CZ312596A3 - COMBINATION FOR INDUCTION OF t-CELL TOLERANCE WITH RESPECT TO A DONOR TISSUE OR ORGAN IN A RECIPIENT - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká kombinace k indukci tolerance u cytotoxických T-iymfocytů. Navození tolerance T-buněk vůči ailoantigenům. kombinací podle vynálezu může být použito jako cřzoravy na transplantaci tkání nebo orgánů.

Dosavadní stav techniky

K

a.Xt zvaoe nezbvtné expanze .<_zcoven zprostředkováné anticen-crezentu^-zozcn buněk

R. (1937) J. Exp. Med. 155, daiši (1590) J. Zm.unoi. 144, Unanue, E signálu, odoovědi, a klonální dva signály molekul chvartz, intzgen-speczrzcke 7-lymfccyfu jsou crostřednictvím povrchových (APC) (Jenkins, M. a

302 až 315; Mueller, D. L., a 3701 až 3709; Williams, I. R. a . R. (1590) J. žmmunol. 145, 85 až 93) . U prvního jenž zajišťuje antigenní specifičnost imunitní je cizorodý antigenní peptid prezentovaný prostřednictvím hlavního histokompatibiiního komplexu (MKC) rozpoznáván prostřednictvím TCR (receptoru T-buněk). Druhý signál, nazývaný též kostimulační signál, indukuje proliferaci T-buněk a umožňuje tak T-buňkám přechod do funkčního stavu (Schwartz, R. H. (1990) Science 248, 1349 až 1356) . Kostimulace není antigen-specifická ani není závislá na přítomnosti MHC. Předpokládá se, že kostimulace je zprostředkována jednou či více molekulami exprimovanými na povrchu APC, jenž molekul, které jsou odlišné od zprostředkovávají přenos prvního signálu (Jenkins, Μ. K., a další (1953) J. Immunol. 140, 3324 až 3330; Linsley, P. S., a 1991) J. Exp. Med. 173, 721 až 730; Gimmi, C.

Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 88, 6575 až další další (1991

Young, J. ^rň., a další (1992) J. Clin. Invest. 90, 22í

D., a 6579; 237;

Koulova, L., a další	(1991) J.	Exp. Med.	173, 759 až	7 62;
Reiser K., a další (1992) Proč.	Nati. Acad.	Sci. USA. 89,	271
až 275; van-Seventer,	G. A., a	další (1990	) J. Immunol.	14 4,
4579 až 4586; LaSaile,	J. M., a	další (1991	) J. Immunol.	147,
774 až 780; Dustin, M.	. I., a další (1939)	J. Exp. Med.	169,
503; Armitage, R. F.,	a další	(1992) Nátuře 357, 80 až	32;
Liu, Y·, a další (1992	) J. Exp.	Med. 175,	437 až 445). Jedna •
kostimulační dráha	umožňující akzivaci T-buněk	je
zprostředkována přes	molekuly	CD23 přítomné na povrchu

T-buněk. Tato molekula může zmíněný kostimulační signál přijmout prostřednictvím interakce s ligandem na povrchu

B-buněk nebo APC. Mezi ligandy pro CD23 patří zástupci rodiny aktivačních antigenú B-íymfocytů B7, jako například B7-1 a/nebo B7-2 ( Ereecman, A. 3., a další (1937) J. Immunol.

137, 3260 až 3267; Freeman, G. J., a další (1939) J. Immunol.

143, 2714 až 2722; Freeman, G. J., a další (1991) J. Exp.

Med. 174, č25 až 631; Freeman, G. J., a další (1993) Science

262, 909 až 911; -Azuma, M., a další (1993) Nátuře 366, 76 až

79; Freeman, G. J., a další (1993) J. Exp. Med. 173, 2185 až

2192) . B7-1 a B7-2 jsou rovněž ligandy pro jinou molekulu (CTLA4) přítomnou na povrchu aktivovaných T-buněk, nicméně úloha CTLA4 v procesu kostimulace je nejasná.

Jestliže T-buňky obdrží spolu s antigen-specifickým signálem i kostimulační signál, dojde k jejich aktivaci, což znamená jednak jejich proliferaci a jednak sekreci cytokinů. !

Naopak, obdrží-li T-buňky pouze antigen-specifický signál (bez kostimulačního signálu) předpokládá se, že tento proces . indukuje u T-buněk stav funkčního umlčení nebo anergie, a tudíž vlastně indukuje antigen-specifickou toleranci T-buněk.

Interakce mezi T-buňkami a B-buňkami hraje při imunitní I odpovědi klíčovou úlohu. K indukci humorální imunity vůči j antigenům závislým, na thymu je zapotřebí pomoc poskytovaná pomocnými T-buňkami (T helper cells, Th-buňky). Pomoc poskytovaná B-lymfocytům je z části zprostředkovaná prostřednictvím rozpustných molekul produkovaných Th-buňkami (například lymfokiny jako IL-4 a IL-5), nicméně k aktivaci B-buněk je rovněž nezbytná interakce mezi B-buňkami a Th-buňkami, která je závislá na jejich vzájemném kontaktu (dotyku) (Kirohata a další, J. Immunol., 140:3736 až 3744 (1988); Bariett a další, J. Immnol. 143:1745 až 1754 (1939). Tato data naznačují, že k aktivaci B-buněk je nezbytný kontakt mezi povrchovými molekulami B-buněk a Th-bunšk. Molekula nebo molekuly přítomné na povrchu T-buňky tudíž zprostředkovávají helperovou efektorovou funkci závislou na kontaktu. Idea interakce mezi B-buňkami a T-buňkami závislé na kontaktu je dále podporována pozorováním, že izolované aktivovaných T-buněk mohou poskytovat funkce nezbytné k aktivaci 3-buňky. Acad. Sci. USA, 35:564 až 556 (1933);

plasmatické membrán) helperové efektorov; Brian, ?roc. Nati.

Hodgkin a další, Noelie a další, u.

J. Immune _ ., 14 o:

Immunol., 146:1118 a

2025 až 2034 ž 1124 (1991).

í 1^90

Na povrchu zralých i nezralých 3-lymfocytů byla identifikována molekula CD4Q, jenž je schopna po zasíťování prostřednictvím protilátek indukovat proliferací 3-buněk. Valle a další, Eur. J. Immunol., 19: 1463 až 1467 (1939);

Gordon a další, J. Immunol., 140:1425 až 1430 (1938); Gruber a další, J molekulárně

Immunol., klonována

142 :4144 až 4152 (1939). CD40 byla a charakterizována. Stamenkovic . a další, EM30 J., 8:1403 až 1410 (1989). Protein gp39 (rovněž je nazýván CD40L), jenž je ligandem pro CD4.0, byl rovněž molekulárně klonován a charakterizován. Armitage a další, Nátuře, 357:80 až 32 (1992); Lederman a další, J. Exp. Med., 175:1091 až 1101 (1992); Hollebaugh a další, EMBO J., 11:4313 až 4319 (1992). Protein gp39 je exprimován na povrchu aktivovaných CD4⁺ Th-buněk, ale není exprimován na povrchu klidových CD4*. 176:1543 až 1550

Th-buněk. Spriggs a další, J. Exp. Med., (1992); Lané a další, Eur. J. Immunol., 22:2573.2573 (1992); Roy a další, J. Immunol·., 151:1 až 14 (1993). Buňky trans Ukované genem gp39 a exprimujíci na svém

-4povrchu protein gp39, jsou schopny spustit proliferaci B-buněk, a při dostupnosti dalších stimulačních signálů, mohou indukovat produkci protilátek, víz Armitage a další, Nátuře, 357:80 až 82 (1992); Hollebaugh a další, EMBO J., 11:4313 až 4319 (1992) .

Podstata vynálezu

Pro indukci imunitní odpovědi, pro niž je nezbytná pomoc Th-buňky, jsou velmi důležité povrchové molekuly T-buněk, které zprostředkovávají helperové efektorové funkce závislé na kontaktu. Například interakce molekuly gp39 na povrchu T-buněk s receptorem CD40 na povrchu B-buněk hraje klíčovou úlohu při aktivaci imunitní odpovědi B-buněk vůči určitému antigenu. Vynález je mimo jiné založen na objevu, že povrchové molekuly, které u T-buněk zprostředkovávají na kontaktu závislé helperové efektorové funkce, hrají rovněž rozhodující úlohu při odpovědi T-buněk vůči alloantigenům. Bylo zjištěno, že za vhodných podmínek může mít rušivý zásah do interakce mezi proteinem gp39 a ligandem na povrchu allogenní buňky prezentující alloantigenv T-buňce za následek navození tolerance u T-buňky. Výhodné je, jestliže je allogenní buňka prezentující alioantigeny T-buňce schopna poskytnout signály nezbytné k aktivaci T-buňky pouze prostřednictvím interakce mezi ligandem proteinu gp39 na svém povrchu a proteinem gp39 na povrchu T-buňky. Inhibicí interakce mezi ligandem proteinu gp39 na povrchu allogenní buňky a proteinem gp39 na povrchu T-buňky se zamezí aktivaci T-buňky a navíc dojde k navození tolerance T-buňky vůči příslušnému alloantigenu. Navození tolerance T-buňky vůči alloantigenům kombinací podle vynálezu může být použito jako přípravy na transplantaci tkání nebo orgánů.

Předmětem vynálezu je kombinace zvláště vhodná k indukci (navození) tolerance T-buňky vůči donorově tkáni nebo orgánu v recipientovi této tkáně nebo orgánu. Jedná se o

-5kombinaci 1) určité allogenni nebo xenogenní. buňky, která exprimuje na svém povrchu alespoň jeden donorův antigen a která nese na svém buněčném povrchu ligand, jenž vstupuje do interakcí s receptorem na povrchu recipientovy T-buňky, který zprostředkovává helperové efektorové funkce závislé na kontaktu; a 2) antagonisty této molekuly (receptoru) exprimované na povrchu recipientovy T-buňky, která zprostředkovává helperové efektorové funkce závislé na kontaktu. Zmíněný antagonista inhibuje interakci mezi touto molekulou na povrchu T-buňky a jejím iigandem na povrchu allogenni nebo xenogenní buňky.

