CZ76393A3 - Micro-biological process for preparing derivatives of malonyl-7-aminocephalosporanic acid - Google Patents

Micro-biological process for preparing derivatives of malonyl-7-aminocephalosporanic acid Download PDF

Info

Publication number
CZ76393A3
CZ76393A3 CZ93763A CZ76393A CZ76393A3 CZ 76393 A3 CZ76393 A3 CZ 76393A3 CZ 93763 A CZ93763 A CZ 93763A CZ 76393 A CZ76393 A CZ 76393A CZ 76393 A3 CZ76393 A3 CZ 76393A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
aminocephalosporanic acid
microorganisms
malonyl
formula
soluble salts
Prior art date
Application number
CZ93763A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ279523B6 (cs
Inventor
Sabine Dipl Biol Schurr
Andreas Dr Tschech
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of CZ76393A3 publication Critical patent/CZ76393A3/cs
Publication of CZ279523B6 publication Critical patent/CZ279523B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D505/00—Heterocyclic compounds containing 5-oxa-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
    • C07D505/10—Heterocyclic compounds containing 5-oxa-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
    • C07D505/12—Heterocyclic compounds containing 5-oxa-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 substituted in position 7
    • C07D505/14—Heterocyclic compounds containing 5-oxa-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 substituted in position 7 with hetero atoms directly attached in position 7
    • C07D505/16—Nitrogen atoms
    • C07D505/18—Nitrogen atoms further acylated by radicals derived from carboxylic acids or by nitrogen or sulfur analogues thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Mikrobiologický způsob přípravy derivátů kyseliny ma lony 1--7-ami;nocefalosporanové
Oblast techniky , ~ ~
Vynález se týká nových derivátů kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové nebo jejich rozpustných solí obecného vzorce III
HOOC-CH.
Clil)
I (
COOH kde R znamená atom vodíku, hydroxylovou skupinu nebo acetcxyskupinu, nového způsobu jejich přípravy z odpovídajích derivátů cefalosporinu C, jakož i nových mikroorganismů vhodných pro tento způsob. Dále se vynález týká nového mikrobiologického způsobu přípravy derivátů kyseliny 7-aminocefalosporanové z derivátů kyseliny malonyl-7-aminocefalosporanové, jakož i nového použití mikroorganismů rodu Pseudomonas sp. CDSM 7509).
V následujícím textu se pod pojmy deriváty kyseliny malony1 7-aminocefalosporanové C vzorec III ), deriváty cefalosporinu C (vzorec IV), malony1-lakton vzorce II a lakton vzorce I rozumějí také jejich rozpustné soli, jako například jejich amonné nebo alkalické soli.
Dosavadní st.av techniky
Deriváty kyseliny ma1 onyl-7-aminocefa 1osporanové mohou například sloužit jako výchozí materiál pro přípravu derivátů kyseliny 7-aminocefalosporanové. které jsou zase důležité výchozí sloučeniny pro přípravu cefalosporinových antibiotik podle J. Bacteriol., 1987. sv. 169, č. 12. str. 5815-5820.
Až dosud nebyly.známé ani chemické ani mikrobiologické způsoby přípravy der ivátů‘kyše 1 iny malony1-7-aminocefa 1osporanové.
Je známo více mikrobiologických způsobů přípravy kyseliny 7-aminocefalosporanové z cefalosporinu C. 3ako je například popsáno
- X v JP-A 62 48380. Nedostatek všech těchto způsobů však spočívá v tom, že nejsou použitelné v průmyslovém měřítku.
Podstata vynálezu
Úkolem vynálezu je poskytnout pomocí nových mikroorganismů nový, jednoduchý a ekonomický mikrobiologický způsob přípravy nových derivátů kyseliny malonyl-7-aminocefalosporanové- Dalším úkolem je poskytnout s těmito novými deriváty nový mikrobiologický způsob přípravy derivátů kyseliny 7-aminocefalosporanové.
Tento úkol se podle vynálezu řeší pomocí nových mikroorganismů podle patentového nároku 1, pomocí nového způsobu podle patentového nároku 3, pomocí nových derivátů kyseliny malonyl-7amínocefalosporanové podle patentového nároku 8 a pomocí nového způsobu podle patentového nároku 10.
