LV10315B - Microbiological process for preparing of derivatives of malonyl-7-aminocephalosporanic acids - Google Patents

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LV10315B LVP-93-267A LV930267A LV10315B LV 10315 B LV10315 B LV 10315B LV 930267 A LV930267 A LV 930267A LV 10315 B LV10315 B LV 10315B
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Description

LV 10315
MlkLObJoloaisches Verfahren zur Herstellung von Molonvl-7-Amlno-ceDhoJosDoransāure-Derlvaten
Die Erfindung betrlfft neue Malonyl-7-Amlnocephalo$poransāure-Derivate oder deren lāsliche Salze der allgemeinen Formel
worln R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder elne Acetoxygruppe bedeutet, eln neues Verfahren zu deren Herstellung ausgehend von den entsprechenden Cephalosporln C-Derlvaten sowie neue fūr das Verfahren geelgnete Mlkroorganlsmen.
Des vveiteren betrifft die Erfindung eln neues mikrobiologlsches Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansāure-Derivaten ausgehend von Malonyl-7-Amlnocephalosporansdure-Derivaten sowle die neue Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Pseudomanas sd. (DSM 7509).
Im folgenden wird als Malonyl-7-Aminocephalosporansdure-Derivate (Formel III), als Cephalosporln C-Derivate (Formel IV), als Malonyl-lacton gemāss Formel II und als lacton gemāss Formel I auch deren lāsliche Salze, wie beispielsweise deren Ammonium- oder Alkalisalze verstanden.
Malonyl-7-Aminocephalosporansāure*Derivate kānnen beispielsweise als Ausgangsmaterial zur Herstellung von 7-Aminocephalosporans0urerDerivaten dienen, vvelche vviederum wlchtige Ausgangsverbindungen zur Herstellung von Cephalosporln-Antibiotika sind (J. Bacteriol., 1987, Vol. 169, Nr. 12, S, 5815-5820), 3
Bisher slnd weder chemlsche noch mlkroblologlsche Verfahren zur Herstellung von Malonyl-7-Amlnocephalo$poran$āure-Derlvaten bekannt.
Zur Herstellung von 7-Amlnocepha!osporansāure slnd mehrere mlkroblologlsche Verfahren ausgehend von Cephalosporln C bekannt wle bspw, das In der JP-A 62 46380 beschrlebene. Dlese Verfahren haben Jedoch aile den Nachtell, dass sle grosstechnlsch nlcht gangbar slnd.
Auigabe der Erfindung war mlt neuen Mikroorganlsmen ein neues elnfaches und wirf$chaftliches mlkrobiologisches Verfahren zur Herstellung von neuen Malonyl-7-
Aminocephalosporansāure-Derivaten zur Verfugung zu stellen. Eine vveitere Aufgabe war, mlt diesen neuen Derlvaten eln neues mikroblologisches Verfahren zur 1·
Herstellung von 7-Aminocephalo$porinsāure-Derlvaten zur VerfOgung zu stellen.
Erfmdungsgemdss wird dlese Aufgabe mlt den neuen Mikroorganismen gemāss Patentanspruch 1. mlt dem neuen Verfahren gemdss Patentanspruch 3, mit den neuen Malonyl-7-Amlnocephalo$porans0ure-Derivaten gemāss Patentanspruch 8 und mit dem neuen Verfahren gemāss Patentanspruch 10 gelāst.
Die erflndungsgemāssen Mikroorganismen sind derart selektioniert, dass sle befāhlgt sind, das Lacton der Formel
als einzige Kohlenstoff-, Stickstoff* und Energiequelle Ober Malonyl-lacton der Formel LV 10315
zu verwerten und letzters nicht zu katabollsleren,
Diese Mikroorganlsmen werden mit dem Lacton gemāss Formel I unter Zuhllfenahme traditioneller mlkroblolloglscherīechniken, beisplelsv/else aus dlversen Erdproben, selektiolniert. D.h. zūchtet man aus Erdproben als fnokulum mit dem Lacton gemāss Formel i Mikroorganlsmen an, erhālt man Mikroorganlsmen, die befāhlgt sind, mit diesem als einzlge Kohlenstoff-, Stlckstoff- und Energlequelle zu wachsen. Aus dlesen Mikroorganlsmen werden dann nach fachmānnisch Ciblichen Methoden dle selektlonlert, dle das Lacton gemāss Formel I in Malonyl-Lacton gemāss Formel II ūberfOhren und die letzteres nicht katabollsleren.
Das fūr dle Selektion notwendige Lacton, Formel I, kann aus kduflichem Desacetylcephalosporin C erhalten werden. Hierzu wird zunāchst auf bekannte Weise (Jefferay et al., Biochem. J., 1961,81, S. 591) Desacetylcephalosporin C zum entsprechenden Lacton lactonisiert. Zur Bildung des gewOnschen Lactons mit gespaltenem Lactam-Ring gemāss Formel I wird dann der Lactam-Ring fochmānnisch beispielsweise mittels Penicillinase gespalten.