Ve výhodném provedení vynálezu je povrchovým T-buněčným receptorem v recipientním organismu, zprostředkovávajícím helperové efektorové funkce závislé na kontaktu, molekula gp39. V popsaném provedení vynálezu je daným antagcnistou molekula, která inhibuje interakci mezi proteinem gp39 na povrchu T-buňky a Iigandem pro protein gp39 na povrchu allogenni nebo xenogenní buňky. Zvláště výhodným antagcnistou molekuly gp39 je protilátka proti proteinu gp39. V jiném provedení vynálezu je antagcnistou molekuly gp39 rozpustná forma ligandů pro protein gp39, například rozpustný protein CD40. Jako allogenni nebo xenogenní buňka, která je podána recipientovi, je nej vhodnější nějaká lymfoidní buňka, například B-buňka. Jinou možností je použití malé klidové B-buňky. Allogenni a xenogenní buňka a antagonista (například protilátka proti proteinu gp39) jsou obvykle recipientovi podávány před vlastní transplantací tkáně nebo orgánu tomuto subjektu. Lymfoidní buňky (například B-buňky) pocházející od donora tkáně nebo orgánu jsou například spolu s příslušným antagonistou podány recipientovi před vlastní transplantací tkáně nebo orgánu tomuto subjektu.

Kombinace podle vynálezu může být například využito k navození tolerance T-buněk vůči transplantovaným tkáním nebo orgánům jako jsou například játra, ledviny, srdce, plíce,

-ekůže, sval, nervová tkáň, žaludek nebo střevo. V jednom případě byly jako transplantovaná tkáň použity pankreatické ostrůvky. Vynález tudíž popisuje kombinace k ošetření cukrovky, které zahrnují 1) aliogenní a xenogenní buňky exprimující donorovy antigeny; 2) antagonistů receptorů na povrchu recipientových Τ-buněk, který zprostředkovává helperové eřektorové funkce závislé na kontaktu. Tímto antagonistou může být například antagonista proteinu gp39 (například protilátka proti proteinu gp39); a 3) donorovy pankreatické ostrůvky.

?oois obrázků

- ...

Obrázek 1 je grafickým znázorněním přeživších transplantovaných ailoštěpů pankreatických ostrůvků u myší s chemicky indukovaným diabetes. Těmto myším byla před vlastní transplantací podána buď samotná protilátka proti proteinu gp39 nebo pouze řrakcionované nebo nefrakcionované aliogenní slezinné buňky. Na ose x jsou vyjádřeny dny od počátku experimentu, zatímco osa y udává kumulativní procento přeživších ailoštěpů. Legenda k symbolům: čára A odpovídá myším jimž nebyly před transplantací podány žádné buňky ani protilátky (N=32), čára S platí pro myši jimž byly podány nefrakcionované slezinné buňky (75 až 83x10®, N=7), čára C jsou myši jimž byla podána 19. frakce slezinných buněk (75 až 83x10®, N=13), čára D platí pro myši jimž byla podána 19, frakce slezinných buněk v množství 40 až 44x10®, N=16) a konečně čára E platí pro myši jimž byla podána samotná protilátka proti proteinu gp39 (N=ll).

Obrátky 2A a 2B jsou grafickým znázorněním přeživších transplantovaných ailoštěpů pankreatických ostrůvků u myší s chemicky indukovaným diabetes. Množství přeživších transplantovaných ailoštěpů bylo stanoveno měřením změny hladiny koncentrace glukosy v plasmě. Těmto myším byla před vlastní transplantací podána jedna dávka frakcionovaných

7allogenních slezinných buněk a současně byla myším podávána protilátka proti proteinu gp39 (MRI) a to po dobu dvou týdnů (obr. 2A) nebo 7 týdnů (obr. 2B). Každá z křivek reprezentuje data získaná od jednoho jedince. Prázdné symboly označují recipienty, u nichž došlo ke spontánnímu odvržení alloštěpu. Plné symboly označují myši, u nichž byly štěpy pankreatických ostrůvků v době ukončení experimentu ještě funkční. Na svislé ose je vyznačena koncentrace glukosy v plasmě uvedená v mg na 100 ml. Na vodorovné ose jsou dny, přičemž počátek osy je v den transplantace štěpu.

Obrázky 3A, B a C jsou záznamy z průtokového cytometru zobrazující lidské lymfocyty periferního krevního oběhu aktivované po dobu 6 hodin a značené buď CD40Ig (obr. 3A) popřípadě monoklonální protilátkou 4D9-3 (obr. 3B) nebo 439-9 (obr. 3C).

Obrázky 4A, 3 a C jsou záznamy z průtokového cytometru zobrazující lidské lymfocyty periferního krevního oběhu aktivované po dobu 6 hodin a kultivované za přítomnosti cykloporinu A, značené buď monoklonální protilátkou 409-3 (obr. 4A) nebo protilátkou 4D9-9 (obr. 43) nebo CD40Ig (obr. 4C) .

Obrázky 5A a B jsou záznamy z průtokového cytometru zobrazující lidské lymfocyty periferního krevního oběhu aktivované po dobu 6 hodin značené CD40Ig za přítomnosti neznačené monoklonální protilátky 4D9-3 (obr. 5A) nebo neznačené protilátky mAb 4D9-9 (obr. 5B).

Obrázek 6 je grafickým znázorněním inhibice proliferace lidských B-buněk indukované pomocí rozpustného proteinu gp39 a IL-4, přičemž tyto buňky jsou kultivovány za přítomnosti monoklonálních protilátek 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 39-76 nebo 89-79 proti lidskému proteinu gp39. Na vodorovné ose je vyjádřena koncentrace použité monoklonální protilátky v mg/ml, na ose svislé je cpm.

-3Obrázek 7 je grafickým znázorněním inhibice allospecifické odpovědi smíšené populace lymfocytů kultivovaných za přítomnosti monoklonálních protilátek 24-31 nebo 89-75 proti lidskému proteinu gp39.

Podrobný popis vynálezu

Tento vynález popisuje kombinaci, která slouží in vivo k indukci tolerance T-buněk recipienta transplantátu vůči donorově transplantované tkáni nebo orgánu. Jedná se o kombinaci 1) určité allogenní nebo xenogenní buňky, která exprimuje na svém povrchu donorovy antigeny a která nese na svém buněčném povrchu ligand, jenž vstupuje do interakcí s receptorem na povrchu recipientovy T-buňky, který zprostředkovává heiperovou efektorovou funkci závislou na kontaktu; a 2) antagonisty této molekuly (receptorů) exprimované na povrchu recipientovy T-buňky, který inhibuje interakci mezi ligandem a příslušným receptorem. Používaný termín recipient označuje subjekt, jemuž bude, je nebo byl transplantován tkáňový nebo orgánový štěp. Podle vynálezu je allogenní buňka definovaná jako buňka získaná z jiného jedince, který ovšem náleží ke stejnému druhu jako recipient, a tato buňka exprimuje alloantigeny lišící se od antigenů exprimovaných na buňkách recipienta. Xenogenní buňka je získána z jedince, který náleží k jinému druhu než recipient, a tato buňka exprimuje xenoantigeny lišící se od antigenů exprimovaných na buňkách recipienta. Donorovými antigeny podle vynálezu se rozumí antigeny exprimované na donorově tkáňovém nebo orgánovém štěpu, který je určen k transplantaci do organismu recipienta. Donorovy antigeny mohou být v závislosti na zdroji štěpu buď alloantigeny nebo xenoantigeny. Allogenní nebo xenogenní buňka podávaná recipientovi jako součást kombinace sloužící k navození tolerance podle vynálezu exprimuje donorovy antigeny. Exprimuje tedy některé nebo všechny antigeny přítomné na

-9donorově tkáňovém nebo orgánovém štěpu, jenž je určen k transplantaci recipientovi. Allogenni nebo xenogenni buňka je výhodně získávána od donora tkáňového nebo orgánového štěpu, ale může být rovněž získána z jednoho nebo více zdrojů, které mají s donorem společné antigenní determinanty.

Kromě allogenni a xenogenni buňky je recipientovi jako součást kombinace k navození tolerance podle vynálezu podáván rovněž antagonista povrchové molekuly T-buněk. Tato povrchová molekula T-buněk zprostředkovává helperové efektorové funkce závislé na kontaktu. Podle vynálezu jako molekulu nebo receptor zprostředkovávající helperové efektorové funkce závislé na kontaktu označujeme molekulu nebo receptor, který je exprimován na Th-buňce a který vstupuje do interakce s ligandem na efektorové buňce (například 3-buňce). Interakce zmíněné molekuly s příslušným ligandem je nezbytná k vytvoření efektorové buněčné odpovědi (například k aktivaci

3-buňky). Nedávno bylo zjištěno, že tato molekula nebo receptor participuje nejen v procesu efektorové buněčné odpovědi, ale rovněž i při odpovědi T-buňky vůči a.ntigenu. Jako molekula na povrchu T-buňky, která zprostředkovává helperovou efektorovou funkci závislou na kontaktu, se výhodně používá protein gp39. Ve výhodných provedeních vynálezu zahrnuje kombinace podle vynálezu allogenni nebo xenogenni buňku a antagonistu proteinu gp39 k podání recipientovi transplantátu. Aktivace T-buněk recipienta prostřednictvím allogenni nebo xenogenni buňky zahrnuje interakci mezi proteinem gp39 na povrchu T-buněk recipienta a ligandem pro protein gp39 na povrchu příslušné allogenni nebo xenogenni buňky. Inhibice této interakce pomocí antagonisty protein gp39 vede k tomu, že T-buňky recipienta nejsou přítomností antigenů donora exprimovaných na allogenni nebo xenogenni buňce aktivovány, ale je u nich spíše navozena tolerance vůči těmto antigenům. Navození tolerance v organismu recipienta vůči antigenům donora tudíž umožňuje úspěšnou transplantaci donorovy tkáně nebo orgánu bez

-10následného odvržení tohoto štěpu, jež by bylo způsobeno reakcí imunitního systému.

V následujících odstavcích jsou podrobně popsána různá provedení vynálezu.

