JPH11508764A - ヒトｂ７．１および／またはｂ７．２に特異的なサルモノクローナル抗体、その霊長類化形態、医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ファージ提示ライブラリーのスクリーニングまたはＢ７.１および／またはＢ７.２で免疫したサルからのＢリンパ球を用いて得られたサルヘテロハイブリドーマによる、ヒトＢ７.１およびＢ７.２に対するマカークザル抗体の同定に関する。さらに詳しくは、本発明は、Ｂ７：ＣＤ２８経路を抑制し、それによって有効な免疫抑制剤として機能する４つのサルモノクローナル抗体、７Ｂ６、１６Ｃ１０、７Ｃ１０および２０Ｃ９を提供する。本発明はさらに、Ｂ７.１およびおそらくはＢ７.２に結合するサルモノクローナル抗体に由来する３つの霊長類化抗体、霊長類化７Ｃ１０、霊長類化７Ｂ６および霊長類化１６Ｃ１０の軽鎖および重鎖の完全なＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を提供する。これら霊長類化抗体およびサル抗体は、たとえば、自己免疫疾患を治療するためおよび臓器移植拒絶を防ぐための特別の免疫抑制剤として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＢ７.１および／またはＢ７.２に特異的なサルモノクローナル抗体、その霊 長類化形態、医薬組成物 発明の技術分野 本発明は、ヒトＢ７、すなわちヒトＢ７.１およびヒトＢ７.２に対する新規モ ノクローナル抗体およびその霊長類化（primatized）形態の製造および同定に関 する。さらに詳しくは、本発明は、Ｂ７免疫したサルから得たＢリンパ球を用い たファージ提示ライブラリー（phage display libraries）およびサルヘテロハ イブリドーマのスクリーニングにより産生された、ヒトＢ７、すなわちヒトＢ７ .１およびヒトＢ７.２に対するマカークザル（macaque）抗体の製造および同定 に関する。 本発明はさらに、ヒトＢ７、すなわちヒトＢ７.１およびＢ７.２に結合する特 定の霊長類化抗体、並びにその対応アミノ酸配列および核酸配列に関する。 本発明はまた、ヒトＢ７.１および／またはヒトＢ７.２に特異的なサルモノク ローナル抗体または霊長類化抗体を含む医薬組成物並びにＢ７：ＣＤ２８経路を 調節することによる、たとえば自己免疫疾患の治療や臓器移植拒絶の防止のため の免疫抑制剤としてのその使用に関する。 発明の要約 免疫学、血液学および腫瘍学の間での臨床的相互領域が長らく認識されている 。血液学者または腫瘍学者によって処置される多くの状態は、その病理生理学に 自己免疫または免疫不全要因のいずれかを有し、それが血液学者による免疫抑制 剤療法の広範な採用となり、一方、腫瘍学者は腫瘍に対する内生の免疫を高める ための免疫アジュバントを探し求めていた。今日ではこれらの介入措置は、一般 に非特異的なモードの免疫抑制および免疫刺激からなる。これら介入措置の効能 が限られていることに加え、その非特異性による毒性もまた、その全的成功を制 限していた。それゆえ、別の戦略が探し求められている。 迅速にその数を増している細胞表面分子の機能的役割の解明は、免疫学と臨床 血液学および腫瘍学との統合に多大な貢献をしている。２００近い細胞表面抗原 が免疫系および造血系の細胞で同定されている［シュロスマン（Ｓchlossman,Ｓ Ｆ）、ブムセル（Ｂoumsell,Ｌ.）、ジルクス（Ｇilks,ＪＭ）、ハーラン（Ｈar lan,Ｔ.）、キシモト（Ｋishimoto,Ｃ.）、モリモト（Ｍorimoto,Ｃ.）、リッツ （Ｒitz,Ｊ.）、ショー（Ｓhaw,Ｓ.）、シルバースタイン（Ｓilverstein,ＲＬ ）、スプリンガー（Ｓpringer,ＴＡ）、テッダー（Ｔedder,ＴＦ）、トッド（Ｔ odd,ＲＦ）：ＣＤ antigens（１９９３）、Ｂlood ８３：８７９、１９９４］。 これら抗原は、細胞認識、接着、増殖の誘発および維持、サイトカイン分泌、エ フェクター機能、および細胞死さえも含む種々のプロセスに関与する、系統に限 定された分子および広く分布する分子の両方を提示する。これら分子の機能的貢 献の認識は、免疫応答を操作する新規な試みを呼び起こした。以前には細胞接着 および抗原特異的な認識に関与する分子が治療用免疫学的介入の標的とされたが 、最近ではコスティミュラトリー（co-stimulatory）分子と呼ばれる細胞表面分 子のサブグループに関心が集まっている［ブレッチャー（Ｂretcher,Ｐ.）：「 ２１年後のリンパ球活性化の２シグナルモデル」、Ｉmmunol.Ｔoday １３：７３ （１９９２）；ジェンキンス（Ｊenkins,ＭＫ）、ジョンソン（Ｊohnson,ＪＧ） ：「Ｔ細胞コスティミュレーションに関与する分子」、Ｃurr.Ｏpin.Ｉmmunol. ５：３５１、１９９３；ゲッパート（Ｇeppert,Ｔ.）、デービス（Ｄavis,Ｌ.） 、ガー（Ｇur,Ｈ.）、ワコルツ（Ｗacholtz,Ｍ.）、リプスキー（Ｌipsky,Ｐ.） ：「Ｔ細胞活性化に関与するアクセサリー細胞」、Ｉmmunol.Ｒev.１１７：５（ １９９０；ウィーバー（Ｗeaver,ＣＴ）、ウナウエ（Ｕnaue,ＥＲ）：「抗原提 示細胞のコスティミュラトリー機能」、Ｉmmunol.Ｔoday １１：４９（１９９０ ）；ステナム（Ｓtennam,ＲＭ）、ヤング（Ｙoung,ＪＷ）：「抗原提示細胞から 生じるシグナル」、Ｃurr.Ｏpin.Ｉmmunol.３：３６１（１９９１）］。コステ ィミュラトリー分子は、抗原特異的なＴ細胞応答およびエフェクター機能の生成 および増幅を開始はしないが、むしろ可能にする［ブレッチャー：「２１年後の リンパ球活性化の２シグナルモデル」、Ｉmmunol.Ｔoday１３：７３（１９９２ ）；ジェンキンス、ジョンソン：「Ｔ細胞コスティミュレーションに関与する分 子」、Ｃurr.Ｏpin.Ｉmmunol .５：３５１、１９９３；ゲッパート、デービス、ガー、 ワコルツ、リプスキー：「Ｔ細胞活性化に関与するアクセサリー細胞」、Ｉmmun ol.Ｒev .１１７：５（１９９０）；ウィーバー、ウナウエ：「抗原提示細胞のコ スティミュラトリー機能」、Ｉmmunol.Ｔoday １１：４９（１９９０）；ステナ ム、ヤング：「抗原提示細胞から生じるシグナル」、Ｃurr.Ｏpin.Ｉmmunol.３ ：３６１（１９９１）；ジュン（Ｊune,ＣＨ）、ブルーストーン（Ｂluestone, ＪＡ）、リンスレイ（Ｌinsley,ＰＳ）、トンプソン（Ｔhompson,ＣＤ）：「Ｔ 細胞活性化におけるＣＤ２８受容体の役割」、Ｉmmunol.Ｔoday １５：３２１（ １９９４）］。 最近、Ｂ７：ＣＤ２８と称する一つの特異的なコスティミュラトリー経路が、 Ｂ細胞およびＴ細胞活性化におけるその有意の役割のために、異なる研究グルー プにより研究された［ジュン、ブルーストーン、リンスレイ、トンプソン：「Ｔ 細胞活性化におけるＣＤ２８受容体の役割」、Ｉmmunol.Ｔoday １５：３２１（ １９９４）；ジュン、レッドベター（Ｌedbetter,ＪＡ）：「Ｔ細胞の抗原への 応答の間のＣＤ２８受容体の役割」、Ａnn.Ｒev.Ｉmmunol. １１：１９１（１９ ９３）；シュワルツ（Ｓchwartz,ＲＨ）：「Ｔリンパ球のコスティミュレーショ ン：インターロイキン２の産生および免疫療法におけるＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４ およびＢ７／ＢＢ１の役割」、Ｃell ７１：１０６５（１９９２）］。このリガ ンド：受容体経路は４年前に発見されたので、Ｂ７：ＣＤ２８相互作用が免疫応 答性とアレルギーとを決定するうえでの重大な接点の一つを代表することを示唆 する膨大な証拠が得られてきている［ジュン、ブルーストーン、リンスレイ、ト ンプソン：「Ｔ細胞活性化におけるＣＤ２８受容体の役割」、Ｉmmunol.Ｔoday １５：３２１（１９９４）；ジュン、レッドベター：「Ｔ細胞の抗原への応答の 際のＣＤ２８受容体の役割」、Ａnn.Ｒev.Ｉmmunol. １１：１９１（１９９３） ；シュワルツ：「Ｔリンパ球のコスティミュレーション：インターロイキン２の 産生および免疫療法におけるＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＢ７／ＢＢ１の役割 」、Ｃell ７１：１０６５（１９９２）；コーエン（Ｃohen,Ｊ.）：「望んでい ない免疫応答に対して開始される攻撃」（ニュースコメント）Ｓcience ２５７ ：７５１（１９９２）；コーエン：「“コスティミュレーター”として注目を浴 びる 新たなタンパク質」（ニュースコメント）Ｓcience ２６２：８４４（１９９３ ）］。 とりわけ、ヒトＢ７抗原、すなわちヒトＢ７.１およびＢ７.２は、Ｔ細胞活性 化においてコスティミュラトリーな役割を果たすことが報告されている。 １．Ｔ細胞活性化におけるＢ７.１およびＢ７.２のコスティミュラトリーな役 割 首尾よい免疫応答の精巧さは、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の一連の特異的な 相互作用に依存する。このプロセスにおける最初の必須のステップはＭＨＣクラ スII分子との関連での抗原のＴ細胞受容体への結合に依存するが［レイン（Ｌan e,Ｐ.Ｊ.Ｌ.）、マッコネル（Ｆ.Ｍ.ＭcＣonnell）、シーベン（Ｇ.Ｌ.Ｓchieve n）、クラーク（Ｅ.Ａ.Ｃlark）、およびレッドベター（１９９０）、「ヒトＢ 細胞活性化におけるクラスII分子の役割」、Ｔhe Ｊournal of Ｉmmunology、１ ４４：３６８４−３６９２］、この相互作用だけでは所定の抗原に対する継続し た応答に必要なすべての事象を引き起こすのに充分ではない［シュワルツ、「Ｔ リンパ球クローナルアネルギーの細胞培養モデル」、Ｓcience ２４８：１３４ ９；ジェンキンス（１９９２）「クローナルアネルギーの誘発における細胞分裂 の役割」、Ｉmmunology Ｔoday、１３：６９；アズマ（Ａzuma,Ｍ.）、カタビア ブ（Ｍ.Ｃatabyab）、バック（Ｄ.Ｂuck）、フィリップス（Ｊ.Ｈ.Ｐhillips） およびラニエ（Ｌ,Ｌ,Ｌanier）（１９９２）、「ヒトナチュラルキラー白血病 細胞株により媒体されるＭＨＣ非制限細胞毒性へのＣＤ２８の関与」、Ｔhe Ｊo urnal of Ｉmmunology 、１４９：１５５６−１５６１；アズマ、カタビアブ、バ ック、フィリップスおよびラニエ（１９９２）、「ＣＤ２８とＢ７との相互作用 は、小さな静止Ｔリンパ球によって媒体される一次同種増殖応答および細胞毒性 をコスティミュレートする」、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１７５：３５３−３６０］。 ある種の他のコスティミュラトリー分子の関与が必要である［ノートン（Ｎor ton,Ｓ.Ｄ.）、ズッカーマン（Ｌ,Ｚuckerman）、アーダール（Ｋ.Ｂ.Ｕrdahl） 、シェフナー（Ｒ.Ｓhefner）、ミラー（Ｊ.Ｍiller）およびジェンキンス（１ ９９２）「ＣＤ２８リガンドであるＢ７は、Ｔ細胞にコスティミュラトリーシグ ナルを提供することによりＩＬ−２の産生を促進する」Ｔhe Ｊournal of Ｉmmu nology 、 １４９：１５５６〜１５６１］。「Ｔ細胞上で発現されたホモダイマーＣＤ２８ およびＣＴＬＡ−４」［ジューン、レッドベター、リンスレイおよびトンプソン （１９９０）「Ｔ細胞活性化におけるＣＤ２８受容体の役割」、Ｉmmunology Ｔ oday 、１１：２１１〜２１６；リンスレイ、ブラディー、アーンズ、グロスメア （Ｌ.Ｓ.Ｇrosmaire）、ダムル（Ｎ.Ｋ.Ｄamlｅ）およびレッドベター（１９９ １）、「ＣＴＬＡ−４はＢ細胞活性化抗原Ｂ７の第二の受容体である」、Ｊ.Ｅx p.Ｍed .１７４：５６１］が、抗原提示細胞上で発現されたＢ７.１（ＣＤ８０） およびＢ７.２（ＣＤ８６）とともに、持続された免疫応答に必要なコスティミ ュラトリー分子の主要なペアである［アズマ、イッセル（Ｈ.Ｙssel）、フィリ ップス、スピッツ（Ｈ.Ｓpits）およびラニエ（１９９３）、「活性化Ｔリンパ 球上でのＢ７／ＢＢ１の機能的発現」、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１７７：８４５〜８５０ ；フリーマン（Ｆreeman,Ｇ.Ｊ.）、フリードマン（Ａ.Ｓ.Ｆreedman）、セジル （Ｊ.Ｍ.Ｓegil）、リー（Ｇ.Ｌee）、ホワイトマン（Ｊ.Ｆ.Ｗhitman）および ナドラー（ＬＭ.Ｎadler）（１９８９）、「活性化された新生物Ｂ細胞上でのみ 発現されるＩｇスーパーファミリーの新たな成員であるＢ７」、Ｔhe Ｊournal of Ｉmmunology 、１４３：２７１４〜２７２２；ハスコック（Ｈathcok,Ｋ.Ｓ. ）、ラスロ（Ｇ.Ｌaslo）、ディックラー（Ｈ.Ｂ.Ｄickler）、ブラッドショー （Ｊ.Ｂradshaw）、リンスレイおよびホーズ（Ｒ.Ｊ.Ｈodes）（１９９３）、「 Ｔ細胞活性化のコスティミュラトリーの他のＣＴＬＡ−４リガンドの同定」、Ｓ cience 、２６２：９０５〜９１１；ハート（Ｈart,Ｄ.Ｎ.Ｊ.）、スターリング （Ｇ.Ｃ.Ｓtarling）、カルダー（Ｖ.Ｌ.Ｃalder）およびフェルナンド（Ｎ.Ｓ. Ｆernando）（１９９３）、「Ｂ７／ＢＢ１は、活性化により誘発されたヒト樹 状細胞上の白血球分化抗原である」、Ｉmmunology、７９：６１６〜６２０］。 インビトロでは、これらコスティミュラトリーシグナルの不在が未発達のＴ細胞 活性化経路および特定の抗原に対する応答の欠如すなわちアネルギーを導くこと を示すことができる［たとえば、ハーディング（Ｈarding,Ｆ.Ａ.）、マッカー サー（Ｊ.Ｇ.ＭcＡrthur）、グロス（Ｊ.Ａ.Ｇross）、ラウレット（Ｄ.Ｍ.Ｒau let）およびアリソン（Ｊ.Ｐ.Ａllison）（１９９２）、「ＣＤ２８により媒体 されたシグナ ル伝達は、マウスＴ細胞をコスティミュレートし、Ｔ細胞クローンにおけるアネ ルギーの誘発を防ぐ」、Ｎature、３５６：６０７〜６０９；ギミ（Ｇimmi,Ｃ. Ｄ.）