Prinzipiell sind aile Mikroorganlsmen geeignet, die unter diesem Selektionsdruck erhalten werden, Diese Mikroorganlsmen sind In der Literatur nicht beschrieben und Bestandteil der Erfindung.
Zweckmāssig werden durch die Selektion die Mikroorganlsmen mit der Bezelchnung FBI (DSM 7007) sov/ie deren Mutantenund Deszendenten erhalten. Diese sind am 25.3,1992 bei der Deutschen Sammlung fūr Mikroorganlsmen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, D-3300 Braunschweig, hinterlegt worden.
Dlese Mlkroorganlsmen slnd nach dem Prloritātstag dleser Anmeldung Ober 16 S RNA-Analyse zu SphlnĢomanos sp, gehOrend Identlfiziert worden. VVlssenschaftliche Beschrelbung von Sphlnņomanas sd, FBI (DSM 7007):
Zellform winzlge Stābchen Brelte μτη Lānge μτη 0.4-0.6 0.8-1.5 Bewegllchkelt Geisseln + polar 1 Gram-Reaktlon Lyse durch 3% KOH «· + Aminopeptidas (Cerny) + Sporen Oxldase m + . Catalase. +
Hauptchlnonkomponente: UbichinonQ10 DNA-Basenzusammensetzung nach HPLC-Schnellmethode: 63 mol % G+C. «
Oblicherweise erfolgt die Selektion und die Anzucht in elnem Mineralsalzmedium, zweckm0ssig In einem Mineralsalzmedium, dessen Zusammensetzung in Tabelle I (a und b) angegeben ist. Zur Anzucht der Mikroorganismen nach erfolgter Selektion sind jedoch auch andere Medien, wie beispielsweise handelsubliche Vollmedien, denkbar. LV 10315
Zweckmčs$lg vvlrd zur Anzucht und Selektion dos Locton gemdss Formel I In elner Menge von 0,2 bis 1 Gew%, vorzugsvvelse von 0,3 bis 0,6 Gw%, dem Mlneralsolzmedium hlnzugefūgt.
Die Temperatur liegt zvveckmdsslg vvdhrend der Selektion und der Anzucht zwlschen 0 und 60° C, vorzugswelse zv/lschen 20 und 40° C.
Selektion und Anzucht vverden zweckmāssig bel einem pH von 5 bis 9, vorzugsvvelse von 6 bis 8 durchgefūhrt,
Ist elne zvveckmāssige optische Dichte bel 650 nm (OD 550) von 0,1 bis 1 erreicht, kdnnen die Mikroorganlsmen nach fachmānnisch Oblichen Methoden geerntet und fur das erfindungsgemāsse Verfahren elngesetzt werden.
Erfindungsgemāss werden die auf diese Welse selektionlerten Mikroorganlsmen Im erfmdungsgemāssen Verfahren fOr die Umsetzung von Cephalosporin C*Derivaten der ailgemelnen Formel
IV worln R ein VVassersfoffatom, eine Hydroxylgruppe oder elne Acetoxygruppe bedeutet, als Substrat, zu Malonyl-7-Aminocephalosporansāure-Derivaten der allgemeinen Formel HOOC-CH, 2
COOH worin R die genannte Bedeutung hat, elngesetzt.
III 7
Zv/eckmčsslg wlrd dos Verfahren mlt den selektlonierten Mlkroorganlsmen Sohlngomonas sd. FBI (DSM 7007) oder deren Deszendenten und Mutanten durchgefCihrt, dle wle berelts beschrleben hlnterlegt slnd.
Clbllchervvelse wlrd das Verfahren auf fachmdnnisch Cibliche Welse mit nlcht wachsenden Zellen durchgefCihrt. •
Al$ Substrate dienen Cephalosporln C-Derivate der dllgemelnen Formel IV, worln R die genannte Bedeutung hat. Zvveckmdsslg dient als Substrat Cephalosporln C (R In der allgemelnen Formel III = eine Acetoxygruppe).
Das Substrat kann fūr das Verfahren einmalig oder kontlnulerllch zugegeben werden, Zweckmāsslg erfolgt die Substratzugabe so, dass die Substratkonzentration Im Kulturmedlum 20 Gew%. vorzugswelse 4 Gew%, nlcht Oberstelgt.
Als Medien kbnnen fur das Verfahren fachmdnnisch Cibliche angewendet werden. Vorzugsweise wird das Verfahren in nledermolarem HEPES-Puffer (4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-l-ethan-sulfonsāure) durchgefCihrt. Ūblicherweise wird das Verfahren mit einer Mikroorganismen-Suspension durchgefCihrt, die eine OD 550 von 1 bis 100, vorzugsv/eise von 2 bis 50 aufweist. t·
Das Verfahren wird zvveckmāssig bei einer Temperatur von 0 bis 60° C, vorzugsvveise von 20 bis 40° C und bei einem pH-Wert von 5 bis 9, vorzugsvveise von 6 bis 8, durchgefCihrt.