I. Antagonisté proteinu gp39

V kombinaci podle vynálezu je antagonista proteinu podáván recipientovi za účelem narušení interakce proteinem gp39 na povrchu T-buněk recipienta a ligandem protein gp39 na povrchu allogenní nebo xenogenní buňky, například 3-buňky, podávané recipientovi. Antagon proteinu gp39 je definován jako molekula, která narušuje interakci. Antagonistou proteinu gp39 může být protil proti proteinu gp39 (například monoklonální protilátka p proteinu gp39) , fragment nebo derivát takovéto profil proti proteinu gp2 3 (například Fab nebo F(ab)'2 fragme chimérické protilátky nebo humanizované prctilát rozpustné formy ligandu pro protein gp39 (například rozpu CD40), rozpustné formy fúzního proteinu ligandu pro pro gp39 (například rozpustný CD40Ig) nebo farmaceutická a která jsou schopna částečně narušit nebo zcela pře interakci mezi proteinem gp39 a receptorem CD40.

gp3 9 mezi pro j ako ista tuto áčka rot i áčky rty, ky) , stný tein ens, rušit imunizován imunogenní proteinového fragmentu nebo jeho fragmentu), příslušnou

A. Protilátky

Savec (například myš, křeček nebo králík) může být formou proteinu gp39 (například peptidového která je schopna v daném organismu vyvolat humorální imunitní reakci. Jako imunogen může být rovněž použita buňka exprimující na svém povrchu protein gp39. Jako alternativní imunoge.ny slouží purifikovaný protein gp39 nebo jeho proteinové fragmenty. Protein g?39 je možné puriřikovat

-IIz buněk exprimujících tento protein pomocí standardních purifikačních technik. Dále pak může být v hostitelských buňkách, například v bakteriích nebo v nějaké savčí buněčné linií, exprimována gp39 cDNA ( Armitage a další, Nátuře, 357:80 až 82 (1992); Lederman a další, J. Exp. Med., 175:1091 až 1101 (1992); Hollebaugh a další, EMBO J., 11:4313 až 4319 (1992)) a protein gp39 následně puriřikován z příslušné buněčné kultury pomocí standardních technik. Jinou alternativou je přímá syntéza proteinu gp39 podle známé aminokyselinové sekvence ( Armitage a další, Nátuře, 357:30 až 82 (1992); Lederman a další, J. Exp. Med., 175:1091 až 1101 (1992); Hollebaugh a další, EMBO J., 11:4313 až 4319 (1992)) za použití známých způsobů (například E-mcc nebo T-boc chemická syntéza). Způsoby sloužící ke zvýšeni imunogenitv zahrnují například konjugaci proteinu s ' nebo jiné techniky dobře v protein může být například Imunitní odpověď může být aplikován spolu s adjuvans. sledována stanovováním litru příslušné protilátky v séru nebo plasmě. Ke stanovení hladiny protilátek může být použita ELIS?, či jiné standardní imunostanovení, kde jako antigen bude použit příslušný imunogen.

Následně po imunizaci může být získáno antisérum nebo, je-li to žádoucí, mohou být ze séra izolovány polykionální protilátky. Za účelem produkce monoklonáinich protilátek mohou být z imunizovaného zvířete izolovány buňky produkující protilátky (lymfocyty) a jejich následnou fúzi s myeloidními buňkami pomocí standardních postupů sloužících k fúzi somatických buněk můžeme získat imcrtalizované buňkyhybridomv. Způsoby sloužící popsanému účelu jsou dobře známy ze stavu techniky. Příkladem zmíněných postupů je způsob přípravy hybridomů. Tento způsob byl původně vyvinut Kohierem a Milsteinem (Nátuře (1975) 256:495 až 497). Dalšími podobnými způsoby jsou například metoda pro přípravu hybridomů lidských B-buněk (Kozbat a další, Immunol. Today (1983) 4:72), metoda pro přípravu hybridomů produkujících lidské monoklonální protilátky pomocí ZBV (Cole a další Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Blisš, ínc., stránky 77 až 9ój a screening kombinovaných knihoven protilátek (Huse a další, Science (L939) 246:1275).

Hybridomy produkující protilátky specificky reagující s daným proteinem nebo peptidem mohou být rozpoznány a příslušné protilátky následně izolovány.

Podle vynále označení fragmentu proteinem gp39, je Protilátky mohou způsobů a použiteZ určena stejným způ Například c(ab':Z zu je termín protilátka používán i k této protilátky, jenž specificky reagují s no fragmentem nebo různím proteinem gp39. být rozštěpeny za použití konvenčních .nost takto získaných fragmentů může být obem jako u intakcr.ích molekul protilátek, fragmenty mohou být připraveny působením pepsinu na protilátku. J mohou být redukovány dis; vznik Pab' fragmentů. T používán rovněž k ozna: molekul, které mají rozeznávající pro protein akte připravených P(ab')2 fragmentů Lfidické můstky, což má za následek rmín protilátka je podle vynálezu ani nespecifických a chimérických : své molekule úsek specificky gp3 9.

protilátky jsou tyto využívány subjektech, celková dokonce

Jsou-li u lidí produkované v jiných než lidských protilátky v rozdílné míře rozpoznány jako cizorodé a tudíž u daného pacienta existuje možnost vzniku imunitní reakce. Jedním z přístupů, jenž je výhodnější než imunosuprese, používaných k minimalizaci nebo eliminaci tohoto problému je produkce chimérických derivátů protilátek, tzn. protilátek, které ve své molekule obsahují variabilní oblast jiného než lidského subjektu a lidskou konstantní oblast. Chimérické molekuly protilátek mohou například obsahovat doménu zodpovědnou za vazbu antigenu odvozenou z myší nebo krysí protilátky nebo protilátky nějakého jiného druhu, spolu s lidskou konstantní oblastí.

-1 3Bylo popsáno velké množství přístupů sloužících k přípravě chimérických protilátek a tyto přístupy mohou být použity k přípravě chimérických imunogloculinovou variabilní rozpoznat protein gp39. Viz.

protilátek obsahujících oblast, která je schopna například Morrison a další,

Proč. Natí. Acad. Nátuře 314.452 (2 4,416,567;

)ci. USA. 31:6851 (1935); Takeda a další,

1935); Cabilly a další, U. S.

Boss a další, U. S. Patent No.

Tanaguchí a další, Europian Patent Publication EP171496; Europían Patent Pubiication 0173494, United Kingdom Patent GB 2177096B. Předpokládá se, že tyto chimérické protilátky by

Patent No. 4,316,397;

měly být pro člověka méně non-chimérické protilátky.

imunogenní něž odpovídající

Jsou-li monoklonální nebo chimérické specificky reagující s proteinem gp39 nebo jeho peptidovým fragmentem určeny k léčbě lidí, mohou být tyto protilátky dále humanizovány tak, že jsou vytvořeny chimérické variabilní oblasti, kde část této variabilní oblasti, zvláště pak konzervované peptidové úseky domény vážící antigen, je lidského původu, a jiného než lidského původu jsou pouze hypervariabiiní úseky. Takto pozměněné imunoglobuiinové molekuly mohou být připraveny některou z mnoha v současné době známých technik (například Teng a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 33:7303 až 7312 (1933); Kozbor a Immunology Today, 4:7279 (1933); Olsson a další,

Enzymol., 92:3 až 16 (1932)) a výhodně rovněž technikou popsanou v PCT Publication W092/06193 nebo EP0239400. Humanizované protilátky mohou být komerčně připraveny například firmou Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Velká Erifánie.

protilátky další,

Meth.

Jiným způsobem sloužícím protilátek (nebo jejich fragmentů) jeho peptidovému fragmentu, je k přípravě specifických proti proteinu gp39 nebo screening (právě pomocí proteinu gp39 nebo jeho peptidového fragmentu) expresních

-14knihoven kódujících imunoglobulinové geny nebo jejich části exprimované v bakteriálních buňkách. Kompletní Fab fragmenty, VH oblasti a FV oblasti mohou být například exprimovány v bakteriích za použití fágových expresních knihoven. Viz. například Ward a další, Nátuře, 341: 544 až 546 (1939); Huse a další, Science, 246:1275 až 1231 (1939); a McCafferty a další, Nátuře, 343:552 až 554 (1990). Screening takových knihoven pomocí, například, peptidového fragmentu proteinu gp39 může indentifikovat imunoglobulinové fragmenty reagující s proteinem gp39. Jinou možností k produkci protilátek nebo jejich fragmentů je využití SCID-hu myší (Genpharm).

Metodologie pro produkci monoklcnálních protilátek proti proteinu gp35, . a to jak proti lidskému proteinu gp39 tak proti myšímu gp39, jakož i monoklonální protilátky vhodné k použití v kombinacích podle vynálezu, jscu podrobně pcpsány v Příkladu 2.

Podle vynálezu jsou k navození antigen-specifické tolerance T-buněk výhodně použity monoklonální protilátky proti lidskému proteinu gp39. Mezi výhodné protilátky patří monoklonální protilátky 3E4, 2H5, 2H3, 439-3, 4D9-9, 24-31, 23-43, 89-76 a 89-79, popsaná v Příkladu 2. Zvláště výhodné protilátky jsou monoklonální protilátky 89-76 a 24-31. Hybridomy 89-76 a 24-31 produkující protilátky 39-75 a 24-31 byly umístěny podle ustanovení Budapešťské smlouvy u ATCC (American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., 2. září, 1994). Hybridom 89-76 byl uložen pod číslem HB11713 a hybridom 24-31 byl uložen pod číslem HB11712. Protilátky 24-31 a 89-76 jsou protilátkami izotypu IgGj..

V jiném provedení vynálezu se monoklonální protilátka proti lidskému proteinu gp39 používaná v kombinaci podle vynálezu váže na epitop rozpoznávaný monoklonální protilátkou vybranou ze skupiny sestávající z monoklonálních protilátek 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 a 89-79. Výhodněji se monoklonální protilátka proti lidskému proteinu

-15gp39 váže na epitop rozpoznávaný monoklonální protilátkou 24-31 nebo monoklonálrtí protilátkou 39-76. Schopnost monoklonálních protilátek vázat se na epitop rozpoznávaný některou z dříve zmíněných protilátek muže být stanovena standardními kompetitivními vazebnými testy. Například protilátka, která se váže na epitop rozpoznávaný rovněž monoklonální protilátkou 24-31, bude se značenou protilátkou 24-31 kompetovat o vazbu na povrch aktivovaných T-buněk, kdežto protilátka, která se váže na epitop odlišný od epitopu rozpoznávaného monoklonální protilátkou 24-31, se značenou protilátkou 24-31 kompetovat nebude.

3. Rozpustné ligandy proteinu gp39

Mezi jiné antagonisty proteinu gp39 oodávánv za účelem navození které mohou bvt tolerance T-buněk, náleží rozpustné formy ligandu pro protein gp39. Monovaientní rozpustný ligand proteinu gp39, jako například rozpustný receptor CD40, se může vázat na protein gp39 a tudíž může inhibovat interakci mezi proteinem gp39 a receptorem CD40 na povrchu 3-buněk. Termín rozpustný⁷' označuje skutečnost, že ligand není trvale ascci Rozpustný ligand pro pros n s pissmatickou memoranou. i gp39 může být syntetizován chemickou cestou nebo výhodně Domoci rekombinantnícn DNA technik, například extracelulární doména tak, ze je expnmovana pouze příslušného ligandu (zcela· chybí transmembránové a cytoplasmatická doména). Upřednostňovaným rozpustným ligandem proteinu gp39 je rozpustný receptor CD40. Jinou možností je použití fúzního proteinu jako rozpustného ligandu pro protein gp39. Takový různí protein tvoří alespoň část ligandu proteinu gp39 připojená k jiné molekule. Například receptor CD40 může být exprimován jako fúzní protein s imunoglobuiinem (například fúzní protein CD40Ig). V jednom provedení vynálezu je vytvořený fúzní protein složen z aminokyselinových zbytků extracelulární domény části CD40 a na tuto strukturu jsou připojeny aminokyselinové zbytky

-16úseku, který odpovídá pantové, CH2 a CH3 oblastem těžkého imunoglobulinového řetězce, například Cgl. Vzniklý fúzní protein označujeme CD40Ig (viz. například Linsley a další (1991) J. Exp. Med. 1733:721 až 730; Capon a další (1939) Nátuře 337, 525 až 531; a Capon U. S. 5, 116, 964). Fúzní protein může být syntetizován chemickou cestou nebo výhodněji za použití rekombinantních- DNA technik využívajících cDNA molekuly CD40 (Stamenkovic a další, EM30 J., 8:1403 až 1410 (1939)).

