KR19990022650A - 사람 ｂ7.1 및/또는 ｂ7.2 영장류화된 형태에 특이적인 원숭이 단일클론성 항체 및 이의 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파아지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 생성된 사람 B7, 즉, 사람 B7.1 및 사람 B7.2에 대한 짧은꼬리원숭이 항체를 생성시키고 동정하는 방법에 관한 것이고, B7.1 및/또는 B7.2 면역된 원숭이로부터 얻은 B 림프구를 사용한 원숭이 헤테로하이브리도마의 생성 및 동정방법에 관한 것이다. 더욱 특히 본 발명은 B7:CD28 경로를 억제하여 효과적인 면역억제제로 작용하는 4가지의 단일 클론성 항체 7B6, 16C10, 7C10 및 20C9를 제공한다. 본 발명은 또한 B7.1 및 가능하게는 B7.2, 영장류화된 7C10, 영장류화된 7B6 및 영장류화된 16C10과 결합하는 이들 단일클론성 항체로부터 유도된 세가지의 영장류화된 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열 및 완전 DNA를 제공한다. 이들 영장류화된 및 원숭이 항체는 특정의 면역억제제, 예를 들어, 자가면역 질환을 치료 및 기관이식 거부반응을 억제하는데 사용할 수 있다.

Description

사람 Ｂ7.1 및/또는 Ｂ7.2 영장류화된 형태에 특이적인 원숭이 단일클론성 항체 및 이의 약제학적 조성물
발명의 분야
본 발명은 사람 B7, 즉, 사람 B7.1 및 사람 B7.2에 대한 신규한 단일클론성 항체의 제조방법 및 동정방법에 관한 것이고, 이의 영장류화된 형태에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 파아지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 생성된 사람 B7, 즉, 사람 B7.1 및 사람 B7.2에 대한 짧은꼬리원숭이 항체를 생성시키고 동정하는 방법에 관한 것이고, B7 면역된 원숭이로부터 얻은 B 림프구를 사용한 원숭이 헤테로하이브리도마의 생성 및 동정방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 사람 B7, 즉, 사람 B7.1 및 사람 B7.2 뿐만 아니라 이들의 상응하는 아미노산 및 핵산 서열에 결합하는 특이적 영장류화된 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 사람 B7, 즉, 사람 B7.1 및 사람 B7.2에 특이적인 원숭이 단일클론성 항체 또는 영장류화된 항체를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이고, B7:CD28 경로를 조절하여 예를 들어, 자가면역질환을 치료하고 장기 거부반응을 억제하는 면역 억제제로서의 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
면역학, 혈액학, 및 종양학 사이의 임상적 인터페이스는 오랜 기간동안 구별되어 왔다. 혈액 또는 종양과 관련하여 치료된 많은 질환은 혈액치료에 의한 면역억제 약물의 광범위한 적용을 유도하는 이들의 이상 생리학에 대한 자가면역 또는 면역결핍부분을 지니고 있으며, 종양학자들은 종양에 대한 내생성 면역을 증진시킬 수 있는 면역학적 보조제를 고려하게 된다. 오늘날까지, 이러한 개입은 일반적으로 면역 억제 및 면역자극의 비특이적인 모드로 구성된다. 이러한 개입의 제한된 효능에 추가하여, 이들의 비특이성에 대한 속발성의 독성은 이들의 전체적인 성공을 제한다. 따라서, 또 다른 방법이 요구되고 있다.
신속하게 증가하는 수의 세포 표면 분자의 기능적 역할은 임상적인 혈액학 및 종양학과 면역학을 통합하는데 크게 기여한다. 거의 200 세포표면 항원이 면역 및 혈액 시스템의 세포상에서 동정되었다[문헌: Schlossman SF. Boumsell L. Gilks JM, Harlan T. Kishimoto, TA, Tedder TF, Todd RF:CD 항원(1993), Blood 83:879, 1994]. 이러한 항원은 세포 인식, 유착, 도입 및 증식의 유지, 시토킨 분비, 이펙터 작용 및 세포치사를 포함한 다양한 과정에서 연루된 선형의 제한된 및 보다 광범위하게 분포된 두 분자를 나타낸다. 이러한 분자이 작용성 기여에 대한 인식은 면역반응을 처리하는 새로운 연구를 수행되게 한다. 세포 유착 및 항원 특이적 인식과 연관된 분자가 치료학적 면역중재의 표적으로 평가되어 왔지만, 최근에는 공동 자극성 분자로 일컬어지는 세포표면 분자의 서브그룹에 관심이 집중되고 있다[문헌: bretscher P: The two-signal model of lymphoyte activation Twenty-one years later. Immunol. Today 13:73, (1992); Jenkins MK, Johnson JG: molecules involved in T-cell co-stimulation. Curr Opin Immunol 5:351, 1993; Geppert T, Davis L. Gur H. WacholtzM. Lipsky P: Accessory cell signals involved in T-cell activation. Immunol Rev 117:5, (1990); Weaver CT, Unanue ER: The co-stimulatory function of antigen-presenting cells.Immunol Today 11:49, (1990); Stennam RM, Young JW: Signals arising from antigen-presenting cells. Curr Opin Immunol 3:361, (1991)]. 공동-자극성 분자는 항원 특이적 T-세포 반응 및 이펙터 기능을 개시하지 않지만 상기 반응 및 기능을 생성 및 증폭시킬 수 있다[문헌: Bretscher P: The two-signal model of lymphocyte activation twenty-one years later.Immunol. Today 13:73, (1992); Jenkins MK, Johnson JG: Molecules involved in T-cell co-stimulation. Curr Opin Immunol 5:351, (1993); Geppert T, Davis L. Gur H. Wacholtz M. Lipsky P: Accessory cell signals involved in T-cell activation. Immunol Rev 117:5, (1990); Weaver CT, Unanue ER: The co-stimulatory function of antigen-presenting cells.Immunol Today 11:49, (1990); Stennam RM, Young JW:Signals arising from antigen-presenting cells.Curr Opin Immunol 3:361, (1991); June CH, Bluestone JA, Linsley PS, Thompson CD: Role of the CD28 receptor in T-cell activation. Immunol Today 15:321, (1994)].
최근에, B7:CD28로 일컬어지는 하나의 특이성 공동-자극성 경로가 상이한 연구그룹에 의해 연구되어 왔는데, 그 이유는 B 및 T 세포 활성화에서 이의 상당한 역할 때문이다[문헌: June CH, Bluestone JA, Linsley PS, Thompson CD: Role of the CD28 receptor in T-cell activation. Immunol Today 15:321, (1994); June ch, Ledbetter JA: The role of the CD28 receptor during T-cell responses to antigen. Annu Rev Immunol 11:191, (1993); Schwartz RH: Co-stimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherpy. Cell 71:1065, (1992)]. 이러한 리간드:수용체 경로는 4년전에 발견되었으며, 축적된 대부분의 증거는 B7:CD28 상호작용이 면역 반응성 대 에네르기를 측정하는데 중요한 접합점중 하나라는 것을 제시하고 있다[문헌: June CH, Bluestone JA, Linsley Ps, Thompson CD: Role of the CD28 receptor in T-cell activation. Immunol Today 15:321, (1994); June CH, Ledbetter JA: The role of the CD28 receptor during T-cell responses to antigen. Annu Rev Immunol 11:191, (1993); Schwartz RH: Co-stimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy.Cell 71:1065,(1992); Cohen J: Mounting a targeted strike on unwanted immune responses (news; comment).Science 257:751, (1992); Cohen J: New protein steals the show as 'co-stimulator' of T-cells (news:comment). Science 262:844, (1993)].
특히, 사람 B7 항원, 즉, 사람 B7.1 및 B7.2의 역할은 T-세포 활성화에서 공동-자극성 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.
1. T-세포 활성화에서의 B7.1 및 B7.2 공동-자극성 역할
성공적인 면역 반응은 T 세포와 항원 조재 세포 사이의 일련의 특이적 상호작용에 좌우된다. 이러한 과정에서 필수적인 제 1 단계는 MHC 클래스 분자에서 T 세포 수용체에 대한 항원의 결합에 좌우되며[문헌: Lane, P.J.L., F.M. McConnell, G.L. Schieven, E.A. Clark, and J.A. Ledbetter, (1990), The Role of Class II Molecules in Human B Cell Activation. The Journal of Immunology, 144:3684-3692], 이러한 상호작용 단독은 주어진 항원에 대한 지연된 방응에 필요한 모든 현상을 유도하는데 불충분하다[문헌: Schwartz, R.H.(1990), A Cell Culture Model for T Lymphocyte Clonal Anergy. Science, 248:1349; Jenkins, M.K. (192). The Role of Cell Division in the Induction of Clonal Anergy. Immunology Today, 13:69; Azuma, M., M. Catabyab, D. Buck, J.H. Phillip, and L.L. Lanier, (1992). Involvement of CD28 in MHC-unrestricted Cytotoxicity Mediated by a Humen Natural Killer Leukemia Cell Line. The Journal of Immunology, 149:1556-1561; Azuma, M., M. Catabyb, D. Buck, J.H. Phillips, and L.L. Lanier, (1992). CD28 Interaction with B7 Costimulates primary Allogeneic Proliferative Responses and Cytotoxicity Mediated by Small Resting T Lymphocytes. J.Exp. Med., 175:353-360].
특정의 그밖의 공동 자극성 분자가 요구된다[문헌: Norton, S.D., L. Zuckerman, K.B. Urdahl, R. Shefner, J. Miller, and M.K. Jenkins. (1992), The CD28 Ligand, B7, Enhances IL-2 Production by Providing A Costimulatory Signal to T Cells.' The Journal of Immunology, 149:1556-1561]. T 세포에서 발현된 단일 이량체 CD28 및 CTLA-4[문헌: June, C.H., J.A. Ledbetter, P.S. Linsley, and C.B. Thompson, (1990), Role of the CD28 Receptor in T-Cell Activation. Immunology Today, 11:211-216; Linsley, P.S., W. Brady, M. Urnes, L.S. Grosamaire, N.K. Damle, and J.A. Ledbetter, (1991), CTLA-4 is a Second Receptor for the B Cell Activation Antigen B7. J. Exp. Med., 174:561]는 항원존재 세포상에서 발현된 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86)과 함께 지연된 면역반응에 필요한 주요 공동 자극성 분자쌍이다[문헌: Azuma, M., H. Yssel, J.H. Phillips, H. Spits, and L.L. Lanier, (1993), Functional Expression of B7/BB1 on Activated T Lymphocytes.' J. Exp. Med., 177:847-850; Freedman, G.J., A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman, and LM. Nadler, (1989), B7, A New Menber of the Ig Superfamily with Unique Expression on Activated and Neoplastic B Cells. The Journal of Immunology, 143:2714-2722; Hathcock, K.S., G. Laslo, H.B. Dickler, J. Bradshaw, P. Linsley, and R.J. Hodes, (1993), Identification of an Alternative CTLA-4 Ligand Costimulatory for T Cell Activation. Science, 262:905-911; Hart, D.N.J., G.C. Starling, V.L. Calder, and N.S. Fernando, (1993). B7/BB-1 is a Leucocyte Differentiation Antigen on Human Dendritic Cells Induced by Activation. Immunology, 79:616-620]. 시험관내에서 이러한 공동 자극성 시그날은 발육부전의 T 세포 활성화 경로 및 특이적 항원에 대한 비반응성 또는 에네르기의 개발에 유도된다[참조: Harding, F.A., J.G. McArthur, J.A. Gross, D.M. Raulet, and J.P. Allison, (1992). CD28 Mediated signalling Co-sbmulates Murine T Cells and Prevents Induction of Anergy in T Cell Clones. Nature, 356:607-609; Gimmi, C.D., G.J. Freeman, J.G. Gribben, G.Gray, and L.M. Nadler, (1993). Human T-Cell Clonal Anergy is Induced by Antigen Presentation in the Absence of B7 Costimulation. Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6586-6590;Tan, P., C. Anasefti, J.A. Hansen, J.Melrose, M. Brunvand, J. Bradshaw, J.A. Ledbetter, and P.S. Linsley, (1993), Induction of Alloantigen-specific Interaction of CD28 with Its Natural Ligand B7/BB1. J. Exp. Med., 177:165-173]. 시험관내 내성은 기관 이식 거부에 대한 면역억제 및 생존 치료 메카니즘 및 자가 면역질환의 치료 메카니즘으로 구성된다. 이러한 메카니즘은 CTLA4-Ig의 투여후의 실험실 모델에서 달성된다[문헌: Lenschow, D.J., Y. Zeng, R.J. Thistlethwaite, A. Montag, W. Brady, M.G. Gibson, P.S. Linsley, and J.A. Bluestone, (1992), Long-Term Survival of Xenogeneic Pancreatic Islet Grafts Induced by CTLA-4Ig. Science, 257:789-795].
B7.1은 Kd 200으로 CD28에 결합하고, 20배의 고친화도로 CTLA-4에 결합하지만, 분자 B7.1 및 B7.2는 CD28 또는 CTLA-4에 결합할 수 있다[문헌: Linsley, P.S., E.A. Clark, and J.A. Ledbetter, (1990), T-Cell Antigen CD28 Mediates Adhesion with B Cells by Interacting with Activation Antigen B7/BB-1. Proc. Natl. Acad. Sci., 87:5031-5035; Linsley et al., (1993), The Role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen, Annu. Rev. Immunol., 11:191-192; Linesley et al., (1993), CD28 Engagement by B7/BB-1 Induces Transient Down-regulation of CD28 Synthesis and Prolonged of Immunology, 150:3151-3169]. B7.2는 활성화된 B 세포 및 인터페론 유도된 단구상에서 발현되지만, 휴지 B 세포는 아니다[문헌: Freeman, G.J., G.S. Gray, C.D. Gimmi, D.B. Lomarrd, L-J. Nadler, (1991). Structure, Expression and T Cell Costimulatory Activity of the Murine homologue of the Human B Lymphocyte Activation Antigen B7, J.Exp. Med., 174:625-631]. 반면, B7.2는 휴면단구, 수지상 세포 및 B 세포상에서 아주 낮은 수준으로 구성적으로 발현되며, 이의 발현은 활성화된 T 세포, NK 세포 및 B 림프구상에서 증진된다[문헌: Azuma, M. D. Ito, H. Yagita, K. Okumura, J.H. Phillips, L.L. Lanier, and C. Somoza, 1993, B70 Antigen is a second Ligand for CTLA-4 and CD28, Nature, 366:76-79]. B7.1 및 B7.2가 동일한 세포형에서 발현되지만, B 세포상에서의 이들의 발현은 상이한 키네틱으로 발생된다[문헌: Lenschow, D.J., G.H. Su, L.A. Zuckerman, N. Nabavi, C.L. Jellis, G.S. Gray, J. Miller, and J.A. Bluestone, (1993), Expression and Functional Significance of an Additional Ligand for CTLA-4, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11054-11058; Boussiotis, V.A., G.J. Freeman, J.G. Gribben, j. Daley, G. Gray, and L.M. Nadler, (1993), Activated human B Lymphocytes Express Three CTLA-4 Counter-receptors that Co-stimulate T-Cell Activation. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11059-11063]. RNA 수준에서의 추가의 분석은 B7.2 mRNA가 구성적으로 발현되지만, B7.1 MRNA는 활성 4시간후에 검출되고, 초기의 낮은 수준의 B7.1 단백질은 자극후 24시간까지 검출되지 않는다[문헌: Boussiotis, V.A., G.J. Freeman, J.G. Gribben, J. Daley, G. Gray, and L.M. Nadler, (1993), Activativated Human B Lymphocytes Express Three CTLA-4 Counter-receptors that Co-stimulate T-Cell Activation, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11059-11063]. 따라서, CTLA-4/CD28 역 수용체는 B 세포 활성화 후의 다양한 시점에서 발현될 수 있다.