Nach einer Ciblichen Umsetzungsdauer von 1 bis 24 h kbnnen dann dle bisher nicht beschriebenen Malonyl-7-Aminocephalosporansāure-Derivate gemOss Formel III auf fachmdnnisch Obliche Weise isoliert vverden. Als bevorzugter Vertreter der Malonyl-7* 9
Demnach betrlfft die vorllegende Erfindung auch der Verwendung dleser Mlkroorganlsmen zur Hydrolyse von Malonyl-7-Amlnocephalosporansčure-Derlvaten (Formel V), vorzugsvveise von Malonyl-7-Amlnocephalosporansāure (R = AcetoxyO.
Zvveckmāsslg wlrd dieses Verfahren entweder mlt permeabllislerten Mlkroorganlsmenzellen oder mlt elnem zellfrelen Enzymextrakt durchgefuhrt, insbesondere mlt elnem zellfrelen Enzymextrakt.
Zur Herstellung elnes zellfrelen Enzymextraktes kdnnen fachmdnnisch Cibliche Methoden wle belspielsweise die Behandlung mlt Ultraschall oder mlt ’French-press’ Anwendung fmden.
Als Substrat dlenen Malonyl-7-Amlnocephalosporan$āure-Derivate der allgemeinen Formel V, worin R die genannte Bedeutung hat. Zv/eckmdsslg dient ols Substrat Malonyl-7-Amlnocephalosporansāure (R = Acetoxy·).
Dos Substrat kann elnmalig oder kontinuierlich zugegeben v/erden, zv/eckmdsslg derart, dass die Substratkonzentratlon im Kulturmedium 10 Gew.%, vorzugsweise 2 Gew.% nlcht Oberstelgt.
Als Medien kdnnen fūr dieses Verfahren fochmdnnisch Obliche Ndhrmedien angewendet werden.
Wird das Verfahren mlt einem zellfreien Enzymextrakt durchgefuhrt, vveist die Proteinkonzentration dieses Extraktes zweckmāssig 0,1 bis 20 g pro I, vorzugsvveise 1 bis 5 g pro I, auf. l· LV 10315
Aminocephalosporansdure-Derivate v/trd Malonyl-7-Aminocephalosporans<3ure (R In der allģemelnen Formel III - elne Acetoxygruppe) Isollert.
Dos erfindungsgemdsse Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansāure-Derlvaten der allģemelnen Formel
COOH
V wor!n R die genannte Bedeutung hat, wird derart durchgefūhrt, das$ mdn Malonyl-7-Amlnocephalosporansdure-Derlvate oder deren Idsllche Salze der allģemelnen Formel III, als Substrat, mlttels Mlkroorganlsmen der Gattuna Pseudomonas sp (DSM 7509) oder deren Deszendenten und Mutanten oder mit zellfreien Enzymen aus dlesen Mlkroorganlsmen, In das Produkt gemāss Formel V CiberfOhrt.
Die Mikroorganismen Pseudomonas sd (DSM 7509) šind am 5.3.1993 bel der Deutschen Sammlung fūr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Mascheroderweg 1b, D-3300 Braunschweig, hinterlegt worden.
Diese Mikroorganismen sind bekannt und in der JP-A 62 483 80 als Mikroorganismen Pseudomonas sd. SE-495 (FERM BP-818) beschrieben. Gemdss der JP-A 62 483 80 sind diese Mikroorganismen derart selektioniert, dass sie Glutaryl-7-Aminocephalo-sporansdure zu 7-Aminocephalosporansdure hydrolysieren. Nicht beschrieben ist die
Verwendung dieser Mikroorganismen zur Hydrolyse von Malonyi-7-Aminocephalo-sporansāure. LV 10315
Zw©ckmčisslg wird das Verfahren b©l elner Temperatur von 4 bis 50° C, vorzugsw©I$e von 20 bis 35° C und bel elnem pH-W©rt von 4 bis 9, vorzugsv/els© von 7 bis 8, durchgefūhrt.
Nach ©iner Ciblichen Umsetzungsdauer von 3 bis 24 h kdnnen dann dle 7-Amlnocephalosporansdure-Derlvate gemdss Formel V Isoliert werden. ( l· I* 11
Belsplel 1:
Isolotlon der Mikroorganlsmen
Zu 100 ml Mineralsalzmedium (Tabelle l),.pH 7,0, enthaltend 5 mmolar (0,5 mmol/100 ml) das Lacton mit gespaltenem Lactam-Ring (Formel I) v/urden diverse Erdproben aus der Umgebung von Vlsp (Schvvelz) als Inokulum hlnzugefugt und bel 25° C auf dem Schūttler bel 140 Upm (Umdrehungen pro Minūte) Inkubiert. Dlese Kulturen vvurden 4mal auf frisches Mineralsalzmedium ūberimpft, und anschliessend wurden sie auf diese Lacton-Umsetzung mittels analytlscher HPLC ūberprūft.