、フリーマン、グリベン（Ｊ.Ｇ.Ｇribben）、グレイ（Ｇ.Ｇray）および ナドラー（１９９３）、「ヒトＴ細胞クローナルアネルギーは、Ｂ７コスティミ ュレーションの不在下での抗原提示により誘発される」、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓ ci .、９０：６５８６〜６５９０；タン（Ｔan,Ｐ.）、アナセフティ（Ｃ.Ａnase fti）、ハンセン（Ｊ.Ａ.Ｈansen）、メルローズ（Ｊ.Ｍelrose）、ブランバン ド（Ｍ.Ｂrunvand）、ブラッドショー、レッドベターおよびリンスレイ（１９９ ３）、「ＣＤ２８とその天然リガンドであるＢ７／ＢＢ１との間の相互作用を阻 止することによるヒトＴリンパ球でのアロ抗原特異的な低応答性の誘発」、Ｊ. Ｅxp.Ｍed .１７７：１６５〜１７３］。インビボの寛容の達成は、免疫抑制のメ カニズムおよび臓器移植拒絶や自己免疫疾患の治療のための実行可能な療法を構 成する。このことは、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ投与後の実験モデルでは達成されてい る［レンショー（Ｌenshow,Ｄ.Ｊ.）、ゼング（Ｙ.Ｚeng）、ジスルスウェイト （Ｒ.Ｊ.Ｔhistlethwaite）、モンタグ（Ａ.Ｍontag）、ブラディー、ギブソン （Ｍ.Ｇ.Ｇibson）、リンスレイおよびブルーストーン（Ｊ.Ａ.Ｂluestone）（ １９９２）、「ＣＴＬＡ４−Ｉｇにより誘発された異種個体膵臓島移植の長期生 存］、Ｓcience、２５７：７８９〜７９５］。 Ｂ７.１分子およびＢ７.２分子はＣＤ２８かまたはＣＴＬＡ−４のいずれかに 結合することができるが、Ｂ７.１はＣＤ２８には２００ＮｍのＫｄで結合し、 ＣＴＬＡ−４には２０倍高い親和性で結合する［リンスレイ、クラークおよびレ ッドベター（１９９０）、「Ｔ細胞抗原ＣＤ２８は、活性化抗原Ｂ７／ＢＢ１と 相互作用することによりＢ細胞との接着を媒体する」、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci .、８７：５０３１〜５０３５；リンスレイら（１９９３）、「抗原へのＴ細胞 応答の際のＣＤ２８受容体の役割」、Ａnnu.Ｒev.Ｉmmunol.、１１：１９１〜１ ９２；リンスレイら（１９９３）、「Ｂ７／ＢＢ１とＣＤ２８との連動が、ＣＤ ２８合成の一過性のダウンレギュレーションおよびＣＤ２８シグナル伝達に対す る長期化した応答の欠如を誘発する」、Ｔhe Ｊournal of Ｉmmunology、１５０ ：３ １５１〜３１６９］。Ｂ７.２は活性化されたＢ細胞およびインターフェロン誘 発された単球上では発現されるが、静止状態のＢ細胞では発現されない［フリー マン、グレイ、ギミ、ロマルド（Ｄ.Ｂ.Ｌomarrd）、ゾウ（Ｌ−Ｊ.Zhou）、ホ ワイト、フィンゲロス（Ｊ.Ｄ.Ｆingeroth）、グリベンおよびナドラー（１９９ １）、「ヒトＢリンパ球活性化抗原Ｂ７のマウスホモログの構造、発現およびＴ 細胞コスティミュラトリー活性」、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１７４：６２５〜６３１］ 。一方、Ｂ７.２は、静止状態の単球、樹状細胞およびＢ細胞上で非常に低レベ ルではあるが構成的に発現され、その発現は活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞およ びＢリンパ球では促進される［アズマ、イトー（Ｄ.Ｉto）、ヤギタ（Ｈ.Ｙagit a）、オクムラ（Ｋ.Ｏkumura）、フィリップス、ラニエおよびゾモザ（Ｃ.Ｚomo za）（１９９３）、「Ｂ７０抗原はＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の第二のリガン ドである」、Ｎature、３６６：７６〜７９］。Ｂ７.１およびＢ７.２は同じ細 胞型上で発現されうるが、Ｂ細胞上での発現は異なる動力学で起こる［レンショ ー、ス（Ｇ.Ｈ.Ｓu）、ズッカーマン、ナバビ（Ｎ.Ｎabavi）、ジェリス（Ｃ.Ｌ .Ｊellis）、グレイ、ミラーおよびブルーストーン（１９９３）、「ＣＴＬＡ− ４の別のリガンドの発現および機能的有意」、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 、９０：１１０５４〜１１０５８；ブショティス（Ｂoussiotis,Ｖ.Ａ.）、フリ ーマン、グリベン、ダリー（Ｊ.Ｄaley）、グレイおよびナドラー（１９９３） 、「活性化されたヒトＢリンパ球は、Ｔ細胞活性化をコスティミュレートする３ つのＣＴＬＡ−４対応受容体を発現する」、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、 ９０：１１０５９〜１１０６３］。ＲＮＡレベルでさらに分析したところ、Ｂ７ .２ ｍＲＮＡが構成的に発現されるのに対して、Ｂ７.１ ＭＲＮＡは活性化の４ 時間後に検出され、初期低レベルのＢ７.１タンパク質は刺激から２４時間後ま では検出できなかった［ブショティス、フリーマン、グリベン、ダリー、グレイ およびナドラー（１９９３）、「活性化されたヒトＢリンパ球は、Ｔ細胞活性化 をコスティミュレートする３つのＣＴＬＡ−４副受容体を発現する」、Ｐroc.Ｎ atl.Ａcad.Ｓci .ＵＳＡ、９０：１１０５９〜１１０６３］。それゆえ、ＣＴＬ Ａ−４／ＣＤ２８対応（counter）受容体は、Ｂ細胞活性化後の種々の時間に発 現 される。 Ｂ７.１およびＢ７.２の差異的な時間をずらした（differential temporal） 発現は、これら２つの分子とＣＴＬＡ−４および／またはＣＤ２８との相互作用 がＴ細胞への別個だが関連したシグナルを送達することを示唆している［ラサル （ＬaＳalle,Ｊ.Ｍ.）、トレンチーノ（Ｐ.Ｊ.Ｔolentino）、フリーマン、ナド ラーおよびハフラー（Ｄ.Ａ.Ｈafler）（１９９２）、「ＣＤ２８およびＴ細胞 抗原受容体シグナル伝達は、スーパー抗原刺激に応答したインターロイキン２遺 伝子発現を共同的に制御する」、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１７６：１７７〜１８６；バ ンデンベルグ（Ｖandenberghe,Ｐ.）、フリーマン、ナドラー、フレッチャー（ Ｍ.Ｃ.Ｆletcher）、カモウン（Ｍ.Ｋamoun）、ツルカ（Ｌ.Ａ.Ｔurka）、レッ ドベター、トンプソンおよびジュン（１９９２）、「抗体およびＢ７／ＢＢ１媒 体されたＣＤ２８受容体のライゲーションはヒトＴ細胞においてチロシンリン酸 化を誘発する」、Ｔhe Ｊournal of Ｅxperimental Ｍedicine、１７５：９５１ 〜９６０］。Ｔ細胞に対するＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の正確なシグナル伝達 機能は、現在のところ知られていない［ジェインウェイ（Ｊaneway,Ｃ.Ａ.,Ｊr. ）およびボトムリー（Ｋ.Ｂottomly）（１９９４）、「リンパ球応答のシグナル および信号」、Ｃell、７６.２７５２８５］。しかしながら、１セットの受容体 がＴ細胞活性化の初期刺激および第二の持続されたシグナルを提供し、該経路の さらなる精巧さ（elaboration）およびクローン拡張が起こるのを可能にしうる 可能性がある［リンスレイ、グリーン（Ｊ.Ｌ.Ｇreene）、タン、ブラッドショ ー、レッドベター、アナセッティ（Ｃ.Ａnasetti）およびダムル（１９９２）、 「活性化Ｔリンパ球上でのＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の同時発現および機能的 協同」、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１７６：１５９５〜１６０４］。現在のデータは、Ｔ 細胞拡張、リンホカイン分泌およびエフェクター機能の完全な発達のためにＴＣ Ｒとコスティミュラトリーシグナルの両者が必要である［グリーナン（Ｇreenan ,Ｖ.）およびクレーマー（Ｇ.Ｋroemer）（１９９３）、「細胞免疫寛容への複 数の経路」、Ｉmmunology Ｔoday、１４：５７３］というジェンキンスおよびシ ュワルツにより提唱された２シグナル仮説［シュワルツ（１９９０）、「Ｔリン パ球クローナ ルアネルギーのための細胞培養モデル」、Ｓcience、２４８：１３４９；ジェン キンス（１９９２）、「クローナルアネルギーの誘発における細胞分裂の役割」 、Ｉmmunology Ｔoday、１３：６９］を支持している。第二のシグナルの送達が できないとＴ細胞がＩＬ−２を分泌できず、細胞は抗原に対して非応答性となる 。 構造的には、Ｂ７.１およびＢ７.２の両者ともに、細胞外免疫グロブリンスー パーファミリーＶおよびＣ様ドメイン、疎水性膜貫通領域および細胞質テールを 含む［フリーマン、グリベン、ブショティス、ング（Ｊ.Ｗ.Ｎg）、レスティボ （Ｖ.Ｒestivo,Ｊr.）、ロンバード（Ｌ.Ａ.Ｌombard）、グレイおよびナドラー （１９９３）、「Ｂ７.２のクローニング：ヒトＴ細胞増殖をコスティミュレー トするＣＴＬＡ−４対応受容体」、Ｓcience、２６２：９０９］。Ｂ７.１およ びＢ７.２はともに高程度にグリコシル化されている。Ｂ７.１は、２２３アミノ 酸の細胞外ドメイン、２３アミノ酸の膜貫通ドメインおよび６１アミノ酸の細胞 質テールからなる４４〜５４ｋＤの糖タンパク質である。Ｂ７.１は、３つの潜 在的なプロテインキナーゼリン酸化部位を含む［アズマ、イッセル、フィリップ ス、スピッツおよびラニエ（１９９３）、「活性化Ｔリンパ球上でのＢ７／ＢＢ １の機能的発現」、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１７７：８４５〜８５０］。Ｂ７.２は、３ ０６アミノ酸の膜糖タンパク質である。Ｂ７.２は、２２０アミノ酸の細胞外領 域、２３アミノ酸の疎水性膜貫通ドメインおよび６０アミノ酸の細胞質テールか らなる［フリーマン、フリードマン、セジル、リー、ホワイトマンおよびナドラ ー（１９８９）、「活性化された新生物Ｂ細胞上でのみ発現されるＩｇスーパー ファミリーの新たな成員であるＢ７」、Ｔhe Ｊournal of Ｉmmunology、１４３ ：２７１４〜２７２２］。Ｂ７.１およびＢ７.２の両遺伝子は同じ染色体領域中 に局在するが［フリーマン、ロンバード、ギミ、ブロッド（Ｓ.Ａ.Ｂrod）、リ ー、レイニング（Ｊ.Ｃ.Ｌaning）、ハフラー、ドーフ（Ｍ.Ｅ.Ｄorf）、グレイ 、レイサー（Ｈ.Ｒeiser）、ジュン、トンプソンおよびナドラー（１９９２）、 「ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８のＭＲＮＡは活性化後に大抵のＴ細胞で同時に発 現される」、Ｔhe Ｊournal of Ｉmmunology、１４９：３７９５〜３８０１；シ ュワルツ（１９９２）、「Ｔリンパ球のコスティミュレーション：ＣＤ２８、Ｃ ＴＬＡ−４お よびＢ７／ＢＢ１の役割」、セルバクマール（Ｓelvakumar,Ａ.）、モハンラジ ュ（Ｂ.Ｋ.Ｍohanraj）、エディ（Ｒ.Ｌ.Ｅddy）、ショーズ（Ｔ.Ｂ.Ｓhows）、 ホワイト（Ｐ.Ｃ.Ｗhite）、ペリン（Ｃ.Ｐerrin）およびデュポン（Ｂ.Ｄupont ）（１９９２）、「Ｂリンパ球活性化抗原Ｂ７をコードするヒト遺伝子のゲノム 構成および染色体位置」、Ｉmmunogenetics、３６：１７５〜１８１］、これら 抗原は高レベルのホモロジーを共有してはいない。Ｂ７.１とＢ７.２との間の全 体のホモロジーは２６％であり、マウスＢ７.１とヒトＢ７.１との間の全体のホ モロジーは２７％である［アズマ、イッセル、フィリップス、スピッツおよびラ ニエ（１９９３）、「活性化Ｔリンパ球上でのＢ７／ＢＢ１の機能的発現」、Ｊ .Ｅxp.Ｍed .、１７７：８４５〜８５０；フリーマン、フリードマン、セジル、 リー、ホワイトマンおよびナドラー（１９８９）、「活性化された新生物Ｂ細胞 上でのみ発現されるＩｇスーパーファミリーの新たな成員であるＢ７」、Ｔhe Ｊournal of Ｉmmunology 、１４３：２７１４〜２７２２］。ヒトＢ７.１、ヒト Ｂ７.２およびマウスＢ.１配列のアラインメントは、長いホモロジーを示す領域 は殆どないことを示すが、これら３つの分子はすべてヒトＣＴＬＡ−４およびＣ Ｄ２８に結合することが知られている。従って、これら３つの分子に共通する隣 接しているかまたは立体配置的な共通した密接に関連した相同領域が存在する可 能性が高い。この領域は、Ｂ７.１分子およびＢ７,２分子の対応受容体への結合 部位を構成する。これらエピトープに対して産生された抗体は、Ｔ細胞上でのＢ ７と対応受容体との相互作用を阻止する可能性がある。さらに、Ｂ７.１分子と Ｂ７.２分子との両者の上の該領域と交差反応する抗体は、Ｂ７.１またはＢ７. ２に対して別々に向けられた抗体よりも実際的に有利である可能性がある。 ２．Ｂ７／ＣＤ２８相互作用の阻止 Ｂ７／ＣＤ２８相互作用の阻止は特異的な免疫抑制の可能性を与え、長期間持 続する抗原特異的な治療効果が得られる可能性がある。Ｂ７.１かまたはＢ７.２ のいずれかに対する抗体は、インビトロでのＩＬ−２産生の抑制により測定され るようにＴ細胞活性化を阻止することが示されている［デュボア（ＤeＢoer,Ｍ. ）、パレン（Ｐ.Ｐarren）、ドーブ（Ｊ.Ｄove）、オッセンドープ（Ｆ.Ｏssend orp）、 ファン・デア・ホルスト（van der Ｈorst）およびリーダー（Ｊ.Ｒeeder）（１ ９９２）、「新規な抗Ｂ７モノクローナル抗体の機能的特徴付け」、Ｅur.Ｊour nal of Ｉmmunology 、２２：３０７１〜３０７５；アズマ、イッセル、フィリッ プス、スピッツおよびラニエ（１９９３）、「活性化Ｔリンパ球上でのＢ７／Ｂ Ｂ１の機能的発現」、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１７７：８４５〜８５０］。