특이형태의 B7.1 및 B7.2의 일시적인 발현은 이들 두 분자와 CTLA-4 및/또는 CD28과의 상호작용은 독특하지만 T 세포에 대해 관련된 시그날을 전달한다[문헌: LaSalle, J.M., P.J. Tolentino, G.J. Freeman, L.M. Nadler, and D.A. Hafler, (1992), CD28 and T Cell Antigen Receptor Signal Transduction Coordinately Regulate Regulate Intedeukin 2 gene Expression in Response to Superantigen Stimulation, j. Exp. Med., 176:-177-186; Vandenberghe, P., G.J. Freeman, L.M. Nadler, M.C. Fletcher, M. Kamoun, L.A. Turka, J.A. Ledbetter, C.B. Thompson, and C.H. June, (1992), antibody and B7/BB1-mediated Ligation of the CD28 Receptor Induces Tyrosine Phosphorylation in Human T Cells, The Journal of Experimental Medicine, 175:951-960]. T 세포상의 CTLA-4 및 CD28의 정확한 시그날화 기능은 현재 공지되어 있다[문헌: Janeway, C.A., Jr. and K. Bottomly, (1994), signals and Signs for lymphocyte Responses, Cell, 76.275285]. 그러나, 한 세트의 수용체에 초기의 자극을 가하여 T 세포를 활성화시키고, 이러서 지연된 시그날을 가하여 추가의 동화경로 및 클론성 확장을 수행시킬 수 있다[문헌: Linsley, P.S., J.L. Greene, P. Tan, J. Bradshaw, J.A. Ledbetter, C. Anasetti, and N.K. Damle, (1992), coexpression and Functional Cooperation of CTLA-4 and CD28 on Activated T Lymphocytes, J. Exp. Med., 176:1595-1604]. 상기 문헌의 데이터는 TCR 및 공동 자극성 시그날이 T 세포 확자, 림포킨 분비 및 전체의 이펙터 기능의 발전을 필요로 한다는 젠킨스 및 쉬바르츠(Jenkins and Schwartz)에 의해 제안된 두 시그날 가설[문헌: Schwarts, R.H., (1990), A Cell Culture Model for T Lymphocyte Clonal Anergy, Science, 248;1349; jenkins, M.K., (1992), The Role of Cell Division in the Induction of Clonal Anergy, Immunology today, 13:69]을 지지하고 있다[문헌: Greenan, V. and G. Kroemer, (1993), Immunology Today, 14:573]. 제 2 시그날을 전달하는 것이 실패하면 T 세포를 무능력하게 되어 IL-2가 분비되고, 세포가 항원에 대하여 비반응성이 된다.
구조적으로는 B7.1 및 B7.2는 세포외 면역글로블린 수퍼패밀리 V 및 C-유사 도메인, 소수성 막통과 영역 및 세포질 테일을 함유한다[문헌: Freeman, G.J., J.G. Gribben, V.A. Boussiotis, J.W. Ng, V. Restivo, Jr., L.A. Lombard, G.S. Gray, and L.M. Nadler, (1993), Cloning of B7-2: A CTLA-4 Counter-receptor that Co-stimulates Human T Cell Proliferation. Science, 262:909]. 두 B7.1 및 B7.2는 과도하게 글리코실화된다. B7.1은 223 아미노산 세포와 도메인, 23 아미노산 막통과 도메인, 및 61 아미노산 세포질 테일로 구성된 44-54kD의 당단백질이다. B7.1은 3가지의 효능적인 단백질 키나아제 포스포릴화 부위를 함유한다[문헌: Azuma, M., H. Yssel, J.H. Phillips H. Spits, and L.L. Lanier, (1993), Functional Expression of B7/BB1 on Activated T Lymphocytes, J. Exp. Med., 177:845-850]. B7.2는 306 아미노산 막 당단백질이다. B7.2는 220 아미노산 세포외 영역, 23 아미노산 소수성 막통과 도메인 및 60 아미노산 세포질 테일로 구성되어 있다[문헌: Freeman, G.J., A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman, and LM. Nadler, (1989), B7, A New Member of the Ig Superfamily with Unique Expression on Activated and Neoplastic B Cells, The Journal of Immunology, 143:2714-2722]. B7.1 및 B7.2 유전자가 동일한 염색체 영역에 편재되어 있지만[문헌: Freeman, G.J., D.B. Lombard, C.D. Gimmi, S.A. Brod, L Lee, J.c. Laning, D.A. Hafler, M.E. Dorf, G.S. Gray, H. Reiser, C.H. June, C.B. Thompson, and L.M. Nadler, (1992), CTLA-4 and CD28 MRNA are Coexpressed in Most T Cells After Activation, The Journal of Immunology, 149:3795-3801; Schwarts, R.H., (1992), Costimulation of T Lymphocytes: The Role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1 in Selvakumar, A., B.K. Mohanraj, R.L. Eddy, T.B. Shows, P.C. White, C. Perrin, and B. Dupont, (1992), genomic Organization and Chromosomal Location of the human Gene Encoding the B-Lymphocyte Activation Antigen B7, Immunogenetics, 36:175-181], 이러한 항원은 고수준의 상동성을 공유하지 않는다. B7.1과 B7.2의 전체 상동성은 26%이고, 쥐 B7.1과 사람 S7 사이에 27%이다[문헌: Azuma, M., H. Yssel, J.H. Phillips, H. Spits, and L.L. Lanier, (1993), Functional Expression of B7/BB1 on Activated T Lymphocytes, J. Exp. Med., 177:845-850; Freeman, G.J., A.S. Freedman, j.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman, and LM. Nadler, (1989), B7, A New Member of the Ig Superfamily with Unique Expression on Activated and Neoplastic B Cells, The Journal of Immunology, 143:2714-2722]. 사람 B7.1 사람 B7.2 및 쥐 B.1은 약간의 긴 상동성 스트래치를 나타내지만, 세분자 모두는 사람 CTLA-4 및 CD28에 결합한다. 따라서, 연속되거나 형태적일 수 있는 세 분자에 의해 공유한 일반적이거나 밀접한 상동성 영역이 있을 수 있다. 이러한 영역은 이들의 카운터 수용체에 대한 B7.1 및 B7.2 분자의 결합 부위를 구성한다. 이들 에피토프에 대하여 생성된 항체는 T 세포상의 이의 카운터 수용체로 B7의 상호작용을 효능적으로 억제할 수 있다. 도한, 두 B7.1 및 B7.2 분자상의 이러한 영역과 교차 반응한 항체는 B7.1 또는 B7.2에 대해 유도된 항체에 비해 실질적으로 유리할 것이다.
2. B7/CD28 상호작용의 봉쇄
B7/CD28 상호작용을 차단하면 특이적인 면역억제가 가능하고, 장기간 지속되는 항원 특이적 치료효과를 생성하는 효능이 있다. B7.1 또는 B7.2에 대한 항체는 시험관내 IL-2 생성의 억제로 측정되는 바와 같이 T 세포 활성화를 차단한다[문헌: DeBoer, M., P. Parren, J. Dove, F. Ossendorp, G. van der Horst, and j. Reeder, (1992), Functional characterization of a novel Anti-B7 Monoclonal Antibody, Eur. journal of Immunology, 22:3071-3075; Azuma, m., H., H. Yssel, j.H. Phillips, H. Spits, and L.L. Lanier, (1993), Functional Expression of B7/BB1 on Activated T Lymphocytes, J. Exp. Med., 177:845-850]. 그러나, 상이한 항체가 이들의 면역억제 효능에서 상이하다. 이러한 항체는 이들의 친화성 또는 에피토프 특이성에 영향이 있을 수 있다. CTLA-4/lg 융합 단백질 및 항-CD28 Fab는 IL-2 생성의 하향조절에 유사한 효과를 지니는 것으로 밝혀졌다.
생체내에서 가용성 CTLA-4/lg 융합 단백질을 투여하면 마우스에서 T 세포 의존성 항체 반응을 억제하고[문헌: Linsley, P.S., J.L. Greene, P. Tan, j. Bradshaw, J.A. Ledbetter, C. Anasetti, and N.K. Damle, (1992), Coexpression and Functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on Activated T Lymphocytes, J. Exp. Med., 176:1595-1604; Lin, H., S.F. Builing, P.S. Linsley, R.O. Wei, C.D. Thompson, and L.A. Turka, (1993), Long-term Acceptance of Major Histocompatibility Complex Mismatched Cardiac Allografts Induced by CTLA-4-Ig Plus Donor Specific Transfusion, J. Exp. Med., 178:1801], 또한, 보다 많은 용량이 제 2 면역화에 대한 반응을 억제할 수 있어서, 항체 중재된 자가면역질환의 처리에 대한 연구의 실행가능성을 입증하고 있다. 또한, CTLA-4/Ig는 T 세포와 B7.1/B7.2 항원 존재 세포의 상호작용을 직접 억제함으로서 마우스에서의 췌장섬 세포 거부를 억제할 수 있다[문헌: Lenschow, D.J., G.H. Su, L.A. Zuckerman, N. Nabavi, C.L. Jellis, G.S. Gray, J. Miller, and J.A. Bluestone, (1993), Expression and Functional Significance of an Additional Ligand for CTLA-4, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11054-11058]. 이러한 경우에, 장기간 공여자 특이적 내성이 달성된다.
3. 항원 선택을 위한 재조합 파아지 디스플레이 기술
현재까지, 두 B7.1 및 B7.2와 교차 반응하는 단일클론성항가 보고된 바는 없다. 상기 주지된 바와 같이, 그러한 항체는 면역억제제로서 아주 효능적으로 바람직할 것이다. 파아지 디스플레이 기술은 면역반응 동안에 생성된 항체를 분리하는 통상의 방법을 대체하는 것이다. 그 이유는 면역 레퍼터리의 아주 많은 비율이 검정될 수 있고, 이어서 종래의 방법을 이용하는 것이 가능하기 때문이다. 이러한 사항은 일부인데 그 이유는 PEG 융합 비효율, 염색체 불안정화 및 대량의 조직배양 및 헤테로하이브리도마와 연관된 스크리닝에 기인되기 때문이다. 반면, 파아지 디스플레이 기술은 주어진 항원에 대한 반응과 연관된 면역글로블린의 전체 레퍼터리를 효능적으로 포착하는 분자상의 기술에 좌우된다.
이러한 기술은 문헌[Barber et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 7978-7982, (1991)]에 기재되어 있다. 기본적으로, 면역글로블린 중쇄 유전자는 중쇄 융합 단백질이 생성되는 방법으로 필라멘트성 파아지 M13의 소량의 피복 단백질을 암호화하는 유전자를 함유한 벡터내로 PCR 증폭 및 클로닝된다. 중쇄융합 단백질은 회합됨에 따라 경쇄유전자와 함께 M13 파아지 입자내로 혼입도니다. 각각의 재조합 파아지는 이의 게놈내에 표면에 디스플레이되는 상이한 항체 Fab분자에 대한 유전자를 함유한다. 이러한 라이브러리내에, 과량의 106의 상이한 항체가 클로닝될 수 있고 디스플레이될 수 있다. 상기 파아지 라이브러리는 항원 피복된 마이크로리터 웰상에 끼워지고, 비특이성 파아지는 세척되며, 항원 결합 파아지는 용출된다. 항원 특이성 클론으로부터의 게놈을 분리하고 유전자 III을 삭제하여, 항체가 추가의 특정화를 위해 가용성 FaB 형태로 발현될 수 있게 한다. 단일의 Fab가 효능적인 치료학적 대상으로 선택되면, 이는 전체 항체로 용이하게 전환될 수 있다. Fab 서열을 전체 항체로 전환시키는 상기 설명된 발현 시스템은 IDEC의 포유동물 발현 벡터 NEOSPLA이다. 이러한 백터는 사람 감마 1 또는 감마 4 일정영역 유전자를 함유한다. CHO 세포는 NEOSPLA 벡터로 형질감염되고, 증폭된 후에 이러한 벡터 시스템은 아주 높은 발현 수준을 나타내는 것으로 보고되어 있는데, (＞30 pg/세포/일)이 달성될 수 있다.
4. 영장류화된 항체
재조합 항체를 생성시키는 그밖의 효능적인 수단은 문헌[Newman, (1992), Biotechnology, 10, 1455-1460]에 개시되어 있다. 더욱 특히, 이러한 기술은 원숭이 가변 도메인 및 사람 일정 서열을 함유하는 영장류화된 항체를 생성시킨다. 이러한 참조 문헌은 본원에서 전체를 참조로 인용한다. 또한, 이러한 기술은 1995년 1원 25일자 출원된 미국 특허원 제 08/379,072호에 기재된 기술이고, 여기서, 상기 특허원은 1992년 7월 10자 출원된 미국 특허원 제07/912,292호의 연속출원이며, 미국 특허원 제07/912,292호는 1992년 3월 23일자 출원된 미국 특허원 07/856,281호의 일부 부분 연속출원이며, 상기 미국 특허원 제07/856,281호는 1991년 7월 25일자 출원된 미국특허 제07/735,064호의 일부 부분 연속출원이다. 상기 미국 특허원 제08/379,072호 및 이의 모출원은 전체 내용을 본 발명에서 참조로 인용한다.