Diese Kulturen wurden dann auf Mineralsalzmedium-Agar-Platten enthaltend 5 mmolar des Lactons (Formel I) bel 25° C Inkubiert. Anschliessend vvurde der Bakterienstamm Sphlngomonas so. FBI (DSM 7007), der v/dhrend des Wachstums aus diesem Lacton das Malonyl-lacton der Formel II bildete und letzteres nicht vollstāndig abbaute, isollert.
Bslsplel.2;
Bildung von MaloQvl-7-AmlnocephalQ$poronsāure (Formel 111)
Die Mikroorganismen Sphlngomonas sp. FBI (DSM 7007) vvurden In Mineralsalzmedium, pH 7,0 (Tabelle Ib) enthaltend 5 mmolar Lacton (Formel I) bis zu einer von OD&jo = 0,44 innerhalb von 4 Tagen angezuchtet. (Nach den ersten 2 Tagen vvurde nochmals dieses Lacton zugegeben, so dass die Gesamtkonzentratlon 1 mmol Lacton pro 100 ml Medium betrug). Anschliessend vvurden die Zellen abzentrifuglert und das Zell-Pellet In 20 ml 10 mmolarem HEPES-Puffer, pH 7,0, resuspendiert, vvobei eine OD550 von 2,2 eingestellt vvurde. Zu dieser Zellsuspension vvurden 0,4 mmol Cephalosporin C (Formel IV) hlnzugefugt. Die Inkubation erfolgte auf dem Schūttler (140 Upm) bei 25° C. LV 10315
Nach 30 min, 60 min, 2,25 h, 5,0 h und 24 h wurde Jevvells elne Probe mlttels HPLC-Analyse untersucht.
Die Blldungsrate an Malonyl-7-Amlnocephalo$poran$0ure betrug bel 2,25 h: 410 mg/l/h/OD^.
Nach 5 h vvurden 142 mg Malonyl-7-Amlnocephalo$poran$āure analytisch nachgewie$en, was elner 99%igen Umsetzung von Cephalosporln C entsprach. Dle Malonyl-7-Amlnocephalosporan$0ure konnte mlt elner Ausbeute von 40% mlttels prāparatlver HPLC Isollert werden. fielsplei 3:
Identifizierunņ von Molonvl-Z-Aminocephalosporonsāure (Formel 1111
Zur Identifizlerung des Produktos (Formel III) wurden 500 ml Mineralsalzmedlum (Tabelle I), pH 7,0, mlt elner Lāsung von Lacton der Formel I versetzt, so dass die Endkonzentratlon 5 mmolar betrug. Dann vvurde dlese Ldsung mlt elner Vorkultur, deren OD650 = 0,5 war, bel 25° C und 140 Upm Inokullert. Nach elnem Tag \vurden nochmals 5 mmole Lacton (Formel I) pro 500 ml Medium hinzugegeben.
Als elne OD550 von 0,5 errelcht war, vvurden die Zellen abgeerntet. Dann vvurde das Zell-Pellet In 30 ml 10 mmolarem HEPES-Puffer, pH 7,0, enthaltend 0,6 mmol Cephalosporin C (Formel IV) resuspendiert. Nach einer 5-st0ndigen Inkubatlon bel 25° C, bei 140 Upm, wurden die Zellen abzentrifugiert und aus dem Oberstand die Malonyl-7-Aminocephalosporansāure mlttels prāparativer HPLC gereinigt, Die gerelnlgten Proben wurden Ciber Nacht lyophilisiert und das Lyophilisat mlttels NMR (Ί H und 13 0 analysiert.
Durch Vergleich mit einer chemisch hergestellten Referenzsubstanz (hergestellt aus 7-Aminocephalosporansāure gemdss Buli. Soc. Chem. Belg., 1977,86, S. 991 - 1002) wurde die Bildung von Malonyl-7-Aminocephalosporans0ure bewiesen. 13
Malonyl-7-Amlnocephalo$porans0ure Natrium-solz (chemlscher Standard) 13C-NMR (DMSO, 100,5 MHz, δ In ppm): 20, s; 25, s; 40, m; 58, d; 64, S; 112, s; 134, s; 164, d; 170, t. Malonyl-7-Aminocephalo$poran$0ure (erfindungsgemāss) 13C-NMR (DMSO, 100,5 MHz, δ In ppm): 20, s; 25. s; 40, M; 58, d; 64, $; 112.s; 134, s; 164, d; 170, t. ^ H-NMR (chem. Standard, DMSO, 400 MHz, δ In ppm): 20. $; 2,5. s; 3,0, t; 3,5, m; 4,8, d; 5.0,d; 5,6 d. 1 H-NMR (erfindungsgemāss): 2,0,$; 2,5, s; 3,0, t; 3,5, m; 4,8, d; 5,0, d; 5,6. d.
