겐을 포함하거나, 또는 심지어 피브리노겐이 없다.

일부 실시 형태에서, 세척되어 제거된, 트롬빈 이외의 단백질(예를 들어, 피브리노겐) 은 추가로 정제될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 세척 완충액은 1:100 내지 1:25 범위의 세척 완충액 대 혈장의 중량비로 첨가된다. 일부 실시 형태에서, 세척 완충액은 1:100, 1:75, 1:50 또는 1:25(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)의 세척 완충액 대 혈장의 중량비로 첨가된다. 예시적인 실시 형태에서, 세척 완충액은 약 1:50의 세척 완충액 대 혈장의 중량비로 첨가된다.

일부 실시 형태에서, 세척 완충액은 염화나트륨 및/또는 시트르산나트륨을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 용출 완충액을 사용하여 단백질을 흡착제(예를 들어, BaSO₄)-흡착된 단백질로부터 용출하여, 용출된 단백질-함유 분획을 수득한다. 용출 완충액(예를 들어, 200 ml)은 필터 프레스 시스템 내로 펌핑되고, 예를 들어 5 내지 30분 동안 순환될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 용출 완충액은 1:100 내지 1:25 범위의 세척 완충액 대 혈장의 중량비로 첨가된다. 일부 실시 형태에서, 용출 완충액은 1:100, 1:75, 1:50 또는 1:25(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)의 세척 완충액 대 혈장의 중량비로 첨가된다. 예시적인 실시 형태에서, 용출 완충액은 약 1:50의 용출 완충액 대 혈장의 중량비로 첨가된다.

일부 실시 형태에서, 용출 완충액은 칼슘 킬레이팅 염을 포함하고, 선택적으로 pH가 약 6.3 및 7.4이다. 일부 실시 형태에서, 칼슘 킬레이팅 염은 시트르산나트륨을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 시트르산나트륨의 농도는 약 3% (w/v) 내지 약 4.4% (w/v)의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 용출된 프로트롬빈-함유 분획을 농축하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 용출된 단백질-함유 분획을 정용여과(diafiltration) 완충액 중에서 정용여과하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 정용여과 완충액은 글리신을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 정용여과 단계는 2 내지 6회 반복된다.

일부 실시 형태에서, 단백질은 프로트롬빈이고, 본 방법은 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 허용하는 조건을 제공하여 트롬빈을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 용출된 단백질-함유 분획은 동결건조될 수 있다.

다른 태양에서, 프로트롬빈의 공급원으로부터 트롬빈을 수득하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (i) 흡착제, 선택적으로 BaSO₄ 시약 및 프로트롬빈의 공급원을 포함하는 액체 매질을 압력 필터에 통과시켜, 매질로부터 프로트롬빈을 적어도 부분적으로 분리 및/또는 정제하는 단계, 및 (ii) 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 허용하는 조건을 제공하여 트롬빈을 수득하는 단계를 포함한다.

임의의 태양의 일부 실시 형태에서, 흡착제, 선택적으로 BaSO₄ 시약은 프로트롬빈을 적어도 부분적으로 흡착한다. 임의의 태양의 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 허용하는 조건은 칼슘 이온과 같은 활성화제에 프로트롬빈을 노출시키는 것을 포함한다.

임의의 태양의 일부 실시 형태에서, 트롬빈은 분획에 존재하고, 본 방법은 트롬빈 함유 분획을 필터에 통과시켜 그로부터 마이크로 플록(micro floc)을 제거하는 단계를 포함한다.

임의의 태양의 일부 실시 형태에서, 본 방법은 4시간 이내에 프로트롬빈의 공급원, 선택적으로 혈장 1 ml당 70 내지 130 IU의 수율로 트롬빈을 수득하는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "IU"는 "국제 단위"를 나타내며, 예를 들어 트롬빈에 대한 세계 보건 기구(WHO) 제2 국제 표준, 01/580(World Health Organization (WHO) Second International Standard for Thrombin, 01/580)에 대해 보정된 역가 농도 측정을 위한 내부 기준 표준에 대한 응고 분석에 의해 결정될 수 있다. 단위(U)는 국제 단위(IU)와 등가이다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 태양의 방법에 의해 수득되는 트롬빈이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈은 4000 내지 6000 IU/ml의 활성을 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈은 단백질 1 mg당 700 내지 1200 IU의 비활성도(specific activity)를 특징으로 한다.

프로트롬빈의 공급원으로부터 트롬빈을 수득하는 방법의 태양의 추가 실시 형태가 관심 단백질을 정제하는 방법의 태양과 관련하여 상기에 제공되며, 트롬빈을 수득하는 방법의 태양과 관련된 실시 형태의 필수 부분을 형성한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및/또는 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 형태의 수행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료가 하기에 기재되어 있다. 상충되는 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 반드시 제한하고자 하는 것은 아니다.

본 발명의 일부 실시 형태가 첨부 도면을 참조하여 단지 예로서 본 명세서에 기재된다. 이제 도면을 구체적으로 상세히 참조하면, 도시된 상세 사항은 예시이며 본 발명의 실시 형태의 예시적인 논의를 위한 것임이 강조된다. 이와 관련하여, 도면과 함께 취해진 설명은 본 발명의 실시 형태가 어떻게 실시될 수 있는가가 당업자에게 명백하게 되도록 한다.
도 1a 및 도 1b는 프로트롬빈을 정제하기 위한 개시된 필터 프레스 공정(세척 및/또는 용출이 필터 프레스에 의해 수행될 수 있음; 도 1a)의 비제한적인 예; 및 용출액을 농축하기 위해 그리고 정제된 프로트롬빈으로부터 트롬빈을 얻기 위해, 비제한적인 예에 따라 수행되는 (용출액으로부터 시작하는) 추가 단계(도 1b)를 약술하는 흐름도를 나타낸다.
도 2는 프로트롬빈을 세척하고 용출한 후 필터 막 상의 황산바륨 침전물 케이크를 나타내는 사진 이미지를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 프로트롬빈 및 트롬빈 표준물과 비교하여 실험실 규모 연구로부터의 상이한 분획에서 프로트롬빈 및 트롬빈에 대한 SDS PAGE 쿠마시(coomassie) 염색(도 3a) 및 웨스턴 블롯(도 3b)의 결과를 나타내며; 데이터 시리즈 1 내지 9: 1 - α,β,γ 트롬빈 표준물, 2 - MW 마커, 3 - 프로트롬빈 표준물, 4 - 혈장, 5 - 비결합 혈장, 6 - 세척 분획, 7 - 용출된 분획, 8 - 24시간 동안 활성화됨, 및 9 - 61시간 동안 활성화됨; "*"는 프로트롬빈을 나타내고, "**"는 트롬빈을 나타낸다.
도 4a 및 도 4d는 하기 표 7에 기초하여, 비-필터 프레스 공정("현재의 공정")과 비교하여, 본 발명의 필터 프레스 공정 후 프로트롬빈에서 트롬빈으로의 활성화(3회 시험)를 사용하여 얻어진 트롬빈의 특성: 단백질 함량(mg/ml; 도 4a); 트롬빈 활성(IU/ml; 도 4b); 트롬빈 수율(IU/ml 혈장; 도 4c), 및 효소 비활성도(specific enzyme activity)(IU/mg 단백질; 도 4d)을 시각화하는 막대 그래프를 나타낸다.
도 5는 -20℃ 미만에서 동결된 (필터 프레스 공정 및 트롬빈 활성화를 사용하여 얻어지는) 트롬빈 활성의 산포도를 나타낸다(Y - IU/ml 단위의 트롬빈 활성 대 X - 트롬빈이 동결된 상태로 유지된 일수).

본 발명의 목적은 단백질, 예를 들어 프로트롬빈의 개선된 정제 공정을 제공하는 것이다.

하기에 설명되는 바와 같이, 비-필터 프레스 정제 공정은 하기 단계들을 포함한다: 황산바륨을 혈장(1% mg/mg)과 결합시키는(혼합하는) 단계; 원심분리에 의해 분리하여 혈장으로부터 황산바륨을 분리하고 황산바륨 케이크를 수집하는 단계; 세척 완충액을 사용하여 세척하고, 수동으로 침전물을 작은 조각으로 파쇄하고, 이어서 원심분리하여 액체로부터 고체를 분리하는 단계(이 단계를 전형적으로 3회 반복하여 불순물을 제거함); 및 용출 완충액을 첨가하여 용출한 후에 수동으로 침전물을 작은 조각으로 파쇄하고, 이어서 추가로 원심분리하여 액체로부터 고체를 분리하는 단계. 이러한 용출 단계는 전형적으로 프로트롬빈 복합체를 수집하기 위해 5회 반복된다. 고체/액체 분리를 위해 원심분리가 사용되기 때문에, 원심분리기로부터 수집된 침전물은 용이하게 세척/용출하기 위해 수동으로 작은 조각으로 파쇄할 필요가 있다. 세척 단계가 전형적으로 3회 반복됨에 따라, 용출 단계는 전형적으로 5회 반복되며, 원심분리는 혈장 제거 단계를 포함하여 총 9회 사용된다. 따라서, 이 공정은 매우 복잡하고, 오염 위험은 더 높고, 전형적으로 모든 작업을 완료하는 데 16시간이 걸린다. ("필터 프레스 공정"으로도 지칭되는) 개시된 방법의 비제한적인 예를 약술하는 흐름도를 나타내는 도 1a를 참조한다.

개시된 공정은, 이의 일부 실시 형태에서, 다음의 전술한 단계들 중 적어도 하나, 및 선택적으로 2개, 또는 심지어 3개를 대체하는 데 사용될 수 있다: (i) 예를 들어, 혈장 제거를 위한, 원심분리; (ii) 수동으로 및/또는 원심분리에 의해 수행되는 세척, 및 (iii) 수동으로 및/또는 원심분리에 의해 수행되는 용출.