이러한 기술은 항체를 변형시켜 사람에게 투여되는 경우 항원적으로 거부되지 않게 한다. 이러한 기술은 시노몰거스 원숭이를 사람 항원 또는 수용체로의 면역에 좌우된다. 이러한 기술은 사람 세포 표면 항체에 대한 고친화성 단일 클론성 항체를 생성하도록 개발되었다.
이러한 방법으로 생성된 항체는 본 발명 이전에 사람 이펙터 기능을 나타내는 것으로 보고되었으며, 면역원성이 감소되고 장기간의 혈청반감기를 지니는 것으로 보고되었다. 상기 기술은 시노몰거스 원숭이가 사람과 계통학적으로 유하하다는 사실에도 불구하고, 많은 사람 단백질을 외래로 인식하고, 그에 따라, 면역반응을 나타낸다는 사실에 좌우된다. 또한, 시노몰거스 원숭이는 계통학적으로 사람과 유사하기 때문에, 이러한 원숭이에서 생성된 항체는 사람에게서 생성된 아미노산과 고도의 상동성을 지닌 아미노산인 것으로 밝혀졌다. 실제로, 짧은꼬리원숭이 면역글로블린 경쇄 및 중쇄 가변영역 유전자를 서열화시킨 후에, 각각의 유전자계의 서열은 사람의 유전자 서열에 85 내지 98% 상동성이 있는 것으로 밝혀졌다[문헌: Newman et al., (1992), Id.]. 이러한 방법으로 생성된 제 1 항체, 항-CD4 항체는 사람 골격 영역의 교감서열에 91 내지 92% 상동성이었다[문헌: Newman et al., Biotechnology, 10;1458-1460, (1992)].
사람 B7 항원에 특이적인 단일클론성 항체는 앞서 문헌에서 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Weyl et al., Hum. Immunol., 31(4), 271-276, (1991)]에는 천연 및 변이된 항원 변이체를 사용한 HLA-B-27에 대한 사람 단일클론성 항체를 지도화한 에피토프를 기재하고 있다. 또한, 문헌[Toubert et al., Clin. Exp. Immunol., 82(1), 16-20, (1990)]에는 35-KD 박테리아성 외부 막 단백질과 반응하는 HLA-B27 단일클론성 항체를 지도화하는 에피토프를 기재하고 있다. 또한, 문헌[Valle et al., Immunol., 69(4), 531-535, (1990)]에는 활성화된 B 세포 및 HTLV-1-형질전환된 T 세포에서 발현된 B7 항원을 인식하는 IgG1 서브클래스의 단일클론성 항체가 기재되어 있다. 또한, 문헌[Toubert et al., J. Immunol., 141(70, 2503-9, (19880]에는 E. coli에서 하이브리드 유전자의 두 대립유전자 사이에서 하이브리드 유전자를 제조함으로써 구성된 내부도메인 재조합체를 사용한 HLA-B27 및 HLA-B7을 지도화하는 에피토프를 기재하고 있다.
B7 항원의 높은 발현은 자가면역 질환과 상호관련되어 있다. 예를 들어, 문헌[Ionesco-Tirgoviste et al., Med. Interre, 24(1), 11-17, (1986)]에는 제 1 형 인슐인 의존 당뇨병에서의 증가된 B7 항원 발현이 보고되어 있다. 또한, 건선 환자에서 얻은 피부 수지상 세포상에서의 B7 항원 발현의 관련성이 보고되어 있다[문헌: Nestle et al., J. Clin. Invest., 94(1), 202-209, (1994)].
또한, 친화성 정제된 가용성 HLA-B7을 사용한 항-HLA-B7 알로반응성 CTL의 억제반응이 문헌에 보고되어 있다[문헌: Zavazava et al., Transplantation, 51(4), 838-42, (1991)]. 또한, B7을 억제할 수 있는 B7-1-Ig 융합 단백질 및 동물모델에서의 B7 활성[문헌: Lenschow et al., Science 257, 789, 7955(1992)]을 억제하기 위한 B7 수용체 가용성 리간드, CTLA-4-Ig의 용도가 보고되어 있다.
발명의 목적 및 요약
본 발명의 목적은 사람 B7 항원에 대한 신규한 짧은꼬리원숭이 항체를 생성시키고 동정하는데 있다. 더욱 특히, 사람 B7.1 항원 및/또는 사람 B7.2 항원에 대한 짧은꼬리원숭이 항체를 생성시키고 동정하는데 있다.
더욱 특히, 본 발명의 목적은 사람 B7 항원, 즉, 사람 B7.1 항원 및/또는 사람 B7.2 항원 면역된 원숭이로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 파아지 디스플레이 라이브러리 및/또는 원숭이 헤테로하이브리도마를 스크리닝함으로써 사람 B7 항원, 즉, 사람 B7.1 항원 및/또는 사람 B7.2 항원에 대한 신규한 짧은꼬리원숭이 항체를 생성시키고 동정하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 활성화된 T 세포의 B7/CD86 경로 및 B7 자극을 억제하여 IL-2 생성 및 T 세포 증식을 억제하고 효과적인 면역억제제로서 작용하는 사람 B7.1 및/또는 B7.2 항체를 특이적으로 결합시키는 항-B7 원숭이 단일클론성 항체 및 이의 영장류화된 형태를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 공여자의 비장 세포 배양물에서 항원 유도된 반응, 예를 들어, 항원 특이적 IgG 반응, IL-2 생성 및 세포증식을 억제하는 항-사람 B7.1 및 항-사람 B7.2 원숭이 단일클론성 항체 및 이의 영장류화된 형태를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 치료에 유용한 유리한 특성, 즉, 친화성, 면역억제 활성을 지니는 사람 B7.1 및 사람 B7.2 항원 및 이의 영장류화된 형태에 특이적인 특정의 원숭이 단일클론성 항체를 동정하는데 있다. 더욱 특히, 이들 원숭이 항체 및 이의 영장류화된 형태는 면역억제제로서, 즉, 항원 유도된 면역반응을 차단하고, 건선, 류머티스 관절염, 전신 홍반(SLE), 제 1형 당뇨병, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP)와 같은 자가 면역질환을 치료하며, 기관 거부반응을 억제하는데 사용된다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 B7 항원, 즉, 사람 B7.1 및 사람 B7.2 항원 및 이의 영장류화된 형태에 특이적인 하나 이상의 원숭이 단일클론성 항체, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는데 있다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 면역억제제로서 자가면역질환, 예를 들어, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP) 및 전신 홍반(SLE)을 치료하고, 항원 유도된 면역반응을 차단시키며, 이식체 수용체에서의 기관 거부반응을 억제시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 B7 항원, 즉, 사람 B7.1 및 사람 B7.2 항원에 특이적으로 결합하는 치료학적 유효량의 하나 이상의 원숭이 또는 영장류화된 단일클론성 항체를 투여하는 신규한 치료방법을 제공하는데 있다. 상기 치료방법은 B7:CD28 경로를 억제함으로써 치료될 수 있는 질환, 예를 들어, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 전신 홍반(SLE), 제 1형 당뇨병, 건선, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 무형성 빈혈과 같은 자가면역질환을 치료할 뿐만 아니라 이식대상에서의 거부반응을 억제시키는데 유용하다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 B7.1 및/또는 사람 B7.2 항원에 특이적인 원숭이 단일클론성 항체의 적어도 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 발현하는 형질감염체, 예를 들어, CHO 세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 B7.1 및/또는 사람 B7.2 항원에 특이적인 원숭이 단일클론성 항체의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 도메인, 및 이들의 핵산 서열을 함유하는 영장류화된 항체를 발현시키는 발현 벡터를 제공하는데 있다.
정의
하기 용어의 정의는 본 발명을 명확하게 이해할 수 있도록 정의하고 있는 것이다.
고갈성(depleting) 항체 - 활성화된 B 세포 또는 그밖의 항원 존재 세포를 치사시키는 항원.
비고갈성 항체 - 리간드 CD28 및 CTLA-4를 활성화시키는 B7 및 T 세포의 공동 자극성 항체를 차단하는 항체. 따라서, 이러한 항체는 항원 존재 세포를 아네르기화하지 않으며 제거하지도 않는다.
영장류화된 항체 - 원숭이 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 함유하도록 조작된 재조합 항체, 특히, 시노몰거스 원숭이 항체, 바람직하게는 사람 면역글로블린 감마 1 또는 감마 4 일정 (또는 PE 가변체). 이러한 항체의 제조 방법은 문헌[Newman et al., (1992), Primatization of Recombinant Antibodies for Immunotherapy of Human Diseases: A Macaque/Human Chimeric Antibody Against Human CDH, Biotechnology, 10:1458-1460], 및 미국 특허원 08/379,072호에 기재되어 있으며, 본원에서는 상기 문헌 및 특허원을 참조로 인용한다. 이러한 항체는 사람항체와 고도의 상동성, 즉, 85 내지 98%의 상동성을 나타내는 것으로 보고되었고, 면역원성을 감소시키며, 사람 항원에 높은 친화성을 나타낼 수 있다.
B7 항원 - 본원에서 사용되는 B7 항원에는 예를 들어, 사람 B7, B7.1 및 B7.2 항원이 포함된다. 이러한 항원은 CD28 및 /또는 CTLA-4에 결합한다. 이러한 항원은 T 세포 활성화에서 공동 자극역할을 한다. 또한, 이들 B7 항원은 모두 세포외 면역글로블린 수퍼패밀리 V 및 C-유사 도메인, 소수성 막투과 영역 및 세포질 테일을 함유[문헌: Freeman et al., Science, 262:909, (1993)]하며, 아주 많이 글리코실화된다.
항-B7 항체 - B7:CD28 상호작용을 차단하여 면역억제를 유도하도록 충분한 친화성으로 사람 B7 항원, 예를 들어, 사람 B7.1 및 /또는 B7.2 항원을 특이적으로 결합시키는 항체, 바람직하게는 원숭이 단일클론성 항체 또는 이의 영장류화된 항체.
도 1은 짧은꼬리원숭이 면역글로블린 서열을 기본으로 하는 프라이머를 함유하는 필라멘트 파아지의 표면상에 디스플레이된 B7에 대하여 생성된 재조합 면역글로블린 라이브러리를 스크리닝하는데 유용한 pMS 벡터를 도시하는 도면이다.
도 2는 사람 B7.1 항원에 특이적인 영장류화된 항체를 발현시키는데 사용되는 NEOSPLA 발현 벡터를 도시하는 도면이다.
도 3은 형질감염된 CHO 세포상에서의 세포 표면 B7.1에 대해 유도된 원숭이 혈청 항-B7.1 역가를 도시하는 도면이다.
도 4는 비표지된 SB7 및 Mab L307.4 쥐 항-B7.1의 존재하에 SB7.1 친화성 정제된 원숭이 항체에 의해 결합되는 방사성표지된 sB7.1의 억제를 도시하는 도면이다.
도 5는 친화성 정제된 SB7.1와의 경쟁반응에 의한 B7 양성 사람 SB 세포에 대한 방사성 표지된 원숭이 135 및 L3707.4 항-B7.1 항체의 결합억제를 도시하는 도면이다.
도 6은 비표지된 SB7.1 쥐 항-B7.1(L307.4) 및 원숭이 1127 친화성 정제된 혈청 항체와의 경쟁에 의해 활성화된 사람 말초 혈액 T 세포에 결합하는 방사성 표지된 B7-Ig의 억제를 도시하는 도면이다.
도 7은 항-B7.1 친화성 정제된 원숭이 혈청 항체에 의한 혼합된 림프구 배양물에서의 IL-2 단백질의 억제를 도시하는 도면이다.
도 8a는 7C10의 경쇄의 영장류화된 형태의 아미노산 및 헥산 서열을 도시하는 도면이다.
도 8b는 7C10의 중쇄의 영장류화된 형태의 아미노산 및 헥산 서열을 도시하는 도면이다.
도 9a는 7B6의 경쇄의 영장류화된 형태의 아미노산 및 헥산 서열을 도시하는 도면이다.
도 9b는 7B6의 중쇄의 영장류화된 형태의 아미노산 및 헥산 서열을 도시하는 도면이다.
도 10a는 영장류화된 경쇄 16C10의 아미노산 및 헥산 서열을 도시하는 도면이다.
도 10b는 영장류화된 중쇄 16C10의 아미노산 및 헥산 서열을 도시하는 도면이다.
발명의 상세한 설명
상기된 바와 같이 , 본 발명은 사람 B7.1 및/또는 사람 B7.2 항원과 특이적으로 결합하는 신규한 원숭이 단일클론성 항체, 뿐만 아니라, 이로부터 유도된 영장류화된 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 항체는 사람 B7.1 및/또는 B7.2에 높은 친화도를 지니며, 그로인해, B7:CD86 결로를 억제하는 면역억제제로 사용될 수 있다. 원숭이 단일클론성 항체를 제조하는 방법은 파아지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 수행될 수 있거나, B7 (예, 사람 B7.1 및/또는 B7.2) 면역된 원숭이로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 원숭이 헤테로하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 항-B7 항체를 생성시키는 첫 번째 방법은 재조합 파아지 디스플레이 기술을 포함한다. 이러한 기술은 상기 일반적으로 기술된 바와 같다.
필수적으로는, 상기 방법은 필라멘트 파아지의 표면상에 디스플레이된 B7 항원에 대한 재조합 면역글로블린 라이브러리의 합성, 및 B7.1 및/또는 B7.2 항원에 높은 친화성을 지니는 항체를 분비하는 파아지의 선택을 포함할 수 있다. 상기 주지된 바와 같이, 바람직하게는 사람 B7.1 및 B7.2 모두에 결합하는 항체가 선택될 것이다. 이러한 방법을 수행하기 위해서, 본 발명자들은 재조합의 가능성이 감소되고 안정성이 개선된 원숭이 라이브러리에 대한 독특한 라이브러리를 생성시켰다. 이러한 벡터, pMS는 이하 상세히 기술되며, 도 1 에 도시된다.