しかしなが ら、種々の抗体が免疫抑制能においてさまざまであることが示されており、これ は親和性かまたはエピトープ特異性のいずれかを反映しているかもしれない。Ｃ ＴＬＡ−４／Ｉｇ融合タンパク質および抗ＣＤ２８ Ｆａｂは、ＩＬ−２産生の ダウンレギュレーションに対して同様の作用を有することが示された。 可溶性のＣＴＬＡ−４／Ｉｇ融合タンパク質のインビボ投与は、マウスにおい てＴ細胞依存性の抗体応答を抑制することが示されており［リンスレイ、グリー ン、タン、ブラッドショー、レッドベター、アナセッティおよびダムル（１９９ ２）、「活性化Ｔリンパ球上でのＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の同時発現および 機能的協同」、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１７６：１５９５〜１６０４；リン（Ｌin,Ｈ. ）、ビリング（Ｓ.Ｆ.Ｂuiling）、リンスレイ、ウェイ（Ｒ.Ｏ.Ｗei）、トンプ ソンおよびツルカ（Ｌ.Ａ.Ｔurka）（１９９３）、「ＣＴＬＡ−４−Ｉｇとドナ ー特異的な輸血によって誘発された主要組織適合複合体の不適合な心臓同種移植 の長期受容」、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１７８：１８０１］、さらに大用量の投与は第 二の免疫に対する応答を抑制することができ、このアプローチが抗体に媒体され た自己免疫疾患の治療に対して実行可能であることが示されている。さらに、Ｃ ＴＬＡ−４−Ｉｇは、Ｔ細胞とＢ７.１／Ｂ７.２抗原提示細胞との間の相互作用 を直接抑制することにより、マウスにおいて膵臓島細胞の拒絶を防ぐことができ た［レンショー、ス、ズッカーマン、ナバビ、ジェリス、グレイ、ミラーおよび ブルーストーン（１９９３）、「ＣＴＬＡ−４の別のリガンドの発現および機能 的有意」、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、９０：１１０５４〜１１０５８］ 。この場合、長期のドナー特異的な寛容が達成された。 ３．抗体選択のための組換えファージ提示（Ｄisplay）法 今日まで、Ｂ７.１およびＢ７.２の両者に交差反応するモノクローナル抗体は 報告されていない。記載したように、かかる抗体は免疫抑制剤として非常に望ま しいものである。ファージ提示法は免疫応答の際に産生される抗体を単離するた めの従来法に置き換わりつつある。なぜなら、従来法を用いた場合に比べてはる かに高いパーセントの免疫範囲（immune repertoire）を評価することが可能で あるからである。このことは、一部、ＰＥＧ融合の非効率性、染色体の不安定性 、およびヘテロハイブリドーマ産生に伴う大量の組織培養およびスクリーニング によるものである。対照的にファージ提示法は、所定の抗原に応答した免疫グロ ブリン遺伝子の全範囲を潜在的に捕捉するための分子技術に依存している。 この技術はバーバー（Ｂarber）らのＰroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８８、 ７９７８〜７９８２（１９９１）に記載されている。本質的に、免疫グロブリン の重鎖遺伝子をＰＣＲ増幅し、繊維状ファージＭ１３のマイナーコートタンパク 質をコードする遺伝子を含むベクター中に重鎖融合タンパク質が生成されるよう な仕方でクローニングする。重鎖融合タンパク質は、それが組み立てられるとき に軽鎖遺伝子とともにＭ１３ファージ粒子中に取り込まれる。各組換えファージ はそのゲノム内に異なる抗体Ｆａｂ分子の遺伝子を含み、これはファージの表面 上に提示される。これらライブラリー内に１０⁶を越える異なる抗体がクローニ ングされ、提示されうる。ファージライブラリーを抗原をコーティングしたマイ クロタイターウエル上でえり分け、非特異的なファージを洗い落とし、抗原結合 したファージを溶出する。抗原特異的なクローンからのゲノムを単離し、さらに 特徴付けるために可溶性のＦａｂ形態で抗体が発現できるように遺伝子IIIを切 り出す。潜在的な治療候補として単一のＦａｂが一旦選択されたら、これを容易 に全抗体に変換することができる。Ｆａｂ配列を全抗体に変換するために以前に 記載された発現系は、ＩＤＥＣの哺乳動物発現ベクターＮＥＯＳＰＬＡである。 このベクターは、ヒトガンマ１かまたはガンマ４のいずれかの定常領域遺伝子を 含む。ＣＨＯ細胞をＮＥＯＳＰＬＡベクターでトランスフェクションし、増幅後 、このベクター系は非常に高い発現レベル（＞３０ｐｇ／細胞／日）を達成でき る ことが報告された。 ４．霊長類化抗体 組換え抗体を生成するための他の非常に効率的な手段がニューマン（Ｎewman ）によって開示されている［ニューマン（１９９２）、Ｂiotechnology、１０、 １４５５〜１４６０］。さらに詳しくは、この技術によりサル可変ドメインおよ びヒト定常配列を含む霊長類化抗体を得ることができる。上記文献を参照のため その全体を本明細書中に引用する。さらに、この技術はまた、本願と同一の出願 人である１９９５年１月２５日に出願した米国特許出願第０８／３７９,０７２ 号（これは１９９２年７月１０日に出願した米国特許出願第０７／９１２,２９ ２号（これは１９９２年３月２３日に出願した米国特許出願第０７／８５６,２ ８１号（これは１９９１年７月２５日に出願した米国特許出願第０７／７３５, ０６４号の一部継続出願である）の一部継続出願である）の継続出願である）に も記載されている。米国特許出願第０８／３７９,０７２号およびその親出願を 参照のためその全体を本明細書中に引用する。 この技術は、抗体をヒトに投与したときに抗原的に拒絶されないように修飾す るものである。この技術は、ヒト抗原または受容体でカニクイザルを免疫するこ とによっている。この技術は、ヒト細胞表面抗原に向けられた高親和性のモノク ローナル抗体を産生するために開発された。 このようにして生成された抗体は、ヒトエフェクター機能を示すこと、免疫原 性が低減していること、および長期の血清半減期を有することが以前に報告され ている。この技術は、カニクイザルがヒトと系統発生的には類似しているという 事実にもかかわらず、カニクイザルが依然として多くのヒト抗原を異物として認 識し、それゆえ免疫応答を誘起するという事実によっている。さらに、カニクイ ザルがヒトに系統発生的に近接しているため、これらサルで産生された抗体はヒ トで産生された抗体に対して高度のアミノ酸ホモロジーを有することが見出され た。実際、マカークザルの免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域遺伝子を配列 決定したところ、各遺伝子ファミリーはヒトにおけるその対応遺伝子と８５〜９ ８％相同であることがわかった［ニューマンら（１９９２）、上掲］。このよう にして産生された最初の抗体である抗ＣＤ４抗体は、ヒト免疫グロブリンフレー ムワーク領域のコンセンサス配列に９１〜９２％相同であった［ニューマンら、Ｂiotechnology 、１０、１４５８〜１４６０（１９９２）］。 ヒトＢ７抗原に特異的なモノクローナル抗体は、以前に文献に記載されている 。たとえば、ワイル（Ｗeyl）ら［Ｈum.Ｉmmunol.、３１（４）、２７１〜２７ ６（１９９１）］は、天然および変異抗原変異体を用いたＨＬＡ−Ｂ−２７に対 するヒトモノクローナル抗体のエピトープマッピングを記載している。また、ト ゥバート（Ｔoubert）ら［Ｃlin.Ｅxp.Ｉmmunol.、８２（１）、１６〜２０（１ ９９０）］は、３５ＫＤの細菌外膜タンパク質とも反応するＨＬＡ−Ｂ−２７モ ノクローナル抗体のエピトープマッピングを記載している。また、バル（Ｖalle ）ら［Ｉmmunol.、６９（４）、５３１〜５３５（１９９０）］は、活性化Ｂ細 胞およびＨＴＬＶ−１形質転換Ｔ細胞で発現されたＢ７抗原を認識するＩｇＧ１ サブクラスのモノクローナル抗体を記載している。さらに、トゥバートら［Ｊ. Ｉmmunol .、１４１（７）、２５０３〜９（１９８８）］は、ＨＬＡ−Ｂ−２７ およびＨＬＡ−Ｂ−７抗原遺伝子の対立遺伝子間でのハイブリッド遺伝子を大腸 菌で作成することにより構築したドメイン内組換え体を用いたこれら抗原のエピ トープマッピングを記載している。 Ｂ７抗原の高発現が自己免疫疾患と相関関係を有することが何人かの研究者に よって示されている。たとえば、イオネスコーチルゴビスト（Ｉonesco−Ｔirgo viste）ら［Ｍed.Ｉnterre、２４（１）、１１〜１７（１９８６）］は、１型イ ンスリン依存性糖尿病での増大したＢ７抗原発現を報告している。また、乾癬患 者から得た皮膚樹状細胞上でのＢ７抗原の関与が報告されている［ネッスル（Ｎ estle）ら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.、９４（１）、２０２〜２０９（１９９４）］。 さらに、アフィニティー精製した可溶性ＨＬＡ−Ｂ７を用いた抗ＨＬＡ−Ｂ７ 同種反応性ＣＴＬの抑制が文献で報告されている［ザバザバ（Ｚavazava）ら、Ｔransplantation 、５１（４）、８３８〜４２（１９９１）］。さらに、動物モ デルにおいてＢ７活性を阻止するためのＢ７受容体可溶性リガンドＣＴＬＡ−４ −Ｉｇの使用［たとえば、レンショーら、Ｓcience、２５７、７８９、７９５５ （１９９２）を参照］およびＢ７を抑制しうるＢ７−１−Ｉｇ融合タンパク質が 報告されている。 発明の要約および目的 本発明の目的は、ヒトＢ７抗原、より詳しくはヒトＢ７.１抗原および／また はヒトＢ７.２抗原に対する新規なマカークザル抗体を製造および同定すること にある。 さらに詳しくは、本発明の目的は、ヒトＢ７抗原、すなわちヒトＢ７.１抗原 またはＢ７.２抗原で免疫したサルから得たＢリンパ球を用いたファージ提示ラ イブラリーおよび／またはサルヘテロハイブリドーマのスクリーニングによる、 ヒトＢ７抗原、すなわちヒトＢ７.１抗原およびヒトＢ７.２抗原に対する新規な マカークザル抗体の製造および同定にある。 本発明の他の特別の目的は、ヒトＢ７.１抗原および／またはＢ７.２抗原に特 異的に結合し、Ｂ７／ＣＤ８６経路および活性化Ｔ細胞のＢ７刺激を抑制するこ とによりＩＬ−２産生およびＴ細胞増殖を抑制し有効な免疫抑制剤として機能す る、抗Ｂ７サルモノクローナル抗体およびその霊長類化形態を提供することにあ る。 本発明の他の目的はまた、ドナー脾臓細胞培養中での抗原誘発応答、たとえば 、抗原特異的なＩｇＧ応答、ＩＬ−２産生および細胞増殖を抑制する、抗ヒトＢ ７.１および抗ヒトＢ７.２サルモノクローナル抗体およびその霊長類化形態を提 供することにある。 本発明の他の目的はまた、有利な特性、すなわち親和性、免疫抑制活性を有す る、治療剤として有用な、ヒトＢ７.１抗原およびヒトＢ７.２抗原に特異的な特 定のサルモノクローナル抗体およびその霊長類化形態を同定することにある。さ らに詳しくは、これらサル抗体およびその霊長類化形態は、たとえば免疫抑制剤 として、すなわち抗原誘発免疫応答を阻止するため、自己免疫疾患（乾癬、慢性 関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、特発性血小板 減少性紫斑病（ＩＴＰ）など）を治療するため、および臓器移植拒絶を防ぐため に用いることができる。 本発明の他の目的は、ヒトＢ７抗原、すなわちヒトＢ７.１抗原および／また はヒトＢ７.２抗原に特異的な１またはそれ以上のサルモノクローナル抗体、ま たはその霊長類化形態および薬理学的に許容しうる担体または賦形剤を含む医薬 組成物を提供することにある。これら組成物は、たとえば、自己免疫疾患、たと えば、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）や全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ ）を治療するため、抗原誘発免疫応答を阻止するため、および移植受容者におけ る臓器移植拒絶を防ぐための免疫抑制剤として用いられるであろう。 本発明の他の目的は、ヒトＢ７抗原、すなわちヒトＢ７.１抗原および／また はヒトＢ７.２抗原に特異的に結合する１またはそれ以上のサルまたは霊長類化 モノクローナル抗体の治療学的有効量を投与することによる新規な治療方法を提 供することにある。そのような治療方法は、Ｂ７：ＣＤ２８経路の抑制により治 療可能な疾患、たとえば、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、全身性エリテ マトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、 再生不能性貧血などの自己免疫疾患の治療、並びに移植患者において移植拒絶を 防ぐために有用である。 本発明のさらに他の目的は、ヒトＢ７.１抗原および／またはＢ７.２抗原に特 異的なサルモノクローナル抗体の少なくとも可変重鎖および軽鎖ドメインを発現 するトランスフェクタント、たとえばＣＨＯ細胞を提供することにある。 本発明の他の目的は、ヒトＢ７.１抗原および／またはヒトＢ７.２抗原に特異 的なサルモノクローナル抗体の可変重鎖および／または軽鎖ドメインをコードす る核酸配列、およびこれら核酸配列を含む、霊長類化抗体の発現を提供する発現 ベクターを提供することにある。 定義 本発明を一層明確に理解できるように下記術語を定義する。 枯渇（Ｄepleting）抗体 − 活性化Ｂ細胞または他の抗原提示細胞を殺す抗 体。 非枯渇（Ｎon−depleting）抗体 − Ｂ７とＴ細胞活性化リガンドＣＤ２８ およびＣＴＬＡ−４とのコスティミュラトリー作用を阻止する抗体。それゆえ、 この抗体は免疫性を減少させる（anergizes）が抗原提示細胞を排除はしない。 霊長類化抗体 − サル抗体、とりわけカニクイザル抗体の可変重鎖および軽 鎖ドメインを含み、ヒト定常ドメイン配列、好ましくはヒト免疫グロブリンガン マ１またはガンマ４定常ドメイン（またはＰＥ変異体）を含むように設計した組 換え抗体。