개시된 공정의 현탁액(예를 들어, BaSO₄ + 혈장)은, 이의 일부 실시 형태에서, 필터 프레스 상의 심층 필터(depth filter)에 의해 분리된다. 흡착제(예를 들어, BaSO₄)는 필터에 의해 유지되어, (예를 들어, 잔류물로서) 예를 들어 프로트롬빈-BaSO₄의 얇은 케이크 층을 형성할 수 있고, 일부 실시 형태에서, 다음 작업에서, 세척 완충액을 사용하여 펌프에 의해 흡착제(예를 들어, BaSO₄)를 플러싱한다. 그 후에, 액체는 용출 완충액으로 대체될 수 있다. 그 후에, 프로트롬빈이 흡착제(예를 들어, BaSO₄) 케이크로부터 용출될 수 있다. 개시된 공정에서 이러한 세척/용출 작업의 단계는 각각 "온라인" 세척 또는 용출로도 지칭되는데, 즉, 비-필터 프레스 공정에서와 같은 수동 작업이 필요 없이 필터 프레싱 동안 수행된다. 전형적으로, 총 공정 시간은 예를 들어 4시간 이하로 감소될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 방법은, 이의 일부 실시 형태에서, 사용하기에 빠르고 간단하며, 잠재적으로 시간 및/또는 생산 비용의 절감을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 잔류물은 고체 분획, 예를 들어, 필터 상에 남아 있는 슬러리를 지칭한다.

일부 실시 형태에서, 개시된 공정의 총 지속시간(세척 및/또는 용출 단계까지)은 공정의 개시로부터 16시간 미만, 15시간 미만, 14시간 미만, 13시간 미만, 12시간 미만, 11시간 미만, 10시간 미만, 9시간 미만, 9시간 미만, 8시간 미만, 7시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만, 또는 4시간 미만이거나, 일부 실시 형태에서, 1 내지 4시간 이내, 또는 2 내지 4시간 이내이다.

용어 "케이크"는 전형적으로 그러나 비배타적으로, 약간의 물 함량을 갖는, 전형적으로 수분 함량이 가시적이지 않은 다공성 또는 스펀지형 구조-유사 층 또는 필름 형태의 조성물을 지칭한다. "다공성"이란, 표면의 그리고 표면 아래의 재료가 표면과 연통할 수 있는 상호연결된 간극 기공 또는 공동으로 투과되는 재료를 의미한다.

따라서, 본 발명의 일 태양에서, 예를 들어, 불용성 염, 예를 들어, Al(OH)₃ 및/또는 알칼리 토금속 염, 예컨대 황산바륨(BaSO₄) 시약과 같은 흡착제일 수 있는 필터 보조 재료 및 단백질을 포함하는 매질로부터 관심 단백질(예를 들어, 프로트롬빈)을 분리 및/또는 정제하는 방법이 제공되며, 이 방법은, 예를 들어, 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약을 포함함) 내에/상에 적어도 부분적으로 흡착된 단백질을 포함하는 매질을 제공하는 단계, 및 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약을 포함함) 및 단백질의 공급원을 포함하는 액체 매질을 압력 필터에 통과시켜, 흡착제-흡착된 단백질을 세척하고/하거나 흡착제로부터 단백질을 용출하여 단백질을 적어도 부분적으로 정제함으로써, 압력 여과를 수행하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 용어 "필터 보조제" 또는 "필터 보조 재료"는 필터에 의해 제공되는 여과를 돕기 위해 통상적으로 필터 스크린 등에 침착될 수 있는 재료를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 필터 보조제는 흡착제(본 명세서에서 "흡착제", "흡착 재료", "흡착 시약" 또는 "흡착 제제"로도 지칭됨)를 포함한다.

용어 "흡착제"는 입자의 표면 상의 하나 이상의 단백질에 흡착할 수 있는 불용성 물질을 포함하는 하나 이상의 수불용성 고체 입자에 관한 것이다. 용어 "흡착제"는 본 명세서에서 설명의 편의를 위해 사용되며 관심 단백질이 수불용성 고체 입자의 본체 내에 또는 그 상에 흡수될 수 있는 임의의 특정 메커니즘을 제한하려는 의도 없이 사용되며, 흡착제의 단순 투과 및 선택적으로 팽윤뿐만 아니라 다양한 화학적, 분자적, 원자적, 또는 표면적 상호작용을 포함할 수 있는, 흡착제와 수착 또는 흡착되는 단백질에서 일어날 수 있는 다양한 유형의 상호작용을 제한하는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 흡착 메커니즘은, 제한 없이, 분석물이 표면 분자와 물리적으로 상호작용함으로써 수착제, 전형적으로 흡착제, 예를 들어 수착제의 표면과 가역적으로 회합되는 표면 현상을 일반적으로 지칭한다. 회합은, 예를 들어, 임의의 비공유 매커니즘을 통한 것(예를 들어, 반 데르 발스 힘, 예컨대, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 쌍극자-유도 쌍극자 또는 분산력, 소수성 상호작용 또는 수소 공여체 또는 수용체 상호작용을 통한 것)일 수 있다.

흡착제의 비제한적인 예는 규산염(예를 들어, 화강암, 현무암 및 셰일), 탄산염(예를 들어, 석회석 및 백운석), 및 증발암(예를 들어, 암염)을 포함할 수 있다.

추가의 흡착제는 규조토, 펄라이트, 유리 비드, 규산마그네슘, 규산칼슘, 고체 열가소성 또는 열경화성 중합체 비드, 및 규산칼슘으로부터 선택될 수 있다.

전형적으로 그러나 비배타적으로, 흡착제는 불용성 금속 염을 포함한다. 용어 "금속 염"은 적어도 하나의 음이온 및 적어도 하나의 금속(예를 들어, 알칼리 토금속) 양이온으로 구성된 화합물을 지칭한다. 용어 "불용성 염"은 용액에 완전히 또는 부분적으로 불용성인 금속 염을 의미한다. 일부 실시 형태에서, 이 용어는 수불용성 염, 즉, 대략 실온에서 물에 완전히 또는 부분적으로 불용성인 염을 지칭한다.

일부 실시 형태에서, 불용성 염은 황산바륨, 황산칼슘, 및/또는 황산암모늄과 같은 황산염을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 알칼리 토금속 염은 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 인산칼슘을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 불용성 염은 수산화 알루미늄, Al(OH)₃을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 알칼리 토금속 염은 BaSO₄를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 압력 여과는 흡착제(예를 들어, BaSO₄)-흡착된 단백질을 세척하고, 흡착제, 예를 들어 BaSO₄로부터 단백질을 용출하기 위해 수행된다.

일부 실시 형태에서, 매질은 단백질의 공급원을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분석물"은 임의의 관심 분자, 예를 들어 프로트롬빈과 같은 단백질을 의미한다. 분석물은 단백질의 공급원과 같은 샘플에 들어 있을 수 있다.

용어 "정제"는 원하는 성분의 농도를 (최대 100 중량%까지) 증가시키는 것, 하나 이상의 바람직하지 않은 성분의 농도를 (0 중량%까지) 감소시키는 것, 또는 둘 모두를 의미한다.

용어 "분리"는 샘플 내의 하나의 성분(예를 들어, 관심 단백질)의 양을 샘플 내의 다른 성분의 양에 비해 증가시키는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체 또는 올리고머를 지칭하는 데 사용된다. 본 명세서에서, 용어 "단백질(들)"은 또한 펩타이드(들)를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 단백질은 프로트롬빈이거나 이를 포함한다. 프로트롬빈은 당업계에 잘 알려진 바와 같이 혈액 응고의 최종 단계에 관여하는 혈장 단백질이다. 이는 분자량이 약 72,000이고 약 12%의 탄수화물을 함유한다. 프로트롬빈은 알려진 바와 같이 칼슘의 존재 하에 구조적 전이를 겪는 칼슘-결합 단백질이다. 프로트롬빈의 트롬빈으로의 단백질 분해 활성화는 정상적인 지혈에서 중요한 단계이다. 프로트롬빈은 간에서 합성되는데, 간에서 프로트롬빈 전구체는 "번역후 변형"을 거쳐 "본래의 프로트롬빈"(native prothrombin)으로 알려져 있으며 γ-카르복시글루탐산을 함유하는 기능적 형태의 프로트롬빈을 생성한다.

본 명세서에서, 용어 "프로트롬빈"은 추가로, 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈 복합체를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "프로트롬빈 복합체"는, 예를 들어 혈액 응고 인자 VII, 인자 IX, 인자 X 등을 포함하는, 혈액 응고에 관여하는 다른 하나 이상의 인자와 프로트롬빈의 혼합물 또는 용액을 지칭한다.

본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈의 공급원은 혈장(예컨대, 옥살레이트화 혈장) 또는 혈장 분획으로부터 선택된다. 일부 이러한 실시 형태에서, 프로트롬빈의 공급원은 포유류, 예컨대, 제한 없이, 인간, 말, 소 및 돼지로부터 채취된 혈장을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈의 공급원은 돼지 혈장을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈의 공급원은 재조합 프로트롬빈이거나 이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈의 공급원은 바이러스 불활성화 처리를 받는다. 예를 들어, 공급원은 용매/세제(SD) 처리된 혈장이다.

인간 혈장과 같은 정상 포유류 혈장은 다양한 응고 시험을 위한 보정 혈장으로서 사용하기 위한 잘 알려진 풀링된 또는 단일 공여자 혈장 제제이다.

정상 인간 혈장은, 예를 들어 8명 이상의 건강한 성인으로부터, 시트르산칼륨 용액 또는 시트르산나트륨 용액 또는 둘 모두가 첨가된 전혈의 액체 부분을 풀링하고 이를 자외선에 노출시켜 박테리아 및 바이러스 오염물을 파괴함으로써 수득되는 멸균 혈장일 수 있다. 정상 인간 혈장은 예를 들어 응고 시험용 유니캘리브레이터(Unicalibrator) 보정 혈장 00625일 수 있다. "멸균"은 박테리아 또는 다른 미생물, 예컨대 바이러스가 본질적으로 또는 심지어 완전히 없는 것을 의미한다.

용어 "여과"는 모든 이러한 분리 공정뿐만 아니라 하나를 분리하는 필터를 이용하는 임의의 다른 공정을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 프로트롬빈 복합체는 혈장을 음이온 교환기로 처리하여 프로트롬빈 복합체를 제조하는 것, 혈장으로부터 동결침전물을 제거하여 제조될 수 있는 동결침전물-제거 혈장으로부터 프로트롬빈을 생성하는 것 등을 포함하는 다양한 절차에 의해 제조될 수 있다. 출발 혈장은 또한 소 또는 인간, 전형적으로 인간을 포함한 임의의 동물 종의 공급원으로부터 유래될 수 있다.