필수적으로는, 짧은꼬리원숭이 라이브러리와 함께 사용하기 위한 파아지 디스플레이가 수행되기 위해서는, 이러한 벡터는 원숭이 면역 글로블린 유전자를 PCR 증폭시키는 특정의 프라이머를 함유한다. 이러한 프라이머는 사람 서열을 함유하는 영장류화된 기술 및 데이터베이스로 얻은 짧은꼬리원숭이 서열를 기본으로 한다.
적합한 프라이머는 미국특허원 제08/379,072호에 개시되어 있으며, 본원에서는 상기 특허원을 참조로 인용한다.
상기 두 번째 방법은 사람 B7 항원, 바람직하게는 사람 B7.1 및 B7.2 항원에 대한 원숭이, 즉, 짧은꼬리원숭이의 면역화를 포함한다. 단일클론성 항체를 생성시키는 짧은꼬리원숭이의 고유의 이점은 상기 기재되어 있다. 특히, 그러한 원숭이, 즉, 시노몰거스 원숭이는 사람 항원 또는 수용체에 대하여 면역될 수 있다. 또한, 생성된 항체는 문헌[Newman et al., Biotechnology, 10, 1455-1460, (1992)]의 방법, 및 1995년 1월 25일 뉴만(Newman)등의 미국특허원 제08/379,072호에 기재된 방법에 따른 영장류화된 항체를 제조하는데 이용될 수 있으며, 본원에서는 상기 문헌 및 특허원을 참조로 인용한다.
시노몰거스 항체로부터 얻은 항체의 현저한 이점은 이러한 원숭이 항체가 외래 단백질로서 많은 사람 단백질을 인식하여 바람직한 사람 항원, 예를 들어, 사람 표면 단백질 및 세포 수용체에 높은 친화도를 보이면서 항체를 형성시킨다는 것이다. 또한, 이들은 계통학적으로 사람과 유사하기 때문에, 생성되는 항체는 사람에서 생성된 항체와 고도의 상동성 아미노산을 지닌다. 상기 주지된 바와 같이, 짧은꼬리원숭이 면역글로블린 경쇄 및 중쇄 가변영역 유전자를 서열화한 후에, 각각의 유전자계는 이의 사람 유전자에 85 내지 88% 상동성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다[문헌: Newman et al., (1992), Id].
필수적으로는, 시노몰거스 짧은꼬리원숭이는 사람 B7 항원, 예를 들어, 사람 B7.1 및 /또는 사람 B7.2 항원이 투여되고, B 세포가 이로부터 분리하며, 예를 들어, 림프 노드 생검을 동물에서 수행하고, B 림프구를 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 KH6/B5(마우스 x 사람) 헤테로 골수종 세포와 융합시킨다. 이어서, 사람 B7 항원, 예를 들어, 사람 B7.1 및/또는 사람 b7.2 항원과 결합하는 헤테로하이브리도마 분비 항체를 동정한다.
B7.1 및 B7.2에 결합하는 항체가 바람직한데, 그 이유는 그러한 항체가 효능적으로 B7.1와 B7.2의 상호작용, 뿐만 아니라 이들의 카운터 수용체, 즉, 사람 CTLA-4 및 CD28와의 상호작용을 억제시키는데 사용될 수 있기 때문이다. 이러한 에피토프에 대한 항체는 사람 B7.1 및 사람 B7.2의 T 세포상에서의 이들의 카운터 수용체와의 상호작용을 억제할 수 있다. 이러한 결과는 효능적인 상승효과를 제공할 수 있다.
그러나, 단지 하나의 사람 B7 항원, B7.1 항원 또는 B7.2 항원에 결합하는 항체가 아주 바람직한데, 그 이유는 T 세포 활성화, 클론 팽창 림포킨 (IL-2) 분비, 및 항원에 대한 반응성에서의 이들 분자의 공동관련성 때문이다. 사람 B7.1 및 B7.2 모두가 사람 CTLA-4 및 CD28에 결합된다는 것으로, 짧은꼬리원숭이 항체가 효능적으로 생성될 수 있는 적어도 하나의 공통 또는 상동성 영역(공유된 형태학상의 에피토프 또는 에피토프들)이 있다고 예측할 수 있을 것이다.
본 발명의 발명자들은 CHO 세포에서 생성된 재조합 가용성 B7.1 항원을 이용하여 사람 B7.1 항원에 대하여 짧은꼬리원숭이를 면역시켰으며, L307.4-세파로즈 친화성 칼럼을 사용한 친화성 크로마트그래피로 정제하였다. 그러나, 사람 B7 항원, 사람 B7.1 항원 또는 사람 B7.2 항원의 특정 공급원은 중요하지 않다. 단, 특정의 투여된 B7 항원에 대해 및 그밖의 B7 항원에 효능적으로 특이적 항체 방응을 유도하는데는 충분한 순도가 중요한다.
사람 B7 항원, 사람 B7.1 항원(또한, CD80이라 일컬어짐) 및 사람 B7.2 항원(또한 CD86이라 일컬어짐) 유전자는 클로닝되고 서열화되어, 재조합 방법으로 용이하게 제조될 수 있다.
바람직하게는 투여된 사람 B7 항원, 사람 B7.1 항원 및/또는 사람 B7.2 항원은 예를 들어, 이의 막투과 및 세포질 도메인을 제거한 B7, B7.1 또는 B7.2 유전자를 발현시킴으로써 가용성 형태로 투여되어, 단지 세포외 부분, 즉, 세포외 수퍼패밀리 V 및 C-유사 도메인을 생성시킬 수 있다[문헌: Grumet et al., Hum. Immunol., 40(3), p. 228-234, 1994]. 상기 문헌에는 사람 B7의 가용성 형태의 발현을 교시하고 있고, 본 원에서는 상기 문헌의 모든 내용을 참조로 인용한다.
짧은꼬리원숭이는 특이적인 항원을 생성시키는 조건하에 B7, B7.1 및/또는 B7.2 항원, 바람직하게는 이의 가용성 형태로 면역될 수 있다. 바람직하게는, 가용성 사람 B7, B7.1 또는 B7.2 항원은 보조제, 예를 들어, 컴플리트 프런드 보조제(Complete Freund's Adjuvant: CFA), 명반, 사포닌, 또는 그밖의 보조제 뿐만아니라, 이의 혼합물과 함께 투여될 수 있다. 일반적으로, 이러한 투여는 예를 들어, 수개월에 걸쳐 반복주입함으로써 반복면역될 수 있다. 예를 들어, 가용성 B7.1 항원의 투여는 3 내지 4개월에 걸쳐 면역 보충 면역화로 보조제중으로 투여되며, 생성된 혈청은 사람 B7.1 항원과 결합하는 항체를 함유한다.
면역화 후에, 예를 들어, 면역된 동물로부터 취한 림프 노드 생검물, 및 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 KH6/B5(마우스 x 사람) 헤테로골수종 세포와 융합된 B 림프구로 B 세포를 수거한다. 그러한 헤테로골수종을 제조하는 방법은 공지되어 있으며, 1995년 1월 25일자 출원된 뉴만(Newman)등의 미국특허 제08/379,072호에 기재되어 있고, 본원에서는 상기 특허를 참조로 인용한다.
사람 B7, B7.1 및/또는 B7.2와 결합하는 항체를 분비하는 헤테로하이브리도마를 동정할 수 있다. 이러한 동정은 공지된 기술로 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 동정은 표지된 사람 B7, B7.1 및/또는 B7.2 항원를 사용한 ELISA 또는 방사선면역검정 방법으로 수행된다.
사람 B7, B7.1 및/또는 B7.2 항원에 대한 바람직한 특이성을 지닌 항체를 분비하는 세포주를 단일클론성으로 서브 클로닝하였다.
본 발명에서, 본 발명자들은 정제된 항체를 ELISA 검정에서 가용성 B7.1 항원 피복된 판, 항원 양성 B 세포, 및 이들의 세포 표면상에서 사람 B7.1 항원을 발현하는 CHO 형질감염종에 결합하는 이들의 능력에 대하여 스크리닝하였다. 또한, 항체를 IL-2생성에 의해 측정되는 바와 같이 B 세포/T 세포 상호작용을 차단하는 이들의 능력에 대하여 스크리닝하고, B7 결합을125I-방사성 표지된 가용성 B7.1(SB7.1)을 사용하여 검출하면서 혼합된 림프구 반응(MLR)에서 흡수된 티미딘을 삼중수소화시켰다.
또한, 짧은꼬리원숭이로부터의 친화성 정제된 항원을 B7.1/Ig 융합 단백질을 발현하는 CHO 형질감염 및 사람 B7.2 항원을 생성하는 CHO 세포에 대한 이들의 반응성에 대하여 시험하였다. 상기 시험의 결과는 B7.1 면역 혈청이 B7.2 형질감염종에 결합하였음을 나타냈다. 항체가 B7.2 항원에 결합하는 것은 가용성 B7.2-Ig 시약을 사용함으로써 확인될 수 있다. 실시예에서 논의되는 바와 같이, 이는 CHO 형질감염종으로부터 B7.2-Ig를 생성시키고 정제하여 B7.2-Ig 세파로즈 친화성 칼럼을 제조함으로써 수행될 수 있다. B7.2와 교차 반응하는 이들 항체는 B7.2-Ig-세파로즈 칼럼과 결합될 수 있다.
사람 B7 항원, B7.1 항원 및/또는 B7.2 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 세포주를 문헌[Newman et al., (1992), Id.], 및 1995년 1월 25일자 출원된 뉴만등의 미국특허 제379,072호에 기재된 바와 같이 영장류화된 항체를 제조하는 가변도메인 서열을 클로닝하는데 사용된다. 본원에서는 상기 문헌 및 특허원을 참조로 인용한다. 기본적으로는, 이러한 사항은 Ig 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 RNA의 추출, cDNA로의 전환, 및 이의 증폭을 의미한다. 적합한 프라이머는 뉴만등의 1992년 문헌 및 미국특허원 제 379,072호에 기재되어 있다(참조, 특히 미국특허원 제379,072호의 도 1)
이어서, 클로닝된 원숭이 가변유전자를 사람 중쇄 및 경쇄 일정영역 유전자를 함유하는 발현 벡터내로 삽입한다. 바람직하게는, 이러한 삽입은 NEOSPLA로 일컬어지는 IDEC, Inc.의 독점 발현벡터를 사용하여 수행한다. 이러한 벡터는 도 2에 도시되어 있으며, 사이토메갈로바이러스 프로모터/증진제, 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터, SV 40 기원의 복제, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트란스페라제 엑손 1 및 엑손 2, 사람 면역글로블린 카파 또는 람다 일정영역, 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자, 사람 면역글로블린 감마 1 또는 감마 4PE 일정영역 및 리더서열을 함유한다. 이러한 벡터는 원숭이 가변영역 유전자의 혼입, CHO 세포에서의 형질감염, G418 함유 배지에서의 선택 및 메토트렉사트 증폭시에 영장류화된 항체의 아주 높은 수준의 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
예를 들어, 이러한 발현 시스템은 CD4 및 그밖의 사람 세포표면 수용체에 대한 높은 활성(Kd ≤ 10-10M)을 지니는 영장류화된 항체를 생성시키는 것으로 공지되어 있다. 또한, 이러한 항체는 최초의 원숭이 항체와 동일한 친화성, 특이성 및 기능적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 벡터 시스템은 본원에 참조되어 있으며 공동 양도된 미국특허원 제379,072호 뿐만 아니라 1993년 11월 3일자 출원된 미국 특허원 제08/149,099호에 기재되어 있으며, 본원에서는 상기 특허원들을 참조로 인용한다. 이러한 시스템은 높은 발현 수준, 즉, ＞30 pg/세포/일을 제공한다.
이하 기재되는 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 B7.1 항원과 특정적으로 결합되며, 또한 B7.2 항원과 결합될 수 있는 4 리드 지원 원숭이 단일클론성 항체를 선택하였다. 원숭이 단일클론성 항체는 본원에서 7B6, 16C10, 7C10 및 20C9로 일컬어진다.
이하 상세히 기재되는 바와 같이, 이러한 항체는 T 세포 결합에 대한 T 세포 결합 실험을 위해 혼합된 림프구 반응에서의 IL-2 생성 및 삼중수소화된 티미딘 흡수를 측정하는 바와 같이 B 세포/T 세포 상호작용을 차단하는 이들의 능력에 대하여 평가하였고, 사람 피복 말초혈액 림프구를 PHA 자극제의 존재하에 3 내지 6일동안 배양하였다. B7 결합은125I-방사성 표지된 가용성 B7.1을 사용하여 방사성 검정하였다. 관찰된 결과는 모든 이러한 항체가 고친화도로 B7.1 항원과 결합하고 효과적으로 B 세포/T 세포 상호작용을 차단한다는 것을 나타내며, 이러한 결과는 혼합된 림프구 배양물의 감소된 IL-2 생성 및 감소된 증식으로 입증된다.
이러한 특정의 원숭이 단일클론성 항체의 특성은 다음과 같이 요약된다:
1. CTLA4-Ig 사이의 물리적인 상호작용을 차단하는 원숭이 항체의 능력을 입증하기 위해서, 다양한 농도의 원숭이 항-B7.1 항체 및 방사성 표지된 CTLA4-IG를 방사성 표지된 CTLA4-Ig1125와 함께 배양하였다. 억제검정의 결과는 우너숭이 항체에 대한 IC50(50% 억제를 생성하는 억제제의 농도)은 이하와 같다:
a: 7C10: 0.39㎍/M1
b: 16C10: 1.60㎍/M1
c: 20C9: 3.90㎍/M1
d: 7B6: 39.0㎍/M1
2. 스케챠드 분석은 B7-Ig 피복된 판에 결합하는 원숭이 항체에 대한 명백한 친화성 상수(Kd)가 다음과 같이 계산됨을 나타냈다:
a: 7C10: 6.2 x 10-9M
b: 16C10: 8.1 x 10-9M
c: 7B6: 10.7 x 10-9M
d: 20C9: 16.8 x 10-9M
3. 항체를 시험관내 혼합된 림프구 반응 검정(MLR)으로 시험하였다. MLR에서는 모든 4 항-B7.1 항체가 다음과 같은 Ibgo을 나타내는 상이한 범위로 IL-2 생성을 억제시킴을 나타내었다:
a: 7B6: 5.0㎍/M
b: 16C10: ＜0.1㎍/M
c: 20C9: 2.0㎍/M
d: 7C10: 5.0㎍/M
4. 원숭이 항-B7.1 항체를 사람 말초 혈액 림프구(PBL)에서 B7과 결합하는 능력에 대하여 시험하였다. FACS 분석은 모든 4 원숭이 항체가 양성으로 시험되었음을 나타냈다.