Mikroorganismy podle vynálezu se vyberou selekcí tak, že jsou schopné zužitkovat lakton vzorce I
dusíku a energie přes
Cl j jako jediný zdroj uhlíku vzorce II ma1 ony 1-1akton
Cil) a posledně jmenovaný nekatabo1 izovat.
Tyto mikroorganismy jsou vybrány selekcí s laktonera vzorce I pomocí tradičních mikrobiologických technik, například z různých půdních vzorků. Jestliže se tedy pěstují mikroorganismy z půdních vzorků jako inokulum s laktonem vzorce I, získají se mikroorga3 nismy. které jsou schopné s ním růst jako jediným zdrojem uhlíku, dusíku a energie. Z těchto mikroorganismů se pak vyberou selekčními metodami běžnými v oboru takové, které přeměňují lakton vzorce I na malonyl-lakton vzorce II a které ho nekatabolizují.
Pro selekci důležitý lakton vzorce I lze získat z komerčního desacetylcefalosporinu C. K tomu se desacetylcefalosporinu C nejprve známým způsobem laktonizuje na odpovídající lakton podle Jefferay a spol., Biochem.J., 1961, 81, str. 591. Pro tvorbu požadovaného laktonu s rozštěpeným laktamovým kruhem vzorce I se pak laktamový kruh štěpí metodami užívanými v oboru například pomocí pěnic i 1inázy.
V zásadě jsou vhodné všechny mikroorganismy, které získají takovým selekčním postupem. Tyto mikroorganismy nejsou v literatuře popsány a jsou součástí vynálezu. Selekcí se účelně získají mikroorganismy s označením FBI CDSM 7007) jakož i jejich mutanty a descendenty. Tyto mikroorganismy byly uloženy 25.3.1992 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH. Mascher oderveg lb, D-3300 Braunschveig.
Po prioritě této přihlášky byly mikroorganismy identifikovány 16 S RNA-analýzou jako mikroorganismy náležející k Sphinaomonas sp.
Vědecký popis Sph i nctomonas sp. FBI CDSM 7007) buněčná forma šířka pm délka ym drobné tyčinky 0,4-0,6 0,3-1,5 pohyb 1ivcst mrskání polárně 1
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH aminopeptidáza CCerny) spory oxidáza kataláza hlavní chinonová složka: ubichinon Q10 složení bází DNA podle HPLC-rychlé metody: 63 mol -¾ G*C.
Selekce a růst se obvykle provádí v médiu obsahujícím minerální soli, účelné v médiu obsající minerální soli. jehož složení je uvedeno v tabulce I (a a b). Pro pěstování mikroorganismů po uskutečněné selekci jsou vsak použitelná rovněž jiná média, jako například komerčně běžně užívaná plná media“.
Pro pěstování a selekci se účelně přidá lakton vzorce I v množství od 0,2 do 1 % hmotn.. výhodně od 0,3 do 0,6 % hmotn. do média obsahujícího minerální soli.
Během selekce a pěstování je teplota účelně mezi 0 a 60 °C, výhodně mezi 20 a 40 °C.
Selekce a pěstování se účelně uskutečňují při pH od 5 do 9, výhodně od 6 do 8.
Jestliže se dosáhne účelné optické hustoty při 650 nm CODeso) od 0,1 do 1, lze mikroorganismy sklízet v oboru běžnými metodami a použít pro způsob podle vynálezu.
Mikroorgansimy získané touto selekcí se podle vynálezu použiji ve způsobu podle vynálezu pro přeměnu derivátů cefalosporinu C obecného vzorce IV
kde R znamená atom vodíku, hydroxylovou skupinu nebo acetoxyskupinu, jako substrátu na deriváty kyseliny na 1 ony 1-7-aminocefa 1osporanové obecného vzorce III 0 Η
II h
HOOC—CH^—1C-S \Χ^-<:η2-η
Clil)
COOH kde R má uvedený význam.
Způsob se účelně provádí s mikroorganismy Sphinqomonas so. FBI CDSM 7007) získanými selekcí nebo jejich descendenty a mutanty, které jsou uloženy, jak již bylo popsáno.
Obvykle se způsob provádí v oboru běžným způsobem s nerostoucími buňkami.
Jako substráty slouží deriváty cefalosporinu C obecného vzorce IV, kde R má uvedený význam. Jako substrát účelně slouží csfalosporin C CR znamená acetoxaskupinu v obecném vzorci III).
