CZ293456B6 - Způsob výroby suchýchŹ částečně amorfních produktůŹ směsi substancí získané tímto způsobemŹ jejich použití a diagnostické prostředky a terapeutické přípravky obsahující tyto směsi - Google Patents

Abstract

Předložené řešení se týká způsobu výroby suchýchŹ částečně amorfních produktůŹ obsahujících biologickýŹ zejména terapeuticky aktivní materiálŹ které představují makroskopicky homogenní směsi substancíŹ přičemž tyto směsi substancí jsou zvoleny takŹ že obsahují alespoň po jedné substanci ze skupiny }iB sacharid nebo amfoterní iont s polárním zbytkem a jejich deriváty a }iiB amfoterní iont s nepolárním zbytkem a jeho derivátyŹ přičemž se vyrobí roztok biologického nebo terapeuticky aktivního materiálu a substancí }iB a }iiB a tento roztok se při teplotě produktu vyšší než teplota mrazu tohoto roztoku suší@ Dále se řešení týká nových směsí substancíŹ které se získají pomocí uvedeného způsobuŹ jakož i jejich použití při diagnostických a terapeutických metodáchŕ

Description

Způsob výroby suchých, částečně amorfních produktů, směsi substancí získané tímto způsobem, jejich použití a diagnostické prostředky a terapeutické přípravky obsahující tyto směsi

Oblast techniky

Předložený vynález se týká způsobu stabilizace biologických materiálů pomocí sušení bez zmrazování a přípravků k provádění tohoto způsobu. Přitom se cíleně popisují zvolené směsi cukrů a aminokyselin a jejich deriváty, jakož i různých aminokyselin a jejich deriváty, pomocí kterých je možno dosáhnout po výrobě suchých, částečně amorfních produktů pomocí sušení bez zmrazování, obzvláště výhodné stabilizace peptidů, proteinů, glykoproteinů, protilátek a podobných substancí.

Dosavadní stav techniky

Výroba přípravků biologicky aktivních a terapeutických látek, jako jsou peptidy, proteiny, glykoproteiny, nukleotidy, plazmidy, buněčné fragmenty, viry, atd., které jsou stabilní při skladování (zejména při pokojové teplotě), pro diagnostické a terapeutické účely má dnes velký, stále rostoucí význam.

Popsány jsou rozličné formulace a způsoby výroby suchého biologicky nebo terapeuticky aktivního materiálu. Pod suchým materiálem se rozumějí látky a směsi látek, které mají zbytkovou vlhkost nanejvýš 8 % hmotn., přednostně nanejvýš 4 % hmotn., obzvláště přednostně nanejvýš 2 %. Lyofilizační postupy jsou velmi rozšířeny [F. Franks, Cryo Lett. 11, 93 - 110, (1990); M. J. Pikal, Biopharm. 3 (9), 26 - 30 (1990); M. Hora, Pharm. Research 8 (3), 285 - 291 (1992); F. Fransk, Jap. J. Freezing Diying 38, 15 - 16, (1992)], mají však nevýhody. Spotřebují velká množství energie, vyžadují použití částečně škodlivých chladiv (Frigene), trvají dlouhou dobu. Pro velký počet substancí, zejména pro proteiny, je krok zmrazování, nutný pro lyofilizaci, škodlivý, tj. destabilizující. Proto je tento způsob pro mnoho biologických materiálů zcela nepoužitelný.

Alternativami pro lyofilizaci při výrobě suchých proteinových přípravků jsou způsoby, při kteiých se materiál suší pomocí využití tepla nebo vakua [F. Fransk, R. Μ. H. Hatley: Stability and Stabilization of Enzymes; Eds. W. J. J. van den Teel, A. Harder, R. M. Butlaar, Elsevier Sci. Publ. 1993, str. 45 - 54; B. Roser, Biopharm, 4(9), 47 - 53 (1991); J. F. Carpenter, J. H. Crowe, Cryobiol. 25, 459 -470 (1988)]. Zde je možno uvést například vakuové sušení s použitím nebo bez použití zvýšené teploty, sušení rozprašování v nejrůznějších modifikacích včetně kombinovaného využití vakua a techniky rozprašování, jakož i sušení na válcích a jiné způsoby sušení v tenké vrstvě.

V J. F. Carpenter, J. H. Crowe, Biochemistry 28, 3916 - 3922 (1989); K. Tanaka, T. Taluda, K. Miyajima, Chem. Pharm. Bull. 39 (5), 1091 - 94 (1991), DE-C-35 20 228, EP-B-0 229 810, WO 91/18 091, EP-B-0 383 569, US 5 290 765 jsou popsány přípravky, které obsahují cukry nebo cukematé látky. Při výrobě suchých přípravků obsahujících cukry je možno při způsobech popsaných v dosavadním stavu techniky stanovit následující nevýhody, popřípadě problémy: Výroba skutečně dostatečně suchých přípravků obsahujících cukry není možná bez signifikantního energetického nároku. To platí obzvláště pro přípravky v konečném balení. Přitom se počítá s využitím tepla/horka, které se však musí vzhledem ke stabilitě použitých biologických materiálů hodnotit velmi kriticky. Aby se dosáhlo dostatečného vysušení při malém dodávání tepla, je možno alternativně využít drasticky prodloužených dob procesů nebo extrémně tenkých tlouštěk vrstev. Oba postupy však nevedou k cíli. Dlouhé doby procesů jsou ekonomicky velmi nevýhodné, kromě toho je dlouhé setrvání biologické účinné látky v matrici, která jen pomalu ztrácí vodu, destabilizující, a tím rovněž kritické. Sušení tenkých tlouštěk vrstev nevede v mnoha

-1 CZ 293456 B6 případech k ekonomicky významnému výtěžku produktu, tj. za časovou jednotku a/nebo na sušicí plochu se získají jen minimální množství produktu. Kromě toho je zpracování biologických materiálů na velmi velkých otevřených sušicích plochách těžko realizovatelné na častokrát žádoucí sterilitu při farmaceutické a diagnostické aplikaci.

Sušení, která probíhají pomocí vakua při nízké teplotě nebo při teplotě nepatrně zvýšené ve srovnání s pokojovou teplotou, jsou šetrná. Výroba suchých přípravků, obsahujících cukry, stabilních při skladování je však v mnoha případech prakticky stěží proveditelná. Při vysoušení roztoků cukrů vznikají přibývající viskózní, houževnaté látky. Množství zbytkové vody zůstávající v těchto látkách nebo zbytkovou vlhkost nelze odstranit za ekonomicky výhodnou dobu, v mnoha případech se sušení na vysoké úrovni, nevhodné ke stabilizaci, zastavení. Degradace se projevuje například ztrátou aktivity uskladněného materiálu, tvorbou agregačních produktů nebo výskytem produktů degradace s nízkou molekulovou hmotností. Nízký obsah zbytkové vody vhodný ke stabilizaci proteinů atd. je možno rozeznat na základě fyzikálních měřených veličin. Ze shora citované literatury vyplývá, že přípravky vhodné ke stabilizaci proteinů atd. mají vykazovat sklovitou, tj. amorfní strukturu, jejichž teplota skelného přechodu je vyšší než požadovaná teplota uskladnění. Teplota skelného přechodu je teplota, při které amorfní tuhá látka přechází ze sklovitého stavu do houževnatého viskózního stavu a naopak. Přitom se vyskytují prudké změny viskozity a s tím spojené změny koeficientu difúze a kinetické mobility proteinů a jiných molekul. Fyzikální parametry, jako tvrdost a modul, se mění právě tak jako termodynamické stavové veličiny objem, entalpie a entropie. Teplota skelného přechodu například látky obsahující cukry a její obsah zbytkové vody jsou fyzikálně navzájem spojeny tak, že stoupající množství zbytkové vody vedou ke klesajícím teplotám skelného přechodu a naopak. Tím je možno z měření teploty skelného přechodu vyvozovat například pomocí „Differential Scanning Calorimetrie“ (DSC), zda přípravek vykazuje obsah zbytkové vody vhodný ke stabilizaci, popřípadě jak se výše rozvádí, zda je postup sušení úspěšný nebo nikoli. Kromě stanovení teploty skelného přechodu pomocí DSC je možno doložit existenci amorfních struktur také pomocí zkoumání rentgenové difrakce, optických pozorování a pozorování elektronovým mikroskopem.

Žádoucí je proto dát k dispozici stabilizační matrici pro biologicky nebo farmaceuticky aktivní materiály s teplotou skelného přechodu vyšší, než je teplota uskladnění, která obsahuje malou zbytkovou vlhkost, a způsob nepříliš nákladné výroby takových stabilizačních matric.

Podstata vynálezu

Překvapivě se zjistilo, že pomocí přidání amfotemích iontů s nepolárními zbytky k látkám obsahujícím sacharidy lze jejich chování při sušení pozitivně změnit tak, aby předtím špatně schnoucí materiály, které podle toho nevykazovaly žádné dostatečně stabilizující vlastnosti, bylo možno nyní velmi rychle sušit a aby způsobovaly vynikající stabilitu biologicky, zejména terapeuticky aktivních materiálů, v nich obsažených.

Dále se zjistilo, že překvapivě také formulace bez sacharidů sestávající ze směsí určitých amfotemích iontů je možno velmi rychle sušit a že vykazují velmi dobré stabilizující vlastnosti. Přitom se musí použít amfotemího iontu s polárním zbytkem společně s amfotemím iontem s nepolárním zbytkem. Takovými amfotemími ionty jsou přednostně aminokyseliny a jejich deriváty, obzvláště přednostně farmaceuticky snesitelné aminokyseliny. Pod afmotemími ionty se rozumějí nízkomolekulámí sloučeniny, jejichž molekulová hmotnost je menší než 1,67.10^-23 kg, přednostně menší než 8,35.10^-24 kg. Popisují se způsoby, které bez použití zvýšené teploty, tj. při pokojové teplotě umožňují sušit přípravky podle vynálezu tak, aby se pro přípravky ke stabilizaci biologicky aktivních, zejména terapeuticky aktivních substancí dosáhlo vhodných teplot skelného přechodu. Biologicky aktivními substancemi jsou kromě terapeuticky účinných substancí i takové, kterých se používá v biolotechnologických procesech, jako je například fermentace. Rovněž takové substance, kterých se užívá například na ochranu rostlin nebo jako insekticidů. Takovými biologicky, zejména terapeuticky aktivními materiály může být jedna nebo více substancí

-2CZ 293456 B6 zvolených ze souboru zahrnujícího proteiny, peptidy, glykoproteiny, lipoproteiny, enzymy, koenzymy, biologické membrány, protilátky, fragmenty protilátek, buňky, složky buněk, viry, složky virů, vakcíny, DNA, RNA, PNA, plazmidy, vektory, feromony, biologická terapeutika a diagnostika a jejich deriváty. Biologicky aktivními substancemi nejsou míněny žádné potraviny jako takové.

Zvláštní výhody zde popsaných přípravků a způsobů spočívají v tom, že:

- se upouští od zmrazování v průběhu sušení,

- provádění sušení je možné pomocí lyofílizačních zařízení již existujících v chemicko-farmaceutickém průmyslu bez jakéhokoli přestavování,

- plnění, obzvláště výhodné k aseptické výrobě, se může beze změny uchovávat v nádobách obvyklých v obchodě, například ve skleněných lahvičkách,

- provozní doby jsou řádově jako u lyofílizačních postupů a mnohem menší,

- může se použít toxikologicky nezávadných pomocných látek,

- mohou se ušetřit všechna množství energie potřebná ke zmrazování a použití chladiv zhoršujících životní prostředí se může prudce snížit,

- získané produkty představují dobře viditelný, rychle se znovu rozpouštějící „koláč“,

- pomocí rychlého dosažení částečně amorfního stavu biologický materiál méně degraduje než pomocí způsobů popsaných v dosavadním stavu techniky.