5. 원숭이 항체 16C10, 7B6, 7C10 및 20C9를 FACS 분석에 의해 결합하는 C1q에 대하여 시험하였다. 결과는 7C10 원숭이 Ig가 B7.1 CHO-형질감염된 세포와 함께 배양된 후에 강한 사람 C1q 결합을 지니는 것으로 밝혀졌다. 16C10은 양성이지만, 20C9 및 7B6 원숭이 항체는 음성적이었다.
6. 패스-톡스 연구에 대한 동물모델을 선택하기 위해서, 원숭이 항체를 상이한 종으로부터의 동물 혈액으로 시험하였다. 원숭이 항-B7.1 항체는 사람, 침팬지 , 및 가능한 비비원숭이와 교차반응하였음이 측정되었다.
상기된 특성을 근거로 하여, 3 가지의 원숭이 단일클론성 항체, 16C10, 7C10 및 20C9가 가장 유리한 특성을 나타낸다는 것이 명백하다. 16C10 및 7C10이 20C9보다 다소 우수하다.
공동 양도된 미합중국 출원 제 08/379,072호에 기술된 기술을 사용하여, 본 발명자들은 7C10, 7B6 및 16C10의 가변성 도메인을 클로닝시키고, 7C10 경쇄, 7C10 중쇄, 7B6 경쇄, 7B6 중쇄, 16C10 경쇄 및 16C10 중쇄의 영장류화 형태의 아미노산 및 핵산 서열을 제공하였다. 이들 아미노산 및 핵산 서열은 도 8a 및 8b, 9a 및 9b, 및 10a 및 10b에서 발견할 수 있다. 사람 감마 1 불변 도메인에 대한 DNA 및 아미노산 서열은 미합중국 특허 출원 제 08/379,072호에서 발견할 수 있다.
기술된 바와 같이, 이들 영장류화 항체는 본원에 참고문헌으로 인용된 공동 양도된 미합중국 특허 출원 제 08/379,072호 및 제 08/149,099호에 실제로 기술된 도 2에 도시된 NEOSPLA 발현 인자를 사용하여 발현시키는 것이 바람직하다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 영장화 항체는 사람 감마 1 또는 감마 4 불변 영역을 함유하는 것이 바람직할 것이며, 감마 4는 두 위치에서 바람직하게 돌연변이되어 감마 4 PE를 생성시킨다. 감마 4 PE 변종은 2개의 돌연변이체,즉 잔류 FCR 결합을 제거하기 위해 도입된 CH2 영역 중의 글루탐산, 및 중쇄 이황화물 결합 상호작용의 안정성을 향상시키기도록 예정된 힌지 영역 중의 프롤린 치환체를 함유한다 : (참조 : 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Alegre et al, J. Immunol., 148, 3461-3468, (1992)] 및 [Angel et al., Mol. Immunol., 30, 105-158, (1993)]).
본 발명의 영장화 항체는 감마 1, 감마 4 또는 감마 4 PE 불변 영역을 함유하는 지의 여부는 특정 질환 표적에 크게 의존한다. 바람직하게는, 영장화 IgG1 및 IgG4 항체의 결실 및 비결실이 발생하고, 특정 질환 표적에 대해 시험된다.
본 발명의 원숭이 단클론성 항체의 기술된 결합 및 작용성에 대해, 이들 항-B7.1 단클론성 항체 및 이들의 영장화 형태는 B7:CD28 상호작용을 차단하여 면역 억제를 제공하기 위한 치료제로서 매우 적합해야 한다. 특히, B7.1 항체에 대한 이들의 친화성 및 IL-2 생성 및 혼합된 림프구 배양액 중에서의 삼중 티미딘 흡수에 의해 측정하여 B 세포/T 세포 상호작용을 차단하기 위한 능력, 및 감소된 항원 특이적 IgG 반응, IL-2 생성 및 세포 증식에 의해 나타나는 바와 같은 공여자 비장 세포 배양액 중에서의 항원 동인 반응을 효과적으로 억제하기 위한 이들의 능력에 대해, 이들 원숭이 단클론성 항체 및 이들의 영장화 형태는 B7:CD28 경로를 조절하는 효과적인 면역억제제로서 작용해야 한다. 이것은 원하지 않는 항원 특이적 IgG 반응을 억제하기 위해 면역억제가 치료적으로 바람직한 많은 질환, 예를 들어 자가 면역 질환의 치료를 위해, 그리고 또한 기관 거부 및 이식편 대 숙주 질환의 예방을 위해 중요하다. 본질적으로, 본 발명의 항체는 B7:CD28 경로의 억제가 치료적으로 바람직한 임의의 질환을 치료하는 데에 유용할 것이다.
본 발명의 항-B7.1 항체에 대한 주요 치료적 적용은 예를 들어 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 전신성 홍반성 루프스(SLE), 타입 1 당뇨병, 다발성 경화증, 무형성 빈혈, 건선 및 류머티스성 관절염을 포한한다.
본 발명의 항-B7.1의 또다른 중요한 치료적 적용은 기관 이식 및 골수 이식(BMT) 동안 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 예방하는 것이다. 본 발명의 항체는 공여자 특이적 동종 항원에 대한 숙주 내성을 유도하여, 이식편 거부의 발생을 감소시키도록 사용될 수 있다. 동종 심장 이식의 쥐과 동물 모델에서, CTLA4-Ig의 정맥내 투여가 면역억제 또는 심지어는 동종 항원에 대한 내성의 유도를 유발시킬 수 있음이 입증되었다 [참조 : Lin et al., J. Exp. Med. 178:1801, 1993; Torka et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:11102, 1992]. 본 발명의 영장화 항-B7.1 항체는 유사하거나 더 큰 활성을 나타낼 것으로 예측된다.
상기 기술된 방식으로, 또는 동등한 기술에 의해 생성된 항체는 작용성 생물학적 검정에서 특징화를 위해 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합에 정제될 수 있다. 이들 검정은 특이성 및 결합 친화성, 및 발현된 이소타입, 예를 들어 ADCC와 관련된 이펙터 기능, 또는 보체 결합의 결정을 포함한다. 이러한 항체는 B 세포 림프종, AIDS를 포함하는 감염성 질환, 자가 면역 및 염증성 질환 및 이식을 포함하는 많은 사람 질병에 대한 불활성 또는 활성 치료제로서 사용될 수 있다. 항체는 본래의 형태로 사용되거나, 항체/킬레이트, 항체/약체 또는 항체/독소 복합체의 일부로서 사용될 수 있다. 부가적으로, 전체 항체 또는 항체 단편(Fab2, Fab, Fv)은 항-전유전 물질형 반응의 발생을 위해 활성 면역 치료에서 영상화 시약 또는 잠재 백신 또는 면역원으로서 사용될 수 있다.
치료 효과를 발생시키기 위해 유용한 항체의 양은 당업자에게 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 항체는 약제학적으로 허용될 수 있는 완충제 내에서 표준 기술에 의해 제공되는 것이 일반적일 것이고, 임의의 바람직한 경로로 투여될 수 있다. 현재 청구된 항체의 효율 및 사람에 의한 이들의 내성 때문에, 이들 항체를 반복적으로 투여하여 인체 내에서 다양한 질환 또는 질병을 치료하는 것이 가능하다.
본 발명의 항-B7.1 항체(또는 이들의 단편)은 면역 억제를 유도하기 위해, 즉 사람 또는 동물의 면역계의 억제를 유도하기 위해 유용하다. 따라서, 본 발명은 면역 억제를 필요로 하는 사람 또는 다른 동물에 본 발명의 항체를 효과적이고 비독성인 양으로 투여함으로써, 이러한 사람 또는 동물에서 면역 억제를 유도하는 방법에 관한 것이다.
면역 억제를 유도하기 위한 본 발명의 화합물의 능력은 이를 목적으로 사용되는 표준 시험, 예를 들어 혼용된 림프구 반응 시험, 또는 티미딘 흡수에 의해 측정되는 T-세포 증식의 억제를 측정하는 시험으로 입증되었다.
본 발명의 항체가 면역 억제를 유도하는 데에 유용하다는 점은, 이들이 이식된 기관 또는 조직(예를 들어, 신장, 심장, 허파, 골수, 피부, 각막 등)의 거부에 대한 내성의 치료 및 예방; 자가 면역성, 염증성, 증식성 및 과증식성 질환, 면역학적으로 중개된 질환(예를 들어, 류머티스성 관절염, 홍반성 루푸스, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선, 다발성 경화증, 중증근무력증, 타입 1 당뇨병, 포도막염, 네프로오제 증후군, 건선, 아토피성 피부염, 접촉 피부염 및 추가의 습진성 피부염, 지루성 피부염, 편평 태선, 천포창, 수포성 천포창, 표피 수포증, 두드러기, 혈관 부종, 맥관염, 홍진, 피부 호산구 증가증, 원형 탈모증 등)의 피부 징후의 치료 및 예방; 가역성 폐쇄성 기도 질환, 장의 염증 및 알레르기(예를 들어, 체강 질환, 직장염, 호산구 증가성 위장염, 비만세포증, 국한성 회장염 및 궤양성 대장염) 및 음식 관련 알레르기(예를 들어, 편두통, 비염 및 습진)의 치료에 유용해야 한다.
당업자들은 일상적 실험에 의해, 면역 억제를 유도하기 위한 항체의 효과적이고 비독성인 양을 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 일반적으로, 효과적인 용량은 하루에 체중 1㎏당 약 0.05 내지 100㎎일 것이다.
본 발명의 항체(또는 이들의 단편)은 또한 포유동물에서 종양을 치료하기 위해 유용해야 한다. 더욱 상세하게는, 이들은 종양 크기를 감소시키고, 종양 성장을 억제시키고/거나 종양 보유 동물의 생존 기간을 연장시키기 위해 유용해야 한다. 따라서, 본 발명은 또한, 효과적이고 비독성인 양의 항체를 사람 또는 다른 동물에 투여하여, 이러한 사람 또는 동물에서 종얄을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당업자들은 일상적 실험에 의해, 발암성 종양을 치료하기 위한 항-B7 항체의 효과적이고 비독성인 양을 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 일반적으로, 효과적인 용량은 하루에 체중 1㎏당 약 0.05 내지 100㎎인 것으로 예측된다.
본 발명의 항체는 상기 언급된 치료 방법에 따라, 이러한 효과를 치료적 또는 예방적 정도로 발생시키기에 충분한 양으로 사람 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 본 발명의 이러한 항체는 본 발명의 항체를 공지된 기술에 따라 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합시킴으로써 제조되는 통상적인 형태로 이러한 사람 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 당업자들은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제가 이것과 조합시키려는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 널리 공지된 변수에 의해 규정됨을 인지할 것이다.
본 발명의 항체(또는 이들의 단편)의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입 또는 국소적일 수 있다. 본원에 사용되는 용어 비경구는 정맥내, 복강내, 근내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 비경구적 투여의 피하 및 근내 형태가 일반적으로 바람직하다.
면역 억제를 예방적으로 또는 치료적으로 유도하기 위해, 또는 발암성 종양을 치료적으로 치료기 위해 본 발명을 사용하기 위한 매일 비경구적 및 경구적 용량은 하루에 체중 1㎏당 약 0.05 내지 100㎎, 바람직하게는 약 0.5 내지 10이 바람직할 것이다.
본 발명의 항체는 또한, 흡입에 의해 투여될 수 있다. 용어 흡입은 비내 및 경구 흡입 투여를 의미한다. 에어로졸 제형 또는 계측 용량 흡입기와 같은, 이러한 투여를 위해 적합한 투여 형태는 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 사용하려는 본 발명의 화합물의 바람직한 용량은 일반적으로 약 10 내지 100㎎이 바람직하다.
본 발명의 항체는 또한 국소적으로 투여될 수 있다. 국소적 투여는 비전신 투여를 의미하고, 표피, 구강의 외부에 본 발명의 항체(또는 이것의 단편)의 적용 및 귀, 눈 및 코 내로의 이러한 항체의 점적, 및 이러한 항체가 혈류에 상당히 들어가지 않는 경우를 포함한다. 전신 투여는 경구, 정맥내, 복강내 및 근내 투여를 의미한다. 치료적 또는 예방적 효과를 위해 필요한 항체의 양은 물론 선택된 항체, 치료 조건의 정도 및 치료하려는 동물에 따라 변할 것이고, 궁극적으로 의사의 선택에 따른다. 본 발명의 항체의 적합한 국소적 용량은 하루에 체중 1㎏당 약 1 내지 100㎎이 바람직할 것이다.
제형
항체 및 이것의 단편을 단독으로 사용할 수도 있지만, 이것을 약제학적 제혀으로서 제공하는 것이 바람직하다. 활성 성분은 국소적 투여를 위해, 제형의 10 중량%, 바람직하게는 5 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1 중량%의 양으로 포함될 수도 있지만, 제형의 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 1 내지 2 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 본 발명의 국소적 제형은 1종 이상의 허용될 수 있는 담체(들) 및 임의의 다른 치료 성분(들)과 함께 활성 성분을 포함할 수 있다. 담체(들)은 제형의 다른 성분과 양립하고, 이것의 수용자에게 무해해야 한다는 점에서 허용될 수 있어야 한다.
국소적 투여를 위해 적합한 제형은 피부를 통해 치료를 필요로 하는 자리로 침투시키기 위해 적합한 액체 또는 반액체 제조물, 예를 들어 바르는 약, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트, 및 눈, 귀 또는 코에 투여하기에 적합한 드롭을 포함한다.