용어 "가압 필터" 또는 "압력 필터"는 필터에서 2개의 지점들 또는 선택된 공간들 사이에; 예를 들어, 필터를 통과하는 혼합물 유동의 한 쪽과 혼합물 유동의 다른 쪽 사이에 압력차가 있도록 배치되는 필터를 지칭한다.

일부 실시 형태에서, 압력 필터는, 예를 들어 BaSO₄ 시약 및 단백질, 예를 들어 프로트롬빈의 공급원을 포함하는 액체 매질을 필터 프레스에 통과시킴으로써, 필터 프레스를 사용하여 수행된다.

용어 "필터"는 전형적으로 주요 기능이 유체로부터의 미립자 오염물의 분리 및 보유인 다공성 매질을 갖는 장치를 지칭한다.

용어 "필터 프레스"는 전형적으로 투과성 필터를 통해 외부 압력을 가함으로써 여과 막 또는 플레이트를 사용하여 고체 및 액체를 분리하는 기계 또는 장치를 의미한다. 분리 공정은 모든 2개의 필터 플레이트 사이에 형성된 챔버에서 일어날 수 있다. 이 경우, 고체상은 챔버 내부에 있고(소위 "케이크"를 형성함), 액체상(여과액)은 필터 매질을 관통하여 배출 포트를 통해 밖으로 유동한다.

일부 실시 형태에서, 단백질은 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 내에/상에 적어도 부분적으로 흡착된다.

일부 실시 형태에서, 단백질, 예를 들어 프로트롬빈을 흡착시키는 단계는, 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약에 의한 단백질(예를 들어, 프로트롬빈)의 공급원으로부터의 단백질(프로트롬빈)의 흡착을 허용하는 조건 하에서 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약 및 단백질(예를 들어, 프로트롬빈)의 공급원을 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 매질은 액체 매질이거나 이를 포함한다.

따라서, 일부 실시 형태에서, "매질"은 BaSO₄ 시약 및 프로트롬빈의 공급원을 접촉시킬 때 프로트롬빈의 공급원 및 BaSO₄ 시약이 존재하는 액체(예를 들어, 수용액)를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 용액은 접촉 후 대략 실온에서 1 내지 6시간 동안 인큐베이션된다. "대략 실온"이란, 10 내지 40 ^oC 또는 15 내지 37 ^oC, 예를 들어, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 37 또는 40^oC의 범위(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함) 내의 적어도 하나의 온도 값을 지칭하는 것을 의미한다.

일부 실시 형태에서, 예를 들어 트롬빈을 제조하는 공정에서 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기 위한 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약의 적합성은 정상 포유류 혈장, 예를 들어 정상 인간 혈장의 응고 촉진 활성(pro-coagulant activity) 이하인 흡착제-흡착된 프로트롬빈의 응고 촉진 활성에 의해 나타난다. 구체적으로, 일부 실시 형태에서, 주어진 BaSO₄ 시약의 샘플을 프로트롬빈의 공급원과 접촉시켜 그로부터 프로트롬빈을 흡착시켜 BaSO₄-흡착된 프로트롬빈을 수득한다. 전형적으로, BaSO₄-흡착된 프로트롬빈의 응고 촉진 활성이 낮을수록, 주어진 BaSO₄ 시약이 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기에 더 적합하다. 일부 실시 형태에서, 비-활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(Non-Activated Partial Thromboplastin Time, NAPTT) 비가 0.8 이하인 용출액을 생성하거나 또는 혈병이 즉시 시각적으로 관찰되는 BaSO₄ 시약(칼슘 첨가 시 그리고 응고 시간 전에 발생하는 응고는 응고제 측정기에 기록될 수 있음)은 트롬빈 제제에 사용하기에 덜 적합한 것으로 간주된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "응고 촉진 활성"은 혈액의 응고를 촉진하는 것을 지칭한다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시 형태에서, 흡착제-흡착된 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 것은 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약)에 흡착된 상태의 프로트롬빈에 대한 것이다.

전형적으로 그러나 비배타적으로, 예를 들어, 바이러스 불활성화 처리를 위해 용매 세제(SD)가 사용된다. SD는 지질 외피를 파괴함으로써 외피 또는 지질-코팅된 바이러스를 불활성화하는 공정을 지칭한다. 처리는 세제(예컨대, 트리톤(Triton) X-45, 트리톤 X-100 또는 폴리소르베이트 80) 및 용매[예컨대 트라이(n-부틸) 포스페이트(TnBP), 다이- 또는 트라이알킬포스페이트]를 첨가하여 수행될 수 있다. 지질 코팅된 바이러스를 불활성화하는데 사용되는 SD 조합은 당업계에 공지된 임의의 용매-세제 조합, 예컨대 TnBP와 트리톤 X-100; 폴리소르베이트 80과 콜산나트륨 및 다른 조합일 수 있다.

사용되는 용매(들) 세제(들)의 농도는, 예를 들어 미국 특허 제5,094,960호 또는 제4,789,545호에 기재된 바와 같이 수행되는, 당업계에서 일반적으로 사용되는 것들일 수 있다. 사용되는 용매(들) 세제(들)의 농도는 0.1% 초과의 TnBP와 0.1% 초과의 트리톤 X-100의 조합일 수 있다. 사용되는 용매(들) 세제(들)의 농도는 예를 들어, 1% 트리톤 X-100과 0.3% TnBP의 조합일 수 있다. 그러나, 다른 용매 세제(SD) 조합 및 적합한 조건이 당업자에게 명백할 것이다. 일 실시 형태에서, 0.5% 내지 1% 트윈(Tween)-80 및 0.15% 내지 0.3%의 TnBP가 SD 처리에 사용된다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약에 의한 프로트롬빈의 공급원으로부터의 단백질, 예를 들어 프로트롬빈의 흡착을 허용하는 조건 하에서 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약과 관심 단백질(예를 들어, 프로트롬빈)의 공급원을 접촉시켜 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약 내에/상에 프로트롬빈을 흡착시키는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시 형태에서, 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약에 대한 프로트롬빈의 공급원으로부터의 단백질, 예를 들어 프로트롬빈의 흡착을 허용하는 조건은 pH가 7.4 내지 8.6의 범위인 매질(예를 들어, 용액)을 포함한다.

일 실시 형태에서, 트롬빈의 제조에서 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약)에 대한 프로트롬빈 흡착을 허용하는 조건은 pH 7.4 내지 8.6 및/또는 흡착제와 혈장의 총 중량을 기준으로 0.5% 내지 22% (w/v) (예를 들어, 약 1%) 범위의 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약)의 농도를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조건은, 예를 들어, 20℃ 내지 25℃의 범위의 실온을 포함한다.

일 실시 형태에서, BaSO₄에 의한 프로트롬빈의 흡착은 실온에서 예를 들어 25℃에서 2시간 동안 pH 7.4 내지 8.6에서 배치식(batch mode)으로 수행된다. 본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태는 BaSO₄ 시약이 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기에 적합하게 할 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시 형태에서, 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약)의 샘플과 프로트롬빈의 공급원을 접촉시키는 단계는 약 1% 내지 약 22%, 약 0.5% 내지 약 22%, 또는 약 0.5% 내지 약 10% (w/v)의 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약)를 프로트롬빈의 공급원(예를 들어, 채취된 혈장)에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 또는 22% (w/v)(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)의 BaSO₄ 시약이 첨가된다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 매질은 약 0.5 내지 22% (w/w), 또는 약 0.5 내지 3% (w/w)의 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약), 선택적으로 약 1 중량%의 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약)를 포함한다.

흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약)에 의한 프로트롬빈의 흡착은 배치식으로 또는 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약)로 패킹된 컬럼에서 수행될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "BaSO₄ 시약"은 명시된 공급업체로부터의 BaSO₄ 시약을 지칭한다. 따라서, 상이한 주어진 BaSO₄ 시약은 상이한 공급업체에 의해 제공된 시약일 수 있거나, 또는 동일한 공급업체에 의해 제공된 상이한 로트의 시약일 수 있다. 일부 실시 형태에서, BaSO₄ 시약은 분말의 형태이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분말"은 입자들의 집합을 지칭한다. 입자는 관심 단백질, 예를 들어 프로트롬빈을 적어도 부분적으로 흡착하기에 적합한 한 임의의 구성, 형상 또는 크기일 수 있다.

일부 실시 형태에서, BaSO₄ 시약은 75% (w/w) 이상의 BaSO₄ 시약, 예를 들어 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97.5% 이상, 및 심지어 약 100% (w/w)의 BaSO₄를 포함하는 시약이다.

용어 "접촉"은 본 명세서에 걸쳐 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, 예를 들어, 단백질(예를 들어, 프로트롬빈) 공급원을 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약과 충분히 근접하게 하여, 흡착제, 예를 들어, BaSO₄ 시약과 공급원 내의 프로트롬빈 사이에서 결합 상호작용이 발생할 수 있도록 하는 임의의 유형의 조합 작용을 지칭한다. 접촉은, 예를 들어 공급원을 흡착제(예를 들어, BaSO₄)에 혼합하고/하거나, 뒤섞고/뒤섞거나, 첨가하거나, 또는 흡착제(예를 들어, BaSO₄)를 공급원에 첨가하는 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

일 실시 형태에서, 흡착제(예를 들어, BaSO₄)-흡착된 단백질은 세척 완충액, 예를 들어 수성 완충액을 사용하여 세척된다. 세척 단계는 흡착제(예를 들어, BaSO₄)-흡착된 단백질을 함유하는 샘플 또는 분획에 존재하는 불순물 또는 억제제를 세척하여 제거하거나 희석시킬 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세척하여 제거"는 완충액을 사용하여 흡착제(예를 들어, BaSO₄)-흡착된 단백질을 함유하는 샘플 또는 분획으로부터 불순물 또는 억제제를 완전히 또는 부분적으로 제거하는 것을 지칭할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "희석"은 완충액을 사용할 때 흡착제(예를 들어, BaSO₄)-흡착된 단백질을 함유하는 샘플 또는 분획에 존재하는 샘플에 존재하는 불순물 또는 억제제의 농도를 감소시키는 것을 지칭할 수 있다. 따라서, 세척 단계는 완전한 또는 부분적인 제거를 초래할 수 있다. 용어 "불순물"은, 관심 단백질과 상이하거나 단백질 또는 이의 유도체와 반응할 수 있는, 매질 내의 재료(예를 들어, 성분 또는 화합물), 예컨대 단백질 공급원, 예를 들어, 관심 단백질이 프로트롬빈인 경우에 피브리노겐을 지칭한다.

