LT3122B - Microbiological process for preparing malonyl-7-aminocephalosporanic acid derivatives - Google Patents

Microbiological process for preparing malonyl-7-aminocephalosporanic acid derivatives Download PDF

Info

Publication number
LT3122B
LT3122B LTIP499A LTIP499A LT3122B LT 3122 B LT3122 B LT 3122B LT IP499 A LTIP499 A LT IP499A LT IP499 A LTIP499 A LT IP499A LT 3122 B LT3122 B LT 3122B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
formula
malonyl
substrate
aminocephalosporanic acid
microorganisms
Prior art date
Application number
LTIP499A
Other languages
English (en)
Inventor
Sabine Schurr
Andreas Tschech
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of LTIP499A publication Critical patent/LTIP499A/xx
Publication of LT3122B publication Critical patent/LT3122B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D505/00—Heterocyclic compounds containing 5-oxa-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
    • C07D505/10—Heterocyclic compounds containing 5-oxa-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
    • C07D505/12—Heterocyclic compounds containing 5-oxa-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 substituted in position 7
    • C07D505/14—Heterocyclic compounds containing 5-oxa-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 substituted in position 7 with hetero atoms directly attached in position 7
    • C07D505/16—Nitrogen atoms
    • C07D505/18—Nitrogen atoms further acylated by radicals derived from carboxylic acids or by nitrogen or sulfur analogues thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Išradime aprašomi' nauji malonil-7-aminocefolosporano rūgšties dariniai arba jų tirpios druskos, turintys .•formulę ?'
HOOC-CIL γ+0 COOH ch2-r
III kurioje, R yra vandenilis, hidroksilas arba acetoksigrupė, naujas jų gamybos būdas, kai pradinė medžiaga yra atitinkami cefalosporino C dariniai, o taip pat nauji šiam būdui tinkami mikroorganizmai.
Be to, išradime aprašomas naujas mikrobiologinis 7aminocefalosporano rūgšties darinių gamybos būdaš, pradedant nuo malonil-7-aminocefalosporano rūgšties darinių, taip pat naujas Pseudomonas sp. (DCM 7509) genties mikoorganizmų panaudoj imas.
'? Tolesniame aprašyme pavadinimai malonil-7-aminocef alosporanorūgšties dariniai (formulė III), cefalosporino
C dariniai (formulė IV), malonil-daktonas (formulė II) ir laktonas (formulė!) apima ir šių junginių tirpias druskas, tokias kaip amonio arba šarminių metalų :++ druskas .+0+'.+ ..+ +
Malonil-7-aminocefalosporano rūgšties dariniai gali būti, pavyzdžiui, pradine medžiagą sintetinant 7aminocefalosporano rūgšties darinius, svarbios pradinės medžiagos antibiotikų gamyboje (š. Bacteriol.,
Nr. 12, 5815-5820). .
kurie vėlgi yra ce f a 1ospor in inių 1987, vol. 169,
Iki Šiol. nebuvo žinomi nei cheminiai, nei mikrobiologiniai malonil-7-aminoęęfalosporano rūgšties- darinių gamybos būdai.· . , .·5 ' 7-Aminocefalosporano rūgšties darinių sintezei yra daug mikrobiologinių metodų, kuriuose pradine medžiaga yra cefalosporinas C, aprašytų, pavyzdžiui, JP-A 62 48380. Visų šių metodų trūkumas yra tai, kad jie negali būti pritaikyti pramonėje.
7 · 7--.. . . ..'i / 7 ; - \ .
Išradimo tikslas buvo sukurti, panaudojant naujus mikroorganizmus, nauj ą paprastą ir ekonomišką mikrobiologinį naujų malonil-7-amindcefalospora.no rūgšties darinių gamybos būdą. Kitas uždavinys buvo, panaudojant
15/ šiuos darinius, sukurtv naują mikrobiologinį 7aminocefalosporar. 7 rūgšties darinių gamybos būdą.
Išradimo tikslas buvo pasiektas pateikus naujus mikroorganizmus pagal išradimo naują būdą pagal išradimo apibrėžties malonil-7-aminocefalosporano rūgšties punktą ir naują būdą' pagal 10 punktą.
ies 1 punktą, 3 punktą, naujus darinius pagal 8
Išradime aprašomi mikroorganizmai -yra atrinkti selekcijos būdu taip, kad jie gali laktoną, turintį formulę
panaudodami kaip vienintelį anglies, azoto ir energijos šaltinį, paversti laktonu, turinčiu formulę
ir pastarąjį nekatabolizuoti.