II. Buňky používané k navození antigen-specifické tolerance

Tento vynález je, alespoň z části, založen na objevu, že za přízomnosti antagonisty proteinu gp39 má prezentace alloantigenů T-buňkám prostřednictvím allogenních buněk za následek navozeni tolerance T-buněk vůči alloantigenům. Mezi buňky schopné navodit tímto mechanismem toleranci T-buněk náleží ty buňky, kzeré prezentují antigen a aktivují T-buňky prostřednictvím interakce s proteinem gp39 (tzn., že interakce mezi proteinem gp39 na povrchu T-buněk a ligandem proteinu g?39 na povrchu prezentujících buněk je nepostradatelná pro přenos signálů nezbytných k aktivaci T-buňky). Inhibice interakce mezi ligandem na povrchu allogenní nebo xenogenní buňky a proteinem gp39 na povrchu T-buněk recipienta zamezí aktivaci T-buňky alloantigenem nebo xenoantigenem a navodí spíše toleranci T-buňky vůči příslušným antigenům.

Při podání kombinace podle vynálezu je tudíž recipientovi podána allogenní nebo xenogenní buňka. Tato allogenní nebo xenogenní buňka je schopna prezentovat recipientovým T-buňkám určitý antigen. Jako příklad těchto buněk může sloužit B-lymřocyt, profesionální antigen prezentující buňka (například monocyt, dendritická buňka, Langerhansova buňka) nebo i jiná buňka prezentující antigen buňkám imunitního systému (keratinocyt, endotheliálni buňka, astrocyt,

-17fibroblast, oligodendrocyt). Dále je výhodné, aby allogenní nebo xenogenní buňka měla sníženou schopnost stimulace kostimulačního signálu v T-buňkách recipienta. Allogenní nebo xenogenní buňka může například úplně postrádat kostimulační molekuly, jako například proteiny rodiny B7 (například B7-1 a B7-2), nebo může tyto molekuly exprimovat na svém povrchu jen v omezeném počtu. Bxprese kostimulačních molekul na povrchu potenciálních allogenních nebo zenogenních buněk používaných v kombinaci podle vynálezu může být stanovena pomocí standardních technik, například průtokovou cytometrií za použití protilátek proti těmto ko stimulačním, molekulám.

K výhodným allogenním nebo xenogenním buňkám používaným k navození tolerance T-buňky patří lymfoídní buňky, například Ivmfocyty periferního krevního oběhu nebo siezinné buňky. K výhodným lymfoidním buňkám používaným k navození tolerance <y. B-buňky mohou býz ze směsi obsahující < (například jiných typů buněk přízemných :ě) purif ikovány

T-buňky patří B-buň různé populace bur.ě

v periferním krev	ním	oběhu nebo	ve sle;
použitím standardu.	ích	separačních	technik.
buňky mohou být	cd	populace d:	ífúzních
kultivací slezinu	yZh	buněk v	kultivač

;h plastikových miskách. T-buňky mohou být ze směsi obsahující různé populace buněk odstraněny použitím protilátky proti T-buňce (například protilátka proti Thyl.l a/nebo protilátka proti Thy 1.2) spolu s komplementem. V jednom provedeni vynálezu jsou jako antigen prezentující buňky použity klidové lymfoídní buňky, výhodněji pak klidové B-buňky. Klidové lymfoídní buňky, jako například klidové 3-buňky, mohou být izolovány pomocí v současnosti známých způsobů, například pomocí způsobů využívajicích malou velikost a vysokou hustotu těchto buněk. Klidové lymfoídní buňky mohou být například izolovány použitím protiproudového centrifugačního propírání (counterflow centrifugal eíutriation) popsaném v příkladu 1. Při použití protiproudového centrifugačního propírání může být populace malých klidových lymfoidních buněk zbavená buněk

-18schopných aktivovat imunitní odpověď T-buňky získána sběrem frakcí při průtoku 14 až 19 ml/min., výhodněji pak sběrem frakcí při průtoku 19 ml/min. (při 3,200 ot/min). Jinou možností izolace malých klidových lymfocytů (například

3-buněk) je použití centrifugace v diskontinuálním hustotním gradientu. Jako gradient je možné použít například komerční preparáty Ficoll nebo Percoll a po centrifugací získáme vrstvu obsahující malé klidové lymfocyty. Malé klidové lymfocyty mohou být rovněž od aktivovaných B-buněk rozlišeny na základě přítomnosti/nepřítomnosti kostimulačních molekul, jako například B7-1 a/nebo B7-2, jenž jsou exprimovány pouze na povrchu aktivovaných 3-buněk, a to použitím standardních technik (například imunofiuorescence).

Úkolem allogenních nebo xenogenních buněk podávaných recipientovi je, alespoň z části, prezentace donorových antigenů T-buňkám recipienta. Tyto buňky tudíž na svém povrchu exprimují antigeny přítomné rovněž na donorově tkáni nebo orgánu. Této skutečnosti je obvykle dosaženo použitím allogenních nebo xenogenních buněk získaných z donorova tkáňového nebo orgánového štěpu. V kombinacích podle vynálezu mohou být použity například lymfoidní buňky periferního krevního oběhu, 3-buňky nebo slezinné buňky izolované z donorovy tkáně nebo orgánu. Jinou možností je získání allogenních nebo xenogenních buněk ze zdroje, který není donorem tkáně nebo orgánu, jestliže ovšem tyto buňky mají s tkání nebo orgánem donora společné antigenní determinanty. Mohou být například použity allogenni nebo xenogenni buňky, které exprimují (většinu nebo všechny) antigeny hlavního histokompatibilního komplexu shodné s odpovídajícími antigeny na donorově tkáni nebo orgánu. Jako zdroj allogenních nebo xenogenních buněk může tedy fungovat subjekt, který má stejný MHC haplotyp jako donor tkáně nebo orgánu (například blízký příbuzný donora štěpu).

-19III. Podávání buněk a antagonistů proteinu gp39

Podle vynálezu může být tolerance T-buněk vůči orgánu nebo tkáňovému štěpu vyvolána, když se příjemci transplantátu podá antagonista proteinu gp39 společně s allogenní nebo xenogenní buňkou, která exprimuje dárcovy antigeny a interaguje s T-buňkami příjemce přes protein gp39. Ve výhodném provedení vynálezu jsou allogenní či xenogenní buňka a antagonista proteinu gp39 podány příjemci současně. Eventuelně může být antagonista proteinu gp39 podán před allogenními či xenogenními buňkami, například je-li antagonistou protilátka s dlouhým poločasem života. V jiném výhodném provedení vynálezu jsou antagonista a allogenní či xenogenní buňky podány příjemci před transplantací orgánu nebo tkáně tomuto příjemci Itzn. že je příjemce předem vystaven působení antagonisty a buněk). Podání aliogenních či xenogenních buněk a antagonisty může býc například provedeno několik dní (například pět až osm dní) před transplantací tkáně nebo orgánu.

Bylo zjištěno, že podání jediné dávky aliogenních buněk (v kombinaci s antagonistou) je dostačující pro vyvolání tolerance T-buněk k káni či orgánu dárce (viz příklad 1). Počet podaných buněk se může měnit v závislosti na typu použitých buněk, na typu tkáňového nebo orgánového štěpu, hmotnosti příjemce, na celkovém stavu příjemce a dalších odborníkům známých proměnných. Vhodný počet buněk použitý v kombinaci podle vynálezu může být určen odborníkem pomocí konvenčních způsobů (například tak, jak je to popsáno v příkladě 1). Buňky jsou podávány v takové formě a takovým způsobem, které jsou vhodné pro indukci tolerance T-buněk v příjemci. Mohou být podávány ve fyziologicky akceptovatelném rozcoku jako je například pufrovaný fyziologický roztok nebo podobné médium. Výhodným způsobem podávání buněk je intravenózní aplikace.

Pro vyvolání tolerance Τ-buněk podle vynálezu je subjektu podáván antagonista v biologicky kompatibilní formě vhodné pro farmaceutické podávání in vivo. Biologicky kompatibilní formou vhodnou pro podávání in vivo se míní forma antagonisty, který má být podáván, jejíž terapeutické subjekt vyvolána nad toxickými.

Termín ucmky převazuji zahrnuje živé organismy, ve imunitní odpověď, například savce. Překlady subjektu zahrnují lidi, psy, kočky, myši,·potkany a jejich transgenní druhy.

muže být může být podáván v jakékoliv případné s farmaceuticky akceptovatelným nosičem. Podávání terapeuticky aktivního množství antagonisty je definováno jako množství, které je

Antagonista proteinu gp39 farmakologické formě, v takovém dávkování a v takových cascvvcn výsledku množství perioaacn, (naoříklaď které jsou nutné k dosažení požadovaného tolerance T-bunek·. Terapeutické antagonisty proteinu gc39 rútě kolísat například v závislosti na faktorech jako jsou nemoc, věk, pohlaví a hmotnost daného individua a také na schopnosti antagonisty vyvolat požadovanou odpověď v tomto individuu. Dávkovači režim může být nastaven tak, aby byla vybavena optimální terapeutická odpověď. Například může být denně podáváno více rozdělených dávek nebo daná dávka úměrně zmenšena podle toho, jak to vyžaduje terapeutická situace. Efektivní léčebný režim může podání protilátky před transplantací (například pět až osm dní před transplantací), následované dalším podáváním protilátky (například každý další den) po dobu několika týdnů (například dvou až sedmi týdnů! po transplantaci (viz příklad 1, kde je použita protilátka proti proteinu gp-39) .

Aktivní látka (například antagonista, kterým může být protilátka) může být podávána různým, způsobem, v závislosti na situaci - například injekci (subkutánní, intravenózní atd.), perorálně, rektálně, dále může být ir.halována nebo aplikována transdermálně. 7 závislosti na způsobu podávání zahrnovat počáteční tkáně nebo orgánu

-21může být aktivní látka potažena materiálem, který ji chrání před působením enzymů, kyselin a dalších přirozených vlivů, které mohou inaktivovat aktivní látku. Výhodným způsobem podání je intravenózní injekce.

