DD141262B1 - Verfahren zur herstellung eines prothrombinkomplexkonzentrates - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung eines Prothrombinkomplexkonzentratea

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrates der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X (Prothrombinkomplex) aus Humanplasma oder aus geeigneten Humanplasmafraktionen zur therapeutischen Anwendung bei bestimmten Erkrankungen vorzugsweise bei Hämophilie B, bei Blutungen durch die Anwendung oraler Antikoagulantien und anderen Erkrankungen, die auf einen Mangel eines oder mehrerer dieser 4 Gerinnungsfaktoren zurückzuführen sind*

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Paktor IX gehört zusammen mit den Paktoren II, VII und X zu dem sogenannten "Prothrombinkomplex" oder den Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoran·

Die Methoden zur Isolierung und Anreicherung des Prothrombinkomplexes werden von der Eigenschaft der Gerinnungsfaktoren bestimmt, an anorganischen Adsorbentien oder organischen Ionenaustauschern (z, B· DEAE-ZaHulose oder DEAE-Sephadex) reversibel adsorbierbar zu sein·

Die anorganischen Adsorbentien tri-Kalziumphosphat oder Bariumsulfat erfordern die Verwendung bestimmter Antikoagulantien, wobei die Blutzellen nur nach Zugabe einer speziellen Konservierungslösung im flüssigen Zustand gelagert und transfundiert werden können· Blutentnahmen in speziellen Antikoagulantien sind unökonomisch und erschweren eine möglichst vollständige therapeutische Nutzung einer ausgewählten Anzahl im Humanplasma enthaltener Proteine·

Von Bariumsulfat ist außerdem bekannt, daß seine Verwendung toxische Konzentrate ergibt·

In ausreichendem Umfang steht mit zitrathaltigen Antikoagulantien versetztes Humanplasma zur Verfügung. Es ist ein Verfahren bekannt, den Prothrombinkomplex aus zitrathaltigem Plasma an Aluminiumhydroxid zu adsorbieren« Wegen der zeit- und arbeitsaufwendigen Präparation wird das auch bezüglich der Ausbeute wenig effektive Verfahren nicht mehr genutzt, außerdem besteht die Gefahr erhöhter Alurainiumkonzentrationen im Konzentrat durch Chelat-Bildung*

Beschrieben wurden eine Reihe von Modifizierungen eines Verfahrens, bei dem DEAE-ZeHulose als Adsorptionsmittel eingesetzt wird* Bei diesem Verfahren muß zur Gewährleistung einer ausreichenden Adsorption das zur Isolierung des Prothrombinkomplexes eingesetzte Humanplaama verdünnt werden«

Dadurch entstehen bei der weiteren Fraktionierung beträchtliche Schwierigkeiten«

Es ist ein Verfahren (DT - OS 2459291) bekannt, bei dem tri-Kalziumphosphat als Adsorptionsmittel und Ionenaustauscher-Plasma zur Isolierung des Prothrombinkomplexes eingesetzt werden« Bei diesem Verfahren stehen konservierte Blutze Ilen nicht zur Verfügung·

Von J« Heystek (J« Heystek, HJG«J« Brummelhuis, H«W. Krijnen II. The large-scale preparation of Prothrombin-Complex, Vox« Sang. 25 (1973) 113-123) wird ein Verfahren beschrieben, das in folgenden Stappen durchgeführt wird:

Adsorption

Aus einem Ansatz von 100 1 Plasma wird der Prothrombinkomplax an 150 g DEAE-Sephadex A-50 bei Raumtemperatur adsorbiert« Die Adsorptionszeit beträgt 45 Minuten« Während der Adsorption wird die Gelsuspension durch Rühren stabilisiert«

Entfernung des Überatandsplasma

Nach einer Sedimentationszeit von 30 Minuten wird zunäcnst das Überstands plasma in einen 30 1-Pilterhalter gepumpt« Nach Entfernung des Überstandsplasmas wird in den gleichen

Filterhalter dia DEAE-Sephadex-Plasraa-Suaрепа ion eingefördert.