. · 7 .//·.' A7J-/., A/,-·- ' '
Šie mikroorganizmai selekcionuojami naudojant laktoną, turintį formulę I, bei pasitelkiant .tradicinius mikrobiologinius metodus, pavyzdžiui>/~ analizuojant įvairius dirvožemio pavyzdžius. Kai mikroorganizmai iš '15 dirvožemio pavyzdžių auginami kaip inokuliatas ant laktono, turinčio formulę I, gaunami mikroorganizmai, galintys augti panaudodami šį laktoną kaip vienintelį anglies, . azoto ir energij os šaltinį * Iš šių mikroorganizmų specialistams žinomais metodais atrenkami mikroorganizmai, kurie paverčia laktoną, turintį formulę I, malonilo laktonu, tu’rinčiu formulę I ir nekatabolizuoja pastarojo.
Selekcijai reikalingą laktoną, turintį formulę I, galima . susintetinti iš komercinio dezacetilcefalosporino C. Iš pradžių dezacetilcefalosporinas C žinomais metodais (Jefferay et ai., Biochem J. 1961, 81, 591) laktonizuoj amas iki’ atitinkamo laktono, Norint gauti pageidaujamą laktoną, turintį perkirstą laktaminį žiedą (formulė I), laktaminis žiedas specialiai skaldomas, pavyzdžiui, penicilinaze.
Iš esmės tinka visi mikroorganizmai, gaunami selekcinių dauginimu. Šie mikroorganizmai literatūroje neaprašyti ir yra šio išradimo dalis.
Selekcionuojant gauti mikroorganizmai, kurie žymimi FB-1 (DSM 7007), jų mutantai ir palikuonys. ’ Jie . yra 1992.03,25 deponuoti firmoje ' Deutsche Sąmmlung fur Mikroorganįsmen ųnd Zelikuituren GmbH, Mascheroderweg li>, D-3300 Braunschweig.
Šie mikroorganizmai, padavus paraišką dėl prioriteto, buvo analizuojami 16 S ,RNA metodu ir nustatyta, kad jie c priklauso Sphingomonas sp; genčiai.
Mokslinis Sphingomonas sp. FBI (DSM 7007) aprašymas:
Ląstelių forma mažytės ląstelės
Plotis, pm 0.4—0.6
Ilgis, μιη < 0.8-1.5
Judrumas +
Ūseliai poliarinis ,1
Gram-reakcija Lizavimas ;3% KOH · 7 . +
Aminopeptidazė (Cerny) '+
Sporos
Oksidazė /:< ? +
Katalazė - . _ +
Pagrindinis chinoninis komponentas: Ubichinonas Q10
DNR sudėtis HPLC metodu: 63 mol% G+C.
Paprastai selekcija ir auginimas vyksta mineralinių druskų terpėje, labiau tinka mineralinių druskų terpė, kurios sudėtis pateikta Lentelėje 1 (a ir b). Mikroorganizmų auginimui gali būti panaudotos ir kitos terpės, pavyzdžiui, komercinės pilnos terpės.
Auginant ir selekcionuojant tikslinga į mineralinių druskų terpę įdėti nuo 0.2 iki 1 svorio %, labiau tinkamas kiekis nuo 0.. 3 iki 0.6 svorio%, laktono, turinčio formulę I. ..,-7Temperatūra auginimo ir selekcijos metu palaikoma tarp 5 0 ir 60°C, labiau tinka temperatūra nuo 20 iki 40°C.
Selekcija ir auginimas vyksta esant pH nuo 57 ik- 9, '7/?- labiau tinka pH nuo 6 iki 8.
Kai optinis tankis prie 650 nm reikšmės (OD650) pasiekia reikšmes nuo 0.1 iki 1, mikroorganizmai surenkami specialistams žinomais metodais ir panaudojami šiame išradime aprašytame metode.
.15 Pagal šį išradimą tokiu būdu selekcionuoti mikroorganizmai panaudojami šiame išradime aprašytame metode cefaįosporinp C darinių kaip substratų, turinčių bendrą formulę '7:7/7-.'7.//7/.-/.7-7//,.//7/-7'?-/777:7/7////
HOOC-CH-(CH )_
4¾
IV
COOH kai R yra vandenilis, hidroksilo grupė- arba pavertimui į malonil-7aminocefalosporano rūgšties -darinius, turinčius bendrą .'formulę.'
HOOC-CH
COOH kai R reikšmės apibrėžtos aukščiau.
III
Tikslinga šiame metode naudoti selekcionuotus mikroor; z ganizmus Sphingomonas sp. .(DSM 7007). arba jų palikuonis . ir mutantus, kurie, kaip jau minėta, yra deponuoti.
' į-' č 7 ' 7'. v
Paprastai šiame procese specialistams žinomais būdais naudojamos neaugančios ląstelės.