Zjistilo se, že zvláštní výhody popsaných receptur z určitých směsí cukrů a aminokyselin, jakož i určitých směsí alespoň 2 aminokyselin působí také, když se použijí v rámci jiných postupů sušení, které se vyhýbají zmrazování. Také při sušení rozprašováním, sušení na válcích atd. se úplně projevuje působení přísad urychlujících sušení, jakož i vlastnost přípravků vytvářet amorfní nebo částečně amorfní systémy.

Podstatné je, že jsou k dispozici pomocí DSC a/nebo rentgenové strukturní analýzy nebo jiných vhodných způsobů dokazatelně signifikantní amorfní podíly a přípravek nemá úplně krystalický charakter. Krystalické přípravky nejsou vhodné ktomu, aby se dosáhlo dostatečné stability u citlivých biologických látek. Úplně amorfní přípravky jsou vhodné ke stabilizaci, a tím jsou principiálně přípravky podle vynálezu, obzvláště však částečně amorfní přípravky.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. Ia: Teploty skelného přechodu jednotlivých směsí maltózy a L-fenylalaninu,

Obr. Ib: Obsah zbytkové vody v jednotlivých směsích maltózy a L-fenylalaninu.

Obr. 2: Difraktogramy prášků ve vakuu sušených (a) fenylalaninu (obsah vody 1,2 %/krystalický), (b) maltózy (obsah vody 4,0 %, T_g = 50 °C) a (c) fenylalaninu a maltózy připravených způsobem podle vynálezu (obsah vody 0,7 %, T_g = 88 °C).

-3CZ 293456 B6

Difraktogramy se snímaly pomocí konvenčního přístroje (Phillips 1730 X-ray) a příslušného software. Teplota měření: 25 °C, úhel rozlišení (2Θ) 0,05°, podmínky měření: 1 s na úhel při napětí elektronky 40 kV a proudu 40 mA.

Obr. 3: Časový průběh (a) obsahu zbytkové vody a (b) teploty skelného přechodu přípravku z maltózy a fenylalaninu podle vynálezu.

Podrobný popis vynálezu

Ve 13 příkladech a 10 srovnávacích příkladech je vynález exemplárně vylíčen a objasněn. Přitom se objevily formulace a způsoby, které prudce zlepšují a urychlují sušení látek obsahujících cukry pomocí vakuového sušení a jsou vhodné ke stabilizaci relevantních terapeutických a diagnostických biologických materiálů. Dále se objevují úplně nová složení, která splňují účel stabilizace za zachování optimalizovaných charakteristik sušení.

Tato složení obsahují přednostně buď alespoň jeden amfotemí iont s nepolárním zbytkem (například aminokyselinu, jako fenylalanin) a cukr, přičemž teplota skelného přechodu cukruje pomocí přísady tohoto amfotemího iontu zřetelně zvýšena. Alternativně se mohou použít také směsi různých speciálně zvolených aminokyselin nebo jejich deriváty. Tyto směsi se skládají z jednoho amfotemího iontu s nepolárním zbytkem a z jednoho amfotemího iontu s polárním zbytkem. K těmto směsím se mohou přidávat také ještě cukry.

Jako pracovní hypotéza se objevilo, že výsledky žádané podle vynálezu poskytují obzvláště směsi cukru nebo polární amfotemí substance (například argininu, kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, histidinu, citrulinu, lysinu) a nepolární amfotemí substance (například fenylalaninu, izoleucinu, methioninu, valinu, alaninu, glycinu, tryptofanu, cysteinu) nebo jejich deriváty (například acetylfenylalaninethylester). Je možno snadno jak obměňovat způsob, tak i rozšiřovat seznamy látek popsané na základě příkladů.

Obzvláště přednostními biologicky nebo terapeuticky aktivními materiály jsou protilátky (monoklonální nebo polyklonální), enzymy a lidské proteiny, popřípadě lidské peptidy, jako například rekombinantní lidský erytropoetin (rh-EPO), rekombinantní lidský faktor stimulující kolonie granulocytů (granulocyten colony stimulating factor (rh-G-CSF)) nebo rekombinantní aktivátor plazminogenu (rPA), nGF, PTH, ularitidy, plazmidy, viry, GUP, BP-5.

Na přípravcích bez účinné látky se dopracovalo toho, jakým způsobem přísada aminokyselin změní sušení matric obsahujících cukry. V příkladu 1 je znázorněno, že přísada fenylalaninu a argininu k maltóze zlepšuje její chování při sušení v závislosti na přidaném množství těchto příměsí. Teplota skelného přechodu se dá pomocí cílené přísady těchto pomocných látek zvýšit o více než 65 K za stejných podmínek sušení, korespondující obsah zbytkové vody se dá snížit snadno na méně než 1 %. Z příkladu 1 vyplývá, že přitom použitý způsob vede po dobu 48 h bez jakéhokoli působení tepla k žádoucímu výsledku. Maltóza bez pomocných látek přidaných podle vynálezu vykazuje za těchto podmínek obsah zbytkové vody 7 - 8 %, teplota skelného přechodu (Tg) je nižší než pokojová teplota, a tedy tento systém není vhodný ke stabilizaci proteinů atd.

Výrobou přípravků podle vynálezu ze sacharózy a jedné aminokyseliny ze skupiny aminokyselin vhodných podle vynálezu k výrobě stabilizujících, částečně amorfních produktů se dosáhne zabránění určitých nevýhod u formulace se sacharózou, zatím co se výhody vlastní sacharóze mohou zcela projevit. Sacharóza má ve srovnání s jinými, v literatuře zmíněnými cukry relativně nízkou teplotu skelného přechodu při přiměřeně normovaných obsazích vody. Proto je při výrobě suchých přípravků obsahujících sacharózu obzvláště obtížné dosáhnout vysokých T_g, které jsou zřetelně vyšší než požadovaná teplota uskladnění. Dále je obtížné převést sacharózu pomocí sušení odpařováním zcela na amorfní formu, cukr snadno vykrystalizuje, a tím snadno vytváří krystalickou strukturu nevýhodnou pro stabilizaci biologických účinných látek. Kromě toho se

-4CZ 293456 B6 pozorovalo, že amorfní sacharóza v průběhu skladování srovnatelně rychle tvoří ve velké míře krystaly a po uplynutí určitých dob uskladnění může úplně krystalizovat. Také při tomto procesu ztrácí takový přípravek své stabilizující vlastnosti. Všechny tyto problémy, rizika a nedostatky spojené s použitím sacharózy se mohou odstranit podle vynálezu pomocí přísady aminokyselin z vhodné skupiny. Obzvláště přednostní je přitom použití fenylalaninu a argininu (příklad 2). Ve srovnávacím příkladu A se ukázalo, že rovněž za použití delších dob sušení a zvýšené teploty nelze čisté cukry účinně sušit. Účinku aminokyselin a cukru zlepšujícího sušení se dá dosáhnout jak pomocí jednotlivých aminokyselin, tak pomocí směsí aminokyselin. Příklady 3 a 4 k tomu poskytují příslušné výsledky na maltózových a sacharózových směsích. Byly nalezeny rovněž aminokyseliny, které nemají žádné účinky zlepšující sušení, například histidin (srovnávací příklad B). V příkladu 5 se ukazuje, že kromě aminokyselin mohou také jejich strukturně příbuzné deriváty mít účinky zlepšující sušení. Výběr určitých aminokyselin se podrobně, i když ne omezujícím způsobem nebo zcela obsáhle, popisuje v příkladu 6. Je možno zachytit, že při dalším nezpůsobuje každá aminokyselina požadovaný účinek, nýbrž jen určité aminokyseliny. Rovněž míra účinků je rozdílná, takže se mohou jmenovat obzvláště přednostní kombinace nebo přípravky. Těmito jsou především fenylalanin, tryptofan, leucin a izoleucin. Z příkladu 1 a 6 se dá dále odvodit, že je možná směs aminokyselin za zachování účinku zlepšujícího sušení. Arginin samotný neprojevuje žádný pozitivní účinek, ale ve směsi s fenylalaninem ano.

Chování aminokyselin při vakuovém sušení se zkoumalo za účelem zjištění, zda také bez matrice obsahující cukry pomocí aminokyselin je možno obdržet přípravky, které mají teplotu skelného přechodu vyšší než teplota místnosti. Překvapivě se zjistilo, že čistá aminokyselina samotná vytváří jen krystalické struktury, zatímco určité soli aminokyselin a směsi aminokyselin vytvářejí sklovité matrice (srovnávací příklad C a příklad 7). Pro výrobu amorfních struktur je třeba volit aminokyseliny cílevědomě různě. Překvapivě se zjistilo, že aminokyseliny lze rozdělit do 2 skupin, které vykazují zjevně rozdílné vlastnosti. Z každé skupiny je potřebné vybrat alespoň jednu aminokyselinu a připravit vhodnou směs a tuto sušit. Tak jako u formulace směsí cukrů a aminokyselin je rovněž zde potřebný určitý poměr míšení k tomu, aby se obdržely přípravky podle vynálezu (příklad 7). Potom se obdrží matrice s amorfními podíly, která je vhodná ke stabilizaci biologických účinných látek.

Účinnost zlepšeného sušení vzhledem k vlastnímu cíli, stabilizaci biologicky aktivního materiálu, exemplárně znázorněná na proteinech, se podrobně dokládá v příkladech 8- 12 a ve srovnávacích příkladech D - J. Příklady 8 a 9 se srovnávacími příklady D - G popisují stabilizaci rh-GCSF, příklad 10 a srovnávací příklad H stabilizaci erytropoetinu a příklady 11 a 12, jakož i srovnávací příklady I a J stabilizaci laktátdehydrogenázy. Na základě dob uskladnění proteinu (rh-G-CSF, příklady 8 a 9, popřípadě srovnávací příklady D, E a F, G), glykoproteinů (rh-EPO, příklad 10 a srovnávací příklad H) a enzymu (LDH, příklady 11, 12 a srovnávací příklad I a J) se příkladně ukazuje překvapivě velmi zlepšená stabilita při skladování přípravků podle vynálezu v porovnání s přípravky sušenými ve vakuu bez pomocných látek a s dalšími přípravky. Změny rozličných přípravků rh-G-CSF za skladovacích podmínek při rozličných teplotách se znázorňují v příkladech. Pouze přípravky podle vynálezu, tj. částečně amorfní, sklovité přípravky neprojevují po 6 měsících žádnou pozoruhodnou degradaci v rozsahu teplot uskladnění od několika °C (chladnička) až do 40 °C (příklady 8 a 9). Vhodné přípravky sušené za vakua bez pomocných látek (srovnávací příklad D) projevují při pokojové teplotě a zvýšené teplotě (40 °C) zřejmý úbytek monomeru až do 20 %. Přípravky, které nejsou amorfní, nýbrž houževnaté, viskózní, které jsou skladovány při teplotě vyšší než teplota skelného přechodu, projevují již při pokojové teplotě po 5 týdnech signifikantní úbytky koncentrace monomeru (srovnávací příklady D a E). Krystalické přípravky (srovnávací příklad G a J) ukazují právě tak signifikantně zkrácené doby uskladnění. Z porovnání příkladu 8 a srovnávacího příkladu E se ukazuje, že při zvýšené teplotě uskladnění (40 °C) přísada aminokyselin k maltóze jako stabilizátor více než zdesateronásobí dobu uskladnění, při které méně než 10 % monomerů G-CSF agreguje. Porovnání příkladu 9 se srovnávacím příkladem G ukazuje, že také volba aminokyselin je rozhodující pro velmi prodlouženou dobu uskladnění. Porovnání podílu monomeru u glykoproteinů EPO (příklad 10, srovnávací příklad H) ukazuje, že přípravky podle vynálezu při pokojové teplotě a zvýšené teplotě

-5CZ 293456 B6 uskladnění jsou ve srovnání s EPO sušeným ve vakuu bez pomocných látek zřetelně výhodnější. Při 5-týdenním skladování citlivého enzymu LDH jako přípravků podle vynálezu (příklady 11 a 12) ve srovnání s LDH sušeným ve vakuu bez pomocných látek (srovnávací příklad I) a krystalickým přípravkem (srovnávací příklad J) se ukazuje, že pouze přípravky podle vynálezu se mohou skladovat při pokojové teplotě nebo při vyšších teplotách uskladnění (30 °C) bez drastické ztráty aktivity. Pozoruhodná přitom je také přídavná stabilizace enzymu pomocí přípravku podle vynálezu přímo po přípravě vzorků (aktivita při 0 týdnů > 80 % oproti 65 % při přípravku bez pomocných látek, popřípadě 10 % při krystalickém přípravku). Typický časový průběh procesu sušení jedné směsi podle vynálezu je exemplárně znázorněn v příkladu 13.