かかる抗体の調製は、ニューマンら（１９９２）、「ヒト疾患の免疫 療法のための組換え抗体の霊長類化：ヒトＣＤＨに対するマカークザル／ヒトキ メラ抗体」、Ｂiotechnology、１０：１４５８〜１４６０；および本願と同じ出 願人に係る米国特許出願第０８／３７９,０７２号（両文献を参照のため本明細 書中にその全体を引用する）に記載されている。これら抗体は、ヒト抗体と高程 度のホモロジー、すなわち８５〜９８％のホモロジーを示し、ヒトエフェクター 機能を示し、免疫原性が減少しており、ヒト抗原に対して高い親和性を示すこと が報告されている。 Ｂ７抗原 − 本願におけるＢ７抗原は、たとえばヒトＢ７.１抗原およびＢ ７.２抗原を含む。これら抗原はＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４に結合す る。これら抗原はＴ細胞活性化においてコスティミュラトリー機能を有する。ま た、これら抗原はすべて、細胞外免疫グロブリンスーパーファミリーＶおよびＣ 様ドメイン、疎水性膜貫通領域および細胞質テールを含み［フリーマンら、Ｓci ence 、２６２：９０９（１９９３）を参照］、高度にグリコシル化されている。 抗Ｂ７抗体 − ヒトＢ７抗原、たとえばヒトＢ７.１抗原および／またはＢ ７.２抗原に充分な親和性にて特異的に結合してＢ７：ＣＤ２８相互作用を阻止 し、それによって免疫抑制を誘発するサルモノクローナル抗体またはその霊長類 化形態。 図面の簡単な説明 図１は、マカークザル免疫グロブリン配列に基づくプライマーを含む、繊維状 ファージの表面に示されたＢ７に対して産生された組換え免疫グロブリンライブ ラリーをスクリーニングするのに用いるｐＭＳベクターを示す。 図２は、本願発明のヒトＢ７.１抗原に特異的な霊長類化抗体を発現させるの に用いるＮＥＯＳＰＬＡ発現ベクターを示す。 図３は、トランスフェクションしたＣＨＯ細胞上の細胞表面Ｂ７.１に対して 向けられたサル血清抗Ｂ７.１力価を示す。 図４は、非標識ＳＢ７およびＭａｂ Ｌ３０７.４マウス抗Ｂ７.１の存在下で のＳＢ７.１アフィニティー精製サル抗体による放射性標識ｓＢ７.１結合の抑制 を示す。 図５は、アフィニティー精製ＳＢ７.１との競合による、放射性標識サル１３ ５およびＬ３７０７.４抗Ｂ７.１抗体のＢ７陽性ヒトＳＢ細胞への結合の抑制を 示す。 図６は、非標識ＳＢ７.１マウス抗Ｂ７.１（Ｌ３０７.４）およびサル１１２ ７アフィニティー精製血清抗体との競合による、放射性標識Ｂ７−Ｉｇの活性化 ヒト末梢血Ｔ細胞への結合の抑制を示す。 図７は、抗Ｂ７.１アフィニティー精製サル血清抗体による、混合リンパ球培 養液中のＩＬ−２タンパク質の抑制を示す。 図８ａは、７Ｃ１０の軽鎖の霊長類化形態のアミノ酸配列および核酸配列を示 す。 図８ｂは、７Ｃ１０の重鎖の霊長類化形態のアミノ酸配列および核酸配列を示 す。 図９ａは、７Ｂ６の軽鎖の霊長類化形態のアミノ酸配列および核酸配列を示す 。 図９ｂは、７Ｂ６の重鎖の霊長類化形態のアミノ酸配列および核酸配列を示す 。 図１０ａは、霊長類化軽鎖１６Ｃ１０のアミノ酸配列および核酸配列を示す。 図１０ｂは、霊長類化重鎖１６Ｃ１０のアミノ酸配列および核酸配列を示す。 発明の詳細な説明 上記のように、本発明は、ヒトＢ７.１抗原および／またはヒトＢ７.２抗原に 特異的に結合する新規なサルモノクローナル抗体、並びにそれから得られる霊長 類化抗体の製造に関する。これら抗体はヒトＢ７.１および／またはＢ７.２に対 する高い親和性を有し、それゆえＢ７：ＣＤ２８経路を抑制する免疫抑制剤とし て用いることができる。 サルモノクローナル抗体の調製は、ファージ提示ライブラリーのスクリーニン グにより、またはＢ７（たとえば、ヒトＢ７.１および／またはＢ７.２）で免疫 したサルから得たＢリンパ球を用いたサルヘテロハイブリドーマの調製により、 行うことができる。 記載のように、抗Ｂ７抗体の第一の製造方法は、組換えファージ提示技術を含 む。この技術は一般に上記文献に記載されている。 本質的に、この技術は、繊維状ファージの表面上に提示されたＢ７抗原に対す る組換え免疫グロブリンライブラリーを合成し、Ｂ７.１抗原および／またはＢ ７.２抗原に対する高い親和性を有する抗体を分泌するファージを選択すること を含むであろう。上記に記載したように、ヒトＢ７.１およびＢ７.２の両者に結 合する抗体を選択するのが好ましいであろう。かかる方法を行うため、本発明者 らは組換えの可能性を減少させ安定性を改善したサルライブラリーのための独特 のライブラリーを作成した。このベクターｐＭＳは以下に詳細に記載するが、図 １に示してある。 本質的に、マカークザルライブラリーに使用するファージ提示を採用するため 、このベクターはサル免疫グロブリン遺伝子をＰＣＲ増幅するための特定のプラ イマーを含んでいる。これらプライマーは、霊長類化技術を開発する際に得られ るマカークザル配列およびヒト配列を含むデータベースに基づく。 適当なプライマーは、本願と同じ出願人に係る米国特許出願第０８／３７９, ０７２号（参照のため本明細書中に引用する）に開示されている。 第二の方法は、ヒトＢ７抗原、好ましくはヒトＢ７.１抗原およびＢ７.２抗原 に対してサル、すなわちマカークザルを免疫することを含む。マカークザルをモ ノクローナル抗体の再生に使用することの本来的な利点は上記に記載してある。 とりわけ、かかるサル、すなわちカニクイザルはヒト抗原または受容体に対して 免疫することができる。さらに、得られた抗体は、ニューマンら、Ｂiotechnolo gy 、１０、１４５５〜１４６０（１９９２）およびニューマンらの本願と同じ出 願人に係る米国特許出願第０８／３７９,０７２号（１９９５年１月２５日出願 ）（その全体を参照のため本明細書中に引用する）に記載の方法に従って霊長類 化抗体 を作成するのに用いることができる。 カニクイザルから得られる抗体の有意な利点は、これらサルが多くのヒトタン パク質を異物として認識し、それゆえ所望のヒト抗原、たとえばヒト表面タンパ ク質および細胞受容体に対して高い親和性を有する抗体を作成できることである 。さらに、カニクイザルはヒトと系統発生的に近接しているため、それから得ら れる抗体はヒトで産生される抗体と高度のアミノ酸ホモロジーを示す。上記に記 載したように、マカークザルの免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域遺伝子の 配列決定したところ、各遺伝子ファミリーの配列はヒトの対応配列と８５〜８８ ％相同であることがわかった（ニューマンら（１９９２）、上掲）。 本質的に、カニクイザルにヒトＢ７抗原、たとえばヒトＢ７.１抗原および／ またはヒトＢ７.２抗原を投与し、それからＢ細胞を単離し、たとえばリンパ節 生検を該動物から採取し、ついでポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてＢ リンパ球をＫＨ６／Ｂ５（マウス×ヒト）と融合させる。ついで、ヒトＢ７抗原 、たとえばヒトＢ７.１抗原および／またはヒトＢ７.２抗原に結合する抗体を分 泌するヘテロハイブリドーマを同定する。 Ｂ７.１およびＢ７.２の両者に結合する抗体が望ましい。なぜなら、そのよう な抗体は、Ｂ７と同様にＢ７.１およびＢ７.２とその対応受容体、すなわちヒト ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８との相互作用を抑制するのに用いることができるか らである。これらエピトープに対する抗体は、ヒトＢ７.１およびヒトＢ７.２の 両者がＴ細胞上の対応受容体と相互作用するのを抑制する。このことは、相乗作 用を付与する可能性がある。 しかしながら、ヒトＢ７抗原、Ｂ７.１抗原またはＢ７.２抗原の一方のみに結 合する抗体もまた、これら分子がともにＴ細胞活性化、クローン拡張、リンホカ イン（ＩＬ−２）分泌、および抗原に対する応答性に関与することから非常に望 ましい。ヒトＢ７.１およびＢ７.２の両者がヒトＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８に 結合するなら、おそらく、それに対してマカークザル抗体が潜在的に産生される 少なくとも一つの共通したまたは相同な領域（おそらく、共通する立体配置エピ トープ）が存在するに違いない。 本発明者らは、マカークザルの免疫を、ＣＨＯ細胞中で産生されＬ３０７.４ −セファロースアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィ ーにより精製した組換え可溶性Ｂ７.１抗原に対して行うことを選択した。しか しながら、特定の投与Ｂ７抗原および潜在的に他のＢ７抗原に対して特異的な抗 体応答となるに充分な純度を有する限りにおいて、ヒトＢ７抗原、ヒトＢ７.１ 抗原またはヒトＢ７.２抗原の特定の採取源は重要ではない。 ヒトＢ７抗原、ヒトＢ７.１抗原（ＣＤ８０とも称される）遺伝子およびヒト Ｂ７.２抗原（ＣＤ８６とも称される）遺伝子はクローニングおよび配列決定さ れており、それゆえ組換え法により容易に製造することができる。 好ましくは、投与するヒトＢ７抗原、ヒトＢ７.１抗原および／またはヒトＢ ７.２抗原は、たとえば膜貫通ドメインと細胞質ドメインを除去することによっ て細胞外部分、すなわち細胞外スーパーファミリーＶおよびＣ様ドメインのみを 有するＢ７、Ｂ７.１またはＢ７.２遺伝子を発現させることにより、可溶性の形 態で投与されるであろう［たとえば、グルメット（Ｇrumet）ら、Ｈum.Ｉmmunol .、４０（３）、２２８〜２３４、１９９４（可溶性形態のＢ７の発現を教示す る；参照のためその全体を本明細書中に引用する）を参照］。 マカークザルをＢ７抗原、Ｂ７.１抗原および／またはＢ７.２抗原、好ましく はその可溶性形態で、これら抗原に対する抗体が産生される条件下にて免疫する であろう。好ましくは、可溶性のヒトＢ７抗原、Ｂ７.１抗原またはＢ７.２抗原 をアジュバント、たとえばフロントの完全アジュバント（ＣＦＡ）、アルミニウ ム、サポニンまたは他の公知のアジュバント並びにそれらの組み合わせとともに 投与されるであろう。一般に、これには、たとえば繰り返し注射することにより 数カ月にわたって繰り返し免疫することが必要であろう。たとえば、可溶性のＢ ７.１抗原の投与をアジュバント中でブースター免疫とともに３〜４カ月間行い 、ヒトＢ７.１抗原に結合する抗体を含む血清を生成した。 免疫後、Ｂ細胞をたとえば免疫動物からリンパ節生検を採取することにより回 収し、ポリエチレングリコールを用いてＢ細胞をＫＨ６／Ｂ５（マウス×ヒト） ヘテロハイブリドーマと融合させる。かかるヘテロハイブリドーマの作成方法は 知られており、１９９５年１月２５日に出願されたニューマンらの米国特許出願 第０８／３７９,０７２号（参照のため本明細書中に引用する）に記載されてい る。 ついで、ヒトＢ７、Ｂ７.１および／またはＢ７.２に結合する抗体を分泌する ヘテロハイブリドーマを同定する。このことは公知技術により行うことができる 。たとえば、このことは酵素または放射性核種で標識したヒトＢ７、Ｂ７.１お よび／またはＢ７.２を用いたＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイにより決 定することができる。 ついで、ヒトＢ７、Ｂ７.１および／またはＢ７.２抗原に対する所望の特異性 を有する抗体を分泌する細胞株をサブクローニングしてモノクローナル化する。 本発明においては、本発明者らは、ＥＬＩＳＡアッセイにおける可溶性Ｂ７. １抗原コーティングプレート、抗原陽性Ｂ７.１細胞、および細胞表面上にヒト Ｂ７.１抗原を発現するＣＨＯトランスフェクタントに結合する能力について精 製抗体をスクリーニングした。さらに、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＩ Ｌ−２産生およびトリチウム化チミジンの取り込みにより測定されるように（Ｂ ７結合は¹²⁵Ｉ放射性標識した可溶性Ｂ７.１（ＳＢ７.１）を用いて検出）、Ｂ 細胞／Ｔ細胞相互作用を阻止する能力について抗体をスクリーニングした。 また、マカークザルからのアフィニティー精製した抗体を、Ｂ７.１／Ｉｇ融 合タンパク質を発現するＣＨＯトランスフェクタントに対する反応性、およびヒ トＢ７.２抗原を産生するＣＨＯ細胞に対する反応性について試験した。これら 結果は、Ｂ７.１免疫血清がＢ７.２トランスフェクトーマに結合することを示し た。Ｂ７.２抗原への抗体の結合は、可溶性のＢ７.２−Ｉｇ試薬を用いて確認す ることができる。実施例に記載するように、このことは、Ｂ７.２−Ｉｇ−セフ ァロースアフィニティーカラムを調製するのに充分な量でＢ７.２−ＩｇをＣＨ Ｏトランスフェクトーマから調製および精製することにより行う。Ｂ７.２に交 差反応する抗体はＢ７.２−Ｉｇ−セファロースカラムに結合するであろう。 ついで、ヒトＢ７抗原、Ｂ７.１抗原および／またはＢ７.２抗原に特異的に結 合する抗体を発現する細胞株を用い、本質的にニューマンら（１９９２）、上掲 、 および１９９５年１月２５日に出願されたニューマンらの米国特許出願第０８／ ３７９,０７２号（ともに参照のため本明細書中に引用する）に記載されたよう にして霊長類化抗体を作成するために可変ドメイン配列をクローニングする。本 質的に、このことには、該細胞株からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およ びＩｇ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅が含まれる。適当なプライマ ーは、ニューマンら（１９９２）、上掲、および米国特許出願第０８／３７９, ０７２号明細書（とりわけ、米国特許出願第０８／３７９,０７２号の図１を参 照）に記載されている。 ついで、クローニングしたサル可変遺伝子を、ヒト重鎖および軽鎖定常領域遺 伝子を含む発現ベクター中に挿入する。好ましくは、このことはＩＤＥＣ,Ｉnc. の特許発現ベクターであるＮＥＯＳＰＬＡを用いて行う。