Substratais/ naudojami cefalosporino C dariniai, turinio lys bendrą formulę IV, kai R reikšmės apibrėžtos aukščiau. Tinkamas substratas yra cefalosporinas C {kai
R bendroje formulėje III = acetoksi). '
Sub stratas proce s o metu įdedamas vienu kartu arba 15.7' nuolatos. Labiau tinka substratą pridėti taip, kad substrato koncentracija kultūrinėje terpėje neviršytų svorio %, dar geriau jei Koncentracija neviršys 4 svorio %. > z;
Procesui gal į būti panaudotos specialistams įprastos terpės. Labiau tinka procesui žemo molingumo HEPES buferis [ 4-(2-hidroksietil)piperazin-l-etansulfoninė rūgštis] . \ /
Paprastai šiuo metodudirbama su suspensijomis, kurių optinis tankis OD650 siekia nuo 1 iki 100, labiau tinka
OD650 r ei kšme nuo 2 iki 50.
Procesui tinkama temperatūra yra nuo 0 iki 60°C, labiau
30 tinkama temperatūra yra nuo 20 iki 40°C, p H reikšmės
nuo 5 ik i.....9, labiau tinka pH reikšmės nuo 6 iki 8.. .
Pasibaigus reakcijai, kurios trukmė yra nuo 1 'iki 24
valandų, galimą specialistams žinomais metodais išs35 kirti iki šiol neaprašytus malonil-7-aminocefalosporano rūgšties darinius, turinčius formulę III. Ypač tinkamas malonil-7-aminocefalosporano rūgšties darinių atstovas ' 7 yra malonil-7-amihocefalosporano rūgštis (kai R bendroje formulėje III = acetoksi).
Šio išradimo būdas, skirtas gaminti 7-aminocefalo5 sporano rūgšties darinius, turinčius bendrą formulę
kurios R reikšmės apibrėžtos aukščiau, vykdomas taip, kad malonil-7-aminocefalosporano rūgšties dariniai' arba jų tirpios druskos, turintys bendrą formulę . III, Pseudomonas sp. (DSM 7509) genties mikoorganizmų arba jų palikuonių arba mutantų', arba veikiant fermentais be ląstelių, išskirtais iš šių mikroorganizmų, paverčiami .produktais, turinčiais formulę V.
Mikroorganizmai Pseudomonas sp. (DSM 7509) yta 1992.03.5 .deponuoti firmoje Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Masč{neroderweg. lb, D-3300 Braunschweig.
Šie mikroorganizmai yra žinomi ir aprašyti-JP-A 62 483 80 kaip Pseudomonas sp. SE-495 (FERMBP-818). Pagal JP-A 62 483 80 šie mikroorganizmai atrinkti taip, kad jie
- hidrolizuotų· glutaril-7-aminocefalosporano rūgštį į, 730 aminocefalosporano rūgštį. Šių mikroorganizmų panaudojimas malonil-7-aminocef alosporano rūgšties hidroližei nėra aprašytas. 7;\'·
Todėl šis išradimas · įprašo ir šių 'mikroorganizmų panaudojimą malonil-7-aminocefalosporano rūgšties darinių (formule V), ypač malonil-7-aminocefalosporano rūgšties (R = acetoksi-), hidrolizei.
Procesas vykdomas su padidinto pralaidumo mikroorr ganizmų ląstelėmis arba ląstelių homogenizatu, .ypač tinka ląstelių homogenizatas. ’ n
Ląstelių homogenizato gaminimui tinka specialistams žinomi metodai, pavyzdžiui, ardymas ultragarsu arba ; ”Fręnch-press tipo’aparatai» y//''..///R
Substratu gali būti malonil-7-aminocefalosporano rūgš10 ties dariniai, turintys formulę V, kai R reikšmės apibrėžtos aukščiau. Tikslingą substratu vartoti malonil-7- aminocefalosporano rūgštį (R = acetoksi-).
Substratas proceso metu gali būti įdedamas vienu kartu · arba nuolatos taip, kvd substrato koncentracija kultūrinėje terpėje neviršytų 10 svorio %, dargeriau jei koncentracija neviršys 2 svorio %. --.7.. J- R/.?
Procesui gali būt i panaudotos specialistams įprastos maitinančios terpės. 7 //':/.'.// -- .? /.7'
Jei procesas vykdomas su ląstelių homogenizatu, baltymo koncentracija šiame ekstrakte yra nuo 0.1 iki 20 g/1, labiautinkakoncentracija-nuo 1 iki 5 g/.l.
'-/////77τ 7'//.7';-/R//R,//. 7/'.7r7///////.r/
Procesą tikslinga vykdyti esant temperatūrai nuo 4viki 50°C, labiau tinka temperatūra nuo 20 iki 35°C, ir pH nuo 4 iki 9, labiau tinka pH reikšmės nuo 7 iki 8.