K výrobě směsí alespoň dvou aminokyselin podle vynálezu k dosažení rychloschnoucích, sklovitých přípravků je třeba zvolit alespoň po jedné aminokyselině a jejích derivátů z těchto uvedených 2 skupin:

Skupina 1: arginin, kyselina asparagová, kyselina glutamová, histidin, citrulin, lysin, omithin;

Skupina 2: fenylalanin, izoleucin, leucin, methionin, valin, alanin, glycin, tiyptofan, acetylfenylalaninethylester, cystein, sarkosin.

Výhradní použití jenom jedné aminokyseliny nebo několika aminokyselin jenom z jedné zobou skupin nevede k výhodným přípravkům podle vynálezu. Směsi látek podle vynálezu se mohou, jak se exemplárně znázorňuje, nalézt tak, že se k roztoku stabilizátoru biologicky nebo terapeuticky aktivních látek přimíchá v rozličných množstvích amfotemí iont s nepolárním zbytkem, například fenylalanin nebo jeho deriváty. Směsi sušené při pokojové teplotě se hned potom přezkoumají pomocí DSC, zda vykazují zvýšenou teplotu skelného přechodu pomocí přísady amfotemího iontu. Teplota skelného přechodu se přitom zvýšila ve srovnání s přípravky bez přísad podle vynálezu o 10 K, přednostně o 20 K, obzvláště přednostně o 40 K. Výhodné přípravky podle vynálezu jsou částečně amorfní, mají teplotu skelného přechodu vyšší než 4 °C, přednostně než 20 °C, obzvláště přednostně vyšší než 40 °C a mají vhodné zbytkové vlhkosti menší než 6 %, přednostně menší než 4 %. Jejich zdánlivá hustota odpovídající sypné hustotě je alespoň o 10 %, přednostně o 50 % vyšší než hustota příslušných lyofilizátů. Zachovávají si svou křehkou, sklovitou, kompaktní, částečně amorfní strukturu po dobu alespoň 2 týdnů, přednostně 2 měsíce, obzvláště přednostně 1 rok. Kromě toho je jejich doba sušení (tj. okamžik, ve kterém se dosáhne stejné zbytkové vlhkosti) ve srovnání se směsmi látek, které obsahují jen jeden sacharid nebo amfotemí iont s nepolárním zbytkem, menší zejména o 25 %, obzvláště přednostně menší o 50 % nebo dokonce o 75 %. Tyto směsi látek se mohou také mlít nebo dále zpracovávat jiným způsobem, například používat v terapeutických prostředcích nebo diagnostikách v kombinaci s obvyklými pomocnými látkami a nosiči. Terapeutické prostředky jsou terapeutické přípravky, které obsahují jedno nebo několik terapeuticky účinných agens kromě obvyklých pomocných látek a přísad. Mohou být ve formě tablet, kapsulí nebo tuhých látek, ze kterých se pomocí přídavku kapaliny (například sterilní vody nebo pufřu) vyrábějí terapeuticky účinné roztoky (například infuzní roztoky). Dále jsou obzvláště vhodné k aplikaci jako tuhé substance pomocí rozličných způsobů, například jako nosní sprej, inhalační prostředek nebo transdermální prášek atd.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vakuové sušení směsí maltózy, L-argininu a L-fenylalaninu

Připravil se roztok s obsahem 50 mg monohydrátu maltózy a 0,1 mg Polysorbátu 80 v 1 ml. K němu se potom přidávaly stoupající množství L-argininu a L-fenylalaninu k stejným podílům

-6CZ 293456 B6 (g/g). Takto připravené roztoky se sterilně filtrovaly (0,22 pm nitrocelulózový filtr) a potom po 1 ml roztoku se plnilo do 2ml lahviček a nasadily se lyofilizační zátky. Takto připravené vzorky se stejným způsobem ve vakuu sušily při 20 °C a za sníženého tlaku 48 h. Po vysušení se stanovil obsah vody vzorků podle Karla Fischera a teplota skelného přechodu se zjistila pomocí diferenční termické analýzy (Perkin Elmer DSC7 - rychlost nahřívání vzorků =10 K/min). Výsledky měření ukazují, že chování maltózy při sušení se pomocí přídavku určitých množství aminokyselin zřetelně mění. Od 7,5 mg každé aminokyseliny obsah vody ve vzorcích zřetelně klesá a teplota skelného přechodu přiměřeně stoupá. Při 10 mg L-argininu a L-fenylalaninu se dosáhne hodnof které už nelze zvyšovat dalším zvyšováním podílů aminokyselin v suchém produktu. K roztoku cukru s 50 mg monohydrátu maltózy a 0,1 mg Polysorbátu 80 v 1 ml se přidávala stoupající množství aminokyselin. Výsledné produkty po vysušení vykazovaly zde uvedené obsahy vody a teploty skelného přechodu.

Tabulka 1

L-Arginin [mg/ml]	L-Fenylalanin [mg/ml]	Obsah zbytkové vody [%]	Teplota skelného přechodu [°C]
0	0	7,68	12,86
1	1	7,95	12,47
2,5	2,5	7,71	12,91
5	5	7,75	13,67
7,5	7,5	3,55	52,04
10	10	0,54	80,57
12,5	12,5	0,76	73,14

Příklad 2

Vakuové sušení směsí sacharózy, L-argininu a L-fenylalaninu

K roztoku sacharózy, který obsahoval 50 mg sacharózy a 0,1 mg Polysorbátu 80 v 1 ml, se přidávala stoupající množství L-argininu a L-fenylalaninu ve stejných podílech. Vzorky se připravily jako v příkladu 1, sušily a analyzovaly. Při množstvích do 10 mg aminokyselin se získaly dokonale krystalické produkty. Až do 10 mg L-argininu a 10 mg L-fenylalaninu na 1 ml bylo možno identifikovat částečně amorfní produkty se skelným přechodem. V tomto příkladu se pomocí přípravku aminokyselin nejen zlepšuje chování roztoku při sušení, nýbrž i systém se pomocí tohoto přídavku převádí do částečně amorfního stavu. K roztoku cukru s 50 mg sacharózy a 0,1 mg Polysorbátu 80 v 1 ml se přidávala stoupající množství aminokyselin. Výsledné produkty po vysušení vykazovaly zde uvedené obsahy vody a teploty skelného přechodu.

Tabulka 2

L-Arginin [mg/ml]	L-Fenylalanin [mg/ml]	Obsah zbytkové vody [%]	Teplota skelného přechodu [°C]
0	0	2,97	krystalický
1	1	1,11	krystalický
2,5	2,5	3,46	krystalický
5	5	6,11	krystalický
10	10	3,43	18,56
15	15	1,53	53,70
20	20	1,60	58,78

I

Srovnávací příklad A

Vakuové sušení čistých roztoků cukrů

Připravil se roztok monohydrátu maltózy a roztok sacharózy o koncentraci 50 mg/ml. Tyto roztoky cukrů se potom filtrovaly, plnily a analyzovaly, jak je popsáno v příkladu 1. Mohlo se ukázat, že ani při 72-hodinovém sušení při 50 °C za sníženého tlaku není možno vysušit 50 mg cukru v 2ml lahvičce na uspokojivou zbytkovou vlhkost tak, aby skelný přechod byl nad 25 °C. Produkt maltózy vykazoval houževnatou konzistenci a obsah zbytkové vody 6,4 %. Teplota skelného přechodu byla 20 °C. Při sacharóze bylo ještě 6,0 % zbytkové vody, skelný přechod při 14 °C. Pro srovnání se čisté roztoky cukrů také 48 h sušily při 20 °C za sníženého tlaku. Výsledné produkty byly ještě více vlhké a skelný přechod byl proto ještě níž než u vzorků sušených při 50 °C. Tento pokus zřetelně ukazuje, že jen pomocí přísady určitých aminokyselin je možno vrstvy cukrů sušit v injekčních lahvičkách nebo v podobných baleních pomocí vakuového sušení na malé zbytkové vlhkosti. Zlepšené chování při sušení pomocí přídavku aminokyselin se tak stává zřejmým.

Tabulka 3

Sušení	Maltóza Obsah zbytkové vody	Maltóza Teplota skelného přechodu	Sacharóza Obsah zbytkové vody	Sacharóza Teplota skelného přechodu
72 h při 50 °C	6,4 %	20,0 °C	6,0 %	14,0 °C
48 h při 20 °C	8,9 %	6,1 °C	9,3 %	-1,8 °C

Příklad 3

Vakuové sušení směsí maltózy a L-fenylalaninu a směsí maltózy a L-izoleucinu

V tomto pokusu se nyní připravily binární směsi aminokyselin a monohydrátu maltózy. Má se přezkoumat, zda tu použité aminokyseliny mají vlastnosti zlepšující sušení a jaká je závislost efektu zlepšujícího sušení na množství při jednotlivých aminokyselinách. K roztoku, který obsahoval v 1 ml 50 mg monohydrátu maltózy, se přidávala stoupající množství L-fenylalaninu nebo L-izoleucinu. Takto připravené roztoky se sterilně filtrovaly (0,22 pm nitrocelulózový filtr) a potom po 1 ml roztoku se plnilo do 2ml lahviček a nasadily se lyofilizační zátky. Takto připravené vzorky se za vakua sušily při 20 °C za sníženého tlaku 48 h. Po vysušení se stanovil obsah vody ve vzorcích podle Karla Fischera vždy 4-krát a teplota skelného přechodu se zjistila pomocí diferenční termické analýzy u dvou vzorků z každé směsi (Perkin Elmer DSC7 - rychlost zahřívání vzorků = 10 K/min).

a. Výsledek maltóza-L-fenylalanin

Výsledky měření jasně ukazují pozitivní vliv L-fenylalaninu na chování maltózy při sušení. Už malá množství L-fenylalaninu postačují na to, aby se teplota skelného přechodu cukru při neměnících se podmínkách sušení zvýšila o přibližně 50 °C (obr. la a lb). Při 10 mg/ml Lfenylalaninu dosahuje efekt zlepšující sušení maxima. Pomocí přídavku větších množství Lfenylalaninu už není možné žádné zlepšení. Teplota skelného přechodu se tak zvýšila pomocí přísady L-fenylalaninu ve srovnání s čistou maltózou o přibližně 80 °C. Při velkých množstvích L-fenylalaninu (10-20 mg/ml) není možno v tomto pokusu poznat žádné rozdíly, co se týče chování při sušení. Toto se však mění při zkrácených dobách sušení. Tu je možno vidět se stoupajícími množstvími L-fenylalaninu stoupání skelných přechodů také v rozsahu 10 - 20 mg

-8CZ 293456 B6

L-fenylalaninu na 1 ml. Tabulka 4 ukazuje množství L-fenylalaninu v roztoku cukru a z toho vyplývající obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu T_g.