Auswaschen des Sephadex-Gela

Inertproteine und mögliches HBs-Antigen werden durch Auswaschen des Sephadex-Gela mit 3 χ 10 1 Portionen Waschflüssigkeit (0,2 mol/1 NaCl, 0,01 mol/1 Uatriumzitrat, pH 7,0) entfernt·

Elution des Prothrombinkomplexes

Die Elution erfolgt mit 2 1 2,0 mol/1 KaGl 0,01 mol/1 Uatriumzitrat (2 Vol# % bezogen auf das eingesetzte Plasmavolumen) ·

Dialyse

2 1 Sluat werden gegen 200 1 0,01 mol/1 Hatriumzitrat (pH 7»0) dialysiert· Innerhalb von 3 Stunden ist Isotonie im Eluat erreicht·

Sterilfiltration

Gefriertrocknung

Nach Portionieren (10 ml/Einheit) erfolgt die abschließende Gefriertrocknung.

Die Etappen 1-6 können zeitmäßig innerhalb eines Tages durchgeführt werden·

Für die Verfahrensachritte 5-7 wird ein Ausbeuteverlust von 22 % angegeben·

H« Suomela (H· Suomela, G.Myllylä, B Hemofilian hoi-co tekijä IX konzentraatilla, Duodecim 82 (1971) 31-38) beschreibt ein ähnliches Verfahren·

Zur Entfernung der zur Elution eingesetzten Salze (0,45 mol/1 NaCl, 0,05 mol/1 Phosphat) wird eine Entsalzung durch Gelfiltration in einer Kolonnentechnik durchgeführt· Die dabei eintretende Verdünnung erfordert eine zusätzliche Lyophilisation· Das Lyophiliaat wird in 0,65 % NaCI-Lösung gelöst und nach Sterilfiltration erneut lyophilisiert·

Die Gesamtproseßzeit einschließlich der 2 Lyophilisationen beträgt mindestens 3 Tage·

In der OE - PS 312465 wird ein Verfahren zur Entfernung des eine Hepatitis Typ B verursachenden HBs-Antigens durch eine fraktionierte Fällung mit Polyäthylenglykol beschrieben.

Hauptsächlichste Nachteile des Standes der Technik sind:

Das zur Adsorption eingesetzte hochgepoolte Ausgangsmaterial kann wegen des hohen Hepatitisrisikos nicht zur Herstellung von Humantrockenplasma eingesetzt werden· Bei Einsatz von Prothrombinkomplexkonzentraten besteht für den Empfänger ein hohes Hepatitisrisiko, das darauf zurückzuführen ist, daß bei Großpoolverfahren zwischen 50 und 1000 1 Humanplasma /Charge eingesetzt werden· Ss ist unbestritten, daß der Chargenumfang in direkter Beziehung zum Risiko einer durch die Verabreichung des Präparates verursachten Transfusionshepatitis steht· Von dem Verfahren gemäß OE - PS 312465 ist bekannt, daß es zu einer Spontanaktivierung der Gerinnungsfaktoren des Prothrombinkomplexes führt·

Pur dieses Verfahren ist noch nicht bewiesen, daß auch endogen in Spuren vorhandenes HBs-Antigen bzw, verwandte, eine Hepatitis beim Empfänger bewirkende Antigene, entfernt werden können, die sich der üblichen ilachweistechnik durch spezifische Antigen-Antikörperreaktionen (z· B· Radioimmunassay) entziehen· Es ist gesichert, daß auch durch die Transfusion von HBs-antigennegativem Blut und Blutderivaten eine Hepatitis übertragen werden kann· Ein weiterer Nachteil der hergestellten Präparate liegt in der Gefahr thxomboembolischer Komplikationen bzw· einer disseminierten intravasalen Gerinnung wahrscheinlich

durch in den Konzentraten vorhandene aktivierte Gerinnungsfaktoren dea Prothrombinkomplexes.