Pasibaigus reakcijai, kurios trukmė nuo 3 iki 24 valandų, galima išskirti 7-aminocefalosporano rūgšties darinius, turinčius formulę V.
>
Pavyzdys 1:
Mikroorganizmų išskyrimas
LT 31228 ' ; 9
Į 100 ml mineralinių druskų terpės (Lentelė 1), pH 7, kurioje yra 5 mmol (0.5 mmol/100 ml) laktono, turinčio suskaldytą laktaminį žiedą (formulė ·Ι), pridedami kaip inokuliatai įvairus dirvožemio pavyzdžiai, surinkti
Visp miesto (Šveicarija) apylinkėse ir inkubuojami purtyklėje su 140 rpm (apsisukimų per. minutę), esant 25°C. Kultūros persėjamos 4 kartus į šviežią mineralinių druskų terpę ir laktono pakitimai tikrinami analitinės aukšto slėgio skysčio chromatografijos (ASSC) metodais.
Po to Šios kultūros inhibuoj amos mineralinių druskų terpės ir agaro lėkštelėse, kur yra 5 mmol laktono (formulė I) esant 25°C. Pagaliau buvo išskirtas ‘15 bakterijų kamienas Sphingomonas sp. FBI (DSM 7007), kuris augimo metu laktoną paverčia malonilo laktonu, turinčiu formulę II, ir pastarojo toliau nesuskaldo.
Pavyzdys 2:
Malonil-7-aminocefalosporano rūgšties (formulė - III) sintezė
Mi krodrgan i žma i Sphingomonas sp. FBI (DSM 7007) auginami 4 dienas mineralinių druskų terpėje, pH 7.0 (Lentelė Ib), kur yra 5 mmol laktono (formule I) iki O D650 -0.44 . (Po pi rmų dviejų dienų p r įdedama pap i ldoma s kiekis laktono, tiek, kad jo visa koncentracija siektų 1 mmol laktono 100 ml terpės) . Po to ląstelės nucentrifuguojamos ir ląstelių pasta resuspenduojama 20 ml lOmmol HEPES buferio, pH 7.0 palaikant optinį tankį; OD65q = 2.2. Į tokią ląstelių suspensiją pridedama 0.4 mmol cefalosporino C (formulė' IV).
Inkubuojama purtant (140 rpm), temperatūra 25°C.
j 10 ;·Po 30 min. 60 min. 2.25 vai, 5.0 vai ir 24 vai terpės pavyzdys analizuojamas ASSC.
Malonil-7-aminocefaiosporano rūgšties sintezės greitis praėjus 2.25 vai sudarė 410 mg/l/val/OD650.
Po 5 valandų analizė parodė, kad susidaro 142 mg maloni!-7-aminocefalosporano rūgšties - tai reiškia, kad sureagavo 99 % cefalosporino C.
Malon.il-'T'-aminocef alosporano rūgštį galima išskirti preparatyvinės ASSC metodais, ‘išeiga 40 %.
Pavyzdys 3:
Maloni'l-7-aminocefalosporano rūgšties (formulė identifikavimas
Norint identifikuoti produktą (formulė III) 500 ml mineralinių druskų terpės (Lentelė. I), pH 7.0, sumaišoma su lektorių, turinčiu formulę I taip, kad jo galutinė koncentracija sudarytų 5 mmol- Po to tirpalas inokuliuojamas ankstesne kultūra, kurios OD650 = 0.5, palaikant 250C ir 140 rpm. Praėjus dienai pridedama dar 5 mmol laktono (formulė 1} skaičiuojant 500 ml terpės. Kai ODgso pasiekia 0.5 ląstelės surenkamos. Po to ląstelių pasta resuspenduojama 30 ml lOmmol HEPES buferio, pH 7.0, kuriame yra 0.6 mmol cefalosporino C (formulė IV). Po 5 vai inkubacijos esant 25°C ir 140 rpm., ląstelės centrifuguojamos ir iš supernatanto·
ASSC metodais išskiriama malonil-7rūgštis. Išgryninti pavyzdžiai liofilįzuojami per naktį ir liofilizatas analizuojamas
BMR (hi ir 13C) metodais.
Lyginant su cheminiais' būdais susintetintu palyginamuoju preparatu (pagamintu iš 735 u
aminocefalosporano rūgšties pagal Bull. Soc. Chem. Belg.* 1977* 86* 991-1002)* įrodomas malonil-7aminocefalosporano rūgšties susidarymas.
' 7/·/·.·' A'''·'
Malonil-7-aminocefalosporano .rūgšties natrio druska (cheminis standartas). .