본 발명에 따르는 드롭은 무균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있으며, 활성 성분을 항균제 및/또는 살균제 및/또는 임의의 다른 적합한 방부제의 수용액 중에 용해시키고, 바람직하게는 표면활성제를 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 생성된 용액은 여과에 의해 분류되고, 밀봉된 적합한 용기로 옮겨지고, 30분 동안 90 내지 100℃에서 오토클레이브 처리하고 유지시켜서 살균시킬 수 있다. 대안적으로, 용액은 여과에 의해 살균되고, 무균 기술에 의해 용기로 옮겨질 수 있다. 드롭에 포함시키기에 적합한 항균제 및 살균제는 페닐 수은 질산염 또는 아세트산염(0.002%), 염화 벤즈알코늄(0.01%) 및 아세트산 클로르헥시딘(0.01%)이다. 유성 용액의 제조를 위해 적합한 용매는 글리세롤, 희석된 알코올 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
본 발명에 따르는 로션은 피부 또는 눈에 적용시키기에 적합한 것을 포함한다. 눈에 적용되는 로션은 임의적으로 항균제를 함유하는 무균 수용액을 포함할 수 있으며, 드롭의 제조 방법과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 피부에 적용하기 위한 로션 또는 바르는 약은 또한, 건조를 촉진시키고 피부를 냉각시키는 제제, 예를 들어 알코올 또는 아세톤, 및/또는 글리세롤과 같은 습윤제 또는 피마자유 또는 땅콩 기름과 같은 오일을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 크림, 연고 또는 페이스트는 외부 적용을 위한 활성 성분의 반고체 제형이다. 이들은 기름이 있거나 없는 주성분을 사용하여, 적합한 기계를 사용하여, 활성 성분을 단독으로 또는 수성 또는 비수성 유체 중의 용액 또는 현탁액 중에서 미립 또는 분말 형태로 기름이 있거나 없는 주성분과 혼합시킴으로써 제조될 수 있다. 주성분은 경질, 연질 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀랍 또는 금속성 비누와 같은 탄화수소; 점액; 아몬드, 옥수수, 땅콩, 아주까리 또는 올리브유와 같은 천연유; 울 지방 또는 이것의 유도체, 또는 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산을 프로필렌 글리콜 또는 마크로골과 같은 알코올과 함께 포함할 수 있다. 제형은 소르비탄 에스테르 또는 이것의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 음이온성, 양이온성 또는 비이온성 표면 활성제와 같은 임의의 적합한 표면 활성제를 혼입할 수 있다. 천연 고무, 셀룰로오스 유도체 또는 규소질 실리카, 및 라놀린과 같은 다른 성분과 같은 현탁제가 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 항-B7.1 또는 이것의 단편은 또한 B7:CD28 경로를 조절하는 다른 부분과 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 부분은 예를 들어, IL-7 및 IL-10, CTLA-Ig, 가용성 CTLA-4 및 항-CD28 항체 및 이들의 단편을 포함한다.
당업자들은 항체 또는 이것의 단편의 개별적 투여의 최적량 및 간격이 처리 조건의 성질 및 정도, 투여 형태, 경로 및 자리, 및 처리하려는 특정 동물에 의해 결정될 것이고, 이러한 최적 조건은 통상적인 기술에 의해 결정될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 당업자들은 최적 치료 과정, 즉 규정된 일수 동안 하루에 주어진 본 발명의 항체 또는 이것의 단편의 투여 횟수가 치료 결정 시험의 통상적인 과정을 사용하여 당업자에 의해 달성될 수 있음을 인식할 것이다.
추가의 부연 설명 없이, 당업자는 상기 설명을 이용하여 본 발명을 가장 완전한 정도로 이용할 수 있을 것으로 믿어진다. 따라서, 하기의 제형은 단지 예시적 양태로서 구성된 것이며, 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
캡슐 조성물
캡슐 형태의 본 발명의 약제 조성물은 표준 2조각 경질 젤라틴 캡슐을 분말 형태의 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 50㎎, 락토오스 100㎎, 탈크 32㎎ 및 스테아르산 마그네슘 8㎎으로 채움으로써 제조된다.
주사할 수 있는 비경구 조성물
주사에 의한 투여에 적합한 형태의 본 발명의 약제 조성물은 1.5 중량%의 본 발명의 항체 또는 이것의 단편을 10 부피%의 프로필렌 글리콜 및 물과 교반시킴으로써 제조된다. 용액은 여과에 의해 살균시킨다.
연고 조성물
본 발명의 항체 또는 이것의 단편 : 1.0g.
백색 연질 파라핀 : 전체가 100.0g이 되게 하는 양.
본 발명의 항체 또는 이것의 단편을 소량의 부형제 중에 분산시켜서 매끄럽고 균일한 생성물을 생성시킨다. 접을 수 있는 금속관을 분산액으로 채운다.
국소용 크림 조성물
본 발명의 항체 또는 이것의 단편 : 10g.
폴라왁스 GP 200 : 20.0g.
백색 비스왁스 : 2.5g.
메틸 히드록시벤조에이트 : 0.1g.
증류수 : 전체가 100.0g이 되게 하는 양.
폴라왁스, 비스왁스 및 라놀린을 60℃에서 함께 가열시킨다. 메틸 히드록시벤조에이트의 용액을 첨가하고, 고속 교반에 의해 균일화시킨다. 온도를 50℃ 까지 감소시킨다. 본 발명의 항체 또는 이것의 단편을 첨가하고, 골고루 분산시키고, 조성물을 냉각시키면서 저속 교반시킨다.
국소용 로션 조성물
본 발명의 항체 또는 이것의 단편 : 1.0g.
소르비탄 모노라우레이트 : 0.6g.
폴리소르베이트 20 : 0.6g.
세토스테아릴 알코올 : 1.2g.
글리세린 : 6.0g.
메틸 히드록시벤조에이트 : 0.2g.
정제수 B.P. : 전체가 100-00 ㎖가 되게 하는 양 (B.P.= 영국 약전).
메틸 히드록시벤조에이트 및 글리세린을 75℃에서 70㎖의 물 중에 용해시킨다. 소르비탄 모노라우레이트, 폴리소르베이트 20 및 세토스테아릴 알코올을 75℃에서 함께 용융시키고, 수용액에 첨가하였다. 생성된 에멀션을 균일화시키고, 냉각시키면서 연속 교반시키고, 본 발명의 항체 또는 단편을 잔류하는 물 중의 현탁액으로서 첨가한다. 전체 현탁액을 균일해질 때 까지 교반시킨다.
눈에 적용되는 드롭 조성물
본 발명의 항체 또는 이것의 단편 : 0.5g.
메틸 히드록시벤조에이트 : 0.01g.
프로필 히드록시벤조에이트 : 0.04g.
정제수 B.P. : 전체가 100-00㎖가 되게 하는 양.
메틸 및 프로필 히드록시벤조에이트를 75℃에서 70㎖의 정제수 중에 용해시키고, 생성된 용액을 냉각시킨다. 본 발명의 항체 또는 이것의 단편을 첨가하고, 용액을 막 필터(0.022㎛ 공극 크기)를 통해 여과에 의해 살균시키고, 적합한 무균 용기 중에 무균적으로 충전시킨다.
흡입에 의한 투여용 조성물
용량이 15 내지 20㎖인 에어로졸 용기에 대해, 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 10㎎을 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 0.2 내지 0.5%의 윤활제와 혼합시키고, 혼합물을 프레온과 같은 추진제, 바람직하게는 (1,2-디클로로테트라풀루오로에탄)과 디플루오로클로로메탄의 배합물 중에 분산시키고, 비내 또는 경구 흡입 투여용으로 개조된 적합한 에어로졸 용기 내에 넣는다.
흡입에 의한 투여용 조성물
용량이 15 내지 20㎖인 에어로졸 용기에 대해, 본 발명의 항체 또는 이것의 단편을 에탄올(6 내지 8㎖) 중에 용해시키고, 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 0.1 내지 0.2%의 윤활제를 첨가하고; 프레온과 같은 추진제, 바람직하게는 (1,2-디클로로테트라풀루오로에탄)과 디플루오로클로로메탄의 배합물 중에 분산시키고, 비내 또는 경구 흡입 투여용으로 개조된 적합한 에어로졸 용기 내에 넣는다.
본 발명의 항체 및 약제 조성물은 비경구 투여, 즉 피하, 근내 또는 정맥내 투여에 특히 적합하다. 비경구 투여용 조성물은 허용될 수 있는 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해시킨 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 또는 이들의 칵테일의 용액을 포함하는 것이 통상적일 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 물, 완충된 물, 0.4% 식염, 0.3% 글리신 등을 사용할 수 있다. 이들 용액은 무균성이고, 일반적으로 미립체를 함유하지 않는다. 이들 용액은 통상적인 널리 공지된 살균 기술에 의해 살균시킬 수 있다. 조성물은 pH 조절제, 완충제 등과 같은, 대략적 생리학적 조건에 필요한 바와 같은 약제학적으로 허용될 수 있는 보조 성분을 함유할 수 있다. 이러한 약제 제형 중의 본 발명의 항체 또는 이것의 단편의 농도는 광범위하게 변할 수 있으며, 즉 약 0.5 중량% 미만, 일반적으로 1% 내지 15 또는 20 중량%이고, 선택된 특정 투여 방식에 따라 주로 유체 부피, 점도 등을 기준으로 선택될 것이다.
따라서, 근내 주사를 위한 본 발명의 약제 조성물은 무균 완충된 물 1㎖ 및 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 50㎎을 함유하도록 제조할 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제 조성물은 무균 링거액 250㎖, 및 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 150㎎을 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구 투여용 조성물을 제조하기 위한 실제 방식은 당업자들에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 기술되어 있다.
본 발명의 항체(또는 이것의 단편)은 저장을 위해 동결 건조시키고, 사용 전에 적합한 담체 중에서 재구성할 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역 글로불린을 사용할 경우에 효과적인 것으로 입증되었고, 당분야에 공지된 동결 건조 및 재구성 기술을 사용할 수 있다.
예정된 결과에 따라, 예방 및/또는 치료를 위해 본 발명의 약제 조성물을 투여할 수 있다. 치료를 위해, 조성물은 이미 질환에 걸린 환자에게, 질환 및 이것의 합병증을 치료하거나 최소한 부분적으로 억제하기에 충분한 양으로 투여된다. 예방을 위해, 본 발명의 항체 또는 이들의 칵테일을 함유하는 조성물이 아직 질환에 걸리지 않은 환자에게 투여되어 환자의 내성을 향상시킨다.
약제 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 투여량 수준 및 패턴에 따라 수행될 수 있다. 어떠한 경우에도, 본 발명의 약제 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 변형된 항체(또는 이것의 단편)를 제공해야 한다.
또한, 본 발명의 항체가 항체와 같은 치료에 유용한 펩티드 또는 비-펩티드 화합물(의태물)의 디자인 및 합성을 위해 사용될 수 있음을 유의해야 한다.
본 발명을 추가로 예시하기 위해, 하기의 실시예가 제공된다. 이들 실시예는 본 발명을 제한하도록 예정되지도 않고, 구성되지도 않은 것이다.
실시예 1
섬사상 파지의 표면상에 나타난 재조합 면역 글로불린 라이브러리는 문헌[McCafferty et al., Nature, 348:552-554, 1990 and Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:7978-7982, 1991]에 기술되어 있다. 상기 기술을 사용하여, 고친화성 항체를 면역 사람 재조합 라이브러리로부터 단리시켰다 : [참고문헌 : Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 589:10164-10168, 1992]. 사용된 파지 디스플레이 개념이 문헌 [Barbas, 1992, Id.]에 기술된 것과 실질적으로 유사할 수 있지만, 기술은 원숭이 라이브러리를 독특한 인자로 치환시켜서 변형되어 재조합의 가능성을 감소시키고, 안정성을 개선시켰다. 상기 인자, 즉 pMS(도 1)는 폴리시스론성 중쇄 및 경쇄 원숭이 DNA의 효율적인 전사 및 번역을 위한 단일 lac 프로모터/오퍼레이터를 함유한다. 상기 인자는 2개의 상이한 리더 서열, 즉 경쇄에 대한 omp A [Movva et al., J. Biol. Chem., 255 : 27-29, (1980)] 및 중쇄에 대한 pel B [Lei, J. Bact. 4379-109:4383 (1987)]을 함유한다. 리더 서열은 둘 모두 중쇄 또는 경쇄 클로닝된 생성물을 페리플라즘 공간으로 분비시키는 소수성 단일 펩티드 내로 번역된다. 페리플라즘의 산화성 환경에서, 2개의 사슬은 접히고, 이황화물 결합이 형성되어 안정한 Fab 단편을 생성시킨다. 파지미드 블루스크립트로부터 인자의 골격이 유도된다 [참조 : Stratagene, La Jolla, CA]. 이것은 pMS DNA를 잠복하고 있는 박테리아 에 대한 암피실린(카르베니실린) 저항성을 제공하는 효소 베타-락타마아제에 대한 유전자를 함유한다. 또한, 블루스크립트로부터 다중 복제 플라스미드 ColE1의 복제원 및 섬사상 박테리오파지 f1의 복제원이 유도된다. 파지 f1의 복제원(소위, 유전자내 영역)은 단일 표준 pMS DNA의 합성의 개시, 캡시드 형성의 개시 및 바이러스 효소에 의한 RNA 합성의 종결을 신호한다. 파지 입자로의 pMS DNA 표준 물질의 복제 및 어셉블리는 헬퍼 파지에 의해 제공되어야 하는 바이러스 단백질을 필요로 한다. 본 발명자들은 이를 위해 특히 적합한 헬퍼 파지 VCSM13을 사용하였으며, 그 이유는 이것이 또한 카나마이신 저항성에 대해 코드화된 유전자를 함유하고 있기 때문이다. VCSM13 및 pMS로 감염된 박테리아는 카나마이신 및 카르베니실린을 성장 배지에 첨가함으로써 선택할 수 있다. 박테리아는 최종적으로 pMS 또는 VCSM13 게놈 중 어느 하나를 함유하는 섬사상 파지 입자를 생성시킬 것이다. 헬퍼 파지의 팩키징은 pMS 보다 덜 효율적이어서, 재조합 pMS 파지를 우세하게 함유하는 혼합된 파지군을 생성시킨다. 파지의 말단은 각각의 말단에 특이적인 마이너 코우트 단백질을 픽업한다. 파지의 한 말단에서 3 내지 5개의 복제물 중에 존재하는 유전자 III 생성물이 특히 중요하다. 유전자 III 생성물은 406개의 아미노산 잔기를 갖고, F pili를 통한 대장균의 파지 감염을 위해 필요하다. 중쇄의 첫 번째 2개의 도메인, 가변성 및 CH1 도멘인을 유전자 III 생성물의 카르복시 말단 절반에 융합시킨다. pel B 리더에 의해 유도된 상기 재조합 pili 단백질을 페로플라즘에 분비시켜서, 상기 단백질을 축적시키고, 단백질이 파지의 코우트 내에 혼입되기 때문에 경쇄와의 이황화물 결합을 형성시킨다. 또한, 또다른 인자는 유전자 III의 하류에서 처리된 FLAG 서열을 함유한다. FLAG는 Fd 단백질의 카르복시 말단에서 발현되는 8개의 아미노산 펩티드이다. 본 발명자들은 ELISA에 의한 파이지의 정제 및 검출 둘 모두를 위해 시판용 다클론성 항-FLAG M2를 사용하였다 : [참조 : Brizzard,Bio Techniques, 16(4):703-731, (1994)].