Der Umfang der Aktivierung der Gerinnungsfaktoren wird mit großer Wahrscheinlichkeit durch verfahrenstechnische Parameter wie z· B# Prozeßzeit, Dauer und Art des Kontaktes zwischen Plasma und Adsorbens, Kontakt mit hydrophilen Oberflächen und unterschiedlichen anderen Materialien beeinflußt. Alle Paktoren, die zu den unerwünschten Nebenwirkungen bei dem klinischen Einsatz führen, sind noch nicht bekannt«

Außerdem ergeben sich bei einem Großpoolverfahren andere verfahrenstechnische Nachteile wie verlängerte Prozeßzeit, ungünstiger Auswascheffekt und erschwerte Freisetzung des Prothrombinkomplexes in kleinen Volumina Elutionsflüssigkeit·

Die bei allen beschriebenen Verfahren obligaten Verfahrensschritte Entsalzung durch Dialyse oder durch Gelfiltration und Sterilfiltration verlängern nicht nur die Prozeßzeit, sondern dabei erhöht sich durch den Kontakt mit hydrophilen, teilweise sogar thrombogen wirkenden Oberflächen die Gefahr einer Spontanaktivierung der Gerinnungsfaktoren im Konzentrat, da die natürlichen im Plasma vorhandenen Inhibitoren einer solchen Spontanaktivierung bei der Isolierung des Prothrombinkomplexes bis zu diesen Verfahrensstufen bereits entfernt sind«

Bei den bekannten Verfahren wird bedingt durch den relativ hohen Flüs3igkeits einsatz bei der Slution der Prothrombinkomplex in einer verhältnismäßig großen Verdünnung isoliert. Es ist bekannt, daß die Stabilität gereinigter Gerinnungsfaktoren in konzentrierten Lösungen günstiger als in verdünnten ist, wofür die Ausbeuteverluste von mehr als 20 % bei den Verfahrensschritten Entsalzung, Sterilfiltration und Lyophilisation als Beweis dienen»

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren, bei dem gegenüber dsm Stand der Technik duroh eine Vereinfachung des Verfahrens eine wesentliche Verkürzung der Prozeßzeit erreicht wird, um die Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen wie thromboembolische Komplikationen und eine disseminierte intravasale Gerinnung und das Hepatitiarisiko durch Begrenzung der Menge des pro Charge des Präparates eingesetzten Humanplasmas su mindern*

Ein solches Verfahren mit verringertem Chargenumfang (Kleinpoolverfahren) soll bezüglich des Material- und Arbeitsaufwandes, der Ausbeute und dem in der Menge des in der therapeutischen Einzeldosis vorhandenen gerinnungsaktiven Proteins und der Konstanz des Gehaltes von Charge zu Charge einem Großpoolverfahren nicht unterlegen sein·

Das Verfahren ist so zu konzipieren, daß eine Erhöhung des Chargenumfanges ohne Änderung der Verfahrensprinzipisn dann vorgenommen werden kann, wenn nach dem Stand der Technik eine Verringerung der Gefahr von Komplikationen beim Smpfänger auch bei durch Großpoolverfahren hergestellten Konzentraten möglich ist· Dabei soll vor allen Dingen der Vorteil der ProzeßzeitVerkürzung voll erhalten bleiben·

Durch das Verfahren soll ermöglicht werden, auch hochkonzentrierte Konzentrate des Prothrombinkomplexas zu isolieren und, wenn notwendig, nach bekannten Techniken zu entsalzen· Ebenso soll erreicht werden, daß die Hauptmenga des am Adsorbens adsorbierten Proteins ohne Aufkonzentrierung zur Herstellung von Humanalbumin und Huraangammaglobulin durch einen stufenweisen Waschprozeß isoliert werden kann· Gleichzeitig ist zu gewährleisten, daß das zur Herstellung des Prothrombinkomplexkonzentrates eingesetzte Humanplasma oder eine geeignete Fraktion desselben wegen des relativ hohen Hepatitisrisikos hochgepoolter Präparate ausschließlich als niedriggepooltes Präparat mit einem Gesamtproteingehalt von mindestens 45 g/l zur Volumensubstitution für klinische

Zwecks zur Verfügung steht bzw· ohne Einschränkung zur Herstellung von Humantrocksnplasma eingesetzt werden kann« Der Kontakt des Präparates mit hydrophilen Oberflächen oder mit Materialien, die zu einer Aktivierung der Gerinnungsfaktoren des Prothrombinkomplexkonzentrates führen können, soll weitestgehend ausgeschlossen werden·