일부 실시 형태에서, 세척 완충액은 염화나트륨 및/또는 시트르산나트륨을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세척 단계는 여러 번, 2 내지 10회, 또는 2 내지 5회, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 반복될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 압력 필터에서 혼합물을 통과시키는 것은 공급원(매질)으로부터 흡착제(예를 들어, BaSO₄)-흡착된 프로트롬빈의 적어도 일부를 분리할 수 있게 한다.

본 명세서에서 용어 "용출" 또는 이의 임의의 문법적 변형은 흡착제, 예를 들어, 불용성 염 시약, 예컨대, BaSO₄ 시약으로부터의 흡착된 관심 단백질의 방출을 의미하는 데 사용된다. 종종, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 용어 "용출"은 용어 "탈착"과 상호 교환 가능하다. 일부 실시 형태에서, 이 용어는 흡착제로부터 용출액 내로의 흡착된 관심 단백질의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 방출에 관한 것이다. 용출은 소정 용출 조건 하에서 수행될 수 있다. 전형적으로 그러나 비배타적으로, 용출 조건은 비-등용매 조건을 사용하는 것, 예를 들어, 흡착제에 관심 단백질을 로딩하기 위해 사용된 용액 또는 조건과는 상이한 및/또는 이전 단계에서 사용된 용액과는 상이한 용액 또는 조건을 사용하는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 방법은, 일부 실시 형태에서, 전형적으로 비-등용매 용액을 사용하는 적어도 하나의 용출 단계를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "억제제"는 관심 단백질의 활성을 감소시키거나 악영향을 미칠 수 있는 재료(예를 들어, 성분 또는 화합물)를 지칭한다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 (i) 매질을 원심분리하여 흡착제, 예를 들어, BaSO₄ 시약, 및/또는 단백질을 포함하는 침전물을 수득하는 단계; (ii) 흡착제, 예를 들어, BaSO₄ 시약 내에/상에 적어도 부분적으로 흡착된 단백질을 세척 완충액으로 세척하여, 그로부터 불순물을 제거하는 단계; 및 (iii) 예를 들어, 용출 완충액을 사용하여, 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약)-흡착된 단백질로부터 단백질을 포함하는 분획("단백질 함유 분획")을 용출하는 단계로부터 선택되는 적어도 2개의 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 3회 미만의 원심분리 단계, 2회 이하의 원심분리 단계, 또는 1회 이하의 원심분리 단계를 포함한다. 전형적으로 그러나 비배타적으로, 개시된 방법은 원심분리 단계를 사용하지 않는다.

일부 실시 형태에서, 용어 "침전물"은, 예를 들어 원심분리를 통해 또는 필터 프레스를 사용하여 밀도가 높은 물질을 액체 조성물로부터 분리하거나 제거한 후에 상청액으로부터 분리되는 "펠렛"(pellet) 또는 고체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.

일부 실시 형태에서, 용출 완충액을 사용하여 단백질을 흡착제(예를 들어, BaSO₄)-흡착된 단백질로부터 용출하여, 용출된 단백질-함유 분획을 수득한다.

용어 "분획"은 예를 들어 관심 단백질을 포함하는 분리가능한 구성성분을 지칭한다.

일 실시 형태에서, 용출 완충액은 칼슘 킬레이팅 염을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용출 용액은 킬레이팅 염을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용출 용액 중 킬레이팅 염의 농도는 약 0.2% (w/v) 내지 약 4.4% (w/v) 또는 약 3.0% (w/v) 내지 약 4.4% (w/v)의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 킬레이팅 염은 시트르산나트륨을 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 용출 용액 중 시트르산나트륨의 농도는 약 0.2% (w/v) 내지 약 4.4% (w/v) 또는 약 3.0% (w/v) 내지 약 4.4% (w/v), 예를 들어 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1%, 1.2%, 1.4%, 1.6%, 1.8%, 2%, 2.2%, 2.4%, 2.6%, 2.8%, 3%, 3.2%, 3.4%, 3.6%, 3.8%, 4%, 4.2% 또는 4.4% (w/v)(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)이다.

일부 실시 형태에서, 용출 완충액은 pH가 6.3 내지 7.4, 예를 들어 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.3, 또는 7.4(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)이다.

일부 실시 형태에서, 용출 용액의 pH는 6.1 이상, 6.2 이상, 또는 심지어 6.3 이상이다. 일부 실시 형태에서, 용출 용액의 pH는 6.5 이하, 6.6 이하, 심지어 6.7 이하, 또는 약 pH 6.3 내지 6.7이다. 일부 실시 형태에서, 용출 용액의 pH는 6.3 내지 7.4의 범위이다.

일부 실시 형태에서, (i) 흡착제, 예를 들어, BaSO₄ 시약 내에/상에 적어도 부분적으로 흡착된 단백질을 세척하는 단계("세척 단계"); 및 (ii) 흡착제-흡착된 단백질로부터 단백질을 포함하는 분획을 용출하는 단계("용출 단계") 중 하나 또는 둘 모두의 단계는 매질을 압력 필터에 통과시키는 단계에 의해 또는 그와 동시에 수행된다.

본 명세서 전반에 사용되는 용어 "동시에"는 반드시 모든 관련 단계가 동시에 수행되는 것을 의미하는 것은 아니며, 예를 들어 먼저 세탁 단계를 시작하고 그 후 즉시 매질을 압력 필터에 통과시키는 경우, 또는 예를 들어, 먼저 매질을 압력 필터에 통과시키고 그 후 즉시 용출 단계를 수행하는 경우를 또한 지칭할 수 있다. 일부 실시 형태에서, "즉시"는 0 내지 20초, 0 내지 10초, 또는 0 내지 2초, 예를 들어 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20초(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)를 지칭하는 것을 의미한다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 정용여과 완충액을 사용하여, 용출된 단백질-함유 분획을 정용여과하는 단계를 추가로 포함한다

"정용여과" 또는 이의 임의의 문법적 변형은, 순수한 용액을 얻기 위해, 마이크로-분자 투과성 필터를 사용하여 분자 크기에 기초하여 용액의 성분(예컨대, 염, 단백질, 용매 등과 같은 투과성 분자)을 제거 또는 분리하는 것을 전형적으로 수반하는 희석 공정을 지칭하는 것으로 의도된다.

비제한적인 예시적인 정용여과 완충액은 글리신 및/또는 시트르산나트륨을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 정용여과 완충액 중 글리신의 농도는 약 0.5% (w/v) 내지 약 1.5% (w/v)의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 정용여과 용액 중 시트르산나트륨의 농도는 약 1% (w/v)이다.

일부 실시 형태에서, 정용여과 완충액은 pH가 6.5 내지 7.5, 예를 들어, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.3, 7.4, 또는 7.5(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함)이다.

일부 실시 형태에서, 정용여과 단계는 여러 번, 2 내지 10회, 또는 2 내지 6회, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 반복될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 단백질은 프로트롬빈이고, 본 방법은 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 허용하는 조건을 제공하여 트롬빈을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.

따라서, 본 발명의 일 태양에서, 프로트롬빈의 공급원으로부터 트롬빈을 수득하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (i) 프로트롬빈 및 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약을 포함하는 매질을 제공하고, 예를 들어, 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약 및 프로트롬빈의 공급원을 포함하는 액체 매질을 압력 필터에 통과시킴으로써 압력 여과를 수행하여, 예를 들어, 흡착제-흡착된 단백질을 세척하고/하거나 흡착제로부터 단백질을 용출하여, 프로트롬빈을 적어도 부분적으로 정제하는 단계, 및 (ii) 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 허용하는 조건을 제공하여, 트롬빈을 수득하는 단계를 포함한다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈은 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약 내에/상에 적어도 부분적으로 흡착된다. 일부 실시 형태에서, 흡착제, 예를 들어 BaSO₄ 시약과의 프로트롬빈의 접촉은 트롬빈으로의 전환(즉, 프로트롬빈의 그의 중간체 및/또는 트롬빈으로의 전환)을 촉발한다. 이는 생산 공정의 종료 시 트롬빈 수율을 해칠 수 있는 조기 전환이다. 본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈의 그의 중간체 및/또는 트롬빈으로의 전환 후에 응고 촉진 활성이 발생한다. 이러한 중간체는 프로트롬빈의 트롬빈으로의 단백질 분해 전환 동안 형성될 수 있다. 중간체의 비제한적인 예는 프리트롬빈 및 메이조트롬빈이다.

일 실시 형태에서, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 허용하는 조건은 칼슘 이온과 같은 활성화제에 프로트롬빈을 노출시키는 것을 포함한다

예시적인 실시 형태에서, 활성화제는 칼슘 이온 및 글리신을 포함하는 활성화 완충액을 포함한다. 일부 실시 형태에서 칼슘 이온의 공급원은 칼슘 염, 예컨대 염화칼슘이다. 칼슘 이온은 0.5% (w/v) 내지 약 3% (w/v), 또는 0.75% 내지 약 1.5%, 예를 들어, 0.5%, 0.75%, 1%, 1.25%, 1.5%, 1.75%, 2%, 2.25%, 2.5%, 2.75%, 또는 3% (w/v)(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 활성화 완충액은 pH가 6.5 내지 7.5, 예를 들어, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.3, 7.4, 또는 7.5(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)이다.

일부 실시 형태에서, 수득된 트롬빈은 분획에 존재하고, 본 방법은 트롬빈 함유 분획을 필터에 통과시켜 분획에 존재할 수 있는 마이크로 플록을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 필터는 마이크로필터이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "마이크로필터"는 약 0.1 내지 약 10 마이크로미터, 예를 들어 약 0.2 μm의 기공 크기를 갖는 필터 막을 의미한다. 선택적으로, 여과된 분획은 추가로 투석된다.