Bslsp.lel,4:
LactonlslerunĢ von Desocetvlcephalosporln
Ausgehend von Desacetylcephalosporin C (Ciba-Gelgy AG, Basel) wurde
Desacetylcephalosporin C-Lacton folgendermassen hergestellt: 100 g Desacetyicephalosporin C vvurden in 1120 mmolarem Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, gelāst. Zu dieser Lāsung vvurde ein lonaustauscher (DOWEX 50X8 (Fluka) (H+-Form)) zugegeben, bis der pH 2,5 erreichte. Nach 10 min Rūhren (250 Upm, Raumtemperatur) wurde das lonenoustauscherharz abfiltriert und der pH der Lāsung mit konz. Salzsāure auf 0,8 eingestellt. Nach 1 h Rūhren (Raumtemperatur, 250 Upm) wurde zur Reaktionslāsung DOWEX 1X8 (Acetat-Form) (Fiuka) zugegeben, bis ein pH von 3,0 - 3,2 erreicht war.
Dann vvurde bei Raumtemperatur fur vveitere 1,5 h bel 250 Upm gerOhrt und anschliessend das lonenaustauscher-Harz abfiltriert. Dann vvurde erneut DOWEX 1x8 (Acetat-Form) hinzugegeben, bis ein pH von 3,3 * 3.5 erreicht vvar, 1 h gerOhrt (Raumtemperatur, 250 Upm) und anschliessend das lonenaustauscher-Harz abfiltriert. Die Reaktionslāsung vvurde anschliessend am Rotavapor bis zurTrockene LV 10315 elngdampft (30 mbar, 30° C). Um dle noch erhaltene Esslgsdure zu entfernen, wurde das Produkt nach dem Elndampfen In VVasser geldst, bis elne 35%lge Lbsung errelcht w ar und dann der pH mlt konz, Salzsāure auf 1,5 elngestellt,
Dle so erhaltene Lāsung wurde 2mal mlt Ethylacetat (glelches Volumen wle dle Ldsung) extrahlert. Die vvčssrigen Phasen wurden verelnigt und mlt 3 molarer KOH-Lbsung auf pH 3,5 elngestellt und am Rotavapor (30 mbar, 30° G) elngedampft. Das Produkt wurde anschliessend noch Im Trockenschrank unter Vakuum (30 mbar, 20° C) vollstāndig getrocknet.
Dle Gesamtausbeute betrug 60 g entsprechend einer Ausbeute von 60% ausgehend von 100 g Desacetylcephalosporin C.
BelspieLS:
Herstellung des Lactons mlt gespaltenem Lactam-Rina (Formel I)
Zur Herstellung von Lacton (Formel I) wurde Desacetylcephalosporln C-Lacton In Stockldsung 6 (Tabelle la), mlt einer p-Lactamase. Penlclllinase E.C. 3.5.2.6. (Sigma) behandelt. Die Reaktion startete unmlttelbar nach Zugabe der Penlclllinase. Wdhrend der Reaktion wurde der pH-Wert durch Zugabe einer 1 normalen NaOH-LOsung auf pH 7,0 gehalten. Die Reaktion vvar beendet, sobaid ein konstanter pH-Wert von 7,0, ohne NaOH-Zugabe, errelcht war. Nach Beendigung der Reaktion (ca. 2 h) wurde dies© LOsung sterilfiltriert (0,2 ^ Filter) und dann bei -80° C gelagert.
Beispiel 6:
Bildung von7-AmlnoceDhalosporansāure (Formel V)
Die Mikroorganismen Pseudomonas sd SE-495 (DSM 7509; FERM BP-818) wurden In elnem Nāhrmedium (pH 7,0) enthaltend 0*2% w/v Fleischextrakt, 0,2% w/v Hefeextrakt, 0,5% w/v Pepton, 0,5% vv/v Natriumglutamat und 0,005% w/v 15
Magneslumsulfat, bel 30° C, Ober Nacht angezOchtet. Dlese Kulturen wurden in frlsches Ndhrmedlum der glelchen Zusammensetzung Oberlmpft (Impfmenge: 10%) und 2 bis 4 Tage Inkublert.