Darlegung: des Wesens der Erfindung

Erfindungskennzeichnend ist, daß der Verfahrensschritt Adsorption des Prothrombinkomplexes am DEAE-Sephadex A-50 oder einem anderen geeigneten Adsorptionsmittel räumlich von den Verfahrensschritten Entfernung von adsorbiertem Inertprotein und Elution getrennt wird, indem erstere in Blutkonservenflaschen durchgeführt wird, das Überstandsplasma nach Adsorption des Prothrombinkomplexes, abgetrennt durch Zentrifugation, als niedriggepooltes Präparat mit einem Gesamtproteingehalt von mindestens 45 g/l ohne Einschränkung zur Volumensubstitution bzw. zur Herstellung von Humantrockenpiasma eingesetzt wird, sofern kein alkoholhaltiges Ausgangsmaterial zum Einsatz kommt·

Srfindungskennzeichnend ist weiterhin, daß die Freisetzung des Prothrombinkomplexes vom eingesetzten Adsorptionsmittel durch Zusammensetzung und Menge der Elutionsflüssigkeit so gesteuert und die ohne vorangegangene Entsalzung je therapeutische Einze!dosis portionierte Menge so bemessen wird, daß nach Lyophilisation und Lösen im Anwendungsvolumen ein isotonisches oder gering hypertonisches Präparat mit ausreichend hohem Wirkstoffgehalt zur Verfügung stent·

Es ist bekannt, daß zur Freisetzung des Prothrombinkomplexes vom DEAE-Sephadex A-50-Gel eine Uatriumchloridkonzentration von 0,5 mol/1 erforderlich ist und daß bei der Durchführung gelchromatographisGher Trennungen nach der Batch-Technik die Eigenschaft der Schrumpfung der Gele in Abhängigkeit von der Ionenstärke der Lösung zum Vorteil für bestimmte Anwendungen werden kann·

Sa wurde gefunden, daß eine durch Silikonisierung erreichte Hydrophobierung der Glasoberfläche der Blutkonservenflaschen die Gelverluste bei Einzelgefäßadsorption senkt· Es wurde gefunden, daß durch ein rotierendes Rühren die Adsorption des Prothrombinkomplexes schonend, ohne jegliche mit der Gefahr der Denaturierung verbundene Schaumbildung, möglich ist, Auf Rühreinrichtungen in den Blutkonservenflaschen kann dadurch verzichtet werden.

Erfindungsgemäß wird die Freisetzung des Prothrombinkomplexes mit einer minimalen Menge entsprechend zusammengesetzter Elutionsflüssigkeit (0,15 - 0,20 % bezogen auf das Volumen des zur Isolierung des Prothrombinkomplexes eingesetzten Humanplasmas) so gesteuert, daß bei Berücksichtigung des bei der Schrumpfung des Gels erfolgenden Flüssigkeitsaustritts aus diesem eine ausreichend hohe Konzentration der zur Freisetzung erforderlichen Ionen erreicht wird« Zweckmäßigerweise kann die Freisetzung des Prothrombinkomplexes vom Gel zusätzlich durch die temperaturabhängige Schrumpfung des Gels unterstützt werden.

Die durch die Ausbeute an isoliertem gerinnungsaktivem Protein, bezogen auf die in dem eingesetzten Volumen Humanplasma vorhandene Menge gerinnungsaktiven Proteins bei Verfahrensbeginn, bestimmte Effektivität des Verfahrens hängt von der reproduzierbar konstanten Menge an vom Gel eingeschlossener und nicht abgetrennter Waschflüssigkeit vor dem Verfahrensschritt EIution und von der Quantität der Abtrennung der Eluate zwischen den einzelnen Schritten der Elution ab, sofern diese überhaupt stufenweise durchgeführt werden muß. Es wurde gefunden, daß es im Gegensatz zur üblichen Praxis zweckmäßig ist, die Elution mit einer konzentrierten Elektrolytlösung zu beginnen und die Elution mit Flüssigkeiten fortzusetzen, die nur so viel Salze enthalten, daß nach ihrer Zugabe zum Gel eine erneute Adsorption des Prothrombinkomplexes nicht stattfinden kann. Dadurch können die Elektrolytkonzentration im Eluat und die Eluatmenge auf ein Miniraum gesenkt werden

Ss wurde gefunden, daß bei stufenweiser Elution und Einsatz

konzentrierter Elektrolytlösung in der 1* Elutionsstufѳ in der 2* Elutionsstufe gerinnungsaktives Protein nicht zusätzlich vom Gel freigesetzt wird, sondern daß diese Flüssigkeiten bereits іш 1. Elutionsscnritt freigesetztes gerinnungsaktives Protein lediglich auswaschen·