このベクターは図２に 示してあり、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロ ビン主要プロモーター、ＳＶ４０の複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化 配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ヒ ト免疫グロブリンκまたはλ定常領域、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、ヒト 免疫グロブリンγ１またはγ４ＰＥ定常領域およびリーダー配列を含む。このベ クターは、サル可変領域遺伝子の導入、ＣＨＯ細胞中でのトランスフェクション 、ついでＧ４１８含有培地中での選択およびメトトレキセート増幅の後に非常に 高レベルの霊長類化抗体が発現されることがわかった。 たとえば、この発現系は、これまでにＣＤ４その他のヒト細胞表面受容体に対 して高い結合活性（Ｋｄ≦１０^-10Ｍ）を有する霊長類化抗体が得られることが 開示されている。さらに、これら抗体は、もともとのサル抗体と同じ親和性、特 異性および機能的活性を示すことがわかっている。このベクター系は、本願と同 じ出願人に係る米国特許出願第３７９,０７２号（参照のため本明細書中に引用 する）、および１９９３年１１月３日に出願された米国特許出願第０８／１４９ ,０９９号（参照のためその全体を本明細書中に引用する）に実質的に開示され ている。この系は高発現レベル、すなわち＞３０ｐｇ／細胞／日を提供する。 以下に記載するように、本発明者らは、Ｂ７.１抗原に特異的に結合し、Ｂ７. ２ 抗原にも結合する４つの先導（lead）候補サルモノクローナル抗体を選択した。 これらサルモノクローナル抗体は、本明細書において７Ｂ６、１６Ｃ１０、７Ｃ １０および２０Ｃ９と称する。 以下にさらに詳細に記載するように、これら抗体を、Ｔ細胞結合についてのＴ 細胞結合実験のための混合リンパ球反応中でのＩＬ−２産生およびトリチル化チ ミジンの取り込みによって測定されるように、Ｂ細胞／Ｔ細胞相互作用を阻止す る能力について評価し、ヒト体コート（human body coat）末梢血リンパ球をＰ ＨＡ刺激物質の存在下で３〜６日間培養した。Ｂ７結合を¹²⁵Ｉ−放射性標識し た可溶性Ｂ７.１を用いてラジオアッセイした。観察した結果は、減少したＩＬ −２産生および混合リンパ球培養の減少した増殖により示されるように、これら すべての抗体がＢ７.１抗原と高い親和性にて結合し、Ｂ細胞／Ｔ細胞相互作用 を有効に阻止することを示す。 これら特定のサルモノクローナル抗体の特性は、まとめると以下のとおりであ る。 １．これらサル抗体がＣＴＬＡ４−Ｉｇ間の物理的相互作用を阻止する能力を 示すため、種々の濃度のサル抗Ｂ７.１抗体および非標識ＣＴＬＡ４−Ｉｇを放 射性標識したＣＴＬＡ４−ＩｇＩ¹²⁵とともにインキュベートした。抑制アッセ イの結果は、サル抗体のＩＣ５０（５０％抑制となるインヒビターの濃度）が以 下のとおりであることを示した： ａ：７Ｃ１０： ０.３９μｇ／Ｍ１ ｂ：１６Ｃ１０： １.６０μｇ／Ｍ１ ｃ：２０Ｃ９： ３.９０μｇ／Ｍ１ ｄ：７Ｂ６： ３９.０μｇ／Ｍ１ ２．スキャッチャード分析は、Ｂ７−Ｉｇコーティングプレートに結合したサ ル抗体の見かけの親和定数（Ｋｄ）がおよそ以下のとおりであることを示した： ａ：７Ｃ１０： ６.２×１０^-9Ｍ ｂ：１６Ｃ１０： ８.１×１０^-9Ｍ ｃ：７Ｂ６： １０.７×１０^-9Ｍ ｄ：２０Ｃ９： １６.８×１０^-9Ｍ ３．抗体を混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲ）においてインビトロで試験し た。ＭＬＲは、４つのすべての抗Ｂ７.１抗体が下記Ｉｂｇｏ値に示されるよう に異なる程度にＩＬ−２産生を抑制することを示した： ａ：７Ｂ６： ５.０μｇ／Ｍ ｂ：１６Ｃ１０： ＜０.１μｇ／Ｍ ｃ：２０Ｃ９： ２.０μｇ／Ｍ ｄ：７Ｃ１０： ５.０μｇ／Ｍ ４．サル抗Ｂ７.１抗体を、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）上のＢ７に結合す る能力について試験した。ＦＡＣＳ分析は、４つのすべてのサル抗体が陽性であ ることを示した。 ５．サル抗体１６Ｃ１０、７Ｂ６、７Ｃ１０および２０Ｃ９をＦＡＣＳ分析に よりＣ１ｑ結合について試験した。その結果は、Ｂ７.１ ＣＨＯトランスフェク ション細胞とともにインキュベートした後に７Ｃ１０サルＩｇが強いヒトＣ１ｑ 結合を有することを示した。１６Ｃ１０は陽性であったが、２０Ｃ９および７Ｂ ６サル抗体は陰性であった。 ６．病理−毒性（path-tox）研究のための動物モデルを選択するため、異なる 種からの動物血でサル抗体を試験した。サル抗Ｂ７.１抗体は、ヒト、チンパン ジーおよびおそらくヒヒと交差反応した。 これら特性に基づき、３つのサルモノクローナル抗体、１６Ｃ１０、７Ｃ１０ および２０Ｃ９が最も有利な特性を備えていると思われ、そのうちでも１６Ｃ１ ０および７Ｃ１０は２０Ｃ９に比べて若干優れていた。 上記技術および本願と同じ出願人に係る米国特許出願第０８／３７９,０７２ 号に開示された技術を用い、本発明者らは７Ｃ１０、７Ｂ６および１６Ｃ１０の 可変ドメインをクローニングし、７Ｃ１０軽鎖、７Ｃ１０重鎖、７Ｂ６軽鎖、 ７Ｂ６重鎖、１６Ｃ１０軽鎖および１６Ｃ１０重鎖の霊長類化形態のアミノ酸配 列および核酸配列を提供する。これらアミノ酸配列および核酸配列は、図８ａお よび８ｂ、９ａおよび９ｂ、および１０ａおよび１０ｂに示されている。ヒトガ ンマ１定常ドメインのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は米国特許出願第０８／３ ７９,０７２号に記載されている。 上記に記載したように、これら霊長類化抗体は図２に示したＮＥＯＳＰＬＡ発 現ベクター（実質的に、本願と同じ出願人に係る米国特許出願第０８／３７９, ０７２号および０８／１４９,０９９号（両出願を参照のため本明細書中に引用 する）に記載されている）を用いて発現させるのが好ましい。 上記で記載したように、本発明の霊長類化抗体はヒト免疫グロブリンガンマ１ またはガンマ４定常領域のいずれかを含むのが好ましく、ガンマ４は２つの位置 にて突然変異させてガンマ４ＰＥを作成するのが好ましいであろう。このガンマ ４ＰＥ変異体は２つの変異、すなわち残留ＦＣＲ結合を排除するために導入した ＣＨ２領域中のグルタミン酸、および重鎖ジスルフィド結合相互作用の安定性を 増大させることを意図したヒンジ領域におけるプロリン置換を含んでいる［アレ グル（Ａlegre）ら、Ｊ.Ｉmmunol.、１４８、３４６１〜３４６８（１９９２） ；およびエンジェル（Ａngel）ら、Ｍol.Ｉmmunol.、３０、１０５〜１５８（１ ９９３）；ともに参照のため本明細書中に引用する］。 本発明の霊長類化抗体がガンマ１、ガンマ４またはガンマ４ＰＥ定常領域のい ずれを含むかは、特定の疾患標的にほぼ依存する。好ましくは、枯渇および非枯 渇霊長類化ＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体を作成し、特定の疾患標的に対して試験 する。 本発明のサルモノクローナル抗体が上記結合特性および機能的特性を有すると するなら、これら抗Ｂ７.１モノクローナル抗体およびその霊長類化形態はＢ７ ：ＣＤ２８相互作用を阻止するための治療剤として充分に適しているに違いなく 、かくして免疫抑制剤が提供される。とりわけ、混合リンパ球培養におけるＩＬ −２産生およびトリチウム化チミジンの取り込みによって測定されるようなＢ７ .１抗原への高親和性およびＢ細胞／Ｔ細胞相互作用を阻止する能力、並びに減 少し た抗原特異的ＩｇＧ応答、ＩＬ−２産生および細胞増殖によって示されるような ドナー脾臓細胞培養において抗原誘発応答を有効に抑制する能力を有するとする なら、これらサルモノクローナル抗体およびその霊長類化形態はＢ７：ＣＤ２８ 経路を調節する有効な免疫抑制剤として機能するに違いない。このことは、免疫 抑制が治療学上望ましい多くの疾患、たとえば自己免疫疾患を治療するため、望 ましくない抗原特異的ＩｇＧ応答を抑制するため、および臓器移植拒絶および移 植片対宿主病を防ぐために重要である。本質的に、本発明の抗体は、Ｂ７：ＣＤ ２８経路の抑制が治療学上望ましいあらゆる疾患を治療するうえで有用であろう 。 本発明の抗Ｂ７.１抗体の重要な治療適応症としては、例として、特発性血小 板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、 多発性硬化症、再生不能性貧血、乾癬および慢性関節リウマチなどの自己免疫疾 患が挙げられる。 本発明の抗Ｂ７.１抗体の他の治療適応症は、臓器移植および骨髄移植（ＢＭ Ｔ）の際の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防ぐことである。本発明の抗体は、ド ナー特異的な同種抗原に対する宿主寛容を誘発し、それによって移植を容易にし 、移植拒絶の発生を低減するのに用いることができる。同種抗原心臓移植のマウ スモデルにおいて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの静脈内投与が免疫抑制あるいは同種抗原 に対する寛容の誘発とさえなりうることが示されている［リン（Ｌin）ら、Ｊ. Ｅxp.Ｍed .１７８］１８０１、１９９３；トルカ（Ｔorka）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａ cad.Ｓci.ＵＳＡ 、８９：１１１０２、１９９２］。本発明の霊長類化抗Ｂ７.１ 抗体は同様またはそれ以上の活性を示すであろうことが期待される。 上記方法によりまたは同等の技術により産生した抗体は、機能的生物学的アッ セイにおいて特徴付けるためにアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除 クロマトグラフィーとの組み合わせにより精製することができる。これらアッセ イには、特異性および結合親和性の決定並びに発現されたイソ型に伴うエフェク ター機能、たとえばＡＤＣＣ、または補体固定化が含まれる。かかる抗体は、多 くのヒト疾患、たとえば、Ｂ細胞リンパ腫、ＡＩＤＳなどの感染疾患、自己免疫 疾患、炎症性疾患、および移植に対する受動および能動治療剤として用いること ができる。これら抗体は、その天然型か、または抗体／キレート複合体、抗体／ 薬剤複合体もしくは抗体／毒素複合体の一部として用いることができる。さらに 、全抗体または抗体フラグメント（Ｆａｂ₂、Ｆａｂ、Ｆｖ）を造影試薬として 、または抗イディオタイプ応答を生成するための能動免疫療法における潜在的な ワクチンまたは免疫原として用いることができる。 治療効果を得るのに有用な抗体の量は、当業者によく知られた標準法により決 定することができる。これら抗体は一般に、標準法により薬理学的に許容しうる 緩衝液中にて提供され、所望の経路にて投与できる。本願の請求に係る抗体の有 効性およびヒトによる寛容のため、ヒトにおける種々の疾患または疾患状態を治 療するためにこれら抗体を繰り返し投与することが可能である。 本発明の抗Ｂ７.１抗体（またはそのフラグメント）は、免疫抑制を誘発する のに、すなわちヒトまたは動物の免疫系の抑制を誘発するのに有用である。それ ゆえ、本発明は、本発明の抗体の有効な非毒性量を免疫抑制を必要とするヒトそ の他の動物に投与することによる、かかるヒトその他の動物において免疫抑制を 予防的または治療的に誘発する方法に関する。 本発明の化合物が免疫抑制を誘発する能力は、この目的のために使用される標 準的な試験、たとえば、混合リンパ球反応試験またはチミジンの取り込みにより 測定されるＴ細胞増殖の抑制を測定する試験で示される。 本発明の抗体が免疫抑制を誘発するうえで有用性を有するという事実は、本発 明の抗体が移植臓器または組織（たとえば、腎臓、心臓、肺、骨髄、皮膚、角膜 など）に対する抵抗または拒絶の治療または予防；自己免疫疾患、炎症疾患、増 殖性および過増殖性疾患、および免疫学的に媒体された疾患の皮膚症状（たとえ ば、慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、橋本甲状 腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、１型糖尿病、ぶどう膜炎、ネフローゼ症候 群、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、およびさらなる（further）湿疹性 皮膚炎、脂漏性皮膚炎、偏平苔せん、天疱瘡、水泡性天疱瘡、表皮水泡症、蕁麻 疹、血管浮腫、脈管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、円形脱毛症など）の治療また は予防；可逆性閉塞性気道疾患（reversible obstructive airways disease）、 胃腸炎症およびアレルギー（たとえば、小児脂肪便症、直腸炎、好酸球増加性胃 腸炎、肥満細胞症、クローン病および潰瘍性大腸炎）および食物関連アレルギー （たとえば、偏頭痛、鼻炎および湿疹）の治療に有用であるに違いないことを示 している。 当業者であれば日常的な実験により、免疫抑制を誘発する目的のための抗体の 有効かつ非毒性の量を決定できるであろう。しかしながら、一般に、有効投与量 は１日当たり体重１ｋｇ当たり約０.０５〜１００ｍｇの範囲であろう。 本発明の抗体（またはそのフラグメント）はまた、哺乳動物において腫瘍を治 療するうえでも有用であるに違いない。一層詳しくは、本発明の抗体は、腫瘍の サイズを小さくし、腫瘍の増殖を抑制し、および／または腫瘍を有する動物の生 存時間を延ばすのに有用であるに違いない。さらに、本発明はまた、ヒトその他 の動物に有効かつ非毒性量の抗体を投与することによるヒトその他の動物におけ る腫瘍の治療方法にも関する。当業者であれば日常的な実験により、発癌性腫瘍 を治療する目的のための抗Ｂ７抗体の有効かつ非毒性の量を決定できるであろう 。しかしながら、一般に、有効投与量は１日当たり体重１ｋｇ当たり約０.０５ 〜１００ｍｇの範囲であることが期待される。 本発明の抗体は、上記治療方法に従い、治療または予防効果が期待できる程度 に充分な量にてヒトその他の動物に投与することができる。