C-BMR (DMSO* 100*5 MHz* cheminiai poslinkiai, m.d.:
20* s; 25* s;40* m;58* d;€4, s;112* s;134* s;164z d;170* t..
Malonil-7-aminoeefalosporano rūgštis (pagal šį išradimą)
C-BMR (DMSO* 100*5 MHz* cheminiai poslinkiai* m.d.:
20* 2;25* s;40* m;58* d;64* s;112* s;134* s;164* d;170, ‘t.
XH-BMR (cheminis standartas* DMSO* 400/ MHz, cheminiai poslinkiai* m.d.):
20* s?2.5* s;3.0> t?3.5 m;4.8* d;5.0* d;5.6 d.
H-BMR
20* s;2.5, s;3.0* t;3.5 m?4.8* d;5.0* d; 5.6 d.
Pavyzdys 4:
Dezacetilcefalosporino laktonizavimas
C i akt onas buvo susintetintasis C (Ciba-Geigy* Basei) taip:
'12 /
100 g dezacetilcefalosporino C ištirpinama 1 litre 20 mmol natrio fosfatinio buferio, pH 7.0. Į šį tirpalą pridedama jonų mainų dervos (DOWEX 50X8 (Fluka) (H+ forma), kol pasiekiama pH 2.5. Maišoma 10 min, (250 j : rpm, kambario temperatūra), po to derva nufiltruojama ir tirpalo pH koreguojamas koncentruota druskos rūgštimi iki 0.8. Maišoma į valandą, po to į reakcijos tirpalą pridedama DOWEX 1X8 (Fluka) (acetatinė forma), kol pasiekiama pH 3.0 - 3.2.
Po to maišoma kambario temperatūroje dar 1.5 valandos esant 250 rpm ir derva nufiltruojama. ,Vėl pridedama DOWEX 1X8 (acetatinė forma), kol pasiekiama pH 3.3 -ν'-'7 3.5, Maišoma 1 valandą, (250 rpm, kambario tempera15 tūra), po to derva nufiltruojama. Reakcijosmišinys rotaciniame garintuve nugarinamas iki sausumo (30 mbar, 30°C) . Siekiant pašalinti d^r likusią acto rūgštį produktas po išgarinimo tirpinamas vandenyje taip, kad būtų gautas 35 % tirpalas, kurio pH koreguojamas koncentruota druskos rūgštimi iki 1.5.
Taip paruoštas tirpalas ekstrahuojamas du kartus etilo acetatu, kurio tūris lygus tirpalo tūriui. Vandeninės fazės apjungiamos, pH koreguojamas 3 M kalio šarmu iki
3.5, ir hugarinaiha7rotąęihiu7;,ga.rintūvų (30 mbar, 30°C).
Po to produktas visiškai išdžiovinamas vakuuminėje džiovinimo spintoje (30 mbar, 20°C) .
Bendrą išeiga sudaro 60 g, s kaičiuojant nuo 100 g dezacetilcefalosporino C.
Pavyzdys 5: ,
Laktono su perkirstu laktaminiu žiedu (formulė I) sintezė : 13
Norint susintetinti laktoną (formulė I), dezacetilcefalosporino C laktonas· veikiamas beta-laktamaze, penicilinaze E.C.3.5.2.6. (Sigma) tirpale. 6 (lentelė Ia) . Reakcija prasideda iškart pridėjus penicilinazę.
Reakcijos metu pH palaikomas 7.0 pridedant 1 N NaOH tirpalą. Reakcija pasibaigia, kai pH .7.0 nepridedant NaOH nebekin.ta. Pasibaigus reakcijai (maždaug 2 vai) tirpalas steriliai filtruojamas (0.2 ųm filtras) ir laikomas -80°C.
· '
Pavyzdys. 6:
7-Aminocefalosporano rūgšties . (formulė V) sintezė •15 Mikroorganizmai Pseudomonas sp. SE-495 (DSM -7509; FERMBP-818) auginami per naktį terpėje (pH 7.0), kuri sudaryta iš 0.2% (svoris.tūris) mielių ekstrakto, 0,5% (svoris/tūris) peptono, 0.5% (svoris/tūri's) natrio 'glutamato ir 0.005 % (svoris/tūris), magnio sulfato, esant 30· C. Šios kultūros persejamos į šviežią maitinančią tokios pat sudėties terpę (pasėjamosios .o.·./ . · ... ./~'. , · · .· ' 7-.' . /', '· v .'’··'' .77 /.7/ /// /·- 7· // 7/777·'·'·' 7/'/7/77;.·.'///-/· kultūros kiekis sieKia 10 %) ir inkubuojama nuo 2 iki 4 dienų. . .