Ss wurde gefunden, daß bei möglicnst vollständiger Abtrennung der Eluate vom DEAE-Sephadex-Gel mit Eluatmengen zwischen 0,5 und 0,8 % des eingesetzten Plasmavolumens diese die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X in einer so hohen Konzentration enthalten, daß bei einer portionierten Eluatmenge zwischen 25 und 37 VoI* % des Anwendungsvolumens der therapeutischen Einzeldosis ein ausreichend hoher Wirkstoffgehalt erreicht wird. Bei Auflösung der lyophilisierten Präparate im Anwendungsvolumen sind die Gerinnungsfaktoren in einer i3O"conischen bis geringgradig hypertonischen Lösung enthalten, sodaß erfindungs-Semäß auf die Entsalzung der Eluate vor deren Lyophilisation verzichtet wird*

Mit der bekannten Technik der Überdruckfiltration können die Eluate mit einer ausreichenden Effektivität abgetrennt werden, wenn das therapeutisch einsetzbare Konzentratvolumen 0,6 - 0,3 % des Volumens des zur Isolierung des Prothrombinkomplexes eingesetzten Ausgangsmaterials beträgt*

Überraschend wurde gefunden, daß eine Abtrennung der Elutionsflüssigkeiten von dem Gel durch Sentrifugalfiltration möglich ist, wenn die von der Ionenstärke der Elutionsflüssigkeiten bestimmte Abhängigkeit der mechanischen Stabilität des DEAE-Sephadex A-50-Gels durch die Wahl der entsprechenden Bedingungen für das Zentrifugieren berücksichtigt wird· Bei dieser Technik kann das therapeutisch eingesetzte Konzentratvolumen auf 0,4 bis 0,5 % des Volumens des zur Isolierung eingesetzten Humanplasmas gesenkt werden* Die Effektivität der Technik der Abtrennung der Elutionsflüssigkeiten durch Zentrifugalfiltration ist höher als bei der Technik der Überdruckfiltration* Die Abtrennung der Elutionsflüssigkaiten kann mittels der Technik der Zentrifugalfiltration bei einstufig durchgeführter Elution mit einer höheren Ausbeute an gerinnungsaktivem Protein durcngeführt werden als bei der Überdrucktechnik, die in

der Regel ein mehrstufiges Eluieren bzw. Auswaschen des freigesetzten Prothrombinkomplexes erfordert. Sin technisches Problem des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt im Einsatz einer geeigneten Trenneinrichtung zur Abtrennung granulierter Gele von Prozeßflüssigkeiten. Eine geeignete Vorrichtung ist im Patent 132 850 beschrieben. Bei Einsatz eines Schlauches aus einem geeigneten Siebgewebe mit Stützvorrichtung steht eine Trennvorrichtung zur Verfügung, in der die Verfahrensstufen Auswaschen des DEAE-Sephadex-Gels und Elution des Prothrombinkomplexes in geschlossener Anordnung unter aseptischen Bedingungen möglich sind. Das ortsunabhängige Gefäß gestattet eine schnelle Einstellung von Adsorptions- und Desorptionsgleichgewichten an granulierten Gelen und die Abtrennung von Prozeßflüasigkeiten von den Adsorptionsmitteln wahlweise durch Dekantieren, überdruck-, Unterdruck- oder Zentrifugalfiltration. Dabei ist für die Zentrifugalfiltration von besonderem Vorteil, daß die Trenneinrichtung nicht wie allgemein üblich quer, sondern in Richtung der Beschleunigung angeordnet ist. Die Art der Befestigung der Trenneinrichtung am Gefäß macht in das Gefäß eingeschobene oder an diesem befestigte Stützvorrichtungen für die Trenneinrichtung überflüssig.

Alle Verfahrensstufen werden erfindungsgemäß in geschlossener Anordnung unter aseptischen Bedingungen durchgeführt, sodaß eine Sterilfiltration bei der Herstellung des Prothrombinkomplexkonzentrates entfällt.