인자 pMS를 재구성한 후에, 본 발명자들은 대조 표준 항체 유전자를 사용하여 파지 결합 Fab를 생성시키기 위한 이것의 능력을 시험하였다. 본 발명자들은 항-파상풍균 유독소 항체(카를로스 바바스(Carlos Barbas)로부터 입수함)를 pMS 및 형질감염된 XLI-불루로 클로닝시켰다. 본 발명자들은 세포를 VCSM13으로 동시 감염시키고, 항-파상풍균 유독소 항체를 나타내는 파지를 생성시켰다. 본 발명자들은 항-파상풍균 유독소 파지를 1:100,000으로 부적합한 항체를 함유하는 파지와 배합시키는 효율적인 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 항원(파상풍 유독소) 코우팅된 폴리스티렌 웰에 혼합된 파지 50㎕를 도포시킴으로써 3라운드의 패닝(panning)을 수행하였다. 비접착 파지를 세척해내고, 접착 파지를 산으로 용리시켰다. 용리된 파지를 사용하여 XL1-블루 박테리아의 새로운 분취물을 감염시키고, 헬퍼 파지를 첨가하였다. 밤샌 증폭 후에, 파지를 제조하고, 항원 코우팅된 플레이트 상에서 다시 패닝시켰다. 3라운드의 패닝 후에, 본 발명자들은 항-파상풍균 유독소 파지가 성공적으로 부화되었음을 알 수 있었다. 이러한 기술의 성공은 또한, 최종 패닝된 생성물의 특징화를 위해 가용성 Fab를 제조하기 위한 능력에 의존한다. 이것은 제한 효소 Nhe I를 사용하여 pMS DNA로부터 유전자 III를 절제시킨 후, 재결찰시킴으로써 달성된다. 유전자 III를 절제한 후, Fab는 파지 표면 상에 더 이상 나타나지 않지만, 피로플라즘 공간에서 축적된다. 용해질을 박테리아 발현 가용성 Fab로부터 제조하고, ELISA를 사용하여 항원 특이성을 시험하였다. 고수준의 가용성 Fab가 검출되었다.
짧은 꼬리 원숭이 라이브러리에 사용하기 위해 파지 디스플레이 기술을 적합화시키기 위해, 본 발명자들은 원숭이 면역 글로불린 유전자를 증폭시키는 PCR에 대한 특이적 프라이머를 개발하였다. 이들은 본 발명자들이 PRIMATIZED(상표명) 항체 기술[참조 : 본원에 참고문헌으로 인용된 미합중국 특허 출원 제 08/379,072호] 및 사람 서열을 함유하는 데이터베이스를 개발하면서 얻은 짧은 꼬리 원숭이 서열을 기초로 한 것이다 : [참조 : Kabat et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, National Institute of Health].
본 발명자들은 짧은 꼬리 원숭이 레퍼터리의 증폭을 커버하기 위해 3세트의 프라이머를 개발하였다. 본 발명자들의 제 1 세트의 프라이머는 중쇄 VH 및 초1 (Fd) 도메인의 증폭을 위해 디자인되었다. 이것은 1개의 3' CH1 도메인 프라이머 및 골격 1 영역에 결합하는 6개의 5' VH 패밀리 특이적 프라이머를 포함한다. 본 발명자들의 제 2 세트의 프라이머 전체 람다 사슬을 증폭시키기 위해, 많은 람다 사슬 서브그룹을 커버한다. 이것은 1개의 3' 프라이머 및 VL 골격 1 영역에 결합하는 3개의 5' 변성 프라이머를 포함한다. 본 발명자들의 제 3 세트의 프라이머는 카파 사슬 서브그룹의 증폭을 위해 디자인되었다. 이것은 하나의 3' 프라이머 및 5개의 VK 골격 1 프라이머를 포함한다. 이들 세트를 각각 사용하여, PCR 매개 변수는 충분한 물질이 라이브러리의 클로닝에 이용될 수 있도록 각각의 프라이머 쌍으로부터 충분히 강한 신호를 얻도록 최적화된다. 본 발명자들은 최근에, 이들 최적화된 PCR 조건을 사용하여, 본 발명자들의 pMS 인자에서 짧은 꼬리 원숭이 조합성 라이브러리를 생성켰다. 골수 생체 검사를 면역 글로불린 RNA의 공급원으로서 CD4 면역 원숭이로부터 수행하였다. 라이브러리는 약 106개의 멤버를 함유하고, 현재 항원 코우팅된 웰 상의 특이적 결합제에 대해 패닝되고 있다.
실시예 2
B7/CTLA-4 시약의 개발
본 발명자들은 원숭이를 면역시키기 위한 많은 시약을 생성시켜서, 생체외에서 결합 및 기능성 검정을 개발하고, 헤테로하이브리도마를 스크리닝하고, 파지 라이브러리를 패닝시켰다. 표 1에는 각각의 시약 및 이것의 예정된 용도가 기재되어 있다. B7.1의 경우에, RNA를 SB 세포로부터 추출하고, 역전사 효소를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 첫 번째 가닥 cDNA를 B7.1 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시키고, IDEC's NEOSPLA 포유동물 발현 인자 내로 클로닝시켰다. CHO 세포를 B7.1 NEOSPLA DNA를 사용하여 형질감염시키고, 클론 발현 막 관련 B7.1을 확인하였다. PCR 증폭 B7.1 유전자를 사람 CH2 및 CH3 면역 글로불린 유전자를 함유하는 NEOSPLA 카세트 인자 내로 클로닝시키는 것을 제외하고는, B7.1 융합 단백질을 유사하게 생성시켰다. CHO 세포를 B7.1/Ig NEOSPLA DNA를 사용하여 형질감염시키고, 안정한 클론 분비 B7.1/Ig 융합 단백질을 증폭시켰다. 일반적으로, B7.2 및 CTLA4 시약을 동일한 방식으로 생성시켰으며, 단, B7.2에 대해서는, RNA를 항-Ig 및 IL-4로 24시간 자극한 사람 비장 세포로부터 단리시키고, CTLA4 구성물에 대해서는, 유전자 공급원은 PHA 활성화 사람 T 세포이다.
시약 용도 CHO 발현
가용성 B7.1B7.1 형질전환체B7.1/Ig 융합 단백질B7.2 형질전환체B7.2/Ig 융합 단백질CTLA4 형질전환체CTLA4/Ig 면역화, 면역 검정스크리닝, ELISA억제 연구, 패닝스크리닝, ELISA면역 연구, 패닝억제 연구억제 연구 발현발현발현발현완결되고 있음완결되고 있음완결되고 있음
원숭이 Fab 단편을 검출하기 위해 특별히 개발된, B7.1(L3074)(Becton ickinson, 1994) 및 B7.2(Fun-1)(Engel et al., Blood, 84, 1402-1407, (1994))에 대한 단클론성 항체 및 정제된 염소 및 토끼 항혈청과 함께 이들 시약의 이용성은 바람직한 성질을 갖는 항체의 확인을 촉진시킨다.
실시예 3
가용성 및 세포 관련 사람 B7.1에 대한 시노몰거스 원숭이의 면역 반응의 연구
사람 B7.1 항원에 대한 원숭이 항체를 생성시킬 수 있는 가능성을 평가하기 위해, 먼저 L307.4-세파로오스 친화성 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 CHO 세포 배지로부터 재조합 SB7.1을 정제하였다. SB7.1을 보조제와 함께 5마리의 성숙된 시노몰거스 짧은꼬리 원숭이에게 주사하였다. 3 내지 4개월 동안 두 번째 예방 면역시킨 후, SB7.1 또는 사람 SB 세포에 의해 면역시킨 원숭이로부터의 혈청을 항원 결합에 대해 시험하였다.
SB7.1로 면역시킨 5마리의 원숭이로부터의 혈청 샘플 및 B7.1 양성 사람 SB 세포로 면역시킨 추가의 3마리의 동물을 형질감염된 CHO 세포에서 발현된 막 관련 B7.1에 대한 항체 역가에 대해 시험하였다. 도 3에 요약한 결과는 친화성 정제시킨 SB7.1로 면역시킨 5마리의 원숭이 중 4마리가 1:5000 이상으로 항체 역가를 발생시킴을 보여준다. 세포 관련 B7.1을 함유하는 SB 세포로 면역시킨 3마리의 동물은 1:1400 내지 1:2800으로 더 낮은 항체 역가를 나타낸다.
실시예 4
SB7.1-세파로오스를 사용하여 모두 8마리의 면역된 원숭이의 혈청으로부터 항체를 정제한 후, 1) ELISA 중의 SB7.1 코우팅 플레이트; 2) 항원 양성 B 세포 및 3) B7.1 CHO 형질감염체에 결합하는 능력을 시험하였다. 또한, 항체를 혼합된 림프구 반응(MLR)에서 IL-2 생성 및 삼중 티미딘 흡수에 의해 측정하여, B 세포 상호작용을 차단하기 위한 능력을 평가하였다. T 세포 결합 실험에서, 사람 버피 코우팅 말초 혈액 림프구를 3 내지 6시간 동안 PHA 자극제의 존재하에 배양시켰다. B7 결합을125II-방사성 표지화된 가용성 B7.1(SB7.1)을 사용하여 방사성 검정에 의해 검출하였다.
실시예 5
방사성 표지화된 SB7에 대한 원숭이 항체의 직접 결합
125I-방사성 표지화된 SB7.1을 용액 중의 4, 1 및 0.25㎍/㎖에서 항-B7.1 항체에 대한 결합에 대해 시험하였다. 표 2에 기재된 결과는 SB7.1로 면역시킨 원숭이에 의해 생성된 항체의 대부분이 농도 의존 방식으로 친화성 정제된125I-SB7.1을 결합시킬 수 있음을 제시한다. 표지화된 SB7.1에 대한 결합 특이성을 평가하기 위해, 비표지화 SB7.1 경쟁 실험을 2마리의 동물로부터의 항체를 사용하여 수행하였다. 원숭이 1133 및 1144로부터의 친화성 정제된 항체를 400 ng/웰에서 마이크로웰 플레이트 사에 코우팅시켰다. 친화성 정제된 비표지화 SB7.1(500 및 100 ng/웰)을 경쟁 물질로서 사용하였다. 도 4에 나타낸 결과는 SB7.1 제조물이 항체에 대한 결합으로부터125I-SB7.1을 억제하는 데에 효과적임을 나타낸다.
SB7-세파로오스 친화성 칼럼 상에서의 친화성 정제된 원숭이 항체에 대한 SB7.1-I125의 결합
항체(㎍/㎖) 원숭이의 수769 908 1133 1135 1137 1139 1144 1146
4 175 213 9,056 12,771 4,318 226 5,781 108
1 106 142 6,569 7,940 3,401 110 3,901 80
0.25 95 104 1,803 2,673 1,219 100 1,186 94
데이터는 중복 검정의 평균값이고, cpm SB7-I125결합을 나타낸다.
실시예 6
B7+세포에 대한 방사성 표지화 친화성 정제된 원숭이의 직접 결합 및 SB7.1에 의한 억제
원숭이 PRI135로부터의 친화성 정제된 방사선 표지화 원숭이 항-B7.1 항체를 B7 양성 사람 SB 세포에 대한 직접 결합을 위한 방사성 표지화 L307.4 MAb와 비교하였다. 특이성 대조군으로서, 비표지화 SB7.1(0.002-20 ㎍/mi)를 첨가하여 방사선 표지화 항체 둘 모두와 경재시켰다. 90% 만큼 높은 억제율이 SB7.1의 사용으로 관찰되었다.
실시예 7
활성화된 T 세포에 대한 방사성 표지화 B7-Ig 융합 단백질의 직접 결합 및 친화성 정제된 원숭이 항체에 의한 억제
사람 말초 혈액 T 림프구를 3 내지 6일 동안 활성화시키고,125I-B7.1-Ig의 직접 결합에 대해 시험하였다. 활성화된 사람 T 세포에 대한 Fc 수용체 비조절 때문에, 세포를 열-응집된 사전 면역 면역 글로불린과 사전 인큐베이팅시켜서 세포에 B7.1-Ig를 첨가하기 전에 Fc 결합 자리를 차단시켰다. SP2/0 무린 미엘로마 세포를 사용하는 백그랑운드 조절을 백그라운드 결합을 보정하기 위해 유도하였다. 도 6은 확설화된 T 세포에 대한125I-B7.1-Ig 융합 단백질 결합의 억제가 200 내지 8㎍/㎖의 농도로 친화성 정제된 원숭이 항체의 사용으로 달성됨을 보여준다. 대조군으로서 사용되는 비표지화 SB7.1 및 L307.4 MAb은 또한 B7.1-Ig 융합 단백질 세포 결합을 억제하는 데에 효과적이다.
실시예 8
원숭이 항0B7 항체에 의한 혼합된 림프구 반응에서의 IL-2 생성의 억제
CD28/B7의 차단은 T 림프구에 의한 IL-2 생성의 억제를 유도한다. 도 7에 도시된 실험에서, SB7.1로 면역시킨 2마리의 원숭이(원숭이 1137 및 1135) 및 B7 양성 SB 세포로 면역시킨 한 마리의 원숭이(원숭이 1146)로부터의 친화성 정제된 원숭이 항체를 IL-2 생성의 억제에 의해 측정하여, 혼합된 림프구 반응(MLR)에서의 사람 T 세포 활성화를 억제하기 위한 이들의 능력에 대해 평가하였다. 상기 실험의 결과는 원숭이 1146 및 1137로부터의 친화성 정제된 항-B7 항체가 50㎍/㎖의 농도로 첨가될 때에 IL-2 생성을 억제하을 보여준다. 원숭이 1135 항체는 물질의 결핍으로 이한 2개의 가장 높은 농도에서 평가될 수 없고, 더 낮은 농도에서 상당한 억제를 제공한다. 상기 농도에서 시험한 다른 원숭이 혈청은 네가티브이다 (도시되지 않은 데이터). 이들 결과는 가용성이고 막 관련된 형태의 B7 항원 둘 모두로 면역시킨 원숭이 중 3마리 이상이 면역 억제 가능성을 갖는 B7- 차단 항체를 생성시킴을 입증하였다.