Substrát se pro způsob může přidávat jednorázově nebo kontinuálně. Přidání substrátu se účelně provádí tak. aby koncentrace substrátu v kultivačním médiu nepřesáhla 20 % hmotn., výhodně 4 hmotn.
Pro způsob lze použít média běžně užívaná v oboru. Výhodně se způsob provádí v nízkomolárním HEPES-pufru Ckyselina 4-(2-hydroxyethyl )piperazin-l-ethan-sulfonová) .
Způsob se obvykle provádí se suspenzí mikroorganismů o optické hustotě OD 650 od 1 do 100, výhodně od 2 do 50.
Způsob se účelně provádí při teplotě od 0 do 60 °C, výhodně od 20 do 40 °C a při hodnotě pH od 5 do 9, výhodně od 6 do 8.
Po obvyklé reakční době od 1 do 24 hod. se pak mohou dosud nepopsané deriváty kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové obecného vzorce III izolovat obvyklým způsobem. Jako výhodný zástupce derivátů kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové se izoluje kyselina maIony1-7-aminocefalosporanové CR znamená acetoxyskupi nu v obecném vzorci III).
Způsob podle vynálezu pro výrobu 7-aminccefa 1ospcranové obecného vzorce V derivátů kyseliny
\^X^ch2-r
CV)
COOH kde R má uvedený význam, spočívá v tem, že se deriváty kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové nebo její rozpustné soli obecného vzorce III jako substrát přeměňují pomocí mikroorganismů rodu Pseudomonas so. CDSM 7509) nebo jejich descendentů a mutantů nebo pomocí bezbuněčných enzymů z těchto mikroorganismů na produkt vzorce V.
Mikroorganismy Pseudomonas sp. CDSM 7509) byly 5.3.1993 uloženy u Německé sbírky mikroorgansimů a buněčných kultur GmbH, Mascheroderveg lb, D-3300 Braunschveig.
Tyto mikroorganismy jsou známé a popsané v JP-A 62 483 80 jako mikroorganismy Pseudomonas sp. SE-495 CFERM BP-818). Podle JP-A 62 483 80 se tyto mikroorganismy podrobí selekci tak, že hydrolyzuji kyselinu glutary1-7-cefalosporanovou na kyselinu 7-aminocefalosporanovou. Použití těchto mikroorganismů pro hydrolýzu kyseliny malony1-7-aminocefalosporanovou není popsáno.
Předložený vynález se proto také týká použití těchto mikroorganismů k hydrolýze derivátů kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové (vzorec V), výhodně kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové CR je acetoxy-).
Tento způsob se účelně provádí buď s buňkami mikroorganismů upravenými tak, aby byly permeabilní nebo s bezbuněčným enzymovým extraktem, obvzláště s bezbuněčným enzymovým extraktem.
Pro přípravu bezbuněčného enzymového extraktu se mohou použít v oboru běžné metody, jako například použití ultrazvuku nebo Prenchova tlakového zařízení.)
Jako substráty se používají deriváty kyseliny malonyl-7aminocefalosporanové obecného vzorec V, kde R má uvedený význam. Jako substrát se účelně používá kyselina malony1-7-aminocefalosporanová CR je acetoxy-).
Substrát lze přidávat jednorázově nebo kontinuálně, účelně tak, aby koncentrace substrátu v kultivačním médiu nepřesáhla % hmotn.. výhodně aby nepřesáhla 2 £ hmotn.
Pro tento způsob se jako média mohou použít v oboru obvyklá živná média.
Jestliže se způsob provádí s bezbuněčným enzymovým extraktem. je koncentrace proteinů tohoto extraktu účelně 0,1 až 20 g na 1. výhodně 1 až 5 g na 1.
Způsob se účelně provádí při teplotě od 4 do 50 °C, výhodně od 20 do 35 °C a při hodnotě pH od 4 do 9. výhodně od 7 do 8.
Po běžné reakční době od 3 do 24 hod. se pak mohou izolovat deriváty kyseliny 7-aminocefalosporanová vzorce V.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace Mikroorganismů
Ke 100 ml média s minerálními solemi (tabulka 15 , pH 7,0, obsahujícího 5 mmolární lakton (0,5 mmo1/100 ml 5 s rozštěpeným laktamovým kruhem (vzorec 15 se přidají různé vzorky půdy z okolí Visp ve Švýcarsku jako ínokulum. Kultury se inkubují při 25 °C na trepacím zařízení při 140 otáčkách za min. Tyto kultury se 4krát přeočkují na čerstvé médium obsahující minerální soli a pak se testují na uvedenou laktonovou reakci pomocí analytické vysokotlaké kapalné chromatografie HPLC.