Durch den mit dem erfindungsgemäöen Verfahren möglichen Verzicht auf die eine Verringerung des Chargenumfanges limitierenden Verfahrensstufen Entsalzung und Sterilfiltration ist ein rationeller Verfahrenaablauf auch bei einem Chargenumfang zwischen 8 und 111 Ausgangsmaterial möglich. Durch diese Beschränkung des Chargenumfanges kann das bekanntermaßen hohe Risiko der Poattransfuaionahepatitia von Prothrombinkomplexkonzentraten gesenkt werden. Das ist für die Therapie erworbener Mangelzustände des Prothrombinkomplexes von besonderer Bedeutung. Mit dem erfindungsgemäßen Wegfall der 2 Verfahrensstufen Entsalzung und Sterilfiltration wird die

Prozeßzeit verkürzt, der Kontakt mit nicht; blutneutralen, eine Aktivierung der Paktoren des Prothroobinkoraplexes fördernden Oberflächen eingeschränkt und eine bakterielle Kontamination sowie das Einschleppen von Pyrogenen durch das Arbeiten in geschlossener Anordnung unter aseptischen Bedingungen verhindert· Damit wird das Risiko thromboembolischer Komplikationen und pyrogener Reaktionen beim klinischen Einsatz der Präparate verringert« Das erfindungsgemäße Verfahren wird nur beispielhaft mit dem Adsorptionsmittel DEAE-Sephadex A-50^(Pharmacia Uppsala, Korngröße 40 - 120 μ) erläutert, es iat jedoch nicht auf dieses beschränkt. Andere Adsorptionsmittel (z. B. QAE-Sephadex) können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls eingesetzt werden*

Ausführungsbeispiel

1, Adsorption des Prothrombinkomplexes

In 18 einzelne Überstände (oder ein mehrfaches davon) der Humanplasmafraktion Kryopräzipitat oder entsprechander alkoholhaltiger Überstände mit einem Volumen zwischen 440 und 480 ml in silikonisierten 500 ml-Blutkonaervenflaschen werden bei einer Temperatur von 2 bis. 4⁰C im geschlossenen System mittels einer zeitgesteuerten Dosierpumpe 25 ml einer DEAE-Sephadex A-50-Suspension (9,0 g/480 ml 0,075 mol/1 HaGl) eingefördert. Die Adsorption erfolgt bei Raumtemperatur. Eine ausreichende Stabilisierung der Gelsuspenaionen und die beabsichtigte möglichst vollständige Adsorption des Prothrombinkomplexes wird durch Auflegen der Blutkonservenflaschen auf eine Vorrichtung erreicht, auf der die P'laschen mit 4-12 U/min rotieren. Zur Adsorption können auch Schüttelgeräte eingesetzt werden, die ein schaumfreies Mischen ermöglichen«

2. Abtrennung des Adsorptionsmittel DEAE-SepJaadex A-50 Das DEAE-Sephadex-Gel wird durch Dekantieren, vorzugsweise aber durch Einzelgefäßzentrifugierung (10 min, 1600 U/min), von dem Plasma getrennt. Der Plasmaüberstand wird im geschlossenen System z« B. mittels Überdruck durch ein gasförmiges

Medium (Stickstoff) entfernt· Der Plasmaüberatand kann im Falle des Einsatzes alkoholhaltiger Überstände z. B. zur Herstellung von Humanalbumin oder Humangammaglobulin verwendet werden* Überstände der Humanplasmafraktion Kryopräzipitat können mit einem Gesamtproteingehalt von durchschnittlich 50 g/l zur Herstellung von Humantrockenplasma eingesetzt werden*

3« Entfernen von Inertprotein durch Auswaschen des Adsorptionsmittels DEAE-Sephadex A-50