かかる本発明の抗体 は、公知技術に従って本発明の抗体を通常の薬理学的に許容しうる担体または希 釈液と混合することにより調製した通常の剤型にて、かかるヒトその他の動物に 投与することができる。当業者であれば薬理学的に許容しる担体または希釈液の 形態および特性が、混合する活性成分の量、投与経路および他のよく知られた変 量によって決定されることが認識されるであろう。 本発明の抗体（またはそのフラグメント）の投与経路は、経口、非経口、吸入 または局所投与であってよい。本明細書において用いる非経口なる術語は、静脈 内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内または膣内投与を含む。皮下および筋肉内形 態の非経口投与が一般に好ましい。 本発明の化合物を予防的または治療的に免疫抑制を誘発するためまたは発癌性 腫瘍を治療するために用いる際の毎日の非経口および経口投与計画は、一般に１ 日当たり体重１ｋｇ当たり約０.０５〜１００ｍｇの範囲だが、約０.５〜１０ｍ ｇの範囲であるのが好ましいであろう。 本発明の抗体はまた吸入によっても投与することができる。「吸入」とは鼻内 および経口吸入投与を意味する。かかる投与に適した剤型、たとえばエアロゾル 製剤や定量吸入器（metered dose inhaler）などは通常の技術により製造できる 。本発明の化合物の好ましい投与量は、一般に約１０〜１００ｍｇの範囲である 。 本発明の抗体はまた、局所投与することもできる。局所投与とは非全身投与を いい、本発明の抗体（またはそのフラグメント）化合物を表皮や頬面窩洞に外用 したり、かかる抗体を眼、耳および鼻や血流に実質的に浸入しない場所に点滴注 入することを含む。全身投与とは、経口、静脈内、腹腔内および筋肉内投与を意 味する。治療または予防効果を得るのに必要な抗体の量は、もちろん、選択した 抗体、治療しようとする状態の性質および重篤度および治療を受ける動物により 変わるであろうが、最終的には医師の裁量による。本発明の抗体の局所投与の適 当な投与量は、一般に１日当たり体重１ｋｇ当たり約１〜１００ｍｇの範囲であ ろう。製剤 本発明の抗体またはそのフラグメントは単独でも投与することが可能であるが 、医薬製剤として投与することが好ましい。活性成分は、局所投与の場合、医薬 製剤の０.００１〜１０％ｗ／ｗ、たとえば１重量％〜２重量％を構成してよい が、１０％ｗ／ｗを構成してもよく、好ましくは医薬製剤の５％ｗ／ｗを越えな い量、さらに好ましくは０.１〜１％ｗ／ｗである。 本発明の局所製剤は、活性成分を１またはそれ以上の許容しうる担体および任 意の他の治療成分とともに含む。担体は、製剤の他の成分と適合し、適用者に有 害でないという意味で「許容しうる」ものでなければならない。 局所投与に適した製剤としては、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、 軟膏またはパスタ剤などの治療が必要な部位へ皮膚を通して浸透していくのに適 した液状または半液状の製剤、および眼、耳または鼻に投与するのに適した滴剤 が含まれる。 本発明による滴剤は滅菌した水性または油性の溶液または懸濁液を含み、殺菌 剤および／または殺真菌剤および／または他の適当な保存剤の適当な水溶液（好 ましくは表面活性剤を含む）中に活性成分を溶解することにより調製できる。つ いで、得られた溶液を濾過により清澄化し、適当な容器に移し、ついでこれを密 封し、９０〜１００℃にて半時間オートクレーブまたは維持することにより滅菌 する。別法として、溶液を濾過により滅菌し、無菌技術により容器に移す。滴剤 中に含めるのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸フェニル水銀または酢 酸フェニル水銀（０.００２％）、塩化ベンザルコニウム（０.０１％）および酢 酸クロルヘキシジン（０.０１％）である。油性溶液を調製するのに適した溶媒 には、グリセリン、希アルコールおよびプロピレングリコールが含まれる。 本発明によるローション剤には、皮膚または眼に適用するのに適したものが含 まれる。眼用ローション剤は、任意に殺菌剤を含む滅菌水溶液を含み、滴剤の調 製と同様の方法により調製できる。皮膚に適用するローション剤またはリニメン ト剤はまた、アルコールやアセトンなどの乾燥促進剤や皮膚冷却剤、および／ま たはグリセリンなどの加湿剤またはヒマシ油や落花生油などの油をも含む。 本発明によるクリーム剤、軟膏またはパスタ剤は、活性成分の外用のための半 固形製剤である。これら製剤は、微細に粉砕したまたは粉末形態の活性成分を単 独で、または水性もしくは非水性流体中の溶液または懸濁液中にて、適当な機械 の助けを借りて脂肪性（greasy）または非脂肪性（non−greasy）基剤を用いて 混合することにより調製できる。基剤は、固形パラフィン、軟パラフィンまたは 流動パラフィン、グリセリン、蜜蝋、金属石鹸などの炭水化物；粘漿薬；扁桃油 、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然起源の油； 羊毛脂もしくはその誘導体、またはステアリン酸やオレイン酸などの脂肪酸をプ ロピレングリコールやマクロゴールなどのアルコールとともに含む。製剤は、陰 イオン性、陽イオン性または非イオン性界面活性剤などの適当な界面活性剤、た とえば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などを含んで いてよい。天然ゴム、セルロース誘導体または無機物質（シリカ（silicaceous silicas）などの懸濁化剤、およびラノリンなどの他の成分も含まれていてよい 。 本発明の抗Ｂ７.１抗体またはそのフラグメントはまた、Ｂ７：ＣＤ２８経路 を調節する他の分子（moieties）とともに投与することもできる。かかる分子と しては、その例として、ＩＬ−７やＩＬ−１０などのサイトカイン、ＣＴＬＡ４ −Ｉｇ、可溶性ＣＴＬＡ４および抗ＣＤ２８抗体およびそのフラグメントが挙げ られる。 当業者には、本発明の抗体またはそのフラグメントの個々の投与量の最適量お よび期間（spacing）が治療しようとする状態の性質および程度、投与の形態、 経路および部位、および治療しようとする特定の動物により決定されるであろう こと、およびかかる最適量が通常の技術により決定されうることが認識されるで あろう。当業者にはまた、治療の最適コース、すなわち所定日数の間の１日当た りに投与する本発明の抗体またはそのフラグメントの投与の回数が治療決定試験 （treatment determination tests）の通常のコースを用いて当業者により評価 されうることも認識されるであろう。 さらに詳述するまでもなく、当業者であれば上記の記載を用いて本発明を最大 限に活用することができると思われる。それゆえ、以下に記載する製剤例は例示 的な態様を示すのであって、本発明の範囲をいかなる意味においても限定するこ とを意図するものではない。カプセル組成物 カプセル剤の形態の本発明の医薬組成物は、標準的な２片（two-piece）ハー ドゼラチンカプセルに粉末形態の本発明の抗体またはそのフラグメント（５０ｍ ｇ）、乳糖（１００ｍｇ）、タルク（３２ｍｇ）およびステアリン酸マグネシウ ム（８ｍｇ）を充填することにより調製する。注射可能な非経口組成物 注射により投与するのに適した形態の本発明の医薬組成物は、本発明の抗体ま たはそのフラグメント（１.５重量％）を１０容量％のプロピレングリコールお よび水の中で撹拌することにより調製する。この溶液を濾過滅菌する。軟膏組成物 本発明の抗体またはそのフラグメントを１.０ｇ 白色軟パラフィンを１００.０ｇまで。 本発明の抗体またはそのフラグメントを少量のビヒクル中に分散させて滑らか な均一な生成物を得る。ついで、この分散液を折り畳み式金属チューブに充填す る。局所クリーム組成物 本発明の抗体またはそのフラグメントを１.０ｇ ポラワックスＧＰ２００を２０.０ｇ 無水ラノリンを２.０ｇ 白色蜜蝋を２.５ｇ ヒドロキシ安息香酸メチルを０.１ｇ 蒸留水を１００.０ｇまで。 ポラワックス、蜜蝋およびラノリンをいっしょに６０℃で加熱する。ヒドロキ シ安息香酸メチルの溶液を加え、高速で撹拌して均一な溶液とする。ついで、温 度を５０℃まで下げる。ついで、本発明の抗体またはそのフラグメントを加え、 充分に分散させ、ゆっくりとした速度で撹拌して組成物を冷却する。局所ローション組成物 本発明の抗体またはそのフラグメントを１.０ｇ ソルビタンモノラウレートを０.６ｇ ポリソルベート２０を０.６ｇ セトステアリルアルコールを１.２ｇ グリセリンを６.０ｇ ヒドロキシ安息香酸メチルを０.２ｇ 精製水Ｂ.Ｐ.を１００−００ｍｌ（Ｂ.Ｐ.＝英国薬局方）。 ヒドロキシ安息香酸メチルおよびグリセリンを７５℃の水（７０ｍｌ）中に溶 解する。ソルビタンモノラウレート、ポリソルベート２０およびセトステアリル アルコールをいっしょに７５℃で溶融し、上記水溶液に加える。得られた乳濁液吸入投与のための組成物 １５−２０ｍｌ容のエアロゾル容器用： 本発明の抗体またはそのフラグメント（１０ｍｇ）をエタノール（６〜８ｍｌ ）中に溶解し、ポリソルベート８５またはオレイン酸などの滑沢剤（０.１−０. ２％）を加え、このものをフレオン（好ましくは（１,２ジクロロテトラフルオ ロエタン）とジフルオロクロロメタンとの組み合わせ）などのプロペラント中に 分散し、鼻内かまたは経口吸入投与に適合させた適当なエアロゾル容器中に入れ る。 本発明の抗体および医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下、筋肉内または 静脈内投与に特に有用である。非経口投与用の組成物は一般に、許容しうる担体 、好ましくは水性担体中に溶解した本発明の抗体またはそのフラグメントまたは その組み合わせの溶液を含むであろう。種々の水性担体、たとえば、水、緩衝水 溶液、０.４％食塩水、０.３％グリシンなどを用いることができる。これらの溶 液は滅菌してあり、一般に粒状物質を含まない。これら溶液は、通常のよく知ら れた滅菌法により滅菌することができる。本発明の組成物は、ｐＨ調節剤や緩衝 剤など、適当な生理条件に必要とされる薬理学的に許容可能な補助物質を含んで いてよい。かかる医薬組成物中の本発明の抗体またはフラグメントの濃度は広範 囲に変わりうる、すなわち約０.５重量％未満、通常少なくとも約１重量％から １５または２０重量％までであってよく、選択した特定の投与方法に従って主と して流体容量、粘度などに基づいて選択されるであろう。 それゆえ、本発明の筋肉内投与用医薬組成物は、１ｍｌの滅菌緩衝水溶液およ び５０ｍｇの本発明の抗体またはそのフラグメントを含むように調製できる。同 様に、本発明の静脈内投与用医薬組成物は、２５０ｍｌまでの滅菌リンゲル溶液 および１５０ｍｇの本発明の抗体またはそのフラグメントを含むように調製でき る。非経口投与可能な組成物の実際の調製法は当業者によく知られているかまた は当業者には明らかであり、たとえば、レミントンズ・ファーマシューティカル ・サイエンス（Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓcience）、第１５版、マック ・パブリシング・カンパニー（Ｍack Ｐublishing Ｃompany）、イーストン、ペ ンシルベニア（参照のため本明細書中に引用する）に一層詳細に記載されている 。 本発明の抗体（またはそのフラグメント）は貯蔵のために凍結乾燥し、使用前 に適当な担体中で再構成することができる。この技術は通常の免疫グロブリンに おいて有効であることが示されており、技術分野で公知の凍結乾燥および再構成 法を用いることができる。 本発明の医薬組成物は、意図する結果に依存して予防および／または治療のた めに投与することができる。治療の目的で適用する場合には、すでに疾患を患っ ている患者に該疾患およびその合併症を治癒もしくは少なくとも部分的に寛解さ せるに充分な量の組成物を投与する。予防の目的で適用する場合には、未だ疾患 状態にない患者に本発明の抗体またはその混合物を含む組成物を投与して患者の 耐性を高める。 本発明の医薬組成物の単回投与または多回投与を、治療にあたった医師により 選択された投与量レベルおよびパターンにて行うことができる。いずれの場合に おいても、本発明の医薬組成物は患者を有効に治療するのに充分な所定量の本発 明の改変抗体（またはそのフラグメント）を提供できなくてはならない。 本発明の抗体はまた、該抗体と同じ療法において有用なペプチド性かまたは非 ペプチド性の化合物（模倣物）の設計および合成に用いることができる［たとえ ば、サラゴビ（Ｓaragovi）ら、Ｓcience、２５３、７９２〜７９５（１９９１ ）を参照］。 本発明をさらに説明するため、下記実施例を記載する。これら実施例は本発明 を限定することを意図するものではない。 実施例１ 繊維状ファージの表面上に提示された組換え免疫グロブリンライブラリーは、 マッカファーティー（ＭcＣafferty）ら、Ｎature、３４８：５５２〜５５４、 １９９０およびバーバス（Ｂarbas）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８８ ：７９７８〜７９８２、１９９１に最初に記載された。この技術を用い、高親和 性抗体を免疫ヒト組換えライブラリーから単離した［バーバスら、Ｐroc.Ｎatl. Ａcad.Ｓci .ＵＳＡ ５８９：１０１６４〜１０１６８、１９９２］。本発明で使 用したファージ提示の概念はバーバス（１９９１、上掲）によって記載されたも のと実 質的に同じであるが、組換えの可能性を低減し安定性を改善するため、サルライ ブラリーの独特のベクターを代用することにより該技術を修飾した。このベクタ ー、ｐＭＳ（図１）は、ポリシストロン性の重鎖および軽鎖サルＤＮＡの効率的 な転写および翻訳のための単一のｌａｃプロモーター／オペレーターを含む。こ のベクターは、２つの異なるリーダー配列、すなわち、軽鎖のためのｏｍｐＡ［ モッバ（Ｍovva）ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２５５：２７〜２９（１９８０）］お よび重鎖ＦｄのためのｐｅｌＢ［レイ（Ｌei）ら、Ｊ.