Pokud je antagonista proteinu gp29 podáván jinak než parenterálně, může být nutné povlečení antagonisty materiálem, či spolu s antagonistou podat i materiál, který chrání jeho inaktivaci. Antagonista může být individuu podán například ve vhodném nosiči či rozpouštědle nebo mohou být spolu s antagonistou podávány inhibitory enzymů či příslušný nosič jakým jsou například liposomy. Mezi farmaceuticky akceptovatelná rozpouštědla patří fyziologický roztok a pudrované vodné roztoky. Mezi inhibitory enzymů patří inhibitor pankreatickéno trypsinu, di-isopropyl-fluorofcsfát (DE?) a trasylol. Liposomy se rozumí emulze voda-olej-voda stejně jako konvenční liposomy (Strejan a ost. , (1934) J. Neuroimmunoi 7:27).

Aktivní látka může být také podávána parenterálně nebo intraperitoneálně. Disperze mohou být připraveny také v glycerolu, kapalných polyethylenglygclech, jejich směsích, a v olejích. Za běžných podmínek uskladnění a použití mohou tyto preparáty obsahovat ochranné prostředky k zabránění růstu mikroorganismů.

Mezi farmaceutické směsi vhodné pro injekční použití patří sterilní vodné roztoky (u iátek rozpustných ve vodě) či disperze a sterilní sypké směsi pro rychlou přípravu sterilního injekčního roztoku nebo disperze. V každém případě musí být směs sterilní a musí být tekutá do té míry, aby byla umožněna snadná injekční aplikace. Musí být stabilní za podmínek výroby a uskladnění a musí být chráněna před kontaminací mikroorganismy jako jsou bakterie či houby. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní médium obsahující například vodu, ethanol, polyalkoholy (například glycerol, propylenglykol a kapalný polyethylenglykol apod.) a jejich vhodné směsi. Vhodná viskozita může být udržována například použitím emulgátorú jako je lecitin, zachováním požadované velikosti částic v připadá disperze a použitím surfaktantů. Ochrana před působením mikroorganismů může.být zajištěna použitím různých antibakteriálních a fungicidnícn činidel, například parabens, chiorbufar.clu, zenclu, kyseliny as,korbové, thimerosalu apod. V mnoha případech bude výhodnější, bude-li směs obsahovat isotonická činidla jako jsou například cukry, polyalkohoíy jako je manitol, sorbitol a nebo chlorid sodný. Prodloužení ab-sorbce injekční směsi může být dosaženo přidáním takových činidel, která zpožďují absorbci, například monostearanu hlinitého a želatiny.

Sterilní injekční roztoky inkorporací. požadovaného množszví do vhodného rez mcnou cyt připravovaný akzivní iázkv (nacříkiad antagonisty proteinu gp3S^; kombinací výše zmíněných roztoky mohou býz dále upravován Obecně jsou disperze připravovány inkerporazí aktivní látky do sterilního pojidla, které obsahuje výše jmenované základní disperzní médium a další požadované složky. V případě sterilních sypkých směsí určených pro přípravu sterilních injekčních roztoků jsou výhodnými způsoby přípravy vakuové sušení a sušení za zmrazeného stavu. Tyto způsoby poskytují sypkou směs, která obsahuje danou akzivní složku (například antagonistu). Po přidání sterilně filtrovaného roztoku může být tato sypká směs obohacena i o libovolnou další požadovanou ingredienci.

zušzědla, spolu s zeriiní inžakční

Pokud je aktivní sloučenina patřičně chráněna, jak je popsáno výše, může být protein podáván peroráíně, například s inertním rozpouštědlem nebo s poživazeiným nosičem. Farmaceuticky akceptovatelný nosič podle vynálezu zahrnuje všechna rozpouštědla, disperzní média, povlaky, antibakteriální a fungicidní činidla, isotcr.izká a absorbci prodlužující činidla apod. Použití zé-b.zo médii a činidel pro

-23farmaceuticky aktivní substance je známo ze stavu techniky. Je zvažováno použití konvenčních médií a činidel v terapeutických směsích. Výjimku tvoří taková média a činidla, která jsou nekompatibilní s aktivní sloučeninou. Dodatečně mohou být aktivní sloučeniny inkorporovány do směsí.

Zvláště výhodné je směsi pro mimostřevní aplikaci připravit v jednotkové dávkovači formě z důvodů snadného podávání a jednotnosti dávkování. Jednotková dávkovači forma podle vynálezu odpovídá fyzicky diskrétním jednotkám, které jsou vhodné jako jednotko dávkování pro léčbu savců. Každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivní látky ve spojení s potřebním farmaceutickým nosičem. Toto množství aktivní látky je vypočítané tak, aby byl vyvolán požadovaný terapeutický efekt. Údaje pro jednotkové dávkovači formy vynálezu jsou přímo závislé (a) na charakteristikách aktivní látky a na terapeutickém efektu, který má být dosažen, vymezeních daných technikou přípravy takových sloučenin jako je aktivní látka používaná pro léčení senzitivity.

Dcnorova tkáň nebo orgán jsou konvenčními způsoby transplantovány příjemci transplantátu současně s popsaným tolerizačním režimem nebo po něm.

spsciricicýcn specifickém a (b) na

VI. Použití kombinací podle vynálezu

Kombinace podle vynálezu jsou aplikovatelné při různých transplantacích tkání a orgánů. Mohou být používány k navození tolerance T-buněk příjemce orgánového nebo tkáňového štěpu, pocházejícího z následujících tkání a orgánů : Langerhansovy ostrůvky slinivky břišní, játra, ledviny, srdce, plíce, kůže, svaly, nervová tkáň, žaludek a střeva. Kombinace podle vynálezu tedy mohou být používány při léčení takových onemocnění či stavů, které vyžadují transplantaci tkáně nebo orgánu (například transplantace jater při

-24hypercholesterolemii, transplantace svalových buněk při svalové dystrofii, transplantace nervové tkáně při Huntingtonově či Parkinsonově chorobě atd. ) . Ve výhodném provedení jsou transplantovanou tkání pankreatické ostrůvky.

Vynález tedy popisuje kombinaci pro léčení cukrovky pomocí transplantace buněk pankreatických ostrůvků. Kombinace podle vynálezu tedy zahrnuje:

1) allogenní či xenogenní buňky, které exprimují donorovy antigeny,

2) antagonistů molekuly exprimované na povrchu T-buněk recipienta, která zprostředkovává helperovu efektorovu funkci závislou na kontaktu, příkladem takového antagonisty je antagonista proteinu gp39 (například protilátka proti proteinu gp39) a

3) donorově buňky pankreatických ostrůvku.

Allogenní či xenogenní buňky a antagonista jsou, pokud 1 možno, recipientovi podávány před podáváním pankreatických o s t růvkú.

Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které však vynález neomezují.

Příklad 1: Vyvolání tolerance recipienta vůči štěpům z pankreatických ostrůvků působením aliogenních buněk a protilátky proti proteinu gp39

Současné allotransplantační studie závisí na celkové imunosupresi, která nespecificky potlačuje imunitní I efektorové funkce. Imunosupresivní léky však mohou vyvolávat E podstatné vedlejší efekty. Navíc bylo prokázáno, ze

imunosuprese	je nevhodná	při	allotranspla	ntaci
Langerhansových	ostrůvků,	používané	při	léčení cukrovky	(viz
například Robertson, R.	P. (1992)	N.	Engl. J. Med.	327,
1861). Terapie	pomocí	protilátek	proti T-buňkám	mohou - |

-7=.umožňovat úspěšnou transplantaci allogenních štěpů u hlodavců, ale tento přístup má stejně za násLedek celkovou imunosupresi (Carpenter, C. 3. (1990; M. Engl. J. Med. 322, 1224, Roark, J. H. a osf. (1992) Transplantation 54, 1098, Kahan, 3. D. (1992) Curr. Opin. immunol. 4, 553). V tomto příkladě byla v recipientovi transplantátu indukována tolerance vůči alioštěpům ovlivněním prezentace alloantigenu T-buňkám. V důsledku tohoto ovlivnění je zabráněno jejich aktivaci. Přežívání alloštšců z cankreatickýcn ostrůvků v myších, u kterých byla chemicky indukována cukrovka C57BL/6 (H-2b) bylo ověřováno použitím následuj icích způsobů:

indukce cukrovky

Cukrovka u myší C5731/6J !?

indukována podáním Streetczotoc: cukrovky bylo ověřováno měřením glukosy, přičemž pra cukrovku tyči: od 400 mg/100 ml. Měření byla prov; t ýdne.

i samčího pohlaví byla (140 mg/kg). Trvání lasmatické koncentrace byiy považovány hodnoty a třikrát během jednoho

Erakcionace allogenních buněk sleziny

Reakci štěpu proti hostiteli bylo zabráněno tím, že dárci allogenních buněk, určených pro předběžné ošetření příjemců štěpů, byli získáni z (C57 x BAL3/c)(H-2b/d)Fi hybridních zvířat. Malé lymfoidní buňky byly izolovány tak, že suspenze slezinných buněk staré alespoň 8 týdnů (C57 x BALB/c) F1 myší samičího pohlaví tyly zbaveny erytrocytů a pak frakcionovány podle velikosti propíráním (eiutriation), jak popisuje Tony, Η. P. a ost. (1985) J. Exp. Med. 161, 223, a Gosseiin Ξ. J. a ost. (1908) J. immunol. 140, 1403. Malé lymfocyty byly izolovány pomocí protiproudového centrifugačního propírání například za použití modelu centrifugy J-6B (Beckman Instruments, Palo Alto CA). Přibližně 1 až 5x103 buněk v 3 mi kultivačního média nebo

-26vyváženého solného roztoku s 1, 5% fetálr.ím hovězím sérem je

ieno do	propírací
dového	toku 13,
3, 200	rpm při
malých	buněk je
ten velmi málo

:pány. To	bylo
ecifickvmi	pro
-
Lmi s K-b	(D10 .
alioštépu	byly

komůrky s počáteční rychlostí protistou 5 ml/min a roztočeny konstantní rychlostí teplotě 4°C. Průtoková rychlost trakce typicky 14 až 19 ml/min. Tato frakce je kontaminována velkými buňkami. Konkrétní rychiost toku může záviset na médiu, ve kterém jsou buňky suspendovány. V experimentech, které jsou popsány zde, byla trakce malých buněk odebírána při průtokové rychlosti 19 ml/min (3,200 rpm). Veškeré doplňkové buněčné funkce sloužící k radiační resistenci (3000 rad) byly ověřeno buněčnými liniemi T-iymfccytů králičí IgG a H.d (CDC35) nebo alioreaktrvnim:!