Das nach der Zentrifugation oder nach dem Dekantieren in den einzelnen Flaschen verbleibende DEAE-Sephadex-Gel wird in jeweils 25 ml Waschflüssigkeit (z. B. 0,20 mol/1 ЖаСІ / 0,01 mol/1 Hatriumzitrat / pH 7,0) suspendiert· Die Zugabe der Waschflüssigkeit erfolgt mittels einer automatischen Dosiervorrichtung in geschlossener Anordnung· In einer anderen Ausführungsform wird das Überstands plasma nach dem Zentrifugieren bis auf einen Rest von ca* 25 ml/Behältnis entfernt und auf die Zugabe von Waschflüssigkeit zu diesem Zeitpunkt verzichtet· Anschließend werden die einzelnen DEAE-Sephadex-Suspens ionen in zwei silikonisierten 500 ml-Blutkonservenflaschen mittels der Überdrucktechnik in geschlossener Anordnung gesammelt und erneut zentrifugiert (10 min, I6OO U/min) oder direkt in eine geeignete Trenneinrichtung z« B. nach 7/P DDR 132 850 gefördert. Die zunächst abtrennbare Eiweißlösung (Gesamtproteingehalt 24 bis 50 g/l) enthält ca· 85 % des am DEAE-Sephadex A-50-Gel adsorbierten Inertproteins und kann ohne Aufkonzentrierung für Fraktionierzwecke zur Herstellung von Humanalbumin und Gammaglobulin eingesetzt werden* Danach wird das in der Trennvorrichtung gesammelte Gel mit weiteren 3 1 Waschflüssigkeit (z. B* 0,20 mol/1 UaCl / 0,01 mol/1 Uatriumzitrat / pH 7,0) kontinuierlich unter vorzugsweiser Anwendung der Überdrucktechnik in geschlossener Anordnung ausgewaschen, bis das Gel die zunächst blaue Färbung verloren hat. Die eingesetzte Trennvorrichtung kann dabei zur Beschleunigung der Desorption in einer geeigneten Vorrichtung geschüttelt werden.

4. Elution (Freisetzung) des Prothroinbinkomplexes 4.1« Überdrucktachnik

ITaGh Beendigung des Auswaschens werden mittels Überdruck (0,15 H?a,20 min) die Reste der Auswaschflüssigkeit in einem solchen Umfang entfernt, daß bei der nachfolgenden Elution nach Zugabe von z. B. 15 ml Slutionsflüssigkeit I (4,0 mol/1 IJaCl /0,05 mol/1 Natriumzitrat /pH 7,0) die zur Preisetzung des Prothrombinkomplexes vom DEAE-Sephadex-Gel erforderliche liatriumchloridkonzentration von maximal 0,55 - 0,60 mol/1 erreicht wird· Die Abtrennung des Eluats I erfolgt durch Überdruckfiltration (0,15 MPa, 10 min). Nach Zugabe von z. B. 30 ml Elutionsflüssigkeit II (0,50 mol/1 UaCl /0,02 mol/1 Uatriumzitrat /pH 7,0) und Abtrennung derselben durch Überdruckfiltration werden insgesamt 60 - 65 ml des Konzentrates der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X erhalten. Mittels einer automatischen Dosiervorrichtung werden je therapeutische Einzeldosis 2,5 bis 3»5 ml des Konzentrates unmittelbar nach dessen Abtrennung portioniert und abschließend lyophilisiert. In einem Anwendungsvolumen von 10 ml/therapeutische Sinzeldosis sind etwa 200 bis 250 Einheiten Paktor II, IX und X in einer isotonischen Ьіз geringgradig hypertonischen Lösung vorhanden. Dadurch kann auf eine Entsalzung der Konzentrate durch Gelfiltration oder Dialyse vor der Lyophilisation verzichtet werden. Es werden Ausbeuten von 55 - 60 % und eine 25 - 30-fache Anreicherung dar Gerinnungsfaktoren und eine bis zu 120-fache auf Protein bezogene Anreicherung erreicht. Die Gesamtprozeßzeit beträgt 4 bis 4,5 Stunden.

4.2. Zentrifugalfiltration I

Die Elution erfolgt mit den Elutionsflüssigkeiten I und II. Fach Beendigung das Auswaschens wird im DEAE-Sephadex-Gel durch Zentrifugieren der Trenneinrichtung ein reproduzierbar konstanter Flussigkeitsgehalt erreicht. Uach Zugabe von 15 ml Elutionsflüsaigkeit I wird die Trenneinrichtung 15 min in einem Temperierbad bei O⁰C geschüttelt und anschließend in einer Kühlzentrifuge bei O⁰C 20 bis 25 min bei 800 bis 2000 U/min zentrifugiert.