일부 실시 형태에서, 개시된 방법은 프로트롬빈의 공급원, 예를 들어 혈장 1 ml당 70 내지 130 IU의 트롬빈 수율을 얻는 것을 특징으로 하며, 일부 실시 형태에서, 개시된 방법은 공정의 개시로부터 1 내지 4시간, 또는 2 내지 4시간 내에 프로트롬빈의 공급원, 예를 들어 혈장 1 ml당 70 내지 130 IU의 트롬빈 수율을 얻는 것을 특징으로 한다.

일부 실시 형태에서, 개시된 방법에 의해 수득되는 트롬빈은 3000 내지 7000 IU/ml의 활성을 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 개시된 방법에 의해 수득되는 트롬빈은 3000 내지 6000 IU/ml의 활성을 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 개시된 방법에 의해 수득되는 트롬빈은 4000 내지 6000 IU/ml의 활성을 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 개시된 방법에 의해 수득되는 트롬빈은 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 또는 7000 IU/ml(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)의 활성을 특징으로 한다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 개시된 방법에 의해 수득되는 트롬빈은 단백질 1 mg당 500 내지 1500, 500 내지 1200, 700 내지 1500, 또는 700 내지 1200 IU의 비활성도를 특징으로 한다.

필터 프레스 공정 및 비-필터 프레스 공정에 의해 제조된 생성물의 단백질 함량, 트롬빈 활성, 비활성도, 및 생성물 수율의 협력적 평가를 나타내는 도 4a 내지 도 4d를 참조한다. T-검정에 따르면 두 공정 사이에서 적어도 유의한 차이가 평가되지 않았다.

다양한 유형의 필터 플레이트, 예를 들어 그리고 제한 없이, 플레이트 및 프레임 필터 프레스, 오목형 플레이트 및 프레임 필터 프레스, 막 필터 프레스, 및 (완전) 자동 필터 프레스가 본 발명에 따른 필터 프레스에 사용될 수 있다.

예를 들어, 하나의 유형은 플레이트 또는 일 군의 플레이트를 갖는 여과 챔버를 포함하며, 이때 이러한 플레이트는 플레이트의 양쪽 면 상에 오목한 표면을 포함하는 챔버 플레이트일 수 있고, 이들 면의 각각은 플레이트들이 함께 클램핑될 때 인접한 플레이트와 함께 필터 챔버를 형성하는 역할을 한다. 필터가 이러한 오목한 표면 각각을 덮을 수 있고, 개스킷에 의해 플레이트 상에 장착되거나 2개의 인접한 플레이트 사이에 드레이핑될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 일 군의 플레이트는 내측으로 오목한 한 쌍의 대향하여 배치된 면을 구비한 프레임을 갖는 플레이트를 포함한다. 투과성, 비투과성 또는 반투과성 막을 프레임에 고정하고, 오목면 중 하나를 가로질러 연장시켜 그 사이에 압력 챔버를 한정할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 막 표면은 0.04 m² 내지 10 m²의 범위, 예를 들어, 0.04, 0.08, 0.12, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9, 9.2, 9.4, 9.6, 9.8, 또는 10 m²(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)이다. 일부 실시 형태에서, 한 쌍 또는 몇 개의 쌍의 막이 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 막은 마이크로 크기의 기공을 갖는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "마이크로 크기의"는, 명시되지 않는 한, 약 0.5 μm 내지 약 100 μm, 또는 전형적으로 0.5 내지 5 μm, 예를 들어 약 1 μm의 평균 입자 크기에 관한 것이다.

따라서, 매질은 2개의 인접한 플레이트의 필터들 사이에 형성된 필터 챔버 내로 펌핑될 수 있고, 액체 매질은 필터를 통과한 다음 플레이트의 여과액 포트를 통해 배출될 수 있다. 본 발명에 따른 사용된 흡착제-흡착된 단백질은 필터 챔버 내에 갇혀 케이크를 형성할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 압력 여과를 수행하는 단계는 압력 하에서 여과 챔버를 통해 매질을 통과시키는 단계를 포함하고, 여과 챔버는 필터 막, 선택적으로 선택 투과성 또는 반투과성 필터 막을 포함한다. 용어 "반투과성 막"은 크기 또는 분자량에 기초하여 실질적으로 선택적인 막을 의미한다. 따라서, 반투과성 막은 제1 분자량 또는 크기는 실질적으로 통과시키는 반면, 제1 분자량 또는 크기보다 큰 제2 분자량 또는 크기의 통과는 실질적으로 차단한다.

하기에 기재되는 바와 같이, 예시적인 실시 형태에서, 막 표면 상에서 황산바륨 침전의 균일한 분포를 위해 소정 배압이 도움이 될 수 있기 때문에, 여과 단부의 배압이 약 10 psi로 유지되도록, 여과 단부는 초기 여과 단계에 부분적으로 폐쇄된 상태로 유지될 수 있다. 여과가 진행됨에 따라, 공급 포트(입구) 압력이 점진적으로 증가할 수 있으므로, 공급 포트의 압력이 2 바 미만이 되도록 또한 보장하기 위해 배압을 조정할 필요가 있다. 마지막으로, 여과 공정은 입구 압력이 3.5 바, 예를 들어 2 내지 5 바 초과일 때 중단될 수 있다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 압력 여과를 수행하는 단계는 압력 하에서 여과 챔버를 통해 매질을 통과시키는 단계를 포함하며, 여과 챔버는 필터 막을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 압력은 1.5 내지 약 4 바, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 또는 4 psi(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 압력 여과를 수행하는 단계는 매질을 압력 필터에 통과시키고 막에, 예를 들어 5 psi 내지 15 psi의 범위, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 psi(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)의 배압을 가하여, 필터 막 내에/상에 흡착제(예를 들어, BaSO₄)-흡착된 단백질의 균일한 케이크를 수득하는 단계를 포함한다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 매질을 여과 챔버에 통과시키는 것은 펌프를 사용하여, 즉 매질을 시스템 내로 펌핑함으로써 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 압력을 표시된 압력으로, 예를 들어 1 바(15 psi) 이하로 유지하면서 저속(예를 들어, 30 내지 100 ml/min, 예컨대 약 70 ml/min)으로 시스템에서 10 내지 30분, 예를 들어 15분 동안 매질을 우선 순환시킨다.

일부 실시 형태에서, 개시된 공정에 따라 사용될 수 있는 단백질 공급원(예를 들어, 혈장)의 양은, 예를 들어 사용된 막의 수에 따라, 100 내지 1500 ㎏, 또는 일부 실시 형태에서 200 내지 1000 ㎏, 예를 들어 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 또는 1500 ㎏(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함) 또는 그 초과의 범위이다.

일부 실시 형태에서, 필터 프레스 공정은 막 1 m²당 30 ㎏ 이상의 단백질, 예컨대 프로트롬빈의 공급원의 여과 용량을 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 필터 프레스 공정은 막 1 m²당 30 내지 200 ㎏의 단백질, 예컨대 프로트롬빈의 공급원의 여과 용량을 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 필터 프레스 공정은 막 1 m²당 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200(이들 사이의 임의의 값 및 범위 포함)의 단백질, 예를 들어 프로트롬빈의 여과 용량을 특징으로 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 ±10%를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 예를 들어 비, 중량, 양, 압력, 온도 등을 표현하는 것과 같은 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 그리고 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 상호 교환적으로 사용되는 용어 "중량 기준", "w/w", "중량 퍼센트", 또는 "중량%"는 상응하는 혼합물, 용액, 제형 또는 조성물의 총 중량 중 특정 물질의 농도를 기술한다.

용어 "포함한다", "포함하는", "포함된다", "포함되는", "갖는", 및 이들의 동근어(conjugate)는 "포함하지만 이로 한정되지 않는"을 의미한다. 용어 "~로 이루어진"은 "~를 포함하며 이로 한정되는"을 의미한다. 용어 "~로 본질적으로 이루어진"은 조성물, 방법 또는 구조체가 추가적인 성분, 단계 및/또는 부품을 포함할 수 있지만, 추가적인 성분, 단계 및/또는 부품이 청구된 조성물, 방법 또는 구조체의 기본적이고 신규한 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 경우에만 그러함을 의미한다.

단어 "예시적인"은 본 명세서에서 "예, 사례, 또는 실례로서의 역할을 하는"을 의미하도록 사용된다. "예시적인"으로 기술되는 임의의 실시 형태는 반드시 다른 실시 형태에 비해 바람직하거나 유리한 것으로 및/또는 다른 실시 형태로부터의 특징의 포함을 배제하는 것으로 해석되어야 하는 것은 아니다.

단어 "선택적으로"는 "일부 실시 형태에서 제공되며 다른 실시 형태에서는 제공되지 않음"을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 본 발명의 임의의 특정 실시 형태는 복수의 "선택적인" 특징을 그러한 특징들이 상충하지 않는 한 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형("a," "an," 및 "the")은 문맥상 명백히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "하나 이상의 화합물"은 복수의 화합물(이들의 혼합물을 포함함)을 포함할 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 실시 형태가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범주에 대한 유연성 없는 제한으로서 해석되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 구체적으로 개시된 하위범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.

수 범위가 본 명세서에 지시될 때마다, 이는 지시된 범위 내의 임의의 인용된 수(분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 첫 번째 표시 수(indicate number)와 두 번째 표시 수 "사이에 걸친/그 사이의 범위" 및 첫 번째 표시 수"로부터" 두 번째 표시 수"까지에 걸친/그까지의 범위"라는 어구는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 첫 번째 표시 수와 두 번째 표시 수 및 그들 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 명세서 전반에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "방법" 또는 "공정"은 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 실무자에게 알려져 있거나 이들에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 용이하게 개발되는 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하지만 이로 한정되지 않는 주어진 과제를 달성하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는"은 병태의 진행을 저지하거나 실질적으로 억제하거나 늦추거나 역전시키는 것, 병태의 임상적 또는 심미적 증상을 실질적으로 개선하는 것, 또는 병태의 임상적 또는 심미적 증상의 출현을 실질적으로 방지하는 것을 포함한다.