Po to ląstelės surenkamos centrifuguojani (20 min 600 rpm), resuspenduojamos 0.1 M kalio fosfato buferyje ir recentrifuguojamos (viso 3 kartus su 10% kultūros tūrio). Po to ląstelių· pasta resuspenduojama minimaliame kiekyje kalio fosfato buferio Ir apgarsinama šaldant ledu (10 kartų po 30 sek,; pertrauka 20 sek) . Iš tokio homogenizato centrifugavimu (20 min, min.. 20 000 apsis./min. atskiriamos ląstelių nuolaužos.
Siekiant susintetinti 7-aminocefalosporano rūgštį šis ekstraktas (baltymo koncentracija 2 mg/ml) šildomas iki kambario temperatūros ir po to pridedama malonil/7aminocefalosporano rūgšties, ištirpintos kalio fosfato ·14 .
buferyje, koncentracija 5 mmol. Visas tirpalas inkubuojamas 25°C nemaišant ir 24 vai bėgyje analizuojamas 7aminocefalosporano rūgšties susidarymas.
Analizė atliekama plonasluoksnės chromatografijos metodais (plokštelė: silikagėlis 60F245, nešėjas: butanolismetanolis-acto rūgštis-vanduo santykiu 50:30:3:17). 7Aminocefalosporano rūgšties (Rf 0.51) susidarymas iš malonil-7-iarainocef alosporano rūgšties (R^ 0.43) gali būti įrodomas pagal UV-absorbciją esant nm bangos ilgiui 'Arba nupurškus plokštelę Fluram-reagentu (3 mg Fluram; Fluka CH-9470 Buchs,* ištirpinti 10 ml acetono) pagal UV-absorbciją, esant 366 nm bangos ilgiui.
.· Po maždaug 14 vai šiame ekstrakte, kurio sudėtyje zyra malonil-7-aminocefalosporano rūgšties acilazė, galima aptikti nuo 50 iki 100 molio 7-aminocefalospotano / ·. ' ;-i rūgšties.
/./·:' . : 7'.7··'·.. :/ 7/'7'' 7/-.,77/. / //7 /' ' '/ ' ' . / '/ \ .7
Lentelė 1
a) Mineralinių druskų terpės tirpalai
Tirpalas 1: ../ ,
NaH2PO4 2H2O 156.0 g
'.77 nh4ci /7^7//7/7/7- 77//77////'/z-'/0/ ;,/7 /7./7.//7 -./7 10.0 g
K2SO4 . - 1.2 g 7
Dist.vanduo 500 ml
Tirpalas 2: /.//77///-7 ' p-Aminobenzoinė rūgštis 8.0 mg
D-Biotinas 2.0 mg
Nikotino rūgštis 20.0 mg
Ca-D-pantotenatas 10.0 mg
Piridoksalhidrochloridas 30.0 mg
Tiamindichloridas 20.0 mg
Ciankobalaminas . · . 10.0 mg
Dist. vanduo 100..0 ml steriliai filtruoti 'Tirpalas 3:
HC1 (37%) ' 7.0 ml ·
FeCl2 4H2O 1.5 g
ZnCl2 /'-'/ / /0.07/g
MnCl2 4H2O '/.-/// 0.1 g ;
h3bo3 5 0.006 g
CoCl2 6H2O :///// 5-'';''::'/7?'''5--'/> 0.19 g
CuC12 7H2O 0.002 g
NiCl2 6H2O /5//5 5-5;'/ 0, 024 g
NaMo04 . ·. . 75' '/'775/5 0.036 g
Dist; vanduo .1000.0 ml, autoklavuoti,
? 5: .> 121°Cz20min
Tirpalas 4: ..//;-/.. 5 '' ,////5/5/---7
NaOH 0.5 g
Na2SeO3 5H20 0.003 g
Na2WO4 2H2O 0.004 g
Dist. vanduo 1000.0, autoklavuoti, 121°C,
• 20 min
Tirpalas 5:
MgCl2 6H2O 40.0 g ; -
CaCl2 2H2O . 5.0 g
Dist. vanduo ' 200.0 ml, autoklavuoti,
121°C, 20 min
Tirpalas 6:
Dezacetilcefalosporino C lakto'nas 3.55 g
Dist. vanduo ° / . - . 60.0 ml tenicilinazė (E.C.3.5.2.6) 1.0 MG (Sigma PO389) (25000 U) pH koreguojama NaOH i ki - . )/7.0
Dist. vanduo iki ) 100.0 ml;
b) Mineralinių druskų terpės ir paruošimas
Tirpalas: 25 ml pH koreguojama KOH 'ikiį//.?//' 7.0, po to pripilti
Po s t e r i 1 įn imo p r i dė t i
Tirpalo 2
Tirpalo 3
Tirpalo 4
Tirpalo 5
Tirpalas pagal Pavyzdį 5
0.5 ml
1.0 ml 1.0 ml
0.5 ml
50.0 ml

Claims (13)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    Γ. Mikroorganizmai, atrinkti selekcijos būdu taip, kad jie, panaudodami laktoną arba jo tirpias druskas, kurių formulė.''·' ' -/0.-0.0000/-+/+/^0-10 kaip vieningą anglies, azoto ir energijos šaltinį, gali 15 pervesti -jį į laktoną arba jo tirpias druskas, turinčius formulę
    II
    25 ir pastarąjį nekatabolizuoti.