Ｂact.、４３７９〜１０ ９：４３８３（１９８７）］を含む。両リーダー配列は、重鎖および軽鎖クロー ニング生成物の細胞周辺腔への分泌を指令する疎水性のシグナルペプチドに翻訳 される。ペリプラスムの酸化的環境中では、これら２つの鎖は折り畳まれ、ジス ルフィド結合を生成して安定なＦａｂフラグメントを形成する。本発明者らは、 このベクターの骨格をファージミドであるbluescript（ストラタジーン、ラジョ ラ、カリフォルニア）から得た。それは、ｐＭＳ ＤＮＡを含む細菌にアンピシ リン（カルベニシリン）耐性を付与する酵素β−ラクタマーゼの遺伝子を含む。 本発明者らはまた、マルチコピープラスミドＣｏｌＥ１の複製起点および繊維状 バクテリオファージｆ１の複製起点をbluescriptから得た。ファージｆ１の複製 起点（いわゆる遺伝子内領域）は、一本鎖ｐＭＳ ＤＮＡの合成の開始、カプシ ド形成の開始およびウイルス酵素によるＲＮＡ合成の終止を指令する。ｐＭＳ ＤＮＡ鎖の複製およびファージ粒子への組み立てには、ヘルパーファージによっ て提供されなければならないウイルスタンパク質を必要とする。本発明者らはヘ ルパーファージＶＣＳＭ１３を用いたが、これはカナマイシン耐性をコードする 遺伝子をも含んでいるため特にこの目的に適している。ＶＣＳＭ１３およびｐＭ Ｓが感染した細菌は、増殖培地にカナマイシンおよびカルベニシリンの両者を加 えることにより選択できる。これら細菌は、最終的にｐＭＳゲノムかまたはＶＣ ＳＭ１３ゲノムのいずれかを含有する繊維状ファージ粒子を生成するであろう。 ヘルパーファージのパッケージングはｐＭＳのパッケージングに比べて効率が悪 く、その結果、組換えｐＭＳファージを優勢に含む混合ファージ集団が得られる 。このファージの両末端は各末端に特異的なマイナーコートタンパク質を拾い上 げる（pick up）。 本発明において特に興味深いのは、該ファージの一端に５コピーのうち３コピー 中に存在する遺伝子III生成物である。この遺伝子III生成物は４０６アミノ酸残 基からなり、Ｆ線毛を介した大腸菌のファージ感染に必要である。重鎖の最初の ２つのドメイン、すなわち可変ドメインおよびＣＨ１ドメインは遺伝子IIIタン パク質のカルボキシ末端半分に融合している。この組換え線毛タンパク質（ｐｅ ｌＢリーダーにより指令される）はペリプラスムに分泌され、そこで蓄積し、フ ァージのコート中に組み込まれる前に軽鎖とジスルフィド結合を生成する。また 、他のベクターは遺伝子IIIの下流に組み込んだＦＬＡＧ配列を含む。このＦＬ ＡＧは、Ｆｄタンパク質のカルボキシ末端にて発現される８アミノ酸ペプチドで ある。本発明者らは、ファージＦａｂの精製およびＥＬＩＳＡによる検出の両目 的のために市販のモノクローナル抗ＦＬＡＧ Ｍ２を用いている［ブリザード（ Ｂrizzard）、Ｂio Ｔechnology、１６（４）：７３０−７３１（１９９４）］ 。 ベクターｐＭＳを構築した後、本発明者らは該ベクターがファージ結合Ｆａｂ を産生する能力について対照の抗体遺伝子を用いて試験した。本発明者らは抗破 傷風毒素抗体（カルロス・バーバス（Ｃarlos Ｂarbas）博士より入手）をｐＭ Ｓ中にクローニングし、ＸＬＩ−blueを形質転換した。本発明者らはＶＣＳＭ１ ３および得られた抗破傷風毒素抗体を提示するファージで本発明者らの細胞を同 時感染させた。本発明者らは効率実験を行い、その際、抗破傷風毒素ファージを 関連のない抗体を結合した（beading）ファージと１：１００,０００にて組み合 わせた。本発明者らは、混合ファージ（５０μｌ）を抗原（破傷風毒素）コーテ ィングポリスチレンウエルに適用することにより３回のえり分けを行った。接着 しなかったファージは洗い落とし、接着したファージは酸で溶出した。溶出した ファージを用いてＸＬ１−Ｂlue細菌の新たなアリコートを感染させ、ヘルパー ファージを加えた。一夜増幅させた後、ファージを調製し、抗原をコーティング したプレート上で再びえり分けた。３回のえり分けの後、本発明者らは抗破傷風 毒素ファージに首尾よく富むことを示すことができた。この技術が首尾よくいく かどうかはまた、最終のえり分け生成物の特徴付けのために可溶性のＦａｂを調 製する能力にも依存する。このことは、制限酵素ＮｈｅＩを用いてｐＭＳ ＤＮ Ａか ら遺伝子IIIを切り出し、ついで再ライゲートすることにより行った。遺伝子III を切り出した後はＦａｂはもはやファージ表面上には提示されず、細胞周辺腔中 に蓄積した。可溶性のＦａｂを発現する細菌から溶解液を調製し、ＥＬＩＳＡを 用いて抗原特異性を試験した。高レベルの可溶性Ｆａｂが検出された。 ファージ提示法をマカークザルライブラリーに使用するため、本発明者らはサ ル免疫グロブリン遺伝子のＰＣＲ増幅のために特別のプライマーを開発した。こ れらプライマーは、霊長類化（PRIMATIZED^TM）抗体法（米国特許出願第０８／３ ７９,０７２号を参照；参照のため本明細書中に引用する）を開発する際に本発 明者らが得たマカークザル配列およびヒト配列を含むデータベース（カバット（ Ｋabat）ら（１９９１）、「免疫学的に興味のあるタンパク質の配列」、 Ｕ.Ｓ.Ｄept. of Ｈealth and Ｈuman Ｓervices、Ｎational Ｉnstitute of Ｈ ealth）に基づいていた。 本発明者らは、マカークザルの範囲（repertoire）の増幅をカバーするために ３セットのプライマーを開発した。本発明者らの第一のプライマーのセットは、 重鎖のＶＨおよびＣＨ１（Ｆｄ）ドメインの増幅のために設計したものであった 。それは、３'ＣＨ１ドメインプライマーおよびフレームワーク１領域に結合す る６つの５'ＶＨファミリー特異的プライマーからなっていた。本発明者らの第 二のプライマーのセットは全ラムダ鎖を増幅するためのものであり、多くのラム ダ鎖サブグループをカバーしている。それは、３'プライマーおよびＶＬフレー ムワーク１領域に結合する３つの５'縮重プライマーからなっている。本発明者 らの第三のプライマーのセットは、カッパ鎖サブグループの増幅のために設計し たものであった。それは、３'プライマーおよび５つのＶＫフレームワーク１プ ライマーからなる。これら各セットのプライマーを用い、ライブラリーのクロー ニングに利用するのに充分な物質を利用できるように各プライマーセットから充 分に強いシグナルを得るべくＰＣＲパラメータを最適化した。本発明者らは最近 、これら最適化ＰＣＲ条件を用いて本発明者らのｐＭＳベクターにおいてマカー クザル組み合わせ（combinatorial）ライブラリーを作成した。免疫グロブリン ＲＮＡの採取源として骨髄生検をＣＤ４免疫サルから採取した。これらライブラ リーは 約１０⁶の成員を含んでおり、目下、抗原コーティングウエル上で特異的結合に ついてえり分けている。 実施例２ Ｂ７／ＣＴＬＡ−４試薬の開発 本発明者らは、サルの免疫、インビトロでの結合および機能アッセイの開発、 ヘテロハイブリドーマのスクリーニングおよびファージライブラリーのえり分け の目的のために多くの試薬を作成した。表１には各試薬とその意図する目的を掲 げてある。Ｂ７.１の場合には、ＲＮＡをＳＢ細胞から抽出し、逆転写酵素を用 いてｃＤＮＡに変換した。第一鎖のｃＤＮＡをＢ７.１特異的プライマーを用い てＰＣＲ増幅し、ＩＤＥＣのＮＥＯＳＰＬＡ哺乳動物発現ベクター中にクローニ ングした。このＢ７.１ ＮＥＯＳＰＬＡ ＤＮＡでＣＨＯ細胞をトランスフェク ションし、膜結合Ｂ７.１を発現するクローンを同定した。Ｂ７.１融合タンパク 質も同様にして生成したが、ヒトＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン遺伝子を含 むＮＥＯＳＰＬＡカセットベクター中にＰＣＲ増幅Ｂ７.１遺伝子をクローニン グした。このＢ７.１／Ｉｇ ＮＥＯＳＰＬＡ ＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換し 、Ｂ７.１／Ｉｇ融合タンパク質を分泌する安定なクローンを増幅した。一般に 、Ｂ７.２およびＣＴＬＡ−４試薬も同様にして生成したが、Ｂ７.２ではＲＮＡ を抗ＩｇおよびＩＬ−４で２４時間刺激したヒト脾臓細胞から単離し、ＣＴＬＡ ４構築物については遺伝子の採取源はＰＨＡ活性化したヒトＴ細胞であった。 これら試薬が、Ｂ７.１に対するモノクローナル抗体（Ｌ３０７４）［ベクト ン・ディッキンソン（Ｂecton Ｄickinson）、１９９４］、Ｂ７.２に対するモ ノクローナル抗体（Ｆｕｎ−１）［エンジェル（Ｅngel）ら、Ｂlood、８４、１ ４０２〜１４０７（１９９４）］およびサルＦａｂフラグメントを検出すべく特 別に開発した精製ヤギおよびウサギ血清とともに利用できることは、所望の特性 を有する抗体の同定を容易にする。 実施例３ カニクイザルにおける可溶性および細胞結合ヒトＢ７.１に対する免疫応答の研 究 ヒトＢ７.１抗原に対するサル抗体の産生の実行可能性を評価するため、本発 明者らは、まずＬ３０７.４−セファロースアフィニティーカラムを用いたアフ ィニティークロマトグラフィーによりＣＨＯ細胞培養液から組換えＳＢ７.１を 精製した。ついで、ＳＢ７.１をアジュバントとともに５匹の成熟カニクイザル に注射した。ブースター免疫の３〜４カ月後、ＳＢ７.１またはヒトＳＢ細胞で 免疫したサルからの血清について抗原結合を試験した。 ＳＢ７.１で免疫した５匹のサルおよびＢ７.１陽性ヒトＳＢ細胞で免疫したさ らに３匹の動物からの血清試料について、トランスフェクションしたＣＨＯ細胞 中で発現された膜結合Ｂ７.１に対する抗体力価を試験した。図３にまとめて示 した結果は、アフィニティー精製したＳＢ７.１で免疫した５匹のサルのうち４ 匹が１：５０００を越える抗体力価を産生することを示した。細胞結合したＢ７ .１を含むＳＢ細胞で免疫した３匹のサルは、１：１４００から１：２８００の 範囲のより低い抗体力価を発現した。 実施例４ 本発明者らは、ＳＢ７.１−セファロースを用いて８匹の免疫したすべてのサ ルから抗体を精製し、ついで（１）ＥＬＩＳＡにおけるＳＢ７.１コーティング プレート；（２）抗原陽性Ｂ細胞；および（３）Ｂ７.１ＣＨＯトランスフェク トーマへ結合する能力について試験した。さらに、これら抗体について、混合リ ンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＩＬ−２産生およびトリチウム化チミジンの取り 込みにより測定されるように、Ｂ細胞相互作用を抑制する能力を評価した。Ｔ細 胞結合実験については、ヒト軟膜末梢血リンパ球をＰＨＡ刺激剤の存在下で３〜 ６日培養した。Ｂ７結合は¹²⁵Ｉ−放射性標識した可溶性Ｂ７.１（ＳＢ７.１） を用いたラジオアッセイにより検出した。 実施例５ サル抗体の放射性標識ＳＢ７への直接結合 ¹²⁵Ｉ放射性標識ＳＢ７.１を、溶液中の４、１および０.２５μｇ／ｍｌの抗 Ｂ７.１抗体への結合について試験した。表２に示す結果は、ＳＢ７.１で免疫し たサルにより産生された抗体のほとんどがアフィニティー精製した¹²⁵Ｉ−ＳＢ ７.１に濃度に依存した仕方で結合しうることを示唆している。標識ＳＢ７.１へ の結合の特異性を評価するため、２匹の動物からの抗体を用いて非標識ＳＢ７. １競合実験を行った。サル１１３３および１１４４からのアフィニティー精製抗 体を４００ｎｇ／ウエルにてマイクロウエルプレート上にコーティングした。ア フィニティー精製した非標識ＳＢ７.１（５００および１０００ｎｇ／ウエル） を競合物として用いた。図４に示す結果は、ＳＢ７.１調製物が¹²⁵Ｉ−ＳＢ７. １の抗体への結合を抑制するのに有効であることを示した。 データは２回行ったアッセイの平均値であり，結合したＳＢ７−Ｉ¹²⁵のｃｐｍ を表す。 実施例６ 放射性標識したアフィニティー精製サル抗体のＢ７⁺細胞への直接結合およびＳ Ｂ７.１による抑制 サルＰＲＩ１３５からのアフィニティー精製した放射性標識サル抗Ｂ７.１抗 体を、Ｂ７陽性ヒトＳＢ細胞への直接結合について放射性標識したＬ３０７.４ ＭＡｂと比較した。特異性の対照として非標識ＳＢ７.１（０.００２−２０μｇ ／ｍｉ）を加えて両放射性標識抗体と競合させた。本発明者らは、サル抗体が細 胞に結合したＢ７.１に結合することができ、図５に示すようにＳＢ７.１によっ て抑制されることを示した。ＳＢ７.１で９０％もの高さの抑制が観察された。 実施例７ 放射性標識Ｂ７−Ｉｇ融合タンパク質の活性化Ｔ細胞への直接結合およびアフィ ニティー精製したサル抗体による抑制 ヒト末梢血Ｔリンパ球を３〜６日間活性化し、¹²⁵Ｉ−Ｂ７.１−Ｉｇの直接結 合について試験した。活性化したヒトＴ細胞上にはＦｃ受容体がアップレギュレ ーションされているため、細胞にＢ７.１−Ｉｇを加える前に、細胞を熱凝集し た前免疫（pre−immune）免疫グロブリンとともに前インキュベートしてＦｃ結 合部位をブロックする必要があった。ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞を用いた バックグラウンド対照を含めることにより、バックグラウンド結合の補正をした 。図６は、活性化Ｔ細胞への¹²⁵Ｉ−Ｂ７.１−Ｉｇ融合タンパク質結合の抑制が ２００〜８μｇ／ｍｌの濃度のアフィニティー精製したサル抗体で達成されるこ とを示している。対照として用いた非標識ＳＢ７.１およびＬ３０７.４ＭＡｂも またＢ７.１−Ｉｇ融合タンパク質の細胞への結合を抑制するのに有効であった 。 実施例８ サル抗Ｂ７抗体による混合リンパ球反応におけるＩＬ−２産生の抑制 ＣＤ２８／Ｂ７相互作用の阻止はＴリンパ球によるＩＬ−２産生の抑制へと導 く。図７に示す実験において、ＳＢ７.１で免疫した２匹のサル（サル１１３７ および１１３５）およびＢ７陽性ＳＢ細胞で免疫した１匹のサル（サル１１４６ ）からのアフィニティー精製したサル抗体を、ＩＬ−２産生の抑制によって測定 さ れるように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるヒトＴ細胞活性化を抑制する 能力について評価した。この実験の結果は、サル１１４６および１１３７からの アフィニティー精製抗Ｂ７.１抗体が５０μｇ／ｍｌの濃度で添加したときにＩ Ｌ−２産生を抑制することを示している。