Tyto kultury se pak inkubují na agarových destičkách s médiem obsahujícím minerální soli, 5 mmolární lakton (vzorec 15 při 25 °C. Pak se izoluje bakteriální kmen Sphlngomonas sp. F31 (DSM 70075, který během růstu z tohoto laktonu tvoří malonyllakton vzorce II a ten úplně neodbourává.
Příklad 2
Tvorba kyseliny ma1 ony 1-7-aminocefalosporanové (vzorec III)
Mi kroornani smy ‘Šohinocmonas sp. FB1 (DSM v médiu s minerálními solemi, pH 7,0 (tabulka 5 mmolární lakton (vzorec 15 až k ODeso = 0,44
70075 se pěstují lb) obsahujícím během 4 dnů. (Po prvních 2 dnech se leště jednou přidá tento lakton, takže celková koncentrace ie 1 mmol laktonu na 100 ml média). Pak se buňky odstředí a buněčná peleta se resuspenduje ve 20 ml 10 mmolárního
HEPES-pufru, pH 7,0, přičemž se nastaví CDeso na hodnotu 2.2.
K této buněčné suspenzi se přidá 0,4 mmol ceřalosporinu C (vzorec IV). Buněčná suspenze se inkubuje na třepačce (140 otáček za min.) při 25 °C.
Po 30 min.. 2.25 hod., 5,0 hod. a 24 hod. se pokaždé vzorek testuje pomocí HPLC-analýzy.
Rychlost tvorby kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové je při 2.25 hod.: 410 mg/1/h/ODeso Po 5 hod. se analyticky prokázalo 142 mg kyseliny malonyl7-aminocefalosporanové, což odpovídá 99 %ní reakci cefalosporinu C. Kyselina malonyl-7-aminocefalosporanová se izoluje preparativní chromatografií HPLC ve 40 %ním výtěžku.
Příklad 3
Identifikace kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové (vzorec III)
Pro identifikaci produktu (vzorec III) se smísí 500 ml média s minerálními solemi (tabulka 1), pH 7,0. s roztokem laktonu vzorce I tak, aby byla konečná koncentrace 5 mmolární. Pak se tento roztok inokuluje při 25 °C a 140 otáčkách za min. s předkulturou. jejíž hodnata ODeso je 0,5. Po jednom dni se ještě jednou přidá 5 mmol laktonu (vzorec I) na 500 ml média. Když se dosáhne hodnoty ODesa 0,5, buňky se sklízejí. Pak se buněčná peleta resuspenduje v 30 ml 10 mmolárního HEPES-pufru, pH 7,0, obsahujícím 0,6 mmol cefalosporinu C (vzorec IV). Po petihodinové inkubaci při 25 °C, 140 otáčkách za min. se buňky odstředí a ze supernatantu se vyčistí kyselina malony1-7-aminocefalosporanová pomocí preparativní chromatografie HPLC. Vyčištěné vzorky se přes noc lyofi lizu jí a lyofilizát se analyzuje pomocí NMR <αΗ a 130.
Srovnáním s chemicky připravenou referenční látkou (připravená z kyseliny 7-aminocefalosporanové podle Bul 1.Soc.Chem.Belg. , 1977, 86, str. 991-1002) se prokázala tvorba kyseliny malonyl-7amínocefalosporanové.
Sodná sůl kyseliny raalony1-7-aminocefalosporanové Cchem. standard) 13C-NMR CDMSO, 100.5 MHz, δ v ppm):
20.s:25,s:40,m:58,d;64.s:112.s:134,s:164,d:170,t.
Kyselina malony1-7-aminocefalosporanová Cpodle vynálezu) 13C-NMR CDMSO, 100,5 MHz. δ v ppm):
, s : 25 , s : 40 , m; 58 , d: 64 , s : 112, s ; 134. s : 164. d: 170, t.
1H-NMR Cchem. standard, DSMO. 400 MHz, δ v ppm):
20,s:2,5,s; 3,0,t: 3,5.m:4,8,d:5,0,d:5.6.d.
1H-NMR Cpodle vynálezu):
2,0,s;2,5,s;3,0,t;3.5,m;4,8,d;5,0.d;5,6. d.