    •
  2. 2. Mikroorganizmai pagal 1 punktą, žymimi Sphingomonas sp. FBI (DSM 7007) bei jų palikuonys ir mutantai.
  3. 3. Mikrobiologinis malonil-7-aminocefalosporano rūgšties darinių arba jų tirpių druskų, turinčių formulę HOOC-CH
    Ji
    N
    CH —R 2
    COOH
    III γ, , 7/187/. , 7 gamybos būdas, kai R yra vandenilis, hidroksilas arba acetoksigrupė, b e s i s k i r i a n t i s ' tuo,, kad cefalosporino C darinius arba jų tirpias druskas, kurių bendra formulė
    CH -R
    IV, o 7 R reikšmės apibrėš tos au kščiau, substratą ir, veikiantmikroorganizmais pagal 1 punktą, paverčią produktu, kurio formulė III.
    15 7 /
  4. 4. Būdas pagal 3 punktą, b e s i s k ’i r i a n t /i s tuo, kad procesą vykdo naudoj ant mikroorganizmus Sphingomonas sp. FBI (DSM 70C7) bei jų palikuonis ir mutantus. 7 -
    20
  5. 5. Būdas pagal bent vieną iš 3 arba 4 punkto, b e si sk i r i a n t i · s tuo, kad kaip substratą naudoja '''lc/(7/;7?;7/77
  6. 6. Būdas pagal bent vieną iš 3-5 punktą, b e si s k i25 r i a n t i s tuo, kad proceso eigoje substratą prideda vienu kartu arba nuolatos taip, kad substrato koncentracija kultūrinėje terpėje neviršytų 20 svorio %.
  7. 7. Būdas pagal bent vieną iš 3-6 punktų, b e s i s k i30 r i a n t i s tuo, kad procesą vykdo esant temperatūrai nuo 0 iki 60°C ir pH reikšmėms nuo 5 iki 9.. .
    ,
  8. 8. Malonil-7-aminocefalosporano rūgšties dariniai arba jų tirpios druskos, turinčios formulę
    35 ;· kurioje R yra vandenilis, hidroksilas arba acetoksigrupė.
    10 ' ; ' 4
  9. 9. Maionil-7--aminocefalosporano rūgštis.
  10. 10. Mikrobiologinis 7-aminocefalosporano rūgšties darinių arba jų tirpių druskų, bendros formulės • 15 ' ' ' 't' t λ ' kurios R reikšmės apibrėžtos 3 punkte gamybos būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad malonil-725 aminocefalosporano rūgšties darinius arba/ jų tirpias druskas, turinčias formulę III, vartoja kaip substratą, ' ir Pseudomonas sp. (DSM 7509) genties mikroorganizmų arba jų palikuonių arba· mutantų pagalba, arba veikiant fermentais be ląstelių, išskirtais iš šių mikro30 organizmų, paverčia produktais, turinčiais formulę V.
  11. 11. Būdas pagal 10 punktą, b e s i s k i r i a n t į s tuo, kad kaip substratą naudoja malonil-7-aminocefalo• sporano rūgštį. . ’ . .
  12. 12. Būdas pagal bent vieną iš 10 arba 11 punkto, b es · i s kirianti s tuo, kad proceso eigoje substratą prideda vienu kartu arba nuolatos taip, kad substrato koncentracija kultūrinėje terpė je. neviršytų 10 svorio %.
  13. 13. Būdas pagal bent vieną iš10-12 punktų, b e s i sk i r i a n. t i s tuo, kad procesą vykdo esant temperatūrai nuo 4 iki 50°C ir pH reikšmėms nuo 4>iki 9.