G4). Před injikováním dc ocasní žíly příjemce malé buňky a nefraksionované buňky dvakrát promyty v médiu, které neobsahovalo sérum. 3ylo používáno přibližně 40—100x10* (C57 x BALB/c)F1H-2b/d) nefrakcionovaných buněk nebo

40-100x10° (C57 x BALB/c)FI(K-2b/ď propraných malých slezinných buněk.

Předběžné ošetření recipientů štěpu

Příjemci štěpu byli předem ošetřeni buď nefrakcionovanými (C57 x BALB/c)FI(K-2b/d) allogenními slezinnými buňkami, propranými (trakce 19) malými slezinnými buňkami, které byly zbaveny APC aktivity (izolovanými tak, jak je popsáno výše), a monoklonální protilátkou proti proteinu gp39 (MRI, viz příklad 2, experiment 3), nebo kombinací allogennícň buněk a protilátky proti proteim gp39. 19. trakce buněk byla testována ve dvou odlišných rozsazích dávek. Při nízkých dávkách 40 až 44x10* buněk a při vysokých dávkách 77 až bďxiO¹ buněk. Kontrolní zvířata nedostala ani allogenní buňky, ani protilátky. Allogenní buňky byly příjemci štěpu injik:vány do ocasní žíly pět až osm dní před transplantací allostěců z pankreatických ostrůvků. Protilátka MR1 byla myším podávána uvakrát týdně v dávkách 250 pg/myš. Počátek imunizace byl sedm dní před transplantací a imunizace dáie pokračovala po dobu 2 až sedmi týdnů nebo dokud nebyl štěp odmítnut. První dávka protilátky byla myším injikována tentýž den jako první dávka allogenních slezinnvch buněk.

Transplantace allogenních štěpů z pankreatických ostrůvků

Allogenni pankreatická ostrůvky z myší 3ALB/c (H-2d) štěpení pomocí kolagene; recipientních myší C57B1/Ó0 implantovány ostrůvky hmotnosti recipienta schopností udržet koncentr v mnczst·/ _

D τϊ- -^; -

obem podle práce	Gottlieb P.
!43, využívajícím	částečného
Oo subrenálníc’	h kapsuli
Z d)by i y o kamži t ě	po izolaci
— 4 . ·» . o. ostruvuu na	jeden gram
ostrůvků bylo	definováno
kosy v plasmě pod	200 mg/ml.
byiy jednotlivé	recipientní

Výsledky

V první sadě experiment; myši před vlastní implantací allogenních štěpů ošetřeny buď allocenními slezinnvmi buňkami orctt_atkou oroti proteinu gp39. Jak je patrné z obrázku 1, u myší, které nebyly předem ošetřeny slezinnvmi buňkami, dcšlo odhojení všech allogenních štěpů do 13 dní po transplantaci. Poměrně výrazné odhojování bylo možno pozorovat rovněž u zvířat, které byly ošetřeny pouze nefrakcionovanými slezinnými buňkami s normální APC aktivitou (6ó3 dni, rozsah 4 až 12 dní, N=7), nebo’ malými dávkami (40 až 44x10’) buněk z 19. frakce síezinných buněk bez APC aktivity (7 + 3 dni, rozsah 3 až 14 dní, N=16). Naproti tomu injekce velkých dávek (75 až 88xl0^á) těchto buněk z 19. frakce malých síezinných buněk bez APC aktivity prodloužily dobu přežití alloštěpů na 19+10 dní při rozsah 7 až 4 0 dní, M=I6. Tento vliv na dobu přežití štěpů se ukázal jako statisticky významný ;P3, 58=17, 3, p<0,001)· ve srovnání se skupinami, ošetřeny, nebo byly ošetřeny celým spek: nebo malými dávkami frakcionovaných sple: takto ošetřených myší nelze mluvit o tr: Z delšího, nicméně časově omezeného ořež. pankreatických ostrůvků v příjemcích z. malých slezinných buněk bez A?C aktiv! tyto buňky samy o sobě nemohou zajisti Další skupina recipientů štěpů byla oš88xl0⁶ buněk z 20. frakce. Tato frakce rovněž tvořena malými lymfocyty, ale z tím, že obsahuje měřitelnou aktivito (6 myší) odhojili transplanrzvané štěpy za 8, 5 dne, rozsah ó až 12 čni; . lalš byla před zranspia.zzací štěpů ošetřena protilátkou MRI pro z i proteinu ?p39. Obrbylo těmito recipienty v průběhu 13 d: implantovaných alicšzěpů. Zbývající zachovala funkční štěpy ještě v době u· dnech. Z výsledků vyplývá, že podání protilátky MRI proti proteinu g?39 rez

muže prodloužit	dobu	ořež;t i allos
ostrůvků (průměr	on Zu o 6-	19 dní, rozsah 9
Míra prodloužení	DvUa	statisticky pode
bylo dosaženo po	podání	vyšších dávek sl
frakce, a byla rovněž výrazně delší než

v dalších třech pokusných skupinách (p<2,

Ve výše popsané sérii experiment: podání vysoké dávky slezinných buněk be frakce) nebo monoklonální protilátky przt prodloužit dobu přežití alloštěpů pankze srovnání s postupem, kdy transplantát; příprava. Nicméně ukazuje se, že žádný : kterém se samostatně podává pzuze jedna dostatečně účinný při indukzi dl·: uh eré nebyly předem am slezinných buněk zytů. Nicméně ani u lem přijmutí šzěpu. i štěpů allogenních z ien ých 19. zra kci ; ize usuzovat, že přežití alloštěpů. řena injekcí 77 až a z převážné části frakce 19 se liší Všichni recipienti kam.ž i i ě · v p růmě ru skucina recioientů czuze mcnckicnální

zkusná zvířata- si .cení pokusu po 48 metné monoklonální ientnímu organismu pů pankreatických .ž nekonečno, N=5) . .á prodloužení jež dnnýcn buněk z 19. zzdioužení dosažené bylo dokázáno, že A?C aktivity (19. proteinu gp39 může z.zkych ostrůvků ve nepředchází žádná úsob přípravy, při i z i má složka není i: bé tolerance k alloštěpům pankreatických ostrůvků. Výsledky znázorňuje obrázek 2, kde každá křivka znázorňuje data platná pro jednu z pokusných myší. Prázdné symboly platí pro myši, u kterých došlo ke spontánnímu odmítnutí stepů, zatímco vyplněné symboly znázorňují zvířata, jejichž pankreatické alloštěpy bviv funkční v době ukončení experimentu. Obrázek 2 (část B) znázorňuje, že neomezené doby přežití štěpů bylo dosaženo u zvířat 7 týdnů ošetřovaných monoklonální protilátkou proti proteinu gp39 a jednou injekcí slezinných buněk bez APC aktivity z frakce 19 (N=o). Zkrácení doby, po kterou byly podávány monoklonální protilátky proti proteinu gp39, zmenšilo poněkud pozitivní účinek na přijmutí štěpů, nicméně tento účinek byl· stále patrný. Neomezené doby přijmutí štěpů bylo dosaženo u šesti z osmi pokusných zvířa^- doba podávání mcncklcnální protilátky pro: zkrácena ze sedmi na dva týdny v kcmbinac frakce slezinných buněk ^obrázek 2, čás životnosti aiioštěoů bylo dosazeno rov:

u kterých byla proteinu gp39 s podáním 19. A). Neomezené pnj emcu ošetřovaných podáváním monoklonální protilátky proti proteinu gp39 po dobu neoo vano s jednou injekcí nefrakcroncvanycr. a-iogennxcn siezonnycn ounex.

Funkčnost štěpů pankreatických ostrůvků a absence jakékoli přirozené sekrece insulinu pankreatickými ostrůvky, které by přežily ošetření streotozotccinem, byla ověřena tak, že byly zvířatům odebrány ledviny, ve kterých byly umístěny subrenální implantáty. Ve všech případech vedla jednostranná nefrektomie k hyperglykemii (>300 mg/lOOml) v průběhu 3 dnů.

Alloštěpy pankreatických ostrůvku a nativní slinivky všech zvířat byly histologicky prozkoumány poté co došlo k odmítnutí štěpu r.ebo po ukončeni experimentu. Histologické řezy štěpů z pankreatických ostrůvků z ledvin recipientních zvířat, která byla ošetřen:-. podáním crakcionovaných allogenních malých lymfocytú a kontinuálním (7 týdenním) podáváním monoklonální protilátky MR1, vykazovaly velké množství intaktních pankreatických ostrůvků viditelných pod povrchem renální kapsuie. Tyto ostrůvky byly prosté jakékoli infiltrace monocyty a obsahovaly granulované insulin a glukagon pozitivní buňky. Naproti tomu hiscologické řezy štěpů pankreatických ostrůvků z ledvin recipientů, kteří byli ošetřeni pouze podáním monoklonální protilátky proti proteinu gp39 vykazovaly charakteristické rysy intenzivního zánětu způsobeného monocyzy, který byl doprovázen destrukcí buněk štěpu. Slinivky všech pokusných zvířat vykazovaly morfologické rysy charakteristické crc streptozocinem indukovaný diabetes.

Příklad 2: Produkce a charakt proteinu gp39 crctilátek

Pokus 1: Protilátky proti lidskému proteinu gp39

K indukci antigenně-specizické tolerance T-buněk lidském příjemci je výhodné použit protilátky o: proteinu gp39. Myší monoklonální prot proteinu gp39 byly připraveny podle následujících postupů. Myši Balb/c byly imunizovány rozpustným různím proteinem gp39, gp39-CD8 v kompletním Freundově adjuvans (CPA). Po 6 týdnech byly myši exponovány injekcí rozpustného proteinu gp39-CD8 v neúplném Freundově adjuvans (IFA). Rozpustný protein gp39-CD8 byl podán v rozpuštěné formě 4 týdny po sekundární imunizaci. Dva týdny na to byla myším podána posilovači dávka (booster) tvořená aktivovanými lidskými lymfocyty z periferního krevního oběhu. Dva týdny po této dávce následovala závěrečná posilovači dávka tvořená rozpustným gp39-CD8. Slezinné buňky byly 4 dny po poslední imunizaci fúzovány s buňkami NS1 podle standardního postupu.