Bei der 1. Elution werden in einem Konzentratvolumen von 45 - 50 ml bereits Ausbeuten von 60 - 65 % erreicht·

Die Weiterverarbeitung des Konzentrates erfolgt wie unter 4.1· beschrieben. Durch eine 2, Elution mit 30 ml Eiutionsflüssigkeit II kann die Ausbeute um ca· 5 % erhöht werden*

4·3· Zentrifugalfiltration II

Hach Beendigung des Auswaschens wird durch Überdruckfiltration (0,15 MPa, 10 min) überschüssige Waschflüssigkeit entfernt. Bei der Elution werden zunächst 15 ml Elutionsflüssigkeit I, anschließend 30 ml Elutionaflüssigkait II in die Trenneinrichtung überführt und diese 20 min auf einer geeigneten Vorrichtung bei Raumtemperatur geschüttelt· Die Hauptmenge des Eluats (ca. 70 -75 %) wird durch Überdruckfiltration (0,15 MPa, 10 min) entfernt. Anschließend wird durch Zentrifugalfiltration (30 min, 2000 U/min, 10⁰C) das restliche Sluat abgetrennt und mit dem durch Überdruckfiltration erhaltenen vereinigt«

Im Mittel werden 83 + 3 ml Prothrombinkomplaxkonsentrat erhalten. Eine Sterilfiltration der nach 4.1. bis 4.3· abgetrennten Sluate entfällt, da alle Verfahrensstufen in geschlossener Anordnung unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden· Je therapeutische Einzeldosis werden 3,0-3,5 al Eluat portioniert. In einem Anwendungsvolumen von 10 ml/therapeutische Einzeldosis sind 200 - 250 Einheiten Faktor II, Ei und X in einer geringgradig hypertonischen Lösung vorhanden, sоdaß eine Entsalzung des Eluates vor dem Portionieren nicht notwendig ist.

In Abhängigkeit von der Menge eingesetzter Elutionsflüasigkeit können Konzentrate hergestellt werden, die 90 - 100 Einheiten Faktor II, IX und X je ml enthalten·

Claims (5)

1. Srfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung eines Prothrombinkomplexkonzentratea aus Humanplasma durch Adsorption an organischen Ionenaustauschern gekennzeichnet dadurch, daß

   - zur Adsorption Humanplasma mit einem Volumen von 44.0 - 480 ml eingesetzt wird,

   - die Adsorption in 3ilikonisierten Blutkonsarvenflaschen, die mit einer Geschwindigkeit von 4 - 12 U/min rotieren, bei Raumtemperatur erfolgt,

   - nach der Adsorption der Plasmaübersxand durch Zentriiugation abgetrennt wird,

   - das Inertprotein in einem stufenweisen Waschprozeß mittels 0,2 mol/1 NaGl /0,01 mol/1 Natriumzitrat-Waschflüssigkeit entfernt wird,

   - anschließend durch die Zugabe von 4,0 mol/1 NaCl /0_f05 mol/1 !Tatriumzitrat-Elutionsf lüssigkeit eine HaC!-Konzentration von maximal 0,55 - 0,60 mol/1 eingestellt wird,

   - nach dem Abtrennen des Sluatos I die Elution mit 0,30 raol/' HaCl /0,02 mol/1 ITatriumzitrat-Slutionsf lüssigke it fortgesetzt und beide Eluate vereinigt werden,

   - die je Einzeldosis portionierte Eluatmenge 25 - 37 % ihres therapeutischen Anwendungsvolumen beträgt,

   - alle Verfahrensstufen unter aseptischen Bedingungen in geschlossener Anordnung durchgeführt werden und durch abschließende Lyopniliaation das Konzentrat der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und Z gewonnen wird.-
2. 2. Verfahren nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, dai3 die Abtrennung dea Prothrorabinkomplexkonzentrates vom Adsorptionsmittel DEAE-Sephadex A-50 vorzugsweise durch Zentrifugalfiltration erfolgt.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, daß die Preis ätzung des Prothrombinkomplexes einsxufig und die Abtrennung des Prothrombinkoraplezkonzentrates als ein Bluat durch Überdruckfiltration und anschließender Zentrifugalftitration erfolgt.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß zur Isolierung des Prothrombinkompiexkonzentrates vorzugsweise die Plasmaüberstände der Humanplasmafraktion Кгз?о-präzipitat eingesetzt werden«
5. 5. Verfahren nacn Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß zur Isolierung des Prothrombinkomplexkonzentrats die Plasraaüberstände der Humanplasmafraktion Cohn I eingesetzt werden können.