Tabulka 4

L-Fenylalanin [mg/ml]	Obsah zbytkové vody [%]	Teplota skelného přechodu [°C]
0	8,91	6,1
5	3,21	62,8
7,5	0,95	77,7
10	1,12	86,0
15	0,99	85,2
20	0,99	88,2

Kromě toho se zaznamenaly difraktogramy prášků za vakua sušeného fenylalaninu a maltózy a směsi fenylalaninu a maltózy podle vynálezu (obr. 2a, 2b, 2c). Čistý fenylalanin ukazuje typický difraktogram krystalické substance (obr. 2a), zatímco maltóza ukazuje difraktogram amorfní substance (obr. 2b). Jen u směsi podle vynálezu dochází k tvorbě částečně amorfních struktur, patrno na diskrétních difrakčních maximech na širokém signálu pozadí (obr. 2c).

b. Výsledek maltóza a L-izoleucin

K zásobnímu roztoku s 50 mg monohydrátu maltózy v 1 ml se přidávala různá množství Lizoleucinu a jednotlivé směsi se sušily při 20 °C. Se stoupajícím množstvím aminokyseliny se efekt zlepšující sušení stává zřetelným. Pomocí přídavku 20 mg/ml L-izoleucinu (poměr míšení 5 : 2 hmot, dílů) lze zvýšit T_g maltózového produktu o přibližně 20 °C. Tabulka 5 znázorňuje množství L-izoleucinu v roztoku cukru a z toho plynoucí obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu T_g.

Tabulka 5

Izoleucin [mg/ml]	Obsah zbytkové vody [%]	Teplota skelného přechodu [°C]
0	8,91	6,1
5	7,84	13,7
10	7,52	17,7
15	6,77	19,4
20	5,34	24,7

Příklad 4

Vakuové sušení sacharózy a L-leucinu

V následujících pokusech se připravily binární směsi sacharózy s různými aminokyselinami. Mělo se prozkoumat, zda použité aminokyseliny mají na sacharózu účinek zlepšující sušení. K roztoku, který obsahoval 50 mg sacharózy v 1 ml, se přidávala zvyšující se množství Lleucinu. Roztoky se zpracovaly tak, jak je popsáno v příkladu 3.

-9CZ 293456 B6

Výsledek: sacharóza - L-leucin

Sacharóza vytváří s menšími množstvími L-leucinu krystalický produkt. Tato tvorba krystalů mohla být pozorována již v příkladu 2 s L-argininem a L-fenylalaninem. Sacharóza tvoří tedy při smíchání s určitými aminokyselinami krystalické produkty. Čistý cukr a směsi s většími podíly L-leucinu tvoří systémy se skelným přechodem. To znamená, že existuje částečně amorfní struktura. Tak se stává jasným to, že až koncentrace od 15 mg/ml L-leucinu zlepšují vlastnosti čisté sacharózy při sušení a skelný přechod se může zvýšit pomocí přídavku této aminokyseliny o přibližně 18 °C. L-Leucin je tedy aminokyselinou s účinkem zlepšujícím sušení. Tabulka 6 znázorňuje množství L-leucinu v roztoku cukru a z toho plynoucí obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu T_g konečných produktů.

Tabulka 6

L-Leucin [mg/ml]	Obsah zbytkové vody [%]	Teplota skelného přechodu [°C]
0	9,34	-1,8
5	6,23	kiystalický
10	6,50	krystalický
15	5,81	16,4
20	5,02	16,1

Srovnávací příklad B

Vakuové sušení směsí sacharózy a L-histidinu

Pokusy se prováděly jako v příkladu 4. Místo L-leucinu se použil L-histidin. Směs sacharózy a L-histidinu vytváří při vakuovém sušení amorfní produkty, u kteiých není možno pozorovat žádný účinek zlepšující sušení. Nezávisle na poměru míšení se suší struktury špatně a obsahy zbytkové vody a skelné přechody směsí jsou řádově stejné jako výsledky čisté sacharózy. Tedy L-histidin nemá žádný účinek zlepšující sušení. Tabulka 7 znázorňuje množství L-histidinu v roztoku cukru a z toho vyplývající obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu T_g konečných produktů.

Tabulka 7

L-Histidin	Obsah zbytkové vody	Teplota skelného přechodu
[mg/ml]	[%]	[°C]
0	9,34	-1,8
5	11,23	-1,4
20	9,78	-2,6

Příklad 5

Vakuové sušení směsí sacharózy a L-tryptofanu a směsí sacharózy a N-acetyl-L-fenylalaninethylesteru (APE)

V tomto pokusu se připravil jeden roztok s 10 mg L-tryptofanu v 1 ml a jeden roztok s 3 mg APE v 1 ml (APE má jen omezenou rozpustnost ve vodě). K oběma roztokům se přidávala stoupající množství sacharózy. Takto získané roztoky se jako v příkladu 3 zpracovaly a sušily. Pro srovnání

-10CZ 293456 B6 se při tomto pokusu sušil také roztok sacharózy (50 mg/ml) za stejných podmínek sušení. Tento vykazoval v konečném produktu obsah zbytkové vody 9,98 % a teplotu skelného přechodu

-6,25 °C.

a. Tabulka 8 znázorňuje množství sacharózy v roztoku L-tryptofanu (10 mg/ml) a z toho vyplývající obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu konečných produktů.

Tabulka 8

Sacharóza	Obsah zbytkové vody	Teplota skelného přechodu
[mg/ml]	[%]	[°C]
20	3,09	37,30
40	4,19	22,51
60	5,37	14,44

b. Tabulka 9 znázorňuje množství sacharózy v roztoku APE (3 mg/ml) a z toho vyplývající obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu konečných produktů.

Tabulka 9

Sacharóza	Obsah zbytkové vody	Teplota skelného přechodu
[mg/ml]	[%]	[°C]
10	6,15	13,3
40	8,33	1,4

Výsledky ukazují, že obě zkoumané substance, L-tryptofan a APE, vykazují účinek zlepšující sušení. Pomocí L-tryptofanu lze zvýšit teplotu skelného přechodu částečně amorfního produktu při neměnících se podmínkách sušení o přibližně 45 °C. Pomocí APE je možné zvýšení teploty skelného přechodu při neměnících se podmínkách o 20 °C.

Příklad 6

Vakuové sušení dalších směsí cukrů a aminokyselin

V tomto pokusu se připravily binární směsi monohydrátu maltózy nebo sacharózy s L-aminokyselinou. Přitom se k roztoku cukrů přidávaly aminokyseliny v poměru míšení 5 : 2 až 1 : 1. Mělo se prozkoumat, zda daná aminokyselina vykazuje u odpovídajících cukrů účinek zlepšující sušení. Příprava, zpracování a sušení roztoků se provádělo jako v příkladu 4. Jednotlivě se jednalo o následující směsi:

a. Směsi s monohydrátem maltózy

Tabulka 10

Použitá aminokyselina	Množství AMK [mg/ml]	Množství cukru [mg/ml]	Obsah zbytkové vody[%]	Teplota skelného přechodu [°C]
-	-	50	8,91	6,1
L-Arginin	10	50	8,10	10,3
L-Arginin	20	50	8,63	7,1
L-Leucin	20	50	5,42	20,9

-11 CZ 293456 B6

Tabulka 10 - pokračování

Použitá aminokyselina	Množství AMK [mg/ml]	Množství cukru [mg/ml]	Obsah zbytkové vody [%]	Teplota skelného přechodu [°C]
L-Leucin	20	20	1,87	56,05
L-Histidin	20	50	9,78	5,3
L-Izoleucin	20	20	3,12	37,9
L-Methionin	15	30	7,45	9,7
L-Methionin	20	20	2,70	34,4
L-Valin	20	20	4,93	18,8

b. Směsi se sacharózou

Tabulka 11

Použitá aminokyselina	Množství AMK [mg/ml]	Množství cukru [mg/ml]	Obsah zbytkové vody [%]	Teplota skelného přechodu [°C]
—	—	50	9,34	-1,8
L-Alanin	15	30	6,04	2,8
L-Alanin	20	20	4,46	11,7
L-Glycin	20	20	4,47	5,3
L-Fenylalanin	20	50	1,12	62,7
L-Serin	15	30	11,77	-15,1
L-Serin	20	20	10,61	-14,4

Výsledky sušení ukazují, že L-histidin nemá žádný pozitivní vliv na chování cukrů při sušení (tabulka 10). L-Serin dokonce ještě více zhoršuje sušení cukrů (tabulka 11). L-Leucin, Lizoleucin a L-methionin mají účinek zlepšující sušení (tabulka 10). Tento se stává zřejmým, když se k roztoku cukrů přidávají stoupající množství těchto aminokyselin. Při b-valinu a L-alaninu je možno zjistit zlepšení sušení jen při velkých množstvích aminokyseliny v produktu; L-arginin a L-glycin mají slabý pozitivní vliv. Velmi dobrý účinek L-fenylalaninu na chování při sušení se stává jasným také při binární směsi se sacharózou (tabulka 11). Produkt se suší dobře a vykazuje velmi vysokou teplotu skelného přechodu.

Srovnávací příklad C

Vakuové sušení roztoků aminokyselin nebo roztoků solí aminokyselin

Z jednotlivých aminokyselin nebo solí jednotlivých aminokyselin se připravily roztoky a sterilně se filtrovaly (0,22 pm nitrocelulózový filtr). Po 1 ml roztoku se plnilo do 2ml lahviček a nasadily se lyofilizační zátky. Takto připravené vzorky se za vakua sušily při 20 °C za sníženého tlaku 48 h. Po vysušení se stanovil obsah vody ve vzorcích podle Karla Fischera a teplota skelného přechodu se zjistila pomocí diferenční termické analýzy (Perkin Elmer DSC7 - rychlost zahřívání vzorků = 10 K/min). Následující roztoky se jednotlivě sušily a výsledkem byly zde uvedené obsahy zbytkové vody a výsledky měření DSC:

-12CZ 293456 B6

a. Aminokyseliny

Tabulka 12

Aminokyselina	Koncentrace	Obsah zbytkové vody[%]	Výsledek měření DSC [°C]
[mol/11	[mg/ml]
L-Alanin	0,24	21,38	0,81	krystalický
L-Arginin	0,24	41,80	0,52	krystalický
L-Citrulin	0,24	42,05	4,9	krystalický
L-Cystein	0,24	29,08	2,61	krystalický
Glycin	0,24	18,02	0,76	krystalický
L-Histidin	0,12	18,62	0,77	krystalický
L-Izoleucin	0,12	15,74	1,10	krystalický
L-Leucin	0,12	15,74	1,62	krystalický
L-Lysin	0,24	35,09	0,79	krystalický
L-Methionin	0,12	17,91	1,57	krystalický
L-Fenylalanin	0,12	19,82	1,53	krystalický
L-Prolin	0,24	27,63	19,93	krystalický
L-Serin	0,24	25,22	0,44	krystalický
L-Threonin	0,24	28,59	0,45	krystalický
L-Valin	0,24	28,12	0,57	krystalický

b. Soli aminokyselin

Tabulka 13

Aminokyselina	Koncentrace	Hodnota PH	Obsah zbytkové vody [%]	Výsledek měření DSC [°C]
[mol/1]	[mg/ml]
L-Arginin HCI	0,25 0,30	43,55 10,93	2,70	6,46	3,51
L-Arginin H3PO4	0,25 0,15	43,55 14,70	6,81	3,3	5,17
L-Arginin H2SO4	0,25 0,15	43,55 14,71	2,89	3,24	6,67
L-Arginin HNO3	0,25 0,30	43,55 18,90	2,58	2,66	krystalický
L-Arginin Kyselina octová	0,25 0,30	43,55 18,0	5,24	11,04	krystalický
Kyselina L-asparagová NaOH	0,12 0,12	15,97 4,8	9,65	9,78	27,7
Kyselina L-glutamová NaOH	0,12 0,12	17,66 4,8	5,14	14,69	5,5
L-Omithin HCI	0,24	40,47	5,39	0,4	krystalický

Výsledek ukazuje, že aminokyseliny jsou po vakuovém sušení krystalické. Jen soli zásaditých a kyselých aminokyselin vytvářejí během těchto podmínek sušení amorfní struktury, které se 15 ovšem velmi špatně suší a jejich teplota skelného přechodu za zvolených podmínek je nižší než pokojová teplota.