Několikanásobným screenir.gem byly vybrány klony buněk produkující monoklonální protilátky cr:ti lidskému proteinu gp39. Úvodní vyhledávací krok byl or; veden na citračních.

deskách potažených proteinem gp39-CD8. Pozitivní klony byly testovány vazbou na kontrolní CDS fúzní protein, CD72-CD8. Klony, které byly schopny se na desce vázat na protein CD72-CDS byly z dalšího postupu vyloučeny. Zbývající klony byly poté testovány průtokovou cytometrií s klidovými a 6 hodin aktivovanými lidskými lymfocyty z periferního krevního oběhu (PBL-peripheral blood Iymphocytes). Kybridomy, které barvily aktivované, ale ne klidové PBL, byiy považovány za pozitivní. V posledním kroku byly zbývající klony testovány na jejich schopnost blokovat vazbu CD40Ig na imobilizovaný protein gp39.

Přibližně 300 klonů bylo v počáteční fázi testováno proti gp39-CDď a CD72-CD8 ve vazebných testech na mikrotitračních deskách. Z těch bylo vybráno 30 klonů, které byly schopny vázat se na imobilizovaný protein gp39 a přitom se nevázaly na CDS. Tyto klony byly poté testovány na svojí schopnost vázat se na protein gp39 na povrch aktivovaných lidských PBL. Přibližně 15 klonů se bylo schopno vázat na molekuly na povrchu aktivovaných PBL. Specifita klonů byla dále potvrzena stanovením schopnosti blokovat vazbu protilátky CD43Ig na titrační desku potaženou proteinem gp39. Tři z deseti klonů v tomto testu dokázaly blokovat vazbu protilátky CD40Ig. Těmito klony byly klony 3Ξ4, 2H5 a 2H8. Tyto klony jsou výhodné pro použití v kombinaci podle vynálezu. Klony, které byly pozitivně vyselektovány při vazbě na aktivované, avšak nerozpoznávaly klidové PBL, byly dále testovány na schopnost vazby na klon aktivovaných krysích T-lymfocytů PCMC8. Klon 2H8 byl schopen reakce s touto buněčnou linií krysích T-lymfocytů.

Pokus 2: Protilátky proti lidskému proteinu gp39

Podobné imunizační schéma jako v pokusu 1 bylo použito k přípravě dalších protilátek proti lidskému proteinu gp39. Jedna myš Baíb/c byla imunizována rozpustným proteinem gp39-CD8 v CFA, po čtyřech týdnech násleo.vaia expozice 6 hodin aktivovanými lymřocyty z periferního krevního oběhu. Čtyři dny. před fúzí byla myším podána obnovovací dávka obsahující rozpustný protein gp39-333. Poté byly myši usmrceny a byla provedena jejich slezinnýuh ounék s buňkami NS-1. Fúze byla provedena podle standardního protokolu. Screening hybridomatických klonů byl prováděn pomocí průtokové cytometrie. Byly vybrány klony barvící c hodin aktivované, nikoli však klidové P3L. Pro další analýzu bylo vybráno 6 klonů 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24—42, a 39-79.

Specifita vybraných protilátek b; testy. Nejprve bylo průtokovou zytometri šest monoklonálních protilátek obarvu nikoli klidové T buňky z periferního obrázek 3B a 3C, který znát;rňu⁴e

T-lymfocvtů protilátkami kleno Exprese molekuly, která je rozeznává: monoklonálních protilátek je detekovate aktivaci. Maximálních hladin dosáhne mezi 6 až 3 hodinou oo aktivaci.

ověřena několika dokázáno, že všech aktivované avšak evního· oběhu (viz v-n. aktivovaných každou ze šeszi i již 4 hodiny po exprese zéto molekuly Po 24 hodinách cd aktivačního signálu již nelze šest monoklonálních protilátek aktivovaných lymfocytů CD3‘, rovněž jistá část T-lymfocytů uto mo-e.<u-u aete.oovat. /'secn rozeznává molekulu na povrchu převážně fe.ootypu 3D4*, ale 313' exprimuje tuto molekulu, molekuly je inhibována v

Exprese této rozpoznávané přítomnosti cyklosporinu A. v kultivačním mediu tak, jako inhibována i exprese proteinu gp39 (viz obrázek 4?. a je

4B znázorňující barvení T-lymfocytů, ošetřeny pomocí protilátek produkovaných 4D9-9) . Kinetika a distribuce rozpoznávané těmito monoklonálnimi s kinetikou a distribucí protein: pomocí fúzního proteinu obsahujícího všech 6 monoklonálních protilátek do proteinu gp39 pomocí 3340Ig (viz klony exp rese c r·. z i lát r cyklosporinem,

D9-8 resoektive éto molekuly . je je shodná byla zjištěna .idskou 3340Ig. Navíc zablokovat barvení izek Ά a 53, který

53, znázorňuje inhibici barvení proteinu gp29 pomocí C340Ig v přítomnosti 439-3 respektive 439-9). V Ξ3Ι3Α testu rozeznalo všech 6 monoklonálních protilátek protein gp39-CD8, což je rozpustná fúzní forma proteinu gp39. Nevíc všech šest monoklonálních protilátek dokázalo preoipitovát molekulu o velikosti přibližně 3 6 kd z aktivovaných lidských P3L značených pomocí 355-methioninu. Tato precipítovaná molekula je identická s molekulou, která byla precipitována fúzním lidským proteinem CD4C3z.

Funkční aktivita šesti vybraných monoklonálních protilátek (439-3, 439-9, 24.-22, 24-43, 39-76 a 39-79) byla ověřena následujícím způsobem. Nejprve tyla změřena schopnost monoklonálních protilátek inhibsvat proiiferaci ourifikovar.ých lidských 3-iym.f; oytú kul tov:váných na mediu, které obsahovalo IL-4 a rozpustný protein gc29. Purifikované lidské B-iymfocyty tyly kultivovány na mediu, které obsahovalo 33-4, rozpustný prttein gp3 9 a dále pak buď obsahovalo nebo neobsahovalo purifikované monoklonální protilátky nebo fúzní protein C340Ig v koncentracích 0 až 12,5 gg/ml. Proliferace 3-lymfooytú byla stanovena na základě inkorporace thymidinu pc 2 dnech kultivace. Výsledky (viz obrázek 6) ukazují, že všech 6 monoklonálních protilátek inhibují proiiferaci Ξ-lymfocytú idukovanou proteinem gp39 a IL-4. V této inhibici byly nejúčinější protilátky 39-76 a 24-31.

Dále byla stanovena schopnost monoklonálních protilátek inhibovat diferenciaci S-lymfocytů. Tato schopnost byla měřena na základě produkce Tg po indukci aktivovanými T-lymfocyty anti-CD-3 a i.nterleukinem IL-2. Pozitivní selekcí pomocí FAC 3 byly purifzkovány TgT’ lids-r- S-iymfocyty. Tyto lymfocyty byly poté kultivovaný s aktivovanými lidskými T-lymfocyty anti-CD3 ’ ošetřenými mitomyoinem C) a s IL-2 po dobu β dní přídavkem respektive bez přísavku purifikováných monoklonálních protilátek proti proteinu gp39. Tyto protilátky byly v mediu přítomny v koncentracích 0 až 10 ng/ml. Pomocí ELISA testu byla po ^f, one zh vyhodnocena produkce IgM, IgG a IgA. Změřením produkce L-gM, IgG a IgA bylo prokázáno, že všech šest monoklonálních protilácek je schopno inhibovat na T-lymfocyzech závislou diferenciaci B-lymfocytů (viz tabulka 1).

Tabulka 1

			Prudu.kce im	onnciobulinů
mAb žádná	hg/ml	IgM 17 500	IgG r. :	igA 4 471
4D9-8	0,1	4 813	2 012	2 319
	1,0	4 394	- * 2 c	1 519
	10,0	i r\. - i I JCi	26 2	396
4D9-9	0,1	3 394.	- :	i 731
	1,0	2 659		i 606
	10,0	*72	4 2 -	266
24-31	0,1	3 c 63	981	344
	1,0	1 3b3	2ii	165
	10,0	1 120	596	23
24-43	0,1	c 333	4 131	Ζ» * C? -i x z.
	1,0	3 193	— 2. 2	192
	10,0	721	1 222	1 081
89-76	0,1	3 783	1 069	344
	1,0	2 180	352	171
	10,0	313	c c i -J X	119
89-79	0,1	9 763	1 c.''	3 021
	1,0	2 324	4 66	156
	10,0	133	1o::	434
Účinek	monoklonáln	Ion proti	lat ek c ro :	l cl; zelnu gp
odpověď T-lymfocytů b	y 1 s 3 3. 7.;	oven -.k,	že byly
monoklonální	protilátky	přidány	olo standan	dni reakční

se smíšenou. populací lymfocytů (MLR-mlxed lymphocyte reaction). 300. 000 lidských lymfocytů z periferního krevního oběhu (R= respondentní buňky; bylo kultivováno spolu se 100.000 ozářenými allogenními lymfocyty z periferního krevního oběhu (S=stimulační buňky) v přítomnosti nebo v nepřítomnosti 10 p.g/ml monoklonální protilátky proti proteinu gp39. Ke kulturám byl 4, 5 a 6 dne přidán Έ-thymidin a po dalších 18 hodinách byly buňky odebrány. Všech 6 monoklonálních protilátek proti lidskému proteinu gp39 dokázalo inhibovat allospecifickou odpověď (viz obrázek 7, který znázorňuje inhibici allospecifické odpovědi, R a S byly inkubovány v přítomnosti protilátek 24-31 nebo 89-76, fúzní protein imunoglobuiinu CTLA-4 a monoklonální protilátka proti proteinu CD-23 byly použity jako pozitivní kontrola).

Dále byly provedeny kempetitivr.í vazebné festy. Těmito testy bylo stanoveno, zda-lí jednotlivé monoklonální protilátky rozeznávají různé epitopy na povrchu lidského proteinu gp39. Aktivované lidské PSD byly nejprve blokovány každou ze šesti monoklonálních protilátek (23 ug/ml neznačené protilátky) . Poté byly buňky promyty a obarveny 10 ug/ml protilátky :nacene : rotinem.

Znač detekovány konjugátem avidin-phytoeryth:

;rot iláfky ΡΞ-Αν).

byly

Pomocí

FACS byla nakonec vyhodnocena barevná reakce. Výsledky viz tabulka 2.

Tabulka 2

Blokující Značená protilátka

protilátka	4D9-3	4D9-5	24-3 i	24-42	39-^6	89-79
žádná	+ + +	+^-	Ť--T-	--4-		++++
4D9-8	nezj .	-	4 +--		- —	*4· +
4D9-9	+ -44-	nezj .		—	—
24-31	-r	-	nezj .	—	--
24-43	+	-r	+--	nezj.	—	-L
89-76	+	-i-	+ —		nezj .	+ + +
89-79	+	+ -		-r-ř-r	e-r-	nezj .