"A, B, 및 C 중 하나 이상 등"과 유사한 관례가 사용되는 그러한 경우에, 일반적으로 그러한 구성은 당업자가 그 관례를 이해할 의미로 의도된다(예컨대, "A, B 및 C 중 하나 이상을 갖는 시스템"은 A만을, B만을, C만을, A와 B를 함께, A와 C를 함께, B와 C를 함께, 그리고/또는 A, B 및 C를 함께 등을 갖는 시스템을 포함할 것이지만 이로 제한되지 않는다). 명세서에서든, 청구범위에서든, 또는 도면에서든, 2개 이상의 대안적인 용어를 제공하는 사실상 임의의 분리 단어 및/또는 문구는, 용어들 중 하나, 용어들 중 어느 하나, 또는 둘 모두의 용어를 포함할 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것이 또한 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 문구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

명확성을 위해서 개별 실시 형태와 관련하여 설명된 본 발명의 소정의 특징부는 또한 단일 실시 형태와 조합하여 제공될 수 있다는 것이 인지된다. 반대로, 간결성을 위해서 단일 실시 형태와 관련하여 설명된 본 발명의 다양한 특징부는 또한 본 발명의 임의의 다른 기재된 실시 형태와 별개로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 또는 적합하게 제공될 수 있다. 다양한 실시 형태와 관련하여 기재된 소정의 특징부는, 실시 형태가 이들 부재 없이 사용될 수 있는 한, 이들 실시 형태의 본질적인 특징부가 아니다.

상기에 기술된 바와 같은 그리고 하기 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시 형태 및 태양은 하기 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.

실시예

이제 하기의 실시예를 참조하며, 이는 상기 설명과 함께 본 발명의 일부 실시 형태를 비제한적인 방식으로 예시한다.

본 명세서에서, 개시된 공정은 "필터 프레스 공정"으로 지칭되며; (본 발명의 공정 개발 이전에) 사용된 현재 공지된 공정은 "현재 공정", "수동 공정" 또는 "비-필터 프레스 공정"으로 상호 교환가능하게 지칭된다.

두 공정 모두에서 결합(황산바륨을 혈장(1% m/m)과 혼합하여 황산바륨 상에 프로트롬빈을 흡착시킴)이 선행될 수 있으며; 그 후에 수동 공정에서 다음이 이어진다: 분리 - 원심분리에 의해 혈장으로부터 황산바륨을 분리하고 황산바륨 케이크를 수집함; 세척 - 세척 완충액에 의해 세척하고, 수동으로 침전물을 작은 조각으로 파쇄하고, 이어서 원심분리하여 액체로부터 고체를 분리함(이 단계를 3회 반복하여 불순물을 제거함); 및 용출 - 용출 완충액을 첨가하여 용출하고 수동으로 침전물을 작은 조각으로 파쇄하고, 이어서 원심분리하여 액체로부터 고체를 분리함. 이 단계를 5회 반복하여 프로트롬빈 복합체를 수집한다.

재료 및 장비

재료

재료 세부 사항이 하기 표 1에 요약되어 있다:

[표 1]

장비

장비 세부 사항이 하기 표 2에 요약되어 있다:

[표 2]

실시예 1: 예비 시험

이 시험의 목적은, 특히, 프로트롬빈 정제의 수동 작업("비-필터 프레스 공정")을 대체하기 위해 필터 프레스를 사용하는 것의 타당성(feasibility)을 조사하기 위한 것이다.

A. 제1 세트의 예비 시험:

제1 세트의 실험에서, 1 마이크로미터 기공 크기 필터(에르텔랄솝 M503P-89L)를 사용하여 BaSO₄와 혈장의 현탁액을 여과하고, 여과 액체의 투명도, 여과 유량, 및 심층 필터 막 상의 황산바륨 케이크의 분포를 관찰하여 예비 실험을 수행하였다.

타당성 연구 - 일반 개요: 황산바륨 분말을 혈장에 첨가한 후, 프로트롬빈을 충분히 흡착시키고, 이어서 현탁액을 필터 프레스 내로 펌핑하고, 황산바륨 입자를 필터의 표면 상에 유지하였다. 침전된 층을 세척 완충액으로 세척하여 과량의 불순물을 제거하였다. 세척 후, 세척 완충액을 용출 완충액으로 대체하여 BaSO₄로부터 프로트롬빈을 용출하고, 프로트롬빈을 포함하는 여과액으로부터 용출된 액체를 수집하였다. 프로트롬빈을 포함하는 용출된 액체를 농축하고, 투석하여 염을 제거하였고, CaCl₂를 사용하여 프로트롬빈을 활성화시켰다. 필터 프레스의 개요는 도 1a에 제시된 흐름도에 나타나 있다. 이하에 상세히 설명되는 바와 같이 그리고 도 1b에 약술된 바와 같이 트롬빈을 추가로 수득하기 위해 이 공정을 계속할 수 있다.

상세한 방법

결합: 예시적인 절차에서, 1823 g의 혈장(배치 번호: 40151107, -20℃에서 저장됨)을 37℃ 수조에서 2시간 동안 해동한 후에 사용하였다(하기에 언급된 바와 같이, 사용한 막의 막 용량으로 인해 단지 718 g의 혈장만 필터 프레스의 막을 통과하였음). 다음으로, 18.3 g의 BaSO₄ 고체(혈장에 대해 1:100 중량비)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.

여과: 250 rpm의 펌프 속도로 1 L의 정제수("PuW" 또는 "PW"로 표시됨)를 완전히 순환시킴으로써 필터 프레스 내의 막을 세척하였다. 혈장 황산바륨 혼합물을 필터 프레스에 의해 여과하였고, 황산바륨 침전물은 막(2개의 필터)에 의해 고정되었다. 여과 단부의 배압이 약 10 psi로 유지되도록, 여과 단부를 초기 여과 단계에 약간 폐쇄하였다(막 표면 상에서 황산바륨 침전의 균일한 분포를 위해 소정 배압이 도움이 된다). 여과가 진행됨에 따라, 입구 압력이 점진적으로 증가하므로, 공급 포트(입구)의 압력이 2 바 미만이 되도록 또한 보장하기 위해 배압을 조정할 필요가 있었다. 마지막으로, 입구 압력이 3.5 바 초과일 때 여과 공정을 중단하였다.

여과된 액체를 칭량하여, 막의 여과 플럭스 용량을 계산하였다: 718 g의 혈장이 필터 프레스의 막을 통과하였고 2개의 필터의 표면적은 200 ㎠ 이상이었으며(1개의 필터의 표면적은 100 ㎠임), 이는 약 35.9 ㎏ 혈장/m²의 막 여과 용량을 제공한다.

여과 분리 단계는 1 마이크로미터 기공 크기의 심층 필터가 혈장 혼합물로부터 황산바륨을 효과적으로 분리할 수 있음을 보여주었습니다. 필터 막을 통과한 혈장은 가시적인 백색 분말 없이 깨끗하였다. 그러나, 여과 공정이 진행될 때, 침전된 황산바륨이 막의 표면 상에 계속 축적되었고, 여과 압력이 증가하였다. 공정이 완료된 후, 필터 프레스를 분해하여 황산바륨이 필터 막 표면 상에 고르게 분포되어 있는지 확인할 수 있었다(도 2 참조).

세척: 예시적인 절차에서, BaSO₄ 침전물 케이크를 막 상에서 600 ml 세척 완충액(0.45% NaCl + 0.0025% Na-시트레이트)으로 세척한 후, 처음 100 mL는 바로 배수시키고, 나머지 500 ml 세척 완충액으로 15분 동안 순환시켰다. 세척 단계를 5회 반복하였고, 세척된 액체로부터의 각각의 샘플에 대해 피브리노겐(FIB)(이 공정에서의 불순물임) 및 단백질 함량을 매회 시험하였다. 펌프 속도 설정: 250 rpm: 결과는 다음과 같다(표 3):

[표 3]

비-필터 프레스 공정에서 세척당 완충액 대 혈장의 부피비는 약 1:50의 완충액 대 혈장이었다. 필터 프레스 공정은 완충액이 유동 경로에서 순환될 수 있도록 플레이트 프레임 내부의 부피, 파이프의 부피에 대한 고려를 필요로 하였다. 600 ml 세척 완충액의 양을 각각의 세척 실행에 사용하였다. 샘플링된 데이터는 두 번째 세척 후에도 세척 용액에서 피브리노겐이 검출되지 않았으며 이 방법으로 피브리노겐을 완전히 제거할 수 있음을 보여주었습니다. 세척 용액 내 단백질 함량은 하향 추세를 나타내었다. 제5 세척 용액의 단백질 함량은 0.007 mg/ml였고, 단백질 불순물은 0에 가까웠다.

용출: 예시적인 절차에서, 500 ml 용출 완충액(3.0% Na-시트레이트 pH 6.5)을 사용하였고, 15분 동안 순환시킨 후, 용출 액체를 수집하였다. 용출 단계를 5회 반복하여, 매회 용출 액체로부터 단백질 함량 테스트를 위한 샘플 1.0 ml 액체를 제공하였다. 펌프 속도를 250 rpm으로 설정하였다. 총 약 2,500 ml의 용출 액체를 수집하고, 4 ^oC 냉장고에 저장하였다. 단백질 함량 결과는 다음과 같다(표 4):

[표 4]

수동 비-필터 프레스 공정에서 용출당 혈장 대 용출 완충액의 부피비는 약 50:1의 혈장 부피/용출 완충액 부피였다. 필터 프레스 공정의 사용은 완충액이 유동 경로에서 순환될 수 있도록 플레이트 프레임 내부의 부피, 파이프의 부피에 대한 고려를 필요로 하였다.

500 ml 용출 완충액의 양을 각각의 세척 실행에 사용하였다.

세척 용액 내 단백질 함량은 하향 추세를 나타내었다. 제5 용출액의 단백질 함량은 0.022 mg/ml이었고, 황산바륨으로부터 용출되는 단백질의 양은 점점 줄어들었다.

농축, 정용여과 및 활성화: 예시적인 절차에서, 이전 단계에서 수집된 용출 액체를 41 ml로 농축하였다. 이어서, 일정한 부피를 위해 200 mL 양의 정용여과 완충액(1.0% 글리신 pH 7.0)을 첨가한 후, 5회 투석(총: 41 x 5 ml) 후에 41 ml(1.0% 글리신 pH 7.0의 용액을 포함함)로 농축하였다. 농축된 용출액에서는 FIB가 검출되지 않았다.