サル１１３５抗体に関しては、材料欠 如のために２つの最も高い濃度では評価することができなかったが、それでも一 層低濃度で有意の抑制を示した。マウスＭＡｂ Ｌ３０７.４は１０μｇ／ｍｌの 濃度で抑制した。これら濃度で試験した他のサル血清は陰性であった（データは 示していない）。これら結果は、可溶性および膜結合の両形態のＢ７抗原で免疫 したサルの少なくとも３匹が、免疫抑制能を有するＢ７阻止抗体を産生すること を示している。 実施例９ Ｂ７.１免疫したサル血清のＢ７.２抗原への交差反応性の研究 Ｂ７.１に対して産生された抗体を、Ｂ７.２に対する交差反応性について試験 する。Ｂ７.１免疫血清からのＢ７.１アフィニティー精製抗体を用いた予備的な 結果は、Ｂ７.２でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞への結合の示唆的な証 拠を提供した（示していない）。これらデータは、可溶性のＢ７.２Ｉｇ試薬を 用いて確認しなければならない。本発明者らは、まず、Ｂ７.１免疫した動物か らＢ７.１Ｉｇ−セファロース上のアフィニティークロマトグラフィーによりさ らにサル抗体を精製するであろう。ついで、本発明者らは、ＣＨＯ細胞からＢ７ .２Ｉｇを充分な量で産生および精製してＢ７.２Ｉｇ−セファロースアフィニテ ィーカラムを調製するであろう。本発明者らは、Ｂ７.１特異的な抗体の集団か ら、Ｂ７.２Ｉｇ−セファロースカラムへの結合によりＢ７.２と交差反応する抗 体を選択するであろう。すべての交差反応抗体は、Ｂ７.１トランスフェクショ ンＣＨＯ細胞およびＢ７.２トランスフェクションＣＨＯ細胞の両者への直接結 合およびＢ７.１ＩｇによるＢ７.２トランスフェクション細胞への結合の抑制に より、さらに特徴付けられるであろう。 実施例１０ ファージ提示ライブラリーの作成 組換えファージ提示ライブラリーをＢ７.１およびＢ７.２免疫サルから作成す る。免疫の７〜１２日後にリンパ節および骨髄生検を採取し、ＲＮＡに富むＢ細 胞および形質細胞を回収する。チョンチンスキー（Ｃhomczynski）により記載さ れた方法［Ａnal.Ｂiochem.、１６２（１）、１５６〜１５９（１９８７）］を 用い、リンパ球からＲＮＡを単離する。オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素 を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。第一鎖ｃＤＮＡをアリコートに分け、以 前に記載されたカッパ、ラムダ、および重鎖Ｆｄ領域のプライマーセット並びに Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン、サンジエゴ）かまたはＴａｑポリメラー ゼ（プロメガ、マジソン）のいずれかを用い、ＰＣＲ増幅する。重鎖ＰＣＲ増幅 生成物をプールし、Ｘｈｏ ＶＳｐｅＩ制限酵素で切断し、ベクターｐＭＳ中に クローニングする。その後、軽鎖ＰＣＲ生成物をクローニングし、ＳａｃＩ／Ｘ ｂａＩ制限酵素で切断し、クローニングして組換えライブラリーを作成する。Ｘ ＬＩ−Ｂlue大腸菌を該ライブラリーＤＮＡで形質転換し、ＶＣＳＭ１３で重感 染させて抗体を提示するファージを生成させる。このライブラリーを、Ｂ７.１ 抗原またはＢ７.２抗原をコーティングしたポリスチレンウエル上で４回えり分 ける。各回のえり分けからの個々のファージクローンを分析する。ｐＭＳベクタ ーＤＮＡを単離し、遺伝子IIIを切り出す。可溶性のＦａｂフラグメントが生成 し、Ｂ７.１およびＢ７.２への結合についてＥＬＩＳＡで試験する。 実施例１１ ファージＦａｂフラグメントの特徴付け サルファージＦａｂフラグメントを、その特異性、およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇ またはＣＴＬＡ−４トランスフェクション細胞へのＢ７.１−ＩｇおよびＢ７.２ −Ｉｇ結合を阻止する能力について特徴付ける。ファージフラグメントはまた、 高親和性のフラグメントを選択するため、免疫に使用したＢ７種上で４回行った 最初のえり分け後の交差反応性について特徴付けを行う。Ｂ７.１抗原またはＢ ７.２抗原のいずれかをコーティングした表面上で４回えり分けたものから同 定したＦａｂフラグメントを、大腸菌の２４時間発酵培養液中での感染および増 殖によりスケールアップする。フラグメントを、抗ＦＬＡＧアフィニティーカラ ムへのコダックＦＬＡＧ結合により精製する。精製したファージＦａｂを、西洋 ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗サルＦａｂ抗体または抗Ｆ ＬＡＧ ＭＡｂを用いたＥＬＩＳＡベースの直接結合改変スキャッチャード分析 ［カトー（Ｋatoh）ら、Ｊ.Ｃhem.ＢioＥng.、７６：４５１〜４５４（１９９３ ）］により親和性を試験する。抗サルＦａｂ試薬は、ヒト重鎖定常領域Ｉｇに対 して吸着され、Ｂ７−Ｉｇへの交差反応性は除かれるであろう。Ｂ７.１−Ｉｇ またはＢ７.２−Ｉｇをコーティングしたプレートへの直接結合の測定の後、各 フラグメントについてＫｄ値を計算する。 実施例１２ ファージＦａｂフラグメントによるＣＴＬＡ−４／Ｂ７結合の阻止 最も低い濃度でＢ７−Ｉｇの結合を最も有効に阻止するＦａｂフラグメントを 先導候補として選択する。選択は、ＣＴＬＡ−４−ＩｇまたはＣＴＬＡ−４トラ ンスフェクション細胞への¹²⁵Ｉ−Ｂ７−Ｉｇ結合を競合し尽くすことにより行 う。他の選択基準には、応答細胞での３Ｈ−チミジンの取り込みの抑制［アズマ ら、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１７７：８４５〜８５０；アズマら、Ｎature、３０１：７ ６〜７９（１９９３）］およびＩＬ−２アッセイキットを用いたＩＬ−２産生の 直接分析により測定されるように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻止が含まれ る。ＭＬＲの抑制およびＣＴＬＡ−４結合アッセイにおいて最も有効な３または ４の候補が、ＣＨＯ細胞へのトランスフェクションおよびキメラサル／ヒト抗体 の発現のための上記哺乳動物発現ベクター中へクローニングするために選択され る。 実施例１３ サルヘテロハイブリドーマの生成 モノクローナル抗体を分泌するサルヘテロハイブリドーマを、その血清がＢ７ .１および／またはＢ７.２に対して陽性と試験された生存（existing）免疫動物 から作成する。いずれかまたは両方の抗原に対して陽性の動物からリンパ節生検 を採取する。ハイブリドーマの産生方法は、サル抗ＣＤ４抗体の作成に使用する 確立さ れた方法［ニューマン、１９９２（上掲）］と同様である。高い血清力価を有す るサルは、鼠蹊部のリンパ節の切片を麻酔下で取り除かれるであろう。組織から のリンパ球を洗浄し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてＫＨ６／Ｂ５ ヘテロハイブリドーマ細胞［キャロル（Ｃarrol）ら、Ｊ.Ｉmmunol.Ｍeth.、８ ９：６１〜７２（１９８６）］と融合させる。ハイブリドーマをＨ.Ａ.Ｔ.培地 上で選択し、９６ウエルプレート中で繰り返しサブクローニングすることにより 安定化させる。 Ｂ７.１抗原に特異的なサルモノクローナル抗体をＢ７.２への交差反応性につ いてスクリーニングする。サル抗Ｂ７抗体は、¹²⁵Ｉ−Ｂ７−Ｉｇ結合アッセイ を用いてＢ７／ＣＴＬＡ−４結合の阻止について特徴付けられるであろう。３Ｈ −チミジンの取り込みおよびＩＬ−２産生の直接測定によるＭＬＲの抑制を用い 、３つの候補を選択する。２つの候補はフェーズII試験に持ち込まれ、すべての 機能的研究を繰り返しながらＣＨＯ細胞中に発現されるであろう。インビボ薬理 学のための動物モデルを開発する目的のため、抗Ｂ７抗体が幾つかの動物種の細 胞上で試験されるであろう。動物モデルの確立は、選択した臨床適応のために前 臨床研究を行うことを可能にするであろう。 実施例１４ 上記のように上記ヘテロハイブリドーマ法を用いて４つの先導サル抗Ｂ７.１ 抗体：１６Ｃ１０、７Ｂ６、７Ｃ１０および２０Ｃ９が同定された。これら抗体 は以下のように特徴付けられた： これらサル抗体がＣＴＬＡ４−Ｉｇ間の物理的相互作用を阻止する能力を示す ため、種々の濃度のサル抗Ｂ７.１抗体および非標識ＣＴＬＡ４−Ｉｇを放射性 標識したＣＴＬＡ４−Ｉｇ^I125とともにインキュベートした。抑制アッセイの結 果は、サル抗体のＩＣ５０（５０％抑制となるインヒビターの濃度）が以下のと おりであることを示した： ａ：７Ｃ１０： ０.３９μｇ／Ｍ１ ｂ：１６Ｃ１０： １.６０μｇ／Ｍ１ ｃ：２０Ｃ９： ３.９０μｇ／Ｍ１ ｄ：７Ｂ６： ３９.０μｇ／Ｍ１ スキャッチャード分析は、Ｂ７−Ｉｇコーティングプレートへのサル抗体の結 合の見かけの親和定数（Ｋｄ）がおよそ以下のとおりであることを示した： ａ：７Ｃ１０： ６.２×１０^-9Ｍ ｂ：１６Ｃ１０： ８.１×１０^-9Ｍ ｃ：７Ｂ６： １０.７×１０^-9Ｍ ｄ：２０Ｃ９： １６.８×１０^-9Ｍ 抗体を混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲ）においてインビトロで試験した。 ＭＬＲは、４つのすべての抗Ｂ７.１抗体が異なる程度にＩＬ−２産生を抑制す ることを示した： ａ：７Ｂ６： ５.０μｇ／Ｍ ｂ：１６Ｃ１０： ０.１μｇ／Ｍ ｃ：２０Ｃ９： ２.０μｇ／Ｍ ｄ：７Ｃ１０： ５.０μｇ／Ｍ サル抗Ｂ７.１抗体を、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）上のＢ７に結合する能 力について試験した。ＦＡＣＳ分析は、４つのすべてのサル抗体が陽性であるこ とを示した。 サル抗体１６Ｃ１０、７Ｂ６、７Ｃ１０および２０Ｃ９をＦＡＣＳ分析により Ｃ１ｑ結合について試験した。その結果は、７Ｃ１０サルＩｇがＢ７.１ ＣＨＯ トランスフェクション細胞とともにインキュベートした後に強いヒトＣ１ｑ結合 を有することを示した。１６Ｃ１０は、２９Ｃ９および７Ｂ６サル抗体が陰性で あったように陰性であった。 実施例１５ 本明細書中に参照のために引用した米国特許出願第０８／３７９,０７２号の 霊長類化抗体法を用い、および図２に示すＮＥＯＳＰＬＡベクター系を用い、７ Ｃ１０、７Ｂ６および１６Ｃ１０の重鎖および軽鎖可変ドメンをクローニングし 、その霊長類化形態をＮＥＯＳＰＬＡベクター系を用いてＣＨＯ細胞中で合成し た。霊長類化７Ｃ１０の軽鎖および重鎖、７Ｂ６の軽鎖および重鎖、および１６ Ｃ１０の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列および核酸配列を、それぞれ、図８ａ、 図８ｂ、図９ ａ、図９ｂ、図１０ａおよび図１０ｂに示す。 これら霊長類化抗体は、おそらく低い抗原性およびヒトエフェクター機能のた めに治療剤として極めて適しているであろうことが期待される。実際、最近にな って霊長類化１６Ｃ１０はヒトＣ１₉結合を示すことが明らかにされたが、１６ Ｃ１０は結合を示さない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハンナ，ナビル アメリカ合衆国92024カリフォルニア州 オリブンヘイン、フォートゥナ・ランチ・ ロード 3255番 (72)発明者 シーズトースキー，ウィリアム・エス アメリカ合衆国92109カリフォルニア州 サンディエゴ、トーマス・アベニュー1155 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＢ７.１抗原および／またはヒトＢ７.２抗原に特異的に結合するサル モノクローナル抗体またはその霊長類化形態。 ２．１６Ｃ１０、７Ｃ１０、２０Ｃ９および７Ｂ６よりなる群から選ばれたも のである、請求項１に記載の抗体。 ３．枯渇抗体である請求項１に記載の抗体。 ４．非枯渇抗体である請求項１に記載の抗体。 ５．ヒトＢ７.１抗原に特異的に結合し、１６Ｃ１０、７Ｃ１０、２０Ｃ９お よび７Ｂ６よりなる群から選ばれた抗体の可変重鎖および軽鎖ドメインを含む、 請求項１に記載の霊長類化抗体。 ６．７Ｃ１０に由来し、図８ａおよび図８ｂに示すアミノ酸配列を有する、請 求項５に記載の霊長類化抗体。 ７．図８ａおよび図８ｂに示す核酸配列によりコードされる、請求項６に記載 の霊長類化抗体。 ８．７Ｂ６に由来し、図９ａおよび図９ｂに示すアミノ酸配列を有する、請求 項５に記載の霊長類化抗体。 ９．図９ａおよび図９ｂに示す核酸配列によりコードされる、請求項６に記載 の霊長類化抗体。 １０．１６Ｃ１０に由来し、図４ａおよび図４ｂに示すアミノ酸配列を有する 、請求項５に記載の霊長類化抗体。 １１．図１０ａおよび図１０ｂに示す核酸配列によりコードされる、請求項５ に記載の霊長類化抗体。 １２．ヒトＢ７.１抗原および／またはヒトＢ７.２抗原に特異的に結合する霊 長類化抗体を発現するトランスフェクトーマ。 １３．ＣＨＯ細胞である請求項１２に記載のトランスフェクトーマ。 １４．図８ａ、図８ｂ、図９ａ、図９ｂ、図１０ａおよび図１０ｂのいずれか に記載のアミノ酸配列を有する霊長類化抗体を発現する、請求項１３に記載のト ランスフェクトーマ。 １５．請求項１から１１のいずれか一つに記載の抗体を含み、Ｂ７−ＣＤ２８ 結合の抑制により治療可能な疾患の治療に適した医薬組成物。 １６．請求項１から１１のいずれか一つに記載の少なくとも１の抗体の治療学 的有効量を投与することを含む、Ｂ７：ＣＤ２８経路の抑制による疾患の治療方 法。 １７．該抗体が１６Ｃ１０、７Ｃ１０、２０Ｃ９、７Ｂ６またはそれらの霊長 類化形態である、請求項１６に記載の方法。 １８．該疾患が自己免疫疾患である、請求項１６に記載の方法。 １９．該疾患が、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、１型 糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬および多発性硬化症よりなる群から選ばれたも のである、請求項１６に記載の方法。 ２０．該疾患が移植片対宿主病である、請求項１６に記載の方法。