Intensita obarvení a procento pozitivních buněk je vyjádřeno symbolem + :-4-4-4- značí průměrnou intenzitu vyšší než 200, +++ vyšší než 125, ++ vyšší než 33, - vyšší než 25, značí intenzitu shodnou s pozadím, nezj. - nebylo stanoveno.

Všech šest monokl; nál ní ch pr;tů protilátky CD40Ig na aktivované Lidské tabulce 2 ukazují neschopnost nékterýc vazbu jiných protilátek na aktivované vysvětlit tím, že rozeznávají vzdálen lidského gp3 9.

e.o blokovalo vazbu El. Nicméně údaje v protilátek blokovat idské PBL, což lze ecitopy na povrchu

Hybridomy 39-76 a 24-31 produkující protilátky 39-76 respektive 24-31 byly 2. září 1994 uloženy podle ustanovení Budapeštské smlouvy u Americké sbírky kultur _;'ATCC, Parklawn Drive, Rockville, Mdj . Hybridom 39-76 byl uložen pod číslem HB11713 a hybridom 24-31 byl uložen pod číslem H311712.

Pokus	3 :	Protilátky proti myšímu	p ro t einu	gp39
	V	jednom z provedení vynálezu	je antag	onistou proteinu
gP3 9	monoklonáiní protilátka u-ú i	ρ r . t i	nvšímu proteinu
gp39.		Monoklonáiní protilátce	lír 1 b	via připravena

následujícím způsobem. Tento způsob může být rovněž použit k přípravě jiných protilátek proti proteinu gp39.

intervalech

V průběhu 6 týdnů byly v týdenních imunizováni křečci intraperitoneální injekcí 5x10* aktivovaných Thl buněk (dl. 6j. Buněčná fúze nyla provedena v době, kdy byl titr séra proti myším Thl lymťocytů vyšší než 1:10. 000. K fúzi pomocí polyethylenglykolu byly použity siezinné buňky imunizovaných křečku a buňky N3-1. Supernatant z jamek, které obsahovaly rostoucí hybridomy, byl testován průtokovou cytometrií proti klidovým a aktivovaným Thl lymfocytům. Jeden hybridom, který produkoval monoklonální protilátku schopnou selektivně rozeznat aktivované Thí lymfocyty byl dále testován a subklonován za vzniku protilátky MRI. Protilátka MRI byla produkována v ascitických tekutinách a purifikována pomocí HPLC na iontoměniči. Hybridom MRI byl uložen v Americké sbírce kvlzur (ATCCk pod číslem H311043.

Odborníci mohou rozeznat nebo určiz, pouze pomocí rutinního experimentování mnoho dalších ekvivalentů specifických provedení vynálezu. Takovéto ekvivalenty jsou však pokryty následujícími nároky.

Claims (45)

1. PATENTOVÉ NÁ R.....Ó

   1. Kombinace

   a) allogenní nebo xenogenní buňky, která exprimuje alespoň jeden donorův antigen a která má na povrchu buňky lígand vstupující do interakce s receptorem na povrchu recipientovy T-buňky, který zprostředkovává helperovou efektorovou funkci závislou na kontaktu, a

   b) antagonisty tohoto receptoru na povrchu T-buňky, který inhibuje interakci ligandu s receptorem, k indukci tolerance T-buňky vůči donorově tkáni nebo orgánu v recipientovi této tkáně nebo orgánu.
2. 2. Kombinace podle nároku 1, vyznačující se t i m , že receptorem na povrchu recipientovy T-buňky, který zprostředkovává helperovou efektorovou funkci závislou na kontaktu, je gp39.
3. 3. Kombinace podle nároku 2, vyznačující se t i m , že antagonistou je protilátka proti gp39.

   4. Kombinace podle nároku 3, v y z n ačující se tím, že protilátkou proti gp39 je monoklonální protilátka. 5. Kombinace podle nároku 3, v y z n ačující

   se t i m , že protilátkou proti gp39 je protilátka proti lidskému gp39.
4. 6. Kombinace podle nároku 4, vyznačující se t i m , že monoklonální protilátkou je MR1.
5. 7. Kombinace podle nároku 4, vyznačující se tím, že monoklonální protilátkou je chimérická monoklonální protilátka.

   II
6. 8. Kombinace podle nároku 4, vyznačující se tím, že monoklonální protilátkou je humanizovaná monoklonální protilátka.
7. 9. Kombinace podle nároku 1, vyznačující se t í m , že allogenní nebo xenogenní buňkou je lymfoidní buňka.
8. 10. Kombinace podle nároku 9, vyznačující se t í m , že lymfoidní buňkou je B-buňka.
9. 11. Kombinace podle nároku 10, vyznačuj ící se t í m , že B-buňkou je klidová B-buňka.
10. 12. Kombinace podle nároku 1, vyznačující se t í m , že allogenní nebo xenogenní buňka a antagonista jsou určeny k podání recipientovy před transplantací tkáně nebo orgánu.
11. 13. Kombinace podle nároku 1, vyznačující se tím, že tkáň nebo orgán zahrnuje pankreatické ostrůvky.
12. 14. Kombinace podle nároku 1, vyznačující se tím, že tkáň nebo orgán jsou vybrány ze skupiny zahrnující játra, ledvinu, srdce, plíci, kůži, sval, nervovou tkáň, žaludek a střevo.
13. 15. Kombinace

    a) allogenní nebo xenogenní buňky, která exprimuje alespoň jeden donorův antigen, a

    b) antagonisty gp39, k indukci tolerance T-buňky vůči donorově tkáni nebo orgánu v recipientovi této tkáně nebo orgánu.

    III
14. 16. Kombinace podle nároku 15, vyznačuj ící se t i m , že antagonistou gp39 je protilátka proti gp39.'
15. 17. Kombinace podle nároku 16, vyznačující se tím, že protilátkou proti gp39 je monoklonální protilátka.
16. 18. Kombinace podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m , že protilátkou proti gp39 je protilátka proti lidskému gp39.
17. 19. Kombinace podle nároku 17, vyznačuj ící se t í m , že monoklonální protilátkou je MR1.
18. 20. Kombinace podle nároku 17, vyznačuj ící se tím, že monoklonální protilátkou je chimérická monoklonální protilátka.
19. 21. Kombinace podle nároku 17, vyznačuj ící se tím, že monoklonální protilátkou je humanizovaná monoklonální protilátka.
20. 22. Kombinace podle nároku 15, vyznačující se t í m , že antagonistou gp39 je rozpustná forma ligandu gp39.
21. 23. Kombinace podle nároku 22, vyznačuj ící se tím, že rozpustnou formou ligandu gp39 je fúzní protein CD40.
22. 24. Kombinace podle nároku 15, vyznačuj ící se t í m , že allogenní nebo xenogenní buňkou je lymfoidní buňka.

    Kombinace podle nároku 24, vyznačuj ící

    IV se t í m , že lymfoidní buňkou je B-buňka.
23. 26. Kombinace podle nároku 25, vyznačuj ící se t í m , že B-buňkou je klidová B-buňka.
24. 27. Kombinace podle nároku 15, vyznačuj ící se t í m. , že allogenní nebo xenogenní buňka a antagonista jsou určeny k podání recipientovy před transplantací tkáně nebo orgánu.
25. 28. Kombinace podle nároku 15, vyznačuj ící se tím, že tkáň nebo orgán zahrnuje pankreatické ostrůvky.
26. 29. Kombinace podle nároku 15, vyznačuj ící se tím, že tkáň nebo orgán jsou vybrány ze skupiny zahrnující játra, ledvinu, srdce, plíci, kůži, sval, nervovou tkáň, žaludek a střevo.
27. 30. Kombinace

    a) allogenní nebo xenogenní buňky, která exprimuje alespoň jeden donorův antigen,

    b) antagonisty gp39, a

    c) donorových buněk pankreatických ostrůvků, k ošetření cukrovky.
28. 31. Kombinace podle nároku 30, se tím, že protilátkou proti protilátka.

    vyznačuj ící gp39 je monoklonální
29. 32. Kombinace podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m , že protilátkou proti gp39 je protilátka proti lidskému gp39.
30. 33. Kombinace podle nároku 31, vyznačuj ící v

    se t í m , že monoklonální protilátkou je MR1.
31. 34. Kombinace podle nároku 31, vyznačuj ící se tím, že monoklonální protilátkou je chimérická monoklonální protilátka.
32. 35. Kombinace podle nároku 31, vyznačuj ící se tím, že monoklonální protilátkou je humanizovaná monoklonální protilátka.
33. 36. Kombinace podle nároku 30, vyznačující se t í m , že antagonistou gp39 je rozpustná forma ligandu gp39.

    37 . Kombinace podle nároku 36, v y z nač u j ící se t í m , že rozpustnou formou ligandu gp39 je fúzní protein CD40. 38 . Kombinace podle nároku 30, v y z nač u j ící

    se t í m , že allogenní nebo xenogenní buňkou je lymfoidní buňka.
34. 39. Kombinace podle nároku 38, vyznačuj ící se t í m , že lymfoidní buňkou je B-buňka.
35. 40. Kombinace podle nároku 39, vyznačuj ící se t í m , že B-buňkou je klidová B-buňka.
36. 41. Kombinace podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m , že allogenní nebo xenogenní buňka a antagonista jsou určeny k podání recipientovy před transplantací buněk pankreatických ostrůvků.
37. 42. Kombinace

    a) donorovy allogenní buňky, a f

    •i

    VI

    b) protilátky proti gp39, přičemž tato donorova allogenní buňka a protilátka proti gp39 jsou určeny pro podání recipientovi před transplantací tkáně nebo orgánu, k indukci tolerance T-buňky vůči donorově tkáni nebo orgánu v recipientovi této tkáně nebo orgánu.
38. 43. Kombinace podle nároku 42, vyznačuj ící se tím, že protilátkou proti gp39 je monoklonální protilátka.
39. 44. Kombinace podle nároku 42, vyznačuj ící se t i m , že protilátkou proti gp39 je protilátka proti lidskému gp39.
40. 45. Kombinace podle nároku 43, vyznačuj ící se t i m , že monoklonální protilátkou je MRI.
41. 46. Kombinace podle nároku 44, vyznačuj ící se tím, že monoklonální protilátkou je chimérická monoklonální protilátka.
42. 47. Kombinace podle nároku 44, vyznačuj ící se tím, že monoklonální protilátkou je humanizovaná monoklonální protilátka.
43. 48. Kombinace podle nároku 42, vyznačující se tím, že donorovou allogenní buňkou je lymfoídní buňka.
44. 49. Kombinace podle nároku 48, vyznačující se t i m , že lymfoídní buňkou je B-buňka.
45. 50. Kombinace podle nároku 49, vyznačující se t i m , že 3-buňkou je klidová B-buňka.