Příklad 4
Laktonizace desacetylcefalosporinů
Lakton desacetylcefalosporinu C se připraví z desacetylcefalosporinu C CCiba-Geigy AG, Basel) následujícím způsobem:
100 g desacetylcefalosporinu C se rozpustí v 1 1 20 mmolárním natriumfosfátovém pufru, pH 7,0. K tomuto roztoku se přidá iontoměnič CDOWEX 50X8 CFluka)CH^-forma)) až se dosáhne hodnoty pH 2,5. Po 10 min. míchání C250 otáček/min-, teplota místnosti) se iontoměničová pryskyřice odfiltruje a pH roztoku se upraví koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 0,8. Po 1 hod. míchání Cteplota místnosti, 250 otáček/min.) se do reakčního roztoku přidá DOWEX 1X8 Cacetátová forma)CFluka) až se dosáhne hodnota pH od 3,0-3,2.
Pak se míchá při teplotě místnosti další 1.5 hod. při 250 otáčkách/min. a pak se iontoměničová pryskyřice odfiltruje. Pak se znova přidá DOWEX 1X3 Cacetátová forma), až se dosáhne hodnota pH od 3,3-3,5. 1 hod.míchá Cteplota místnosti,250 otáček/min.) a pak se iontoměničová pryskyřice odfiltruje. Reakční roztok se zahustí do sucha na rotačním odpařovacím zařízení C3kPa, 30 °C).
K odstranění vzniklé kyseliny octové se produkt po odpaření rozpustí ve vodě, až se získá 35 %ní roztoka pak se upraví pH koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 1,5.
Takto získaný roztok se 2x extrahuje ethylacetátem Cstejný objem jako má roztok). Vodné fáze se spojí a upraví se pH 3 mo10 lárním roztokem KOH na hodnotu 3,5 a zahustí se na rotačním odparovacím zařízení C3kPa, 30 °C). Produkt se pak ještě úplně vysuší v sušičce při vakuu C3kPa, 20 °C5 .
Celkový výtěžek je 60 g, což odpovídá 60 %nímu výtěžku ze
100 g desacetylcefalosporinu C.
Příklad 5
Příprava laktonu s rozštěpeným laktamovým kruhem (vzorec 15
K přípravě laktonu (vzorec 15 se lakton desacetylsporinu C v zásobním roztoku 6 C tabulka la 5 nechá reagovat s (3-laktamázou, pěnici 1inázou E.C.3.5.2.6.CSigma). Reakce začne hned po přidání pěnic i 1inázy- Během reakce se udržuje hodnota pH na 7,0 přidáním 1 normálního roztoku NaOH. Reakce je ukončena, jakmile se dosáhne konstantní hodnoty pH 7.0 bez přidání NaOH. Po skončení reakce Cca. 2 hod.5 se roztok sterilně filtruje CO,2 um filtr) a uskladňuje při -80 °C.
Příklad 6
Tvorba kyseliny 7-aminocefalosporanově (vzorec V)
Mikroorganismy Pseudomonas sp. SE-495 CDSM 7509; FERM BP-8185 se pěstují při 30 °C přes noc v živném médiu CpH 7,05, které obsahuje 0,2 % hmotn./obj. masového extraktu. 0,2 % hmotn./obj. extraktu kvasnic, 0.5 % hmotn./obj. peptonu, 0,5 % hmotn./obj. glutamátu sodného a 0,005 % hmotn./obj. síranu hořečnatého. Tyto kultury se preočkují do čerstvého živného média o stejném složení (očkované množství: 10 a 2 až 4 dny se inkubuj í .
Pak se buňky sklízejí centrifugováním C20 min. při 600 otáčkách/min.5, resuspendují v 0,1 molárním pufru fosforečnanu draselného a odstředí (to celé pokaždé třikrát s 10 £ objemu kultury). Pak se buněčná peleta resuspenduje v nejmenším možném množství pufru fosforečnanu draselného a za chlazení ledem se ozáří ultrazvukem ClOkrát na každých 30 sec.; přestávka pokaždé 20 sec.5. 2 tohoto surového extraktu se pak oddělí buněčné zbyt11 ky odstředěním <20 min. při alespoň 10 000 otáčkách/min.)