-13CZ 293456 B6

Příklad 7

Vakuové sušení směsí L-argininu a L-fenylalaninu a jedné směsi L-argininu a L-izoleucinu

V tomto pokusu se připravily, zpracovaly a sušily rozličné směsi L-argininu a L-fenylalaninu a zkoumaly se jako ve srovnávacím příkladu C. Jednotlivě se připravily a sušily následující binární směsi:

Tabulka 14

Molámí poměr míšení	L-Arginin	L-Fenylalanin	Obsah zbytkové vody[%]	Teplota skelného přechodu [°C]
[mol/1]	[mg/ml]	ímol/1]	[mg/ml]
1:1	0,12	20,90	0,12	19,82	2,27	59,5
2:1	0,16	27,87	0,08	13,21	9,32	1,7
3:1	0,18	31,35	0,06	9,91	9,40	2,8
4:1	0,192	33,44	0,048	7,928	9,96	1,3
5:1	0,20	34,83	0,04	6,61	10,73	0,0
6:1	0,206	35,88	0,034	5,61	10,03	1,3
7:1	0,21	36,58	0,03	4,96	11,38	1,0
1:2	0,06	10,45	0,12	19,82	2,85	47,2
1:3	0,04	6,97	0,12	19,82	3,43	46,2
1:4	0,03	5,23	0,12	19,82	3,66	43,45

Tento pokus ukazuje, že pomocí smíchání dvou aminokyselin, které samotné sušené poskytují krystalické produkty, je možno připravit částečně amorfní struktury. Tyto se suší při zvolených poměrech míšení tak dobře, že výsledkem jsou částečně amorfní struktury s vysokou teplotou skelného přechodu a malým obsahem zbytkové vody.

Je zajímavé, že existuje optimální poměr míšení s nejvyšší teplotou skelného přechodu. V tomto pokusu se připravil ještě jeden roztok, který obsahoval L-arginin a L-izoleucin po 0,15M.

Tabulka 15

Molámí poměr míšení	L-Arginin	L-Izo	eucin	Obsah zbytkové vody	Teplota skelného přechodu
[mol/1]	[mg/ml]	[mol/1]	[mg/ml]
1:1	0,15	26,13	0,15	19,68	1,05	53,27

Zde je výsledkem produkt s teplotou skelného přechodu 53,27 °C a obsahem zbytkové vody 1,05 %. Smícháním dvou aminokyselin se mohla vytvořit tak dobře schnoucí částečně amorfní struktura; teplota skelného přechodu se zvýšila přibližně o 50 °C ve srovnání se solemi argininu s minerálními kyselinami (srovnávací příklad C).

Příklad 8 rh-G-CSF sušený za vakua v receptuře maltózy obsahující L-arginin a L-fenylalanin

Připravil se roztok s 50 mg maltózy, 10 mg L-fenylalaninu a 10 mg L-argininu v 1 ml. Kromě toho obsahoval tento roztok 0,1 mg Polysorbátu 80 a 0,35 mg rh-G-CSF v 1 ml. Hodnota pH receptury se nastavila pomocí kyseliny chlorovodíkové na 7,4. Za aseptických podmínek se připravil roztok obsahující protein a sterilně se filtroval (polyvinyliden difluoridový filtr 0,22 gm).

-14CZ 293456 B6

Potom se po 1 ml roztoku plnilo do 2ml lahviček. Naplněné lahvičky s lyofilizačními zátkami se potom izotermicky sušily 48 h při 20 °C a za sníženého tlaku. Vznikl suchý produkt s obsahem zbytkové vody 1,16 % a teplotou skelného přechodu 75 °C. Takto připravené vzorky se skladovaly při různých teplotách a po různých dobách uskladnění se posoudila stabilita proteinu.

Při rh-G-CSF je podíl vzniklého dimeru v připraveném produktu dobrým kritériem pro posuzování stability produktu. Proto jsou množství monomeru a dimeru zjištěná pomocí gelové permeační chromatografíe (na podmínku 4 jednoduchá měření) měrou pro stabilizující účinek našich přípravků připravených sušením. Při gelové permeační chromatografii se molekuly proteinu oddělí na základě velikosti jejich částic v rozpuštěném stavu, tj. vysokomolekulámí složky (dimery) se separují od monomerů rh-G-CSF. Zkoumání (HP-SEC) se provádělo v aparatuře HPLC od Shimadzu za použití ochlazovatelného automatického vzorkovače (WatersTM717). Jako dělicí kolona se použila kolona TSK-Gel G2000 SW (7,5x300 mm) od firmy TosoHaas. Detekce oddělených složek probíhala fotometricky při 214 nm (Fotometr Shimadzu LC-GA). Jako elučního prostředku se použilo 0,lM sodno-draselného fosfátového pufřu, pH 6,2, pomocí kterého se nastavil průtok 0,6 ml/min při pokojové teplotě. Zkoumané vzorky se rozpustily ve dvakrát destilované vodě tak, aby se znovu připravila výchozí koncentrace (přídavek 1 ml). Tyto rozpuštěné vzorky se potom uschovávaly v automatickém vzorkovači ochlazeném na 6 °C až do zkoumání. Vstřikované množství jednoho vzorku bylo 20 μΐ (= 7 gg G-CSF), doba průtoku jednoho vzorku 32 min. Vyhodnocení výsledků probíhalo za použití pracovního standardu GCSF. Aby bylo možno produkty přídavně kvalitativně posuzovat, prováděla se kromě toho při každém stanovení obsahu SDS-gelová elektroforéza s vybarvením pomocí „silver stain“. Výsledky k SDS-gelové elektroforéze jsou znázorněny v příkladu 8 b, obr. 9. Ve vodných roztocích se denaturuje protein při teplotě mezi 45 a 47 °C v průběhu několika hodin. Pomocí této receptury se podařilo po dobu týdnů stabilizovat protein dokonce při teplotě uskladnění 50 °C.

a. Stabilita rh-G-CSF v maltózové receptuře sušené ve vakuu s L-argininem a L-fenylalaninem

Tabulka 16

Obsahy monomeru uvedené v %, získané v HP-SEC

Doba uskladnění [týdny]	Teplota uskladnění
TCH	PT	30 °C	40 °C	50 °C
0	-	99,83 %	-	-	-
5	99,94 %	99,93 %	99,86 %	99,89 %	99,87 %
13	99,83 %	99,86 %	99,88 %	99,83 %	99,83 %
26	99,76 %	99,75 %	99,55 %	99,36 %	99,21 %
39	99,68 %	96,73 %	96,40 %	93,81 %	89,27 %
52	98,34 %	94,81 %	94,70 %	91,27 %	86,27 %

TCH = teplota chladničky,

PT = pokojová teplota = 20-22 °C.

Výsledky gelové permeační chromatografíe jasně ukazují, že pomocí této receptury je možno protein rh-G-CSF v takovém přípravku sušeném za vakua stabilizovat po delší dobu. Pokus ukazuje, že je možno delší dobu stabilizovat rh-G-CSF v částečně amorfní, za vakua sušené receptuře maltózy, obsahující L-arginin a L-fenylalanin pod teplotou skelného přechodu.

-15CZ 293456 B6

b. Přehled výsledků SDS-gelové elektroforézy všech receptur, které obsahovaly účinnou látku rh-G-CSF

Nejdříve se připravily polyakrylamidové gely obsahující SDS, jejichž dělicí gel obsahoval 15 % akrylamidu a jejichž sběrný gel obsahoval 3 % akrylamidu a 1 % dodecylsulfátu sodného (SDS). Příprava vzorků probíhala tak, že ze 3 injekčních lahviček se připravil 1 směsný vzorek. Hned potom se tento zkušební roztok zředil zkušebním pufrem obsahujícím dithiothreit (DTT) a bromfenolovou modř tak, že vznikla koncentrace 150 pg/ml rh-G-CSF. Vzorky se denaturovaly 5 minut při 95 °C v předehřátém vytápěcím bloku. Jako srovnávací proteiny se použily proteiny „Combithek Eichproteine fur die Chromatographie MG 18000-300000“ od Boehringer Mannheim. Tyto se připravily a zpracovaly přesně tak jako vzorky rh-G-SCF. Kromě toho se připravil pracovní standard rh-G-CSF, který se použil ke srovnání. Gelová elektroforéza se prováděla pomocí miniaturní jednotky pro gelovou elektroforézu (Midget Gelektrophoresis Unit, Pharmacia - LKB 2050) a pomocí příslušné jednotky napětí. Když se naplnil elektroforetický pufr, do každého gelového zásobníku se naplnilo 20 μΐ vzorku (tj. 3 gg rh-G-CSF). Po uzavření elektroforetické komory a nastavení vodního chlazení se vložilo napětí 80 V, které se zvýšilo na 130 V, když protekl sběrný gel. Krátce předtím než pás bromfenolové modři dosáhl konce gelu, elektroforéza se ukončila. Gely se odstranily z komory a promyly dvakrát destilovanou vodou. Potom se provádělo barvení „silver stain“ pomocí Daiichi 2D-silver-stain Π Kit podle tam obsaženého návodu. Po ukončení barvení se provádělo optické posuzování gelů.

Tabulka 17

Výsledek gelové elektroforézy

Stopa	Přípravek	Vizuální výsledek
1	Srovnávací proteiny
2	Příklad 8: Maltózová receptura obsahující L-arginin a L-fenylalanin	jen monomery
3	Srovnávací příklad D: Sušení bez pomocných látek	monomery a dimery
4	Srovnávací příklad E: Čistá maltózová receptura	monomery, dimery a trimery
5	Srovnávací proteiny
6	Příklad 9: Receptura bez cukrů, obsahující L-arginin a L-fenylalanin	jen monomery
7	Srovnávací příklad F: L-Argininová receptura s kyselinou fosforečnou	monomery a dimery
8	Srovnávací příklad G: Krystalická receptura L-valinu a L-glycinu	monomery, dimery a produkty odbourání

Receptury příkladů 8 a 9 ukazují při této zkoušce jen monomery. Při srovnávacím příkladu D a F je možno kromě monomeru rozeznat ještě dimery, v příkladu E kromě toho přídavně trimery. V krystalickém přípravku L-valinu a L-glycinu srovnávacího příkladu G se pozorují kromě toho ještě 2 produkty degradace, jejichž molekulová hmotnost je menší než molekulová hmotnost monomeru, a 2 slabé pásy produktů degradace, jejichž molekulová hmotnost leží mezi molekulovou hmotností monomeru a dimeru.

Na základě této citlivé metody se mohly stát velmi dobře viditelnými produkty degradace a agregace monomeru, které se nacházely v množstvích > 1 %.

-16CZ 293456 B6

Srovnávací příklad D

Vakuové sušení rh-G-CSF bez přídavku pomocných látek

Při tomto pokusu se připravil roztok, který obsahoval jen protein rh-G-CSF v koncentraci 0,35 mg/ml ve zředěném fosfátovém pufru (přibližně 0,01m). Tento proteinový roztok se připravil, zpracoval a analyzoval, jak je popsáno v příkladu 8. Při tomto přípravku nebylo z technických důvodů možno u konečných produktů stanovit obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu. Údaje o stabilitě rh-G-CSF sušeného ve vakuu bez pomocných látek.

Tabulka 18

Doba uskladnění [týdny]	Teplota uskladnění
TCH	PT	40 °C
0	—	97,84 %	—
5	94,90 %	94,53 %	93,96 %
13	91,31 %	89,66 %	78,23 %
26	80,06 %	73,60 %	52,22 %

TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C,

PT = pokojová teplota = 20-22 °C.

Údaje o stabilitě čistého proteinu jasně ukazují stabilizující účinek pomocných látek receptury popsané v příkladu 8. Také u této receptury se při každé zkoušce prováděla SDS-gelová elektroforéza s vybarvením pomocí „silver stain“. Výsledky viz v příkladu 8 b.