Anschllessend wurden die Zellen durch Zentrifugatlon (20 min. bel 600 upm) abgeerntet, In 0,1 molarem Kallumphospat-Puffer resuspendlert und rezentrlfuglert, (dos Ganze jevvells 3mal mlt 10% des Kulturvolumens). Danach vvurde das Zell-Pellet Im mlnlmalst mbglichen Volumen mlt Kaliumphosphat-Puffer resuspendlert und unter ElskCihlung mlt Ultraschall (10 mal fūr Je 30 sec.; Pause Jewells 20 sec.) beschallt. Aus diesem Rohextrakt wurden dann die ZelltrOmmer mlttels Zentrifugatlon (20 min. bel mlndestens ĪO'OOO upm) abgetrennt. • f
Zur Bildung von 7-AmInocephalosporans0ure vvurde dieses Rohextrakt (Proteinkonzentration 2 mg/ml) auf Raumtemperatur ervvārmt, und dann wurde Malonyl-7-Aminocephalosporan$āure, Im Kaliumphosphat-Puffer, In elner Konzentration von 5 mmolar, hlnzugegeben. Das Ganze wurde bel 25° C ruhend Inkubiert und Innerhalb 24 h auf die Bildung von 7-Amlnocephglosporan$āure analysiert,
Die Analyse erfolgte dūnnschlchtchromatographisch (Platte: Kieselgel 60 F245, Laufmittel: Butanol-Methanol-Elsessig-Wasser In elnem Verhāltnis von 50:30:3:17). Die Bildung von 7-Amlnocephalosporansāure (Rf-Wert: 0,51) ausgehend von Malonyl-7-Aminocephalosporansdure Rf-Wert: 0,43) konnte entvveder bei einer UV-Wellenl0nge von 254 nm oder nach Besprūhen mit Fluram-Reagens (3 mg Fluram; Fluka CH-9470 Buchs in 10 ml Aceton) bei einer UV-Welleniange von 366 nm nochgewiesen werden.
Nach ca. 14 h konnten mit diesem Roherfrakt. enthaltend als Enzym eine Malonyl-7-
Aminocephlosporansāure-Acylase, 50 bis 100 μ mole 7-Aminocephalosporan$āure nachgewiesen werden.
ToMal a) Mineralsalzmedlum Stocklbsunoan
Stocklbsung 1: ΝαΗ2Ρθ4·2Η2θ 156,0 g NH4CI 10,0g k2so4 1,2 g Aqua dest. 500,0 ml
Stocklbsung 2: p-Aminobenzoesbure 8,0 mg D-Biotin 2,0 mg Nikotlnsbure 20,0 mg Ca-D-Panthothenat 10,0 mg Pyridoxathydrochlorid 30,0 mg Thiamindichlorid 20,0 mg Cyanocobalamin 10,0 mg Aqua dest. 100,0 ml sterilfiltrieren
Stocklbsung 3: HCI (37%) 7,0 ml FeCI2-4H20 1,5 Q ZnCI2 0,07 g MnCI2‘4H20 0,1 g 17 H3B03 0,006 g CoCl2-6H20 0,19 g CuCl2-7H20 0,002 g NiCl2'6H20 0,024 g Να2Μοθ4'2Η2θ 0,036 g Aqua dest. 1000,0 ml, autoklavlerert 121‘C, 20mln
Stockldsung 4: NaOH 0,5 g Na2S©03-5H20 0,003 g N02WO4-2H2O 0,004 g Aqua dest. 1000,0 ml, autoktavieren 12TC, 20 min
Stockldsung 5: MgCl2'6H20 40,0 g CaCl2'2H20 5,0 g Aqua dest. 200,0 ml, autoklavieren, 121’C, 20 min LV 10315
Stocklbsung 6:
Desacetylcephalosporln C-Lacton 3,55 g Aqua dest, 60,0 ml Penlcllllnase (EC 3.5.2.6.) 1,0 mg (25Ό00 Unlts) (Sigma p0389) pH mlt NaOH auf 7,0 eingestellt mlt Aqua dest. auf 100,0 ml auffūllen bl Herstellung des Mineralsalzmedlums Stocklbsung 1: 25,0 ml pH mlt KOH auf 7,0 elngesellt, dann mlt
Aqua dest. auf 950,0 ml auffūllen, autoklavieren, 121‘C, 20 min.
Nach dem Sterilisieren Zugabe von:
Stocklčsung2 0,5 ml
Stocklbsung 3 l ,0 ml
Stockl0sung4 1,0 ml
Stocklbsung 5 0,5 ml LOsung ©rhalten aus Beispiel 5 50,0 ml 19
Pgtentansprūchft 1. Mikroorganismen, dle derart selektlonlert sind, dass $le befdhlgt sind, das Lacton oder dessen Ibsllche Salze der Formel'
HN
0 0 0 als einzige Kohlenstoff*, Stickstoff- und Energlequelle Ciber das Malonyl-Lacton oder dessen lOsliche Salze der Formel
HOOC-CH
0
II zu verwerten und letzteres nicht zu katabolisieren. 2. Mikroorganismen nach Patentanspruch 1 mit der Bezelchnung sphļngomongs sj^ FBI (DSM 7007) sowie deren Deszendenten und Mutanten.
COOH 3. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Malonyl*7-Aminocephalosporansāure-Derivaten oder deren Ibsliche Salze der allgemeinen Formel
III worln R eln VVasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Acetoxygruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man Cephalosporin C-Derlvate oder deren lOsllche Salze der allgemelnen Formel HOOC-CH-
IV
worin R die genannte Bedeutung hat, als Substrat, mittels den Mikroorganlsmen gemāss Patentanspruch 1 In das Produkt gerndss Formel III CiberfOhrt,
Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man dle Umsetzung mittels den Mikroorganlsmen SphlnĢomonas sd. FBI (DSM 7007) oder deren Deszendenten und Mutanten durchfOhrt.