Pro tvorbu kyseliny 7-aninocefalosporanové se tento surový extrakt (koncentrace proteinu 2 mg/ml) zahřeje na teplotu místnosti a pak se přidá kyselina malonyl-7-aminocefalosporanové v pufru fosforečnanu draselného v 5 mmolární koncentraci. Celé se to inkubuje v klidu při 25 °C a během 24 hod. se zjistuje tvorba kyseliny 7-aminocefalosporanové.
Analýza se provádí chromatografií na tenké vrstvě (destička silikátový gel 60 F245 , vyvíjecí směs: butanol-raethanol-ledová kyselina octová-voda v poměru 50:30:3=17). Tvorba kyseliny 7-aminocefalosporanové Chodnota Rf- 0.51) z kyselina malonyl-7aminocefalosporanové (Rf: 0,43) se prokáže buď při UV vlnové délce 254 nm nebo po postříkání fluramovým činidlem (3 mg fluramu; Fluka CH-9470 Buchs v 10 ml acetonu) při UV vlnové délce 366 nm.
Po přibližně 14 hod. se tímto surovým extraktem , který obsahuje jako enzym acylázu kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové , prokázalo 50 az 100 μποί kyseliny 7-aminocefalosporanové.
Tabulka 1
a) Zásobní roztoky médií s minerálními solemi
Zásobní roztok 1=
NaHs P04 -2H2 0
NH^Cl
K2SÍÍ4 destilovaná voda
156,0 g 10.0 g 1,2 g
500,0 ml
Zásobní roztok 2-
kyšelina p-aminobenzoová 8.0 mg
D-biotin 2.0 mg
kyselina nikotinová 20.0 mg
D-panthothenát vápenatý 10.0 mg
pyr i doxa1hydroc h1or i d 30.0 mg
thiaraindichlorid 20.0 mg
kyanokoba1am i n 10,0 mg
deštilivaná voda 100,0 ml . sterilně filtrovat
Zásobní roztok 3:
HC1 <37 30 7.0 m 1
FeClz -4H20 1,5 9
ZnCl2 0,07 g
MnCl2 . 4H20 0.1 g
h3 bo3 0.006 g
CoC12.6H2 0 0,19 g
CuCl2.7H20 0,002 g
NíC12,6H20 0,024 g
Na2Mo04-2H20 0.036 g
deštilovaná voda 1000,0 ml, autok1ávovat, 121 °C, 20 min.
Zásobní roztok 4’-
NaOH 0.5 g
Na2 Se03. 5H2 0 0,003 g
Na2VCL,. 2H2 0 0,004 g
desti 1 ováná' voda
1000,0 ml, autoklávovat,
121 °C. 20 min.
aútoklávovát.
Zásobní roztok 5·'
MgCl2-6H20 40.0 g
CaCl2-2HzO 5,0 g destilovaná voda
200,0 ml.
121 °C, 20 min.
Zásobní roztok 6:
lakton desacetylcefalosporinu C destilovaná voda penicilináza CEC 3.5.2.6.) (Sigma p0389) pH upravit s NaOH na doplnit deštil, vodou na
3,55 g 60,0 ml
1,0 mg <25 000 jednotek)
7,0
100,0 ml
b) příprava média s minerálními solemi
Zásobní roztok 1: 25.0 ml p9 upravit s KOH na
7,0 pak deštil vodou doplnit na 950,0 ml autoklávovat,
121 °C. 20 min.
Po sterilizaci se přidá roztok 2 roztok 3 roztok 4 roztok 5 roztok získaný z příkladu 5
0,5 ml 1,0 ml 1,0 ml 0.5 ml
50,0 ml
Průmyslová využitelnost
Deriváty kyseliny malonyl-7-aminocefalosporanové mohou například sloužit jako výchozí materiál pro přípravu derivátů kyseliny 7-aminocefalosporanová. které jsou zase důležité výchozí sloučeniny pro přípravu cefalosporinových antibiotik.

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Mikroorganismy, které se podrobí selekci tak, že isou schopné zužitkovat lakton nebo jeho rozpustné soli vzorce I
    Cl) jako jediný zdroj uhlíku, dusíku a energie přes nalonyllakton nebo jeho rozpustné soli vzorce II
    Cil)
    Mikroorganismy podle nároku 1 s označením Sphinoomonas sp. FBI DSM 7007 jakož i jejich descendenty a mutanty.