Srovnávací příklad E rhG-CSF v čisté maltózové receptuře sušené ve vakuu

Připravil se roztok, který obsahoval v 1 ml 50 mg monohydrátu maltózy, 0,1 mg Polysorbátu 80 a 0,35 mg rhG-CSF. Hodnota pH receptury se nastavila pomocí sodného louhu na 7,4. Výchozí roztok a konečné produkty se připravily, zpracovaly a analyzovaly tak, jak je popsáno v příkladu 8. Jak ukazuje již příklad 1, je obtížné vysušit maltózu bez přísady aminokyselin za 48 h na malé zbytkové vlhkosti. Proto vznikají produkty s obsahem zbytkové vody 10,43 % a teplotou skelného přechodu -2 °C. Při teplotách uskladnění, tedy nad skelným přechodem, neexistuje žádné amorfní, křehké sklo, nýbrž vysoce viskózní, houževnatá elastická hmota. Stabilita rhGCSF v maltózovém přípravku sušeném ve vakuu bez aminokyselin.

Tabulka 19

Uvedeny jsou obsahy monomeru v %, které se získaly v HP-SEC

Doba uskladnění [týdny]	Teploty uskladnění
TCH	PT	30 °C	40 °C	50 °C
0	-	97,99 %	-	-	—
5	98,26 %	96,82 %	93,91 %	67,45 %	42,63 %
13	97,15 %	90,49 %	73,70 %	30,05 %	18,52%
26	97,05 %	88,23 %	71,32%	22,30 %	15,27 %

-17CZ 293456 B6

K výsledkům SDS-gelové elektroforézy viz příklad 8 b. Výsledek ukazuje, že není výhodné uschovávat rhG-CSF v cukrové směsi bez aminokyselin. Stabilita je jasně nižší než u sypkého materiálu sušeného ve vakuu (srovnávací příklad D) a u optimalizované receptury sušené ve vakuu (příklad 8).

Tento pokus ukazuje jasně nutnost přísady aminokyselin k cukrům při vakuovém sušení k tomu, aby se získaly produkty s vysokými skelnými přechody, ve kterých se potom protein stabilizuje pomocí amorfní struktury pomocné látky. Skladování produktů pod teplotou skelného přechodu se ukazuje jako nutnost pro stabilizaci účinné látky. Je třeba ještě poznamenat, že ve vzorcích, které byly uskladněny při 40 a 50 °C, se zcela vykrystalizovala maltóza již po 4 týdnech. Takovým fyzikálním změnám ve vzorcích v průběhu skladování je třeba zabránit; urychlují úbytek obsahu monomeru.

Příklad 9 rh-G-CSF v receptuře L-argininu a L-fenylalaninu bez cukrů, sušené ve vakuu

Připravil se roztok, který obsahoval v 1 ml 20 mg L-argininu a 20 mg L-fenylalaninu, 0,1 mg Polysorbátu 80 a 0,35 mg rh-G-CSF. Po nastavení hodnoty pH na 7,4 pomocí kyseliny chlorovodíkové se roztok zpracoval, sušil a analyzoval tak, jak je popsáno v příkladu 8. Po ukončení sušení byl k dispozici homogenní produkt s teplotou skelného přechodu 77,0 °C a obsahem zbytkové vody 1,30 %. Stabilita rh-G-CSF v receptuře argininu a fenylalaninu, sušené ve vakuu.

Tabulka 20

Uvedeny jsou podíly monomeru získané v HP-SEC

Doba uskladnění [týdny]	Teploty uskladnění
TCH	PT	30 °C	40 °C	60 °C	80 °C
0	-	99,57 %	-	—	-	-
4	99,36 %	99,36 %	99,50 %	99,81 %	95,56 %	1,44%
13	99,17%	99,31 %	99,40 %	99,64 %	-	—
26	98,64 %	98,62 %	96,52 %	91,06 %	—	—
39	99,64 %	94,18%	88,99 %	79,05 %	-	-

TCH = teplota chladničky = 4-6 °C,

PT = pokojová teplota = 20-22 °C.

Výsledky zkoumání trvanlivosti ukazují jasně, že je možno s touto recepturou po delší dobu protein rh-G-CSF stabilizovat v částečně amorfním, ve vakuu sušeném aminokyselinovém přípravku, pokud teploty uskladnění jsou zřetelně nižší než teploty skelného přechodu (srovnej také srovnávací příklad C). Uskladnění při 80 °C ve srovnání s uskladněním při 60 °C ukazuje tento fenomén vztahující se ke skelnému přechodu při 77 °C.

Aby bylo možno doplňkově posuzovat produkty kvalitativně, provázela se kromě toho s každým stanovením obsahu SDS-gelová elektroforéza s vybarvením „silver stain“. Výsledky této SDSgelové elektroforézy jsou znázorněny v příkladu 8 b. Stejná receptura se uskladňovala také při různých teplotách po dobu 1 roku. Výsledek je znázorněn v tabulce 20a.

-18CZ 293456 B6

	Obsah vody [%]	Tg [°C]	Obsah monomeru G-CSF [%]
Start	0,77	82,1	99,82

po 52 týdnech:

TCH	1,20	79,52	98,34
PT	2,08	69,47	94,81
30 °C	2,21	67,91	94,70
40 °C	2,32	67,36	91,27
50 °C	2,40	68,63	86,26

TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C,

PT = pokojová teplota = 20-22 °C.

Pokus ukazuje, že je možno rh-G-CSF stabilizovat v částečně amorfní, ve vakuu sušené receptuře L-argininu a L-fenylalaninu pod teplotou skelného přechodu.

Srovnávací příklad F rh-G-CSF v L-argininové receptuře sušené ve vakuu s kyselinou fosforečnou

Připravil se roztok, který obsahoval v 1 ml 40 mg L-argininu, 0,1 mg polysorbátu 80 a 0,35 mg rh-G-CSF. Po nastavení hodnoty pH pomocí kyseliny fosforečné na 7,4, se roztok zpracoval, sušil a analyzoval, jak je popsáno v příkladu 8. Vysušený konečný produkt vykazoval obsah zbytkové vody 3,59 % a teplotu skelného přechodu 8,6 °C. Tento produkt byl tedy po ukončení sušení při pokojové teplotě k dispozici nikoli jako křehké, amorfní sklo, nýbrž jako vysokoviskózní, houževnatá plastická hmota. Stabilita rh-G-CSF v L-argininové receptuře, sušené ve vakuu.

Tabulka 21

Podíly monomeru v % získané v HP-SEC

Doba uskladnění [týdny]	Teploty uskladnění
-20 °C	TCH	PT	30 °C	40 °C	60 °C	80 °C
0	-	-	99,60 %	-	—	—	—
4	99,57 %	99,60 %	99,37 %	99,34 %	99,20 %	89,46 %	31,81 %
13	99,75 %	98,17%	98,06 %	97,31 %	93,41 %	-	—
33	99,28 %	99,30 %	99,21 %	97,86 %	93,02 %	-	-

Nedosahuje se stabilizujícího efektu, kterého se dosahuje v suchém, částečně amorfním skle (příklad 8 a 17). Toto ukazuje význam vhodné směsi pomocných látek, aby se jejich chování při sušení v průběhu vakuového sušení zlepšilo a tak se získala při pokojové teplotě částečně amorfní skla. Především při vyšších teplotách (30 a 40 °C) se toto stává zřetelným. Stabilita je ve srovnání s účinnou látkou sušenou ve vakuu bez pomocných látek v této směsi zvýšena (srovnej srovnávací příklad D). Aby bylo možno přídavně kvalitativně posuzovat produkty, prováděla se kromě toho při každém stanovení obsahu SDS-gelová elektroforéza s vybarvením pomocí „silver stain“. Výsledky této SDS-gelové elektroforézy jsou znázorněny v příkladu 8.

-19CZ 293456 B6

Srovnávací příklad G rh-G-CSF v krystalické receptuře L-valinu a glycinu, sušené ve vakuu

K roztoku, který obsahoval v 1 ml po 20 mg L-valinu a glycinu a 0,1 mg Polysorbátu 80, se přidalo 0,35 mg rh-G-CSF na 1 ml a hodnota pH roztoku se nastavila pomocí sodného louhu na 7,4. Hotový smíšený roztok se zpracoval, sušil a analyzoval, jak je popsáno v příkladu 8. Zkouška po ukončení sušení ukazovala, že se při hotových vzorcích jednalo o krystalický produkt s obsahem zbytkové vody 0,82 %. Stabilita rh-G-CSF v krystalické, ve vakuu sušené receptuře L-valinu a glycinu.

Tabulka 22

Podíly monomeru jsou uvedeny v %, jak se získaly v HP-SEC

Doba uskladnění [týdny]	Teploty usk adnění
TCH	PT	30 °C	40 °C	60 °C	80 °C
0	—	94,36 %	—	—	-	-
4	89,93 %	89,66 %	84,26 %	72,47 %	44,54 %	27,44 %
13	74,14%	73,91 %	64,90 %	46,82 %	-	-
33	73,75 %	70,04 %	54,93 %	40,40 %	-	-

TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C,

PT = pokojová teplota = 20 - 22 °C.

Tento výsledek zřetelně ukazuje, že krystalická aminokyselinová receptura ani při nízkých obsazích zbytkové vody není schopna stabilizovat rh-G-CSF. Ve srovnání s rh-G-CSF sušeným ve vakuu bez pomocných látek se zřetelně ukazuje destabilizující účinek takového přípravku (viz srovnávací příklad D).

Aby bylo možno produkty přídavně kvalitativně posuzovat, prováděla se kromě toho při každém stanovení obsahu SDS gelová elektroforéza s vybarvením pomocí „silver stain“. Výsledky této SDS-gelové elektroforézy jsou znázorněny v příkladu 8 b.

Příklad 10

Vakuové sušení erytropoetinu v sacharózové receptuře obsahující L-arginin a L-fenylalanin

Připravil se roztok obsahující v 1 ml 50 mg sacharózy, po 10 mg L-argininu a L-fenylalaninu a 0,1 mg Polysorbátu 80. Do tohoto roztoku se přidalo 5000 U eiytropoetinu (EPO) na 1 ml a hodnota pH se pomocí kyseliny fosforečné nastavila na 7,2. Roztok se zpracoval a sušil, jako je popsáno v příkladu 8. Vznikl suchý, částečně amorfní produkt s obsahem zbytkové vody 0,56 % a teplotou skelného přechodu 86,6 °C. U EPO je podíl vzniklého dimeru v připraveném produktu dobrým kritériem pro posuzování stability produktu. Proto jsou množství monomeru a dimeru zjištěné pomocí gelové permeační chromatografie (na podmínku 3 jednoduchá měření) mírou pro stabilizující účinek našich přípravků připravených pomocí sušení.

Při gelové permeační chromatografíi se molekuly proteinu oddělí na základě velikosti jejich částic v rozpuštěném stavu, tj. vysokomolekulámí složky (dimery) se separují od monomerů EPO. Zkouška (HP-SEC) se prováděla v aparatuře HPLC od Shimadzu za použití automatického vzorkovače (Gilson Abimed 231). Jako dělicí kolona se použila kolona TSK-Gel G3000 SWXL

-20CZ 293456 B6 (7,8x300 mm) od firmy TosoHaas. Detekce oddělených složek probíhala fotometricky při 280 nm (Měrek Fluorescence Spectrophotometer 820 FP). Jako elučního prostředku se použilo 0,41M sodno-draselného fosfátového pufru s chloridem sodným, pH 7,3, pomocí kterého se nastavil průtok 0,6 ml/min při pokojové teplotě. Vzorky určené ke zkoumání se rozpustily ve dvakrát destilované vodě tak, aby se znovu připravila výchozí koncentrace (přídavek 1 ml). Tyto rozpuštěné vzorky se potom uschovávaly v automatickém vzorkovači až do zkoumání. Vstřikované množství jednoho vzorku bylo 100 μΐ (= 2 pg EPO), doba průtoku jednoho vzorku 25 min. Vyhodnocení výsledků se provádělo za využití pracovního standardu EPO.