LTIP499A 1992-04-29 1993-04-29 Microbiological process for preparing malonyl-7-aminocephalosporanic acid derivatives LT3122B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH138192 1992-04-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP499A LTIP499A (en) 1994-07-15
LT3122B true LT3122B (en) 1994-12-27

Family

ID=4209103

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP499A LT3122B (en) 1992-04-29 1993-04-29 Microbiological process for preparing malonyl-7-aminocephalosporanic acid derivatives

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5338667A (lt)
EP (1) EP0568004A2 (lt)
JP (1) JPH0646835A (lt)
KR (1) KR930021796A (lt)
CN (1) CN1077989A (lt)
CA (1) CA2095166A1 (lt)
CZ (2) CZ280145B6 (lt)
LT (1) LT3122B (lt)
LV (1) LV10315B (lt)
MX (1) MX9302238A (lt)
TW (1) TW241265B (lt)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1065278C (zh) * 1994-08-27 2001-05-02 中国科学院上海植物生理研究所 一步两酶法制造7－氨基头孢烷酸
CA2431314C (en) 2000-12-11 2010-04-20 United States Filter Corporation Activated carbon for odor control and method for making same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06248380A (ja) 1993-02-23 1994-09-06 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 積層型熱交換器及びその製造方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1041447A (en) * 1974-01-23 1978-10-31 Tadashiro Fujii Production of 7-amino-cephem compounds by comamonas and pseudomonas
JPS5170884A (en) * 1974-12-12 1976-06-18 Toyo Jozo Kk 77 amino sefuemukagobutsuno seizohoho
FR2434169A2 (fr) * 1978-06-22 1980-03-21 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Nouveaux derives reactifs de l'acide penicillanique et de l'acide cephalosporanique et procede pour leur preparation
JPS6248380A (ja) * 1985-08-28 1987-03-03 Asahi Chem Ind Co Ltd セフアロスポリンｃアシラ−ゼの製造法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06248380A (ja) 1993-02-23 1994-09-06 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 積層型熱交換器及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CZ76393A3 (en) 1993-12-15
TW241265B (lt) 1995-02-21
CZ226494A3 (en) 1995-02-15
LTIP499A (en) 1994-07-15
CZ279523B6 (cs) 1995-05-17
US5338667A (en) 1994-08-16
CA2095166A1 (en) 1993-10-30
KR930021796A (ko) 1993-11-23
MX9302238A (es) 1993-10-01
EP0568004A3 (lt) 1994-03-23
CZ280145B6 (cs) 1995-11-15
LV10315B (en) 1995-06-20
EP0568004A2 (de) 1993-11-03
LV10315A (lv) 1994-10-20
JPH0646835A (ja) 1994-02-22
CN1077989A (zh) 1993-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4814272A (en) Process for the biotechnical production of rhamnolipids including rhamnolipids with only one β-hydroxydecanoic acid residue in the molecule
JPH04365494A (ja) ヒドロキシル化されたピラジン誘導体を製造するための微生物学的方法
DK165191B (da) L-carnitin-producerende mikroorganismer samt fremgangsmaade til fremstilling af l-carnitin under anvendelse af mikroorganismerne
US7279314B2 (en) Chemical substance having morphogenetic and growth-accelerating activities
US4764606A (en) 7-formylaminocephalosporin compounds
JP3098310B2 (ja) ６−ヒドロキシピコリン酸の微生物学的製法
LT3122B (en) Microbiological process for preparing malonyl-7-aminocephalosporanic acid derivatives
US5306630A (en) Microbiological process for hydroxylation of nitrogen-heterocyclic-carboxylic acids
US5316929A (en) Process for the preparation of MA
US5238829A (en) Microbiological process for the production of 6-hydroxypyrazinecarboxylic acid
KR100279227B1 (ko) 방향족히드록시헤테로고리상카르복시산의미생물학적제조방법
US5702930A (en) Microbiological process for the preparation of heteroaromatic carboxylic acids using Alcaligenes faecalis
US5270203A (en) Biologically pure culture of Alcaligenes faecalis DSM 6335
US5264361A (en) Microbiological process for the production of 6-hydroxypicolinic acid
US5352592A (en) Microbiological process for the production of 5-hydroxypyrazinecarboxylic acid
JPH11269175A (ja) 海洋バクテリアが生産する新規紫外線吸収物質およびその製造法
US5238830A (en) Microbiological process for the production of 6-hydroxypicolinic acid
CA2163602A1 (en) Di-and trisubstituted pyridines and their preparation
JP2586283B2 (ja) 微生物学的手段によってｌ−カルニチンを製造する方法
US5268294A (en) Alcaligenes faecalis strains useful for the microbiological process for the production of 6-hydroxypicolinic acid
JPH01104194A (ja) Ｄ−（−）−酒石酸の製造法
JPH099954A (ja) 新規乳酸菌株
JPH07213295A (ja) 微生物を用いた４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法
JPH0482135B2 (lt)
JPH01265890A (ja) 新規抗生物質ｓｆ２５８２ｃ物質及びその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 19950429