예시적인 절차에서, 그 후에 161 ml의 활성화된 완충액(0.75% CaCl₂, 1.0% 글리신 pH 7.0)을 첨가하고, 실온에서 8시간 동안 활성화시킨 다음, 추가 활성화(30시간)를 위해 4 ^oC 냉장고로 옮겼다. 최종 용액은 부피가 202 ml였다.

냉장고에서 30시간 동안 저장한 후에 효소 활성 및 단백질 함량을 측정하였고, 트롬빈 활성은 596 IU/ml였다. 단백질 함량은 0.900 mg/ml였다. 예시적인 절차에서, 이전 단계의 활성화된 용액을 0.2 μm 필터로 여과하여, 액체 내의 마이크로 플록을 제거한 다음, 약 40 ml로 농축하고, 이어서 120 ml의 정제수로 투석하였다. 마지막으로, 39.3 ml의 트롬빈 벌크 용액을 수득하였다.

트롬빈 활성 및 단백질 함량을 측정하였고, 효소 활성은 1976 IU/ml였고, 단백질 함량은 2.430 mg/ml였다.

비-필터 프레스 공정에서 (프로트롬빈을 포함하는) 20 L의 용출액을 수집한 다음, 4 L(즉, 5의 농도 계수)로 농축하였고; 배치당 초기 혈장의 양은 대략 220 L였고, 혈장(220 L)/트롬빈 벌크(4 L)의 부피비는 약 55였다. 비교를 위해, 필터 프레스 공정에서, 혈장과 벌크 사이의 약 55의 유사한 비를 또한 선택하였다.

(프로트롬빈의 농축을 위해) 예시적인 절차에 사용된 한외여과("UF") 장치의 제한으로 인해, 순환 부피는 약 30 ml 이상으로 설정된다. 따라서, 필터 프레스 실험에 의해 여과될 혈장의 양은 1650 ml 초과(즉, 30 ml × 55 초과)였다.

필터 프레스와 수동 공정의 비교: 필터 프레스 예비 실험에서, 여과 단계에 의해 처리된 혈장의 양은 단지 718 ml이었고, 벌크 용액의 이론적 부피는 13 ml(즉, 718/55)이어야 한다. 그러나, 상기에 언급된 바와 같이, 예시적인 절차에서, 실제 실험은 한외여과 장비 데드 볼륨(dead volume)에 의해 제한되었고, 벌크 용액의 최종 벌크 부피는 39.3 ml였다. 따라서, 최종 벌크 용액의 트롬빈 활성은 1976 IU/ml였고 단백질 함량은 2.430 mg/ml였다. 그러나, 이것은 수율 및 트롬빈 비활성도 계산에 영향을 미치지 않는다.

필터 프레스 공정의 파라미터는 다음과 같다:

수율 = 1976 IU/ml × 39.3 ml/718 ml 혈장 = 108 IU/ml 혈장;

비활성도 = 1976 IU/ml/2.430 mg/ml = 813 IU/mg 단백질.

비-필터 프레스 공정:

수율 - 74 IU/ml 혈장, 비활성도 - 1107 IU/mg 단백질.

따라서, 이러한 2-그룹 데이터의 비교에 의하면, 필터 프레스 공정은 비-필터 프레스 공정 제품에 적어도 비슷한 결과를 갖는 제품을 제조할 수 있다.

B. 제2 세트의 예비 시험:

추가의 예시적인 세트의 예비 실험에서, 상이한 돼지 혈장(2 ㎏)을 용매 세제(1% 트윈-80 및 0.3% TnBP)로 25℃에서 1시간 동안 처리하였다. BaSO₄를 1% w/w (20 g)의 최종 농도로 첨가하고, 실온(RT)에서 2시간 동안 혼합하였다. 현탁액을 4℃에서 15분 동안 6000xg로 원심분리하고, 상층액을 버리고, 사용 시까지 BaSO₄를 -30 ^oC 이하에서 동결 상태로 유지하였다.

필터 프레스 시스템 50 ㎠ 막(PALL의 50P)을 2개의 막, 2개의 종이, 2개의 플레이트, 1개의 수집 프레임 및 1개의 블랭킹 헤드와 조립하였다. BaSO₄ 침전물을 해동시키고, 모든 비결합 성분의 효율적인 세척을 보장하기 위해, 비-필터 프레스 공정에 비해 과량인 350 ml의 세척 완충액 중에 재현탁시켰다. 완충액을 저속으로 순환시켜 먼저 시스템을 세척하여 시스템으로부터 공기를 제거하였다. 이어서, 용액을 시스템 내로 펌핑하고, 압력을 1 바(15 psi) 이하로 유지하면서 저속(70 ml/min)으로 시스템에서 15분 동안 순환시켰다. 단백질 수준(흡광도 280 내지 320 nm)을 평형에 도달할 때까지 출구 파이프 및 완충액 탱크에서 세척 완충액의 순환 동안 주기적으로 측정하였다. 세척 용액을 밖으로 펌핑하여 시스템으로부터 배수시켰다.

다음으로, 용출 완충액(200 ml)을 시스템 내로 펌핑하고 15분 동안 순환시켰다. 단백질 수준(흡광도 280 내지 320 nm)을 평형에 도달할 때까지 출구 파이프 및 완충액 탱크에서 용출 완충액의 순환 동안 주기적으로 측정하였다. 용출 완충액을 시스템 밖으로 펌핑하고 깨끗한 용기에 수집하였다.

용출된 프로트롬빈이 트롬빈으로 전환될 수 있는지 확인하기 위해, 12 ml의 용출된 샘플을 25℃에서 13분 동안 센트리콘(Centricon)(등록상표) 원심분리 필터 유닛에서 4,800 x g로 원심분리하여 2.4 ml로 농축하였다. PuW를 12 ml까지 첨가하고, 다른 원심분리 단계를 수행하였다. PuW 첨가 및 원심분리를 1회 더 반복하였다. 다음으로, 활성화 완충액(CaCl₂-글리신)을 12 ml까지 첨가하고, 샘플을 25℃에서 8시간 동안 인큐베이션한 후, 활성화를 위해 4 내지 8℃에서 60시간 동안 인큐베이션하였다.

샘플에서의 프로트롬빈(FII) 활성을 다이아그노스티카 스타고 인크.(Diagnostica Stago Inc.) 시약 및 응고 기계를 사용하여 평가하고, 정상 인간 혈장과 비교하여 계산하였다.

시험 샘플에서 프로트롬빈 및 트롬빈을 검출하기 위한 웨스턴 블롯 분석을, 1차 항체로서의 양 항 인간 트롬빈(어피니티 바이올로지칼스(Affinity biologicals)) 및 2차 항체로서의 당나귀 항-양 IgG Alk. Ph. (시그마(Sigma))를 사용하여 수행하였다.

결과: 비-필터 프레스 공정의 실험실 규모 샘플뿐만 아니라 제조 공정의 배치에서 얻은 공정-중 샘플과 비교하여 2가지 독립 필터 프레스 실행으로부터의 상이한 분획에서 프로트롬빈(FII) 활성(표 5)을 측정하였다. 결과는 2가지 필터 프레스 실행으로부터의 용출 분획 모두가 출발 혈장으로부터 회수된 프로트롬빈 수준(21 내지 23%)과 유사하였음을 나타낸다. 이들 값은 비-필터 프레스 용량 공정에 따라 생성된 실험실 규모 샘플에서 발견되는 수준(23%)과 유사하였고, 비-필터 프레스 공정에서 전체 규모 생산 배치로부터 얻은 공정-중 샘플(32%)과 동일한 자릿수 이내였다(하기 표 5 참조).

[표 5]

하기 표 6은 비-필터 프레스 공정에 대해 이 필터 프레스 타당성 연구에 사용된 파라미터의 값을 나타낸다. 이 표는 비-필터 프레스 생산 규모로 조정된 실험실 규모 시스템뿐만 아니라 예전 규모로부터의 5배 규모 확장에 기초한 이론적으로 계산된 파라미터를 또한 나타낸다.

[표 6]

도 3a 및 도 3b는 프로트롬빈 및 트롬빈 표준물과 비교하여 실험실 규모 연구로부터의 상이한 분획에서 프로트롬빈/트롬빈에 대한 SDS PAGE 쿠마시 염색(도 3a) 및 웨스턴 블롯(도 3b)을 나타낸다. 결과는 용출 분획 중 프로트롬빈(레인 7) 및 활성화된 샘플 중 알파-트롬빈(레인 8, 9)에 상응하는 밴드의 존재를 보여준다. 이러한 결과는 필터 프레스 시스템을 사용하여 얻어진 용출 분획에 활성 프로트롬빈이 존재함을 확인시켜 준다. 종합하면, 필터 프레스 공정을 비-필터 프레스 수동 세척 및/또는 용출 공정과 비교하면, 최종 생성물 품질 및 수율이 유사하다고 결론 내릴 수 있다. 그러나, 필터 프레스 공정은 오염 위험이 더 낮고, 자동화될 수 있으며, 원심분리를 필요로 하지 않고, 규모 확장이 용이하므로, 필터 프레스 공정을 사용하여 트롬빈 생산의 수동 공정을 대체하는 것이 타당하다.

실시예 2: 대규모 타당성 실험

제1 세트의 예비 실험의 결과에 따르면, 2개의 막에 의해 여과되는 혈장의 양이 적었고, 타당성 실험에서는 필터를 4개로 증가시켰다. 동시에, 세척 효과를 개선하기 위해, 각각의 순환 실행에서 처음 300 ml의 세척 완충액은 바로 배수시키고, 나머지 300 ml를 15분 동안 순환시켰다. 타당성 실험을 3회 반복하였고, 3번째 실험에서, 세척 횟수를 4회로 조정하였다. 나머지 작업은 사전 실험과 일치하였다. 실험 파라미터 및 결과가 하기 표 7에 나타나 있으며, 도 4a 내지 도 4d에 추가로 예시되어 있다:

[표 7]

표 7에 제시되고 도 4a 내지 도 4d에 시각화된 단백질 함량 및 트롬빈 활성 데이터는 3회의 필터 프레스 공정으로부터 수득된 트롬빈의 품질이 비-필터 프레스 공정의 결과와 유사함을 보여준다. 3회 실행 단백질 함량의 평균값은 4.892 mg/ml였고, 평균 트롬빈 활성은 4740 IU/ml였다. 생산 중 비-필터 공정의 단백질 함량은 4.300 mg/ml이었고, 트롬빈 활성은 4781 IU/ml이다. 생산의 트롬빈 활성의 허용 표준은 1800 IU/ml 이상이다.