Stabilita EPO v sacharózové receptuře obsahující Lz-arginin a L-fenylalanin, sušené ve vakuu

Tabulka 23

Uvedeny jsou obsahy monomeru v % získané v HP-SEC

Doba uskladnění [týdny]	Teploty uskladnění
TCH	PT	40 °C
0	-	100%	-
4	100 %	100%	100 %
9	100%	100%	100 %
13	100%	100%	100 %
26	100 %	100%	99,9 %

TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C, PT = pokojová teplota = 20 - 22 °C.

Výsledek ukazuje, že je možno stabilizovat EPO pomocí vakuového sušení se zde zvolenými kombinacemi pomocných látek. Aby bylo možno produkty přídavně kvalitativně posuzovat, prováděla se kromě toho při každém stanovení obsahu SDS gelová elektroforéza s vybarvením „silver stain“. Příprava gelů, provádění elektroforézy a vybarvení gelů probíhalo tak, jak se popisuje v příkladu 8 b. Příprava vzorků probíhala tak, že ze 3 injekčních lahviček se připravil 1 směsný vzorek. Hned potom se tento zkušební roztok zředil zkušebním pufrem obsahujícím bromfenolovou modř, takže vznikla koncentrace EPO 20 pg/ml. Vzorky se denaturovaly 5 minut při 95 °C v předehřátém vytápěcím bloku. Jako srovnávací proteiny se použily proteiny „Bio-Rad Standard Low“. Tyto se připravily a zpracovaly přesně tak jako vzorky EPO. Kromě toho se připravil pracovní standard EPO, který se použil pro srovnání. Gelová elektroforéza se prováděla pomocí miniaturní jednotky pro gelovou elektroforézu (Midget Gelektrophoresis Unit, Pharmacia - LKB 2050), a pomocí příslušné jednotky napětí. Když se naplnil elektroforetický pufř, do každého gelového zásobníku se naplnilo 20 μΐ vzorku (tj. 400 ng EPO). Po ukončení barvení se provádělo optické posuzování gelů a gely se fotografovaly. Na základě této citlivé metody se mohly stát velmi dobře viditelnými produkty degradace a agregace monomomeru, které byly v množství > 1 %.

Výsledek elektroforézy

U zde popsané receptury bylo možno u všech vzorků po 9 týdnech rozeznat v gelu jen jeden pás monomeru odpovídající pracovnímu standardu. Toto zdůrazňuje stabilitu proteinu v tomto přípravku.

-21 I

Srovnávací příklad H

Vakuové sušení erytropoetinu bez přídavku pomocných látek

V tomto pokusu se připravil výchozí roztok, který obsahoval jen účinnou látku EPO (50 000 U/ml) ve zředěném fosfátovém pufru (přibližně 5 mM). Roztok se připravil, zpracoval a sušil jako v příkladu 8.

U tohoto přípravku nebylo z technických důvodů možno stanovit u konečných produktů obsah ío zbytkové vody a teplotu skelného přechodu, protože existující množství v jedné lahvičce byla příliš malá (přibližně 0,2 mg). Stabilita proteinu se posuzovala pomocí gelové permeační chromatografie jako v příkladu 10.

Stabilita EPO sušeného ve vakuu bez pomocných látek.

Tabulka 24

Uvedeny jsou obsahy monomeru v % získané v HP-SEC

Doba uskladnění [týdny]	Teplota uskladnění
TCH	PT	40 °C
0	-	99,5 %	—
4	98,6 %	94,4 %	88,0 %
9	96,0 %	89,0 %	75,0 %
13	95,7 %	87,0 %	76,3 %
26	94,7 %	88,2 %	66,6 %

TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C,

PT = pokojová teplota = 20-22 °C.

Při každém stanovení obsahu se rovněž prováděla SDS-gelová elektroforéza s vybarvením „silver stain“. Příprava gelů, příprava vzorků, provádění elektroforézy a vybarvení gelů se uskutečňovalo jako v příkladu 10. Po vybarvení gelů bylo možno u vzorků každé skladovací teploty kromě pásů monomeru odpovídajících pásu pracovního standardu zřetelně rozeznat pás dimeru. Tímto pokusem se stává jasným stabilizující účinek kombinace pomocných látek použité v pří30 kladu 10. Stabilita čisté účinné látky v tomto příkladu je zřetelně snížena ve srovnání se stabilitou účinné látky v receptuře příkladu 10; je možno pozorovat tvorbu dimeru. Čím vyšší je teplota uskladnění, tím zřetelnějším se stává ochranný účinek zvolené kombinace pomocných látek v pokusu 10.

Příklad 11

Laktátdehydrogenáza v receptuře L-maltózy, L-argininu a L-fenylalaninu, sušené ve vakuu

Připravil se roztok obsahující v 1 ml 50 mg monohydrátu maltózy, 10 mg L-argininu a 10 mg Lfenylalaninu. K tomuto roztoku se přidala laktátdehydrogenáza (LDH) tak, že výsledná aktivita proteinu byla 165 U/ml. Hodnota pH roztoku se nastavila pomocí kyseliny fosforečné na 7,0. Roztok se připravil, zpracoval a sušil jako v příkladu 8. Po vysušení vznikl homogenní produkt s teplotou skelného přechodu 96 °C a obsahem zbytkové vody 0,82 %. Hotové vzorky se usklad45 nily při různých teplotách a aktivita proteinu se posuzovala po různých dobách uskladnění. U LDH se určila enzymatická aktivita jako míra pro stabilitu proteinu. Toto určení se provádělo fotometricky. Ve zkušebním roztoku se pyruvát redukoval pomocí NADH za katalytického působení LDH na laktát a NAD. Úbytek obsahu NADH v roztoku bylo možno sledovat

-22CZ 293456 B6 fotometricky (λ = 365 nm; ε = 3,4 cm²/pmol). Aktivita se měřila (spektrofometr Perkin-Elmer

552 UV/VIS) v 100 nebo 200-krát zředěných výchozích roztocích vkyvetě z umělé hmoty (tloušťka absorpční vrstvy = 1 cm). Z úbytku za časovou jednotku se může vypočítat proteinová aktivita LDH. Stabilita LDH v maltózové receptuře obsahující arginin a fenylalanin, sušené ve vakuu. Aktivita výchozího roztoku odpovídala hodnotě 100 %.

Tabulka 25

Uvedena je aktivita v % získaná ve zkoušce

Doba uskladnění [týdny]	Teploty uskladnění
TCH	PT	30 °C	40 °C	60 °C
0	-	85,3 %	-	-	—
5	87,81 %	87,45 %	81,15 %	80,42 %	64,42 %
13	83,28 %	79,41 %	78,79 %	61,74%	-

TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C,

PT = pokojová teplota = 20 - 22 °C.

Pokus zřetelně ukazuje stabilizující účinek receptury pro velmi citlivý protein LDH.

Srovnávací příklad I

Vakuové sušení laktátdehydrogenázy bez přídavku pomocných látek

V tomto pokusu se připravil roztok čisté účinné látky laktátdehydrogenázy (LDH) s aktivitou 136U/ml ve zředěném fosfátovém pufru (8 mM). Roztok se připravil, zpracoval a sušil jako v příkladu 8. Při tomto přípravku nebylo z technických důvodů možno u konečných produktů stanovit obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu, protože existující množství v jedné lahvičce byla příliš malá (přibližně 0,2 mg). Stabilita proteinu se posuzovala jako v příkladu 11. Stabilita LDH bez pomocných látek, sušené ve vakuu. Aktivita výchozího roztoku odpovídala hodnotě 100 %.

Tabulka 26

Uvádí se aktivita v %, získaná ve zkoušce

Doba uskladnění [týdny]	Teplota uskladnění
TCH	PT	40 °C
0	—	64,52 %	—
5	66,54 %	23,03 %	1,57 %
13	50,63 %	6,81 %	0%

TCH = teplota chladničky = 4-6 °C,

PT = pokojová teplota = 20-22 °C.

Tímto pokusem se stává zřetelným stabilizující účinek kombinace pomocných látek použitých v příkladu 11. Stabilita čisté účinné látky v tomto příkladu je ve srovnání se stabilitou účinné látky v receptuře příkladu 11 zřetelně snížena. Čím vyšší je teplota uskladnění, tím zřetelnějším se stává ochranný účinek zvolené kombinace pomocných látek v pokusu 11. Rozdíl mezi

-23CZ 293456 B6 stabilitou čistého proteinu a stabilitou proteinu sušeného v kombinaci pomocných látek je nejzřetelnější u LDH.

Příklad 12

Laktátdehydrogenáza v receptuře L-argininu a L-fenylalaninu bez cukrů, sušené ve vakuu

Připravil se zásobní roztok s 20 mg L-argininu a 20 mg L-fenylalaninu v 1 ml. K němu se po nastavení hodnoty pH na 7,0 pomocí kyseliny fosforečné přidala laktátdehydrogenáza (LDH) tak, že vznikl výchozí roztok s proteinovou aktivitou 168 U/ml. Roztok se připravil, zpracoval a sušil jako v příkladu 8. Po vysušení vznikl homogenní produkt s teplotou skelného přechodu 103,9 °C a obsahem zbytkové vody 1,18 %. Hotové vzorky se uskladnily při různých teplotách a proteinová aktivita se posuzovala po různých dobách uskladnění. Proteinová analýza se prováděla jako v příkladu 11. Stabilita LDH v přípravku L-argininu a L-fenylalaninu bez cukrů, sušené ve vakuu. Aktivita výchozího roztoku před sušením odpovídala hodnotě 100 %.

Tabulka 27

Uvádí se enzymová aktivita v % získaná v testu aktivity

Doba uskladnění [týdny]	Teploty uskladnění
TCH	PT	30 °C	40 °C	60 °C
0	-	80,36 %	—	-	—
4	79,70 %	82,08 %	79,34 %	77,62 %	70,54 %
13	82,25 %	76,11 %	75,21 %	73,06 %	-

Pokus zřetelně ukazuje stabilizující účinek tohoto aminokyselinového přípravku v celém zkušebním teplotním rozsahu. Stabilita LDH je ve srovnání se sušením čisté účinné látky (srovnávací příklad I) zřetelně zvýšena.

Srovnávací příklad J

Laktátdehydrogenáza sušená ve vakuu v krystalické receptuře L-valinu a glycinu

Připravil se zásobní roztok s 20 mg L-valinu a 20 mg glycinu v 1 ml. K němu se po nastavení hodnoty pH na 7,0 pomocí roztoku NaOH přidala laktátdehydrogenáza (LDH) tak, že vznikl výchozí roztok s proteinovou aktivitou 147 U/ml. Roztok se připravil, zpracoval a sušil jako v příkladu 8. Po vysušení vznikl homogenní, dokonale krystalický produkt s obsahem zbytkové vody 1,12 %. Hotové vzorky se uskladnily při různých teplotách a proteinová aktivita se posuzovala po určených dobách uskladnění jako v příkladu 11. Stabilita LDH v dokonale krystalickém přípravku L-valinu a glycinu, sušeném ve vakuu. Aktivita výchozího roztoku před sušením odpovídala hodnotě 100 %.

-24CZ 293456 B6

Tabulka 28

Uvádí se enzymová aktivita v % získaná v testu aktivity

Doba uskladnění [týdny]	Teploty uskladnění
TCH	PT	30 °C	40 °C	60 °C
0	-	9,26 %	-	-	—
5	3,69 %	2,11 %	1,09 %	0,80 %	0,0 %
13	0,08 %	0,01 %	0%	0%	0%

Tento pokus zřetelně ukazuje, že krystalická aminokyselinová receptura má v průběhu vakuového sušení velmi negativní účinek na enzym. Již v průběhu sušení, to znamená během tvorby krystalické struktury, se ztrácí již 90 % aktivity. Také při uskladnění při různých teplotách se nemůže ještě existující aktivita zachovat. Po 5 týdnech se počáteční hodnoty vzorků ještě více zhoršily. Dokonale krystalická aminokyselinová receptura je tedy pro stabilizaci LDH úplně nevhodná.