실시예 9
B7.2 항원에 대한 B7.1 면역된 원숭이 혈청에서의 교차 반응성의 연구
B7.1에 대해 상승된 항체를 B7.2에 대한 교차 반응성에 대해 시험하였다. B7.1 면역 혈청으로부터의 B7.1 친화성 정제된 항체를 사용한 일차 결과는 B7.1 형질감염된 CHO 세포(도시되지 않음)에 대한 암시적 증거를 제공하였다. 이들 데이터는 가용성 B7.2Ig를 사용함으로써 확인해야 한다. 우선, B7.1Ig 세파로오스 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 B7.1 면역된 동물로부터 부가적 원숭이 항체를 정제하였다. 그 다음, B7.2Ig 세파로오스 친화성 칼럼을 제조하기에 충분한 양으로 CHO 세포로부터 B7.2Ig를 생성시키고 정제하였다. B7.2Ig 세파로오스 칼럼에 대한 결합에 의해 B7.2와 교차 반응하는 항체를 B7.1 특이적 항체로부터 선택하였다. 확인된 임의의 교차 반응성 항체는 B7.1 및 B7.2 형질감염된 CHO 세포 둘 모두에 대한 직접 결합 및 B7.1Ig에 의한 B7.2 형질감염된 세포에 대한 결합의 억제를 추가의 특징으로 한다.
실시예 10
파아지 디스플레이 라이브러리의 생성
재조합 파아지 디스플레이 라이브러리를 B7.1 및 B7.2 면역 원숭이로부터 생성시켰다. 림프 마디 및 골수 생체 검사를 면역 7 내지 12일 후에 수행하여 RNA 부화 B 세포 및 혈장 세포를 수득하였다. RNA는 문헌[Chomczynski Anal. Biochem., 162(1), 156-159, (1987)]에 기술된 방법을 사용하여 림프구로부터 단릿켰다. rna를 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 상요하여 cDNA로 전환시켰다. 제 1 가닥 cDNA를 분취량으로 분할하고, 카파, 람다, 및 초기에 기술한 중쇄 Fd 영역 프라이머 및 Pfu 중합효소(Stratagene, San Diego) 또는 Taq 중합효소(Promega, Madison)의 세트를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 중쇄 PCR 증폭된 생성물을 푸울링시키고, Xho VSpe I 제한 효소로 절단시키고, 인자 pMS 내로 클로닝시켰다. 결과적으로, 경쇄 PCR 생성물을 푸울링시키고, Sac I/튬 제한 효소로 절단시키고, 클로닝시켜서 재조합 라이브러리를 생성시켰다. XLI-Blue 대장균을 라이브러리 DNA로 혀질전환시키고, VCSM13으로 초감염시켜서 파아지 디스플레이 항체를 생성시켰다. 라이브러리를 B7.1 및 B7.2로 코팅시킨 폴리스티렌 웰 상에서 4회 패닝시켰다. 각각의 패닝으로부터의 각각의 파아지 클론을 단리시키고, 유저자 III를 절제하였다. 가용성 Fab 단편을 생성시키고, B7.1 및 B7.2에 대한 결합에 대해 ELISA에서 시험하였다.
실시예 11
파아지 Fab 단편의 특징화
원숭이 파아지 Fab 단편을 이들의 특이성, 및 CTLA-4-Ig 또는 CTLA-4 형질감염된 세포에 대한 B7.1-Ig 및 B7.2-Ig 결합을 차단하기 위한 이들의 능력에 대해 특징화시켰다. 파아지 단편을 또한, 고친화성 단편을 선택하기 위해 면역 후에 사용된 B7 종에서의 4회 동안의 제 1 패닝 후에 교차 반응성에 대해 특징화시켰다. B7.1 및 B7.2 항원 코팅된 표면 상에서의 4회 패닝으로부터 확인된 Fab 단편을 감염에 의해 증가시키고, 대장균의 24시간 발효 배양으로 성장시켰다. 단편을 항-FLAG 친화성 칼럼에 대한 Kodak FLAG 결합에 의해 정제하였다. 정제된 파아지 Fab를 양고추냉이 퍼옥시다아제와 콘쥬게이팅시킨 염소 항-원숭이 Fab 항체 또는 항-FLAG MAb를 사용하여 직접 결합 변형 스캣챠드(Scatchard) 분석(Katoh et al, J. Chem. BioEng., 76:451-454, (1993))을 기초로 한 ELISA에 의해 친화성에 대해 시험하였다. 항-원숭이 Fab 시약은 사람 중쇄 일정 영역 Ig에 대해 흡수되어, B7-Ig에 대한 임의의 교차 반응성을 제거할 것이다. Kd 값을 B7.1-Ig 또는 B7.2-Ig 코팅된 플레이트에 대한 직접 결합의 측정 후에 각각의 단편에 대해 계산하였다.
실시예 12
CTLA-4/B7의 파아지 Fab 단편 차단
가장 낮은 농도에서 B7-Ig의 결합을 가장 효과적으로 차단하는 Fab 단편을 리드 캔디데이트로서 선택하였다. 선택은 CTLA-4-Ig 또는 CTLA-4 형질감염된 세포에 대한125I-B7-Ig 결합을 완결시킴으로써 이루어진다. 부가적 선택 기준은 리스판더 세포(Azuma et al., J. Exp. Med., 177:845-850,; Azuma et al, Nature, 301:76-79, (1993))에서의 3H-티미딘 흡수를 억제함으로써 측저하여 혼합된 림프구 반응(MLR)의 차단, 및 IL-2 검정 킷을 사용하는 IL-2 생성의 직접 분석을 포함한다. MLR ALC CTLA-4 결합 검정의 억제에 가장 효과적인 3 또는 4개의 캔디데이트를 CHO 세포 내로의 형질감염 및 키메라 원숭이/사람 항체의 발현 동안 상기 기술된 포유동물 발현 인자 내로의 클로닝을 위해 선택하였다.
실시예 13
원숭이 헤테로하이브리도마의 생성
원숭이 헤테로하이브리도마 분비 단클론성 항체를 시험된 혈청이 B7.1 및/또는 B7.2에 대해 양성인 현재 면역된 동물로부터 생성시켰다. 림프마디 생체 검사를 항체중 하나 또는 둘 모두에 대해 양성인 동물로부터 수행하였다. 하이브리도마 생성 방법은 원숭이 항-CD4 항체의 생성을 위해 사용된 달성된 방법과 유사하다 : [참조 : Newman, 1992(Id.)]. 높은 혈청 역가를 갖는 원숭이는 마취하에 제거된 사타구니 림프마디의 단편을 가질 것이다. 림프구를 조직으로부터 분리해내고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 사용하여 KH6/B5 헤테로미엘로마 세포(Carrol et al, J. Immunol. Meth., 89:61-72, (1986))와 융합시켰다. 하이브리도마를 H.A.T. 배지 상에서 선택하고, 96개 웰 플레이트에서 반복 서브클로닝에 의해 안정화시켰다.
B7.1 항원에 대해 특이적인 원숭이 단클론성 항체를 B7.2에 대한 교차 반응성에 대해 스크리닝하였다. 원숭이 항-B7 항체는125I-B7-Ig 결합 검정을 사용하여 B7/CTLA-4 결합의 차단을 특징으로 할 것이다. 3H-티미딘 흡수에 의한 MLR의 억제 및 IL-2 생성의 직접 측정을 사용하여 3개의 캔디데이트를 선택하였다. 2개의 캔디데이트는 파아지 II 연구에서 전방으로 유도되고, CHO 세포에서 발현되면서 모든 기능적 연구를 반복할 것이다. 생체매 약리학을 위한 동물 모델을 개발하기 위해, 항-B7 항체는 수가지 동물종의 세포에 대해 시험될 것이다. 동물 모델의 성취로, 임상전 연구가 선택된 임상적 지시에 대해 수행될 것이다.
실시예 14
기술된 바와 같이, 상기 헤테로하이브리도마 방법을 사용하여, 4개의 리드 원숭이 항-B7.1 항체, 즉 16C10, 7B6, 7C10 및 20C9가 확인되었다. 이들 항체를 하기와 같이 특징시켰다 :
CTLA4-Ig 사이의 물리적 상호 작용을 차단하기 위한 원숭이 항체의 능력을 입증하기 위해, 변동된 농도의 원숭이 항-B7.1 항체 및 비표지화 CTLA4-Ig를 표지화된 CTLA4-Ig1125와 인큐베이팅시켰다. 억제 검정의 결과는 원숭이 항체에 대한 IC50(50% 억제를 유발시키는 억제제의 농도)는 하기와 같음을 보여준다 :
a : 7C10 : 0.39㎍/㎖
b : 16C10 : 1.60㎍/㎖
c : 20C9 : 3.90㎍/㎖
d : 7B6 : 39.0㎍/㎖
스케챠드 분석은 B7-Ig 코팅된 플레이트에 대한 원숭이 항체 결합에 대한 겉보기 친화성 상수(Kd)가 하기와 같음을 보여준다 :
a : 7C10 : 6.2 x 10-9M
b : 16C10 : 8.1 x 10-9M
c : 7B6 : 10.7 x 10-9M
d : 20C9 : 16.8 x 10-9M
항체를 혼합된 림프구 반응 검정(MLR)에서 생체외 시험하였다. MLR은 모든 4개의 항-B7.1 항체가 IL-2 생성을 상이한 정도로 억제함을 보여준다 :
a : 7B6 : 5.0㎍/㎖
b : 16C10 : 0.1㎍/㎖
c : 20C9 : 2.0㎍/㎖
d : 7C16 : 5.0㎍/㎖
원숭이 항-B7.1 항체를 사람 말초 혈액 림프구(PBL) 상에 B7을 결합시키기 이한 이들의 능력에 대해 시험하였다. FACS 분석은 시험된 모든 4개의 원숭이 항체가 양성임을 보여주었다.
원숭이 항체 16C10, 7B6, 7C10 및 20C9를 FACS 분석에 의해 Clq 결합에 대해 시험하였다. 결과는 7C10 원숭이 Ig가 B7.1 CHO 형질감염된 세포와의 인큐베이팅 후에 강한 사람 Clq 결합을 가짐을 보여주었다.
실시예 15
공동 양도된 미합중국 특허 출원 제 08/379,072호에 참고로 인용된 영장류화 항체 방법을 사용하고, 도 2에 도시된 NEOSPLA 인자 시스템을 사용하여, 7C10, 7B6 및 16C10의 중쇄 및 경쇄 가변성 도메인을 클로닝시키고, 이들의 영장류화 형태를 NEOSPLA 인자 시스템을 사용하여 CHO 세포에서 합성시켰다. 영장류화 7C10 경쇄 및 중쇄, 7B6 경쇄 및 중쇄 및 16C10 경쇄 및 중쇄에 대한 아미노산 및 핵산 서열을 각각 도 8a, 8b, 9a, 9b, 10a 및 10b에 도시하였다.
이들 영장류화 항체, 주어진 이들의 가능한 저항원성 및 사람 이펙터 작용이 치료에 매우 적합할 것으로 예측된다. 사실상, 최근에, 영장류화 16C10이 사람 Cl9결합을 나타내는 반면, 16C10은 나타내지 않음이 입증되었다.
당업자들은 일상적 실험을 더 이상 사용하지 않고도, 본원에 기술된 발명의 특정 양태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기의 청구의범위에 포함된다.

Claims (20)

  1. 사람 B7.1 항원 및/또는 사람 B7.2 항원과 특이적으로 결합하는 원숭이 단일클론성 항체 또는 이의 영장류화된 형태.
  2. 제 1항에 있어서, 16C10, 7C10, 20C9 및 7B6으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 항체.
  3. 제 1항에 있어서, 고갈성 항체(depleting antibody)임을 특징으로 항체.
  4. 제 1항에 있어서, 비고갈성 항체임을 특징으로 항체.
  5. 16C10, 7C10, 20C9 및 7B6으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 함유하는 사람 B7.1 항원에 특정적으로 결합되는 영장류화된 항체.
  6. 제 5항에 있어서, 항체가 7C10으로부터 유도되고, 도 8a 및 도 8b에 기재된 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 영장류화된 항체.
  7. 제 6항에 있어서, 도 8a 및 도 8b에 기재된 핵산서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는 영장류화된 항체.
  8. 제 5항에 있어서, 항체가 7B6으로부터 유도되고, 도 9a 및 도 9b에 기재된 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 영장류화된 항체.
  9. 제 8항에 있어서, 도 9a 및 도 9b에 기재된 핵산서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는 영장류화된 항체.
  10. 제 5항에 있어서, 항체가 16C10으로부터 유도되고, 도 4a 및 도 4b에 기재된 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 영장류화된 항체.
  11. 제 5항에 있어서, 항체가 도 10a 및 도 10b에 기재된 핵산 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는 영장류화된 항체.
  12. 사람 B7.1 및 /또는 사람 B7.2 항체에 특이적으로 결합하는 영장류화된 항체를 발현하는 형질감염종.
  13. 제 12항에 있어서, CHO 세포임을 특징으로 하는 형질감염종.
  14. 제 13항에 있어서, 세포가 도 8a, 도 8b, 도 9a, 도 9b, 도 10a 및 도 10b중의 어느 한 도면에 도시된 아미노산 서열을 지니는 영장류화된 항체를 발현함을 특징으로 하는 형질감염종.
  15. 제 1 항 내지 제 11항중의 어느 한 항에 따른 항체를 포함하여, B7-CD28결합을 억제시킴으로써 치료될 수 있는 질환을 치료하기에 적합한 약제학적 조성물.
  16. 치료학적 유효량의 제 1항 내지 제 11항중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 항체를 투여함을 포함하여, B7:CD28 경로를 억제함으로써 질환을 치료하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 항체가 16C10, 7C10, 20C9, 7B6, 또는 이의 영장류화된 형태임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 질환이 자가면역 질환임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16항에 있어서, 질환이 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 전신성 홍반성 루프스(SLE), 제 1형 당뇨병, 류머티스성 관절염, 건선 및 다발성 경화증으로부터 선택됨을 특징으로하는 방법.
  20. 제 16항에 있어서, 질환이 이식편 대 숙주 질환임을 특징으로하는 방법.
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