    '3. Mikrobiologický způsob přípravy derivátů kyseliny malonyl-7-aminocefalosporanové nebo jejich rozpustných solí obecného vzorce III v H hooc-ch -c-n
    -a
    I 2
    COOH
    CIII) kde R znamená atom vodíku, hydroxylovou skupinu nebo acetoxyskupinu, vyznačující se tím, že se deriváty cefalosporinu C nebo jejich rozpustné soli obecného vzorce IV kde R má uvedený význam, přemění jako substrát pomocí mikroorganismů podle nároku 1 na produkt vzorce III.
  2. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím že se reakce provádí pomocí mikroorganismů Sphinqomonas so. F31 DSM 7007 nebo jejich descendentů a mutantů.
  3. 5. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 3a4, vyznačující se tím, že se jako substrát použije cefalosporin C
  4. 6. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 3 až 5, vyznačující se tím, že se reakce provádí při jednorázovém nebo kontinuálním přidání substrátu tak, že koncentrace substrátu v kultivačním médiu nepřesáhne 20 % hmotnost n ích.
  5. 7. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 3 až 6. vyznačující se tím, že se reakce provádí při teplotě od 0 do 60 °C a při pH od 5 do 9.
  6. 9. Deriváty kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové nebo jejich rozpustné soli obecného vzorce III ? a.
    HOOC—CH —C—fl
    CH -R
    Clil)
    COOH kde R znamená atom vodíku, hydroxylovou skupinu nebo acetoxyskup i nu.
    9. Kyselina ma1ony1-7-aminocefalosporanové.
  7. 10. Mikrobiologický způsob přípravy derivátů kyseliny 7-aminocef alosporanové nebo jejich rozpustných solí obecného vzorce V
    COOH kde R má význam uvedený v nároku 3, vyznačující se tím. že se deriváty kyseliny malony1-7-aminocefalosporanové nebo jejich rozpustné soli obecného vzorce III jako substrát přemění pomocí mikroorganismů rodu Pseudomonas ss DSM 7509 nebo jejich descendentů a mutantů, nebo pomocí enzymů z těchto mikroorgansimů bezbuněčných vzorce V.
    na produkt
  8. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím že se jako substrát použije kyselina ma1 ony 1-7-aminocefalosporanová.
  9. 12. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 10 a 11, vyznačující se tím. že se reakce provádí při jednorázovém nebo kontinuálním přidání substrátu tak, že koncentrace substrátu v kultivačním médiu nepřesáhne 10 % hmotnost n í ch.
  10. 13. Způsob podle .alespoň jednoho .z nároků 10 až- 12.
    že se reakce provádí při teplotě od 4 do 50 °C a při pH od 4 do 9.
  11. 14. Použití mikroorganismů rodu Pseudomonas sp. DSM 7509 k hydrolýze derivátů kyseliny malonyl-7-aminocefalosporanové nebo jejich rozpustných solí obecného vzorce III na deriváty kyseliny 7-aminocefalosporanové obecného vzorce V.
  12. 15. Použití podle nároku 14. vyznačující se tím že se hydrolyzuje kyselina malonyl-7-aminocefalosporanové na kyselinu 7-aminocefalosporanovou.