Příklad 13

V tomto pokusu se sušil ve vakuu roztok čisté maltózy (50 mg/ml) a roztok maltózy a fenylalaninu (40 mg/ml maltózy a 10 mg/ml fenylalaninu). Zároveň stím se připravily podobné přípravky s přísadou 10 pg/ml rh-ngf nebo 100 pg/ml PTH (1-37) nebo 500 pg/ml ularitidů. Roztoky se po přípravě sterilně filtrovaly a plnily do 2ml lahviček. Vzorky se sušily ve vakuu při 20 °C a po předem zadaných dobách se z obou receptur odebraly vzorky. U odebraných vzorků se určilo množství zbytkového plnění, obsah vody podle Karla Fischera a T_g. Během celé doby sušení se udržovala teplota plotny 20 °C. Tlak v komoře se snižoval postupně až na přibližně 10³ mbar (1 bar = 10⁵ Pa). Hmotnost náplně lahviček u obou receptur se 7 h zmenšovala na přibližně 6 % výchozí hodnoty, tj. roztoky se velmi rychle zkoncentrovaly. U receptury čisté maltózy vzniká nejdříve přesycený roztok, který potom přechází do kaučukovitého stavu.

V dalším průběhu sušení je možno rozeznat malou výhodu při úbytku hmotnosti v přípravku obsahujícím fenylalanin ve srovnání s čistým roztokem cukru. Po ukončení sušení je u vzorků maltózy ještě přibližně 5,5 % původní hmotnosti náplně v lahvičkách, zatím co u směsi maltózy a fenylalaninu ještě přibližně 4,9 % množství náplně.

Tento výsledek se stává ještě zřetelnější, když se místo změny hmotnosti náplně posuzuje změna obsahu vody ve vzorcích. Na začátku sušení se roztok skládá z 95,08 % vody, tj. jedna lahvička obsahuje přibližně 965 mg vody. Cílem je suchý produkt se zbytkovou vlhkostí 1 - 2 %. Při množství pevné fáze 50 mg odpovídá 1 - 2 % potom 0,5 - 1 mg vody na 1 lahvičku. Podle toho se musí během sušení asi 99,95 % vyskytující se vody sublimovat ze vzorku, aby se získal suchý produkt. V pokročilém stadiu sušení se určil obsah vody vzorků podle Karla Fischera. Toto se provádělo u vzorků obsahujících fenylalanin pomocí přímého vnesení vzorků do roztoku methanolu. Velmi lepivý cukr se nedá přímo převést do roztoku methanolu. Tento se rozpustil nejdříve v bezvodém DMF. Potom se určil obsah vody tohoto roztoku. Obr. 3a znázorňuje výsledky takto uskutečněného stanovení zbytkové vody. Velmi zřetelně se rozeznává převaha přípravku obsahujícího aminokyseliny. Již po 17 hodinách sušení se tu obsah zbytkové vody snížil na 2,7 %, zatím co u maltózové receptury byl ještě 13,59 %. Tento výsledek ukazuje výhodu roztoku obsahujícího fenylalanin. Maltózy není možno za těchto podmínek způsobu vysušit za 48 h. Po ukončení sušení existuje při pokojové teplotě stále ještě „rubber“ („pryž“) s velkým obsahem zbytkové vody. Kromě obsahů zbytkové vody se určily také teploty skelného přechodu jednotlivých vzorků pomocí DSC. Protože teploty skelného přechodu korespondují přímo s obsahem vody vzorků, vykazuje směs maltózy a fenylalaninu zřetelně vyšší hodnoty. Výsledek ukazuje, že T_g směsí aminokyselin a cukrů je již po přibližně 10 hodinách v rozsahu teploty plotny. Příslušné naměřené hodnoty jsou znázorněny na obr. 3b. Protože v tomto stadiu sušení se odpaří ještě jen velmi málo vody, je teplota produktu v rozsahu teploty plotny. Tak existuje již po 10 hodinách procesu

-25CZ 293456 B6 sušení v lahvičkách při pokojové teplotě sklo. V případě stabilizace proteinů pomocí takové receptury to znamená, že protein je již po 10 hodinách zalitý ve stabilizujícím skle. Doba, v průběhu které zůstává protein ve zkoncentrovaném roztoku nebo v „rubber“, je tedy velmi krátká, což představuje pro stabilitu účinné látky velkou výhodu. Čistý cukr existuje sám oproti tomu po ukončení sušení při pokojové teplotě ještě jako „rubber“ a nemá tak v případě produktu obsahujícího proteiny žádný stabilizující účinek na účinnou látku.

Rozličné přípravky obsahující proteiny se neodlišují fyzikálními zbytkovými veličinami od základních receptur bez účinné látky.

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby suchých, částečně amorfních produktů, které kromě jedné nebo více substancí ze skupin, zahrnujících proteiny, humánní peptidy, glykoproteiny, lipoproteiny, enzymy, koenzymy, protilátky, fragmenty protilátek, viry, složky virů, buňky, složky buněk, vakcíny, DNA, RNA, PNA a jejich deriváty, obsahují směsi substancí, přičemž tyto směsi substancí jsou zvoleny tak, že obsahují alespoň po jedné substanci ze skupiny:

   (i) sacharid nebo amfotemí iont s polárním zbytkem a jejich deriváty, a (ii) amfotemí iont s nepolárním zbytkem a jeho deriváty, vyznačující se tím, že se vyrobí roztok jedné nebo více substancí ze skupin zahrnujících proteiny, humánní peptidy, glykoproteiny, lipoproteiny, enzymy, koenzymy, protilátky, fragmenty protilátek, viry, složky virů, buňky, složky buněk, vakcíny, DNA, RNA, PNA a jejich deriváty, a substancí (i) a (ii) a tento roztok se suší bez zmrazování tohoto roztoku.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že amfotemím iontem s nepolárním zbytkem je aminokyselina nebo její derivát.
3. 3. Způsob podle jednoho z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že amfotemím iontem s polárním zbytkem je aminokyselina nebo její derivát.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že směsi substancí jsou zvoleny z jedné nebo více látek ze skupiny zahrnující:

   sacharidy, monosacharidy, disacharidy, amfotemí ionty s polárním zbytkem, arginin, kyselinu asparagovou, citrulin, kyselinu glutamovou, omithin, histidin, lysin a jejich deriváty a amfotemí ionty s nepolárním zbytkem, acetylfenylalaninethylester, alanin, cystein, glycin, izoleucin, leucin, methionin, fenylalanin, tryptofan, valin, sarkosin a jejich deriváty.
5. 5. Způsob podle jednoho z nároků laž4, vyznačující se tím, že roztok doplňkově obsahuje obvyklé pomocné látky zvolené ze skupin zahrnujících pufry, tenzidy, antioxidanty, izotonizační prostředky, konzervační prostředky.
6. 6. Způsob podle jednoho z nároků laž5, vyznačující se tím, že sušení se provádí prostřednictvím vakuového sušení.
7. 7. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že vakuové sušení se provádí kontinuálním způsobem sušení.

   -26CZ 293456 B6
8. 8. Způsob podle jednoho z nároků laž5, vyznačující se tím, že sušení se provádí prostřednictvím sušení rozprašováním.
9. 9. Způsob podle jednoho z nároků laž5, vyznačující se tím, že sušení se provádí prostřednictvím sušení na válcích.
10. 10. Způsob podle jednoho z nároků laž5, vyznačující se tím, že sušení se provádí prostřednictvím infračerveného záření, mikrovln nebo jiných způsobů sálavého sušení.
11. 11. Způsob podle jednoho z nároků lažlO, vyznačující se tím, že amfotemí iont s nepolárním zbytkem je zvolen tak, aby vysušená směs substancí vykazovala zvýšenou teplotu skelného přechodu ve srovnání se směsí substancí bez odpovídající přísady.
12. 12. Způsob podle jednoho z nároků laž7, vyznačující se tím, že sušení se provádí v lyofilizačním zařízení bez předchozího zmrazování.
13. 13. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 7, 11 nebo 12, vyznačující se tím, že sušení směsi substancí se provádí v jednorázových dávkovačích baleních.
14. 14. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že získaná směs látek se hned potom mele na prášek.
15. 15. Směsi substancí obsahující kromě jedné nebo více substancí ze skupin zahrnujících proteiny, humánní peptidy, glykoproteiny, lipoproteiny, enzymy, koenzymy, protilátky, fragmenty protilátek, viry, složky virů, buňky, složky buněk, vakcíny, DNA, RNA, PNA a jejich deriváty, látky zvolené po jedné nebo více substancí z následujících skupin:

    (i) sacharid nebo amfotemí iont s polárním zbytkem a jejich deriváty, (ii) amfotemí ionty s nepolárním zbytkem a jejich deriváty, vyznačující se tím, že směsi substancí vykazují pomocí přísady jedné nebo více substancí ze skupiny (ii) zvýšenou teplotu skelného přechodu ve srovnání se substancemi ze skupiny (i) bez příslušné přísady, přičemž lyofilizáty jsou vyloučeny.
16. 16. Směsi substancí připravitelné způsobem podle jednoho z nároků 1 až 14.
17. 17. Směsi substancí podle nároku 15 nebo 16, vyznačující se tím, že jsou částečně amorfní.
18. 18. Směsi substancí podle jednoho z nároků 15 až 17, vyzn ač uj ící se tím, že teplota skelného přechodu je vyšší než 4 °C, přednostně vyšší než 20 °C, a zbytková vlhkost je nižší než 6 % hmotn., především nižší než 4 % hmotn.
19. 19. Směsi substancí podle jednoho z nároků 15 až 18, vyznačující se tím, že vykazují alespoň o 10 % vyšší zdánlivou hustotu než lyofilizáty.
20. 20. Směsi substancí podle jednoho z nároků 15 až 19, vyznačující se tím, že vykazují křehkou, částečně amorfní, sklovitou, kompaktní strukturu.
21. 21. Směsi substancí podle jednoho z nároků 15 až 20, vyznačující se tím, žesi zachovávají částečně amorfní strukturu v průběhu dob uskladnění alespoň 2 týdny.

    -27CZ 293456 B6
22. 22. Směsi substancí podle jednoho z nároků 15 až 21, vyznačující se tím, že jejich doby sušení jsou ve srovnání se substancemi ze skupiny (i) alespoň o polovinu kratší.
23. 23. Diagnostické prostředky, vyznačující se tím, že obsahují směsi substancí podle jednoho z nároků 15 až 22.
24. 24. Použití směsí substancí podle jednoho z nároků 15 až 22 k výrobě diagnostik.
25. 25. Terapeutické přípravky, vyznačující se tím, že obsahují směsi látek podle jednoho z nároků 15 až 22.
26. 26. Použití směsí substancí podle jednoho z nároků 15 až 22 k výrobě terapeutických prostředků vedle obvyklých pomocných látek a přísad.
27. 27. Použití alespoň po jedné substanci zvolené ze skupin:

    (i) sacharid nebo amfotemí iont s polárním zbytkem a jejich deriváty a (ii) amfotemí iont s nepolárním zbytkem a jeho deriváty, ke stabilizaci jedné nebo více substancí ze skupin zahrnujících proteiny, humánní peptidy, glykoproteiny, lipoproteiny, enzymy, koenzymy, protilátky, fragmenty protilátek, viry, složky virů, buňky, složky buněk, vakcíny, DNA, RNA, PNA a jejich deriváty v produktu vzniklém pomocí sušení bez zmrazování.