트롬빈 비활성도: 데이터는 필터 프레스의 세척 단계가 불순한 단백질을 제거할 수 있음을 보여준다. 3회 실행 효소 비활성도의 평균값은 974 IU/mg 단백질이었고, 생산 데이터는 1107 IU/mg 단백질이었고, 허용 표준은 500 IU/mg 단백질 초과였다.

트롬빈 수율: 사용된 혈장에 기초하여 트롬빈 수율을 계산한다. 데이터는, 필터 프레스 용출 단계가 BaSO₄로부터 프로트롬빈을 용출할 수 있음을 보여준다. 3회 실험의 평균은 86 IU 트롬빈/ml 혈장이었고, 비-필터 공정의 생산 통계 데이터는 74 IU 트롬빈/ml 혈장이었다.

막 면적: 타당성 실험 규모는 비-필터 프레스 생산 규모의 대략 1/125이다. 이 절차에서 사용된 막은 약 0.04 m²였다. 이러한 계산에 기초하여, 생산 규모에 사용된 막의 면적은 5 m²인 것으로 추정된다. 그러나, 막의 로딩 용량을 추가로 최적화할 수 있으며, 사용되는 막 면적은 감소될 수 있다.

세척 완충액 부피: 3번째 필터 프레스 실험에 사용된 세척 완충액의 총량은 2400 ml였고, 생산 규모로 확장시키면, 세척 완충액 부피가 300 L인 것으로 추정된다. 그러나, 생산 규모에서, 장비의 데드 볼륨, 유동 경로를 최적화하고 세척 공정 파라미터를 최적화함으로써 세척 완충액의 총 부피를 감소시킬 수 있다.

용출 완충액 부피: 3번째 필터 프레스 실험에 사용된 세척 완충액의 총량은 2000 ml였고, 생산 규모로 확장시키면, 세척 완충액 부피가 250 L인 것으로 추정된다. 그러나, 생산 규모에서, 장비의 데드 볼륨, 유동 경로를 최적화하고 세척 공정 파라미터를 최적화함으로써 세척 완충액의 총 부피를 감소시킬 수 있다.

공정 시간: 수동 세척/용출 공정 시간은 대략 16시간인 반면, 필터 프레스 세척/용출 공정 시간은 대략 2 내지 4시간이다.

프로트롬빈 동결 저장: 예시적인 절차에서, 상기 3회의 타당성 실험의 각각으로부터 수득된 프로트롬빈 벌크 액체, 1 ml/per를 -20℃ 냉장고에서 동결시키고, 실온에서 해동한 후에 트롬빈 활성을 측정하였다. -20℃ 미만에서 동결된 트롬빈 활성의 산포도를 나타내는 도 5에 동결 시간 및 트롬빈 활성의 결과가 나타나 있다. 트롬빈 벌크 용액을 -20℃ 미만의 냉장고에서 30일 동안 동결시킨 후에도 트롬빈 활성이 안정하게 유지되는 것으로 나타났다.

본 발명은 이의 구체적인 실시 형태와 관련하여 설명되었지만, 다수의 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 자명함이 분명하다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위의 사상 및 넓은 범주 내에 있는 모든 이러한 대안, 수정 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.

Claims

불용성 흡착제를 포함하는 매질로부터 관심 단백질을 정제하는 방법으로서, 상기 흡착제 내에/상에 적어도 부분적으로 흡착된 단백질을 포함하는 상기 매질을 제공하는 단계, 및 흡착제-흡착된 단백질을 세척하고/하거나 상기 흡착제로부터 상기 단백질을 용출하여 상기 단백질을 적어도 부분적으로 정제하도록 압력 여과를 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 흡착제는 불용성 염을 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 상기 불용성 염은 수산화알루미늄을 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 상기 불용성 염은 불용성 알칼리 토금속 염을 포함하는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 불용성 알칼리 토금속 염은 BaSO₄ 시약이거나 이를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매질은 상기 단백질의 공급원을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매질은 액체 매질인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 프로트롬빈을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매질은 프로트롬빈의 공급원을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 압력 여과를 수행하여 상기 흡착제-흡착된 단백질을 세척하고 상기 흡착제로부터 상기 단백질을 용출하는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 흡착제는 BaSO₄를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흡착제-흡착된 단백질은 세척 완충액을 사용하여 세척되는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 매질을 원심분리하여, 상기 흡착제 및/또는 상기 단백질을 포함하는 침전물을 수득하는 단계; (ii) 선택적으로 BaSO₄ 시약인 상기 흡착제 내에/상에 적어도 부분적으로 흡착된 상기 단백질을 세척 완충액으로 세척하여, 그로부터 불순물을 제거하는 단계; 및 (iii) 용출 완충액을 사용하여 상기 흡착제-흡착된 단백질로부터 상기 단백질을 포함하는 분획을 용출하는 단계로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 포함하는, 방법.
제12항에 있어서, 단계 (ii) 및 단계 (iii)을 포함하며, 단계 (ii) 및 단계 (iii) 중 적어도 하나의 단계는 압력 여과를 수행하는 단계에 의해 또는 그와 동시에 수행되고, 선택적으로 압력 필터에 상기 매질을 통과시킴으로써 수행되는, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흡착제는 분말 형태인, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압력 여과는 필터 프레스에 의해 수행되는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 프로트롬빈이고, 프로트롬빈의 상기 공급원은 혈장 또는 혈장 분획으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 혈장은 옥살레이트화 혈장을 포함하는, 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 프로트롬빈의 상기 공급원은 포유류에서 채취한 혈장을 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 포유류는 인간, 말, 소 및 돼지로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 프로트롬빈의 상기 공급원은 돼지 혈장을 포함하는, 방법.
제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약) 내에/상에 프로트롬빈의 상기 공급원으로부터 프로트롬빈을 흡착시키는 것을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약)와 프로트롬빈의 상기 공급원을 접촉시켜, 상기 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약) 내에/상에 프로트롬빈을 흡착시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 흡착제(예를 들어, BaSO₄ 시약) 내에/상에 프로트롬빈의 상기 공급원으로부터 프로트롬빈을 흡착시키는 것을 가능하게 하는 상기 조건은 7.4 내지 8.6 범위의 pH를 갖는 매질을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 압력 여과를 수행하는 상기 단계는 압력 하에서 여과 챔버를 통해 상기 매질을 통과시키는 단계를 포함하고, 상기 여과 챔버는 필터 막을 포함하는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 압력은 1.5 내지 약 4 바의 범위인, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 압력 여과를 수행하는 상기 단계는 상기 매질을 압력 필터에 통과시키고 상기 막에 5 psi 내지 15 psi 범위의 배압(back pressure)을 가하여, 상기 필터 막 내에/상에 상기 흡착제-흡착된 단백질의 균일한 케이크를 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터 막은 1 m²당 30 ㎏ 이상의 프로트롬빈의 상기 공급원의 여과 용량을 특징으로 하는, 방법.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터 막은 마이크로 크기의 기공을 갖는, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매질은 약 0.5 내지 3% (w/w), 선택적으로 약 1%의 BaSO₄ 시약을 포함하는, 방법.
제11항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세척 단계는 2 내지 6회 반복되는, 방법.
제11항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세척 완충액은 염화나트륨 및/또는 시트르산나트륨을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 용출 완충액을 사용하여 상기 흡착제-흡착된 단백질로부터 상기 단백질을 용출하여, 용출된 단백질-함유 분획을 수득하는, 방법.
제31항에 있어서, 상기 용출 완충액은, 선택적으로 약 6.3 및 7.4의 pH에서, 칼슘 킬레이팅 염을 포함하는, 방법.
제32항에 있어서, 상기 칼슘 킬레이팅 염은 시트르산나트륨을 포함하는, 방법.
제33항에 있어서, 시트르산나트륨의 농도는 약 3% (w/v) 내지 약 4.4% (w/v)의 범위인, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 용출된 단백질-함유 분획, 선택적으로 프로트롬빈-함유 분획을 농축하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농축하는 단계는 상기 용출된 단백질-함유 분획을 정용여과(diafiltration) 완충액에서 정용여과하여 수행되는, 방법.
제36항에 있어서, 상기 정용여과 완충액은 글리신을 포함하는, 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 정용여과 단계는 2 내지 6회 반복되는, 방법.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흡착제-흡착된 단백질을 세척하는 단계 및/또는 상기 흡착제로부터 상기 단백질을 용출하는 단계의 총 지속시간은 16시간 미만, 선택적으로 2 내지 6시간인, 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 프로트롬빈이고, 상기 방법은 상기 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 가능하게 하는 조건을 제공하여 트롬빈을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
프로트롬빈의 공급원으로부터 트롬빈을 수득하는 방법으로서, (i) 흡착제, 선택적으로 BaSO₄ 시약 및 상기 프로트롬빈의 공급원을 포함하는 액체 매질을 압력 필터에 통과시켜, 상기 매질로부터 상기 프로트롬빈을 적어도 부분적으로 분리 및/또는 정제하는 단계, 및 (ii) 상기 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 가능하게 하는 조건을 제공하여 트롬빈을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
제41항에 있어서, 상기 흡착제, 선택적으로 BaSO₄ 시약은 상기 프로트롬빈을 적어도 부분적으로 흡착하는, 방법.
제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 가능하게 하는 상기 조건은 칼슘 이온을 선택적으로 포함하는 활성화제에 상기 프로트롬빈을 노출시키는 것을 포함하는, 방법.
제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬빈은 분획에서 수득되고, 상기 방법은 트롬빈 함유 분획을 필터에 통과시켜 그로부터 마이크로 플록(micro floc)을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 프로트롬빈의 공급원, 선택적으로 혈장 1 ml당 70 내지 130 IU의 수율로 트롬빈을 수득하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제40항 내지 제45항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득되는 트롬빈.
제46항에 있어서, 4000 내지 6000 IU/ml의 활성을 특징으로 하는, 트롬빈.
제46항 또는 제47항에 있어서, 단백질 1 mg당 700 내지 1200 IU의 비활성도(specific activity)를 특징으로 하는, 트롬빈.