CZ93763A 1992-04-29 1993-04-28 Mikrobiologický způsob přípravy derivátů kyseliny malonyl-7-aminocefalosporanové CZ279523B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH138192 1992-04-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ76393A3 true CZ76393A3 (en) 1993-12-15
CZ279523B6 CZ279523B6 (cs) 1995-05-17

Family

ID=4209103

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ93763A CZ279523B6 (cs) 1992-04-29 1993-04-28 Mikrobiologický způsob přípravy derivátů kyseliny malonyl-7-aminocefalosporanové
CZ942264A CZ280145B6 (cs) 1992-04-29 1993-04-28 Způsob přípravy derivátů kyseliny 7-aminocefalosporanové a použití mikroorganismu Pseudomonas k hydrolýze těchto derivátů

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ942264A CZ280145B6 (cs) 1992-04-29 1993-04-28 Způsob přípravy derivátů kyseliny 7-aminocefalosporanové a použití mikroorganismu Pseudomonas k hydrolýze těchto derivátů

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5338667A (cs)
EP (1) EP0568004A2 (cs)
JP (1) JPH0646835A (cs)
KR (1) KR930021796A (cs)
CN (1) CN1077989A (cs)
CA (1) CA2095166A1 (cs)
CZ (2) CZ279523B6 (cs)
LT (1) LT3122B (cs)
LV (1) LV10315B (cs)
MX (1) MX9302238A (cs)
TW (1) TW241265B (cs)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1065278C (zh) * 1994-08-27 2001-05-02 中国科学院上海植物生理研究所 一步两酶法制造7－氨基头孢烷酸
JP2004515355A (ja) 2000-12-11 2004-05-27 ユナイテッド・ステイツ・フィルター・コーポレイション 臭気抑制用活性炭およびその製法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5170884A (en) * 1974-12-12 1976-06-18 Toyo Jozo Kk 77 amino sefuemukagobutsuno seizohoho
DK158316C (da) * 1974-01-23 1990-10-08 Toyo Jozo Kk Fremgangsmaade til fremstilling af 3-substituerede 7-amino-3-cephem-4-carboxylsyrederivater
FR2434169A2 (fr) * 1978-06-22 1980-03-21 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Nouveaux derives reactifs de l'acide penicillanique et de l'acide cephalosporanique et procede pour leur preparation
JPS6248380A (ja) * 1985-08-28 1987-03-03 Asahi Chem Ind Co Ltd セフアロスポリンｃアシラ−ゼの製造法
JPH06248380A (ja) 1993-02-23 1994-09-06 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 積層型熱交換器及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
LV10315B (en) 1995-06-20
CZ280145B6 (cs) 1995-11-15
MX9302238A (es) 1993-10-01
EP0568004A2 (de) 1993-11-03
CZ279523B6 (cs) 1995-05-17
LV10315A (lv) 1994-10-20
EP0568004A3 (cs) 1994-03-23
LTIP499A (en) 1994-07-15
JPH0646835A (ja) 1994-02-22
KR930021796A (ko) 1993-11-23
LT3122B (en) 1994-12-27
TW241265B (cs) 1995-02-21
CZ226494A3 (en) 1995-02-15
CN1077989A (zh) 1993-11-03
US5338667A (en) 1994-08-16
CA2095166A1 (en) 1993-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3233476B2 (ja) Ｆｏ−１２８９物質およびその製造法
US4774179A (en) Process for preparing a 7-aminocephalosporanic acid compound
CZ279790B6 (cs) Mikrobiologický způsob výroby hydroxylovaných de rivátů pyrazinu
US4111749A (en) Method of converting racemic hydantoins into optically active aminoacids
US3436310A (en) Hydrolysis of the acetoxymethyl group at the 3-position of the cephalosporin nucleus
US4517299A (en) Acetylesterases
US4764606A (en) 7-formylaminocephalosporin compounds
CZ279492B6 (cs) Mikrobiologický způsob výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové
KR100274205B1 (ko) 질소-헤테로사이클릭-카르복시산의 미생물학적 히드록시화 방법
CZ76393A3 (en) Micro-biological process for preparing derivatives of malonyl-7-aminocephalosporanic acid
US5108914A (en) Process for the synthesis of l-alpha-amino acids
GB1566088A (en) Hydrlases for the hydrolysis of racemic hydantoins
JP2816167B2 (ja) α−アミノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
CZ281198A3 (cs) Způsob výroby N-chráněných derivátů D-prolinu
US6214604B1 (en) Biotechnical production process of piperazine R-α-carboxylic acids and piperazine S-α-carboxylic acid amide
US4992570A (en) UCN-1028A and UCN-1028C and process for the production thereof
EP0290136A2 (en) 7-Beta-substituted-3-lower alkanoylacetoxymethyl-7-alpha-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid and process for production of same
JPH08332094A (ja) アルカリゲネス属の微生物を利用してヘテロ芳香族カルボン酸を製造する微生物学的方法
SU799668A3 (ru) Способ получени 7-метоксицефалоспори-HOB или иХ СОлЕй
KR100260837B1 (ko) 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법
EP0912751B1 (de) Verfahren zur herstellung von d-prolinderivaten mittels mikroorganismen
CA2163602A1 (en) Di-and trisubstituted pyridines and their preparation
JP2002017386A (ja) インドール−３−カルボン酸誘導体の製造法
JPH04248989A (ja) ８−ヒドロキシカルボスチリル及び／または８−ヒド　　　　　　　　　　　　ロキシクマリンの製造方法
NO147452B (no) Hydrolasepreparat for fremstilling av d-fenylglycin ved enzymatisk omdannelse av d,l-fenylhydantoin