Verfahren nach mlndestens elnem der PatentansprOche 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Substrat Cephalosporin C anwendet. i 1
Verfahren nach mlndestens einem der PatentansprOche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung unter einmaliger oder konti- " nuierlicher Substratzugabe erfolgt, so dass die Substratkonzentration im Kulturmedium 20 Gew.% nicht Obersteigt.
Verfahren nach mindestens einem der PatentansprOche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung bel einer Temperatur von 0 bis 60° C und bel einem pH von 5 bis 9 durchfuhrt, 21 8. Malonyl-7-Amlnocephalosporans0ure-Derlvote oder deren Idsliche Salze der allgemelnen Formel
COOH
III worln R eln VVasserstoffatom, elne Hydroxylgruppe oder elne Acetoxygruppe bedeutet. 9. Malonyl-7-Aminocephalo$poransdure 10. Mikroblologlsches Verfahren zur Herstellung von 7-Amlnocephalosporansāure-
Derlvaten oder deren Idsliche Salze der allgemeinen Formel
S
COOH
V v/orin R die in Patentanspruch 3 genannte Bedeutung hat, dadurch gekennzeichnet, dass man Malonyl-7-Aminocephalo$porans0ure-Derivate oder deren Idsliche Salze der allgemeinen Formel III als Substrat, miftels Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas sd. (DSM 7509) oder deren Deszendenten und Mutanten, oder mit zellfreien Enzymen aus diesen Mikroorganismen, in das Produkt gemāss Formel V Oberfuhrt. 11. Verfahren nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet. dass man als Substrat Malonyl-7-Aminocephalosporan$āure anwendet. 1· LV 10315 12. Verfahren nach mlndestens elnem der Patentansprūche 10 und 11, dadurch gekennzelchnet, dass die Umsetzung unter einmallgeroder kontinulerllcher Substraizugabe erfolgt, so dass dle Substratkonzentration Im Kultumnedium 10Gew.% nlchtObersfelgt. 13. Verfahren nach mlndestens elnem der Patentansprūche 10 bis 12, dadurch gekennzelchnet, dass man die Umsetzung bei elner Temperatur von 4 bis 50° C und bei elnem pH von 4 bis 9 durchfūhrt. 14. Verwendung von Mlkroorganlsmen der Gattung Pseudomonos so. (DSM 7509) zur Hydrolyse von Malonyl-7-Amlnocephalosporans6ure-Derivaten oder deren Idsliche Salze der allgemelnen Formel III In 7-Amlnocephalo-sporansāure-Derlvate der allgemelnen Formel V. 15. Verwendung nach Patentanspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man Malonyl*7-Amlnocephalosporansāure In 7*Aminocephalosporansāure hydrolysiert, I· LV 10315
Zusammenfnssung
Beschrleben vverden neue Mikroorganismam dle derart selektlolnlert sind, dass sie befāhlgt slnd, das Lacton oder dessen Idsliche Salze der Formel
als einzlge Kohlenstoff-, Stickstoff- und Enērglequelle Ober Malonyl-Lacton oder dessen Idsllche Salze der Formel
zu verwerten und letzteres nlcht zu katabolisieren. Des vveiteren vvird wird eln mikrobiologlsches Verfahren zur Herstellung von Malonyl*7-Aminocephalosporan-sāure-Derivafen oder deren ICsliche Salze der allgemelnen Formel
mīt diesen Mikroorganismen ausgehend von Cephalosporin-C-Derivaten oder deren 24
Idsliche Salze der allgemelnen Formel HOOC-CH-(CH ) k2 23
CH2-R
IV beschrieben.
Des vvelteren wlrd ausgehend von den Malonyl-7-AmInocephalo$poran$ČJure-Derivaten ein neues Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephal$poransčiure-Derivaten der allgemelnen Formel
V beschrieben. /

Claims (13)

  1. LV 10315 IZGUDROJUMA FORMULA 1. Mikroorganismi, kas ir tā selekoionēti, ka spēj izmantot par vienīgo oglekļa, slāpekļa un enerģijas avotu laktonu I un tā šķīsto šos sāļus NH_ HOOC-γΒ-()
    I
    1 pārvēršot to laktona malonilatvasinājumā II vai tā šķīstošajos sāļos un to tālāk nekatabolizē jot.
  2. 2. Mikroorganisms peo punkta 1, ar nosaukumu: Sphingomonas sp. FB1 (DSM 7007), kā arī tā pēonāoēji un mutanti,
  3. 3. Mikrobioloģisks panemiens 7-aminooefalosporānskāl)eB malonil-atvaBinājumu vai to šķīstošo Bāļu ar vispārīgo formulu III HOOC—CH. l!L o N %^Xn ch2-r COOH kurā: R ir ūdeņradis, hidroksilgrupa vai aoetoksigrupa, iegūšanai, kas atšķiras ar to, ka oefalosporīna-C atvasinājumus ar vispārīgo formulu IV
    COOH H00C-^K-(CH ) nh 2 kurā R nozīme ir dota iepriekš, vai to šķīstošos sāļus, kā substrātus pārvērš produktoe ar formulu III, izmantojot mikroorganismus pēo punkta 1.
  4. 4. Paņēmiens pēo punkta 3, kas atšķiras ar to, ka pārvēršanu veio ar mikroorganismiem Sphingamnas sp, FB1 (DSM 7007), vai to pēcnācējiem un mutantiem. 2 LV 10315
  5. 5. Fanēmiens pēo vismaz viena no punktiem 3 un 4, kas atšķiras ar to, ka par substrātu izmnto oefalosporīnu-C.
  6. 6. Fanēmiens pēo vismaz viena no punktiem 3-5, kaB atšķiras ar to, ka pārvēršanu veio ar vienreizēju vai nepārtrauktu substrāta pievadīšanu tā, lai Bubstrāta konoentrāoija kultūrā nepārsniegtu 20 ma^as %.
  7. 7. Paņēmiens pēo vismaz viena no punktiem 3-6, kas atšķiras ar to, ka pārvēršanu veio pie temperatūras no 0 0π cn Οn c 7 ~a~ q o xxuzi uu u ixu ΠΟ α lxCLa d« 8. 7-Aminooefalosporānskābes malonilatvasinājumi vai to šķīstošie sāļi ar vispārīgo formulu III hooc-ch, Jj ch2-r C00H kurā R ir ūdeņradis, hidroksilgrupa vai aoetoksigrupa. 9. 7-aminooefalosporānskābes malonilatvasinājums. l·
  8. 10. Mikrobioloģisks paņēmiens 7-aminooefalosporānskābes atvasi nājumu ar vispārīgo formulu V 3 V η2 ν· Ν ch2-r COOH kurā R atbilst punktā 3 dotajām nozīmēm, un to šķīstošo Bāļu iegūšanai, kas atšķiras arto, ka 7-aminooefalosporānskābes malo-nilatvasinājumus vai to šķīstošos sāļus ar vispārīgo formulu III izmanto par substrātu mikroorganismiem no ģints Feeudownae sp, (DSM 7509) vai to pēonāoējiem un mutantiem, vai bezšūnu fermentu sistēmai no šiem mikroorganismiem, lai toe pārvērstu produktā ar formulu V.
  9. 11. Paņēmiens pēo punkta 10, kas atšķiras ar to, ka par substrātu izmanto 7-āminooefalosporānskābes malonilatvasinājumu.
  10. 12. Paņēmiens pēo vismaz viena no punktiem 10 un 11, kas atšķiras ar to, ka pārvēršanu veio ar vienreizēju vai nepārtrauktu substrāta pievadīšanu tā, lai eubstrāta konoentrāoija kultūrā nepārsniegtu 10 manas %. %
  11. 13. Paņēmiens pēo vismaz vien a no punktiem 10-12, kas atšķiras ar to, ka pārvēršanu veio pie temperatūras no 0 °C līdz 50 °C un pH no 4 līdz 9.
  12. 14. Mikroorganismu no ģints PeeuāomonaB sp, (DSM 7509) pielietošana 7-aminooefalosporānskābes malonilatvasinājumu un to šķīstošo sāļu ar vispārīgo formulu III hidrolizēšanai par 7-aminooefaloBporān-skābes atvasinājumiem ar vispārīgo formulu V. 4 LV 10315
  13. 15. Pielietošana pēo punkta 14, kas atšķiras ar to, ka 7-aminooefalosporānskabeE malonilatvasinājumu hidrolizē par 7-amino-oef aloBporānskāhi. 5 LV 10315 Kopsavilkums Aprakstīti jauni mikroorganismi, kas ir selekoionēti tā, ka ir spējīgi par vienīgo oglekļa, slāpekļa un enerģijas avotu izmantot laktonu ar formulu I vai tā Šķīstošos sāļus
    pārvēršot to iaktona malonilatvasinājumā II vai tā šķīstošajos sāļos un to tālāk nekatabolizē jot. Piedāvāts izmantot mikrobioloģisko paņēmienu, lai ar šiem mikroorganismiem iegūtu 7-aminooefalosporānskābes malonilatvaBinājumus ar vispārīgo formulu III vai to šķīstošos sāļus 9 g hooc-ch2-c-n ch2-r COOH 6 izejot no oefalosporīna-C atvasinājumiem ar vispārīgo formulu IV vai to šķīstošajiem sāļiem. HOOC-CH-(CH k2
    ch2-r IV Piedāvāts arī jauns paņēmiens T-aminooefalcspopānskāijes atvasinājumu ar vispārīgo formulu V •N y^ ch2-: COOH iegūšanai no T-aminooefalosporānskāPes malonilatvasinājumiem. 7
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