KR100466670B1 - 비동결건조법에의한생물질의안정화제제및안정화방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 현미경적으로 균질 물질 혼합물인 생물학적, 특히 치료학적 활성 물질을 함유하는 건조 부분 무정형 생성물의 제조방법에 관한 것으로서, 그 물질 혼합물은 (i) 탄수화물 또는 극성 잔기를 갖는 쌍극성 이온 및 그 유도체 와 (ii) 무극성 잔기를 갖는 쌍극성 이온 및 그 유도체의 각 군으로부터 적어도 한 물질이 선택되고, 그 제조방법은 생물학적 또는 치료학적 활성 물질과 (i) 및 (ii)의 물질로 부터 용액을 제조하고, 그 용액을 용액의 빙점이상의 생성물 온도에서 건조시키는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의해 얻어지는 신규 물질 혼합물뿐만 아니라 그것의 진단방법 또는 치료방법에의 용도에 관한 것이다.

Description

비동결 건조법에 의한 생물질의 안정화 제제 및 안정화 방법{METHOD AND PREPARATIONS FOR STABILIZING BIOLOGICAL MATERIALS BY DRYING METHODS WITHOUT FREEZING}
본 발명은 비동결 건조법에 의한 생물질(biological materials)의 안정화 제제 및 안정화 방법에 관한 것이다. 동결이 사용되지 않은 건조법에 의해 건조 부분 무정형(amorphous) 산물을 생성한 후, 펩티드, 단백질, 당단백질, 항체 및 유사 물질의 특별히 유리한 안정화를 이루는 데 사용될 수 있는 당 및 아미노산과 그들의 유도체뿐만 아니라 다양한 아미노산 및 그 유도체의 특별히 선택된 혼합물이 기술된다.
진단 및 치료 목적의 펩티드, 단백질, 당단백질, 뉴클레오티드, 플라스미드, 세포 단편, 바이러스 등과 같은 생물학적 활성 치료 물질의 저장-안정성(특히 실온에서) 제제의 제조가 요즘 계속 중요성을 더해 가고 있다.
건조 생물학적 또는 치료학적 활성 물질을 제조하기 위한 다양한 방법 및 조제가 기술되어 왔다. 건조 물질이란 최대 잔류 수분 8 % (g/g), 바람직하게는 최대 4 % (g/g), 특히 바람직하게는 최대 2 % (g/g)를 가지는 물질 및 그 혼합물로서 이해된다. 동결 건조법이 널리 퍼져있으나 단점을 가지고 있다[F. Franks, Cryo Lett. 11, 93 - 110, (1990); M.J. Pikal, Biopharm. 3 (9), 26 - 30 (1990); M. Hora, Pharm. Research 8 (3), 285 -291 (1992); F. Franks, Jap. J. Freezing Drying 38, 15 - 16, (1992)]. 동결 건조법은 많은 양의 에너지를 소비하고, 약간은 유해한 냉각제(Frigens)의 사용을 필요로 하며, 긴 시간이 걸린다. 수많은 물질들, 특히 단백질에 있어, 동결 건조에 필수적인 동결 단계는 손상을 준다. 즉, 그들을 불안정화시킨다. 그러므로, 이 방법은 몇몇 생물질에 대해 전혀 사용될 수 없다.
건조 단백질 제제를 제조하기 위한 동결 건조의 대안은 열 및/또는 진공을 사용하여 물질을 건조시키는 방법이다[F. Franks, R.M.H. Hatley; Stability and Stabilization of Enzymes; Eds. W.J.J. van den Teel, A. Harder, R.M. Butlaar, Elsevier Sci. Publ. 1993, pp. 45 - 54; B.Roser, Biopharm. 4 (9), 47 - 53 (1991); J.F. Carpenter, J.H. Crowe, Cryobiol. 25, 459 -470 (1988)]. 이것의 예로서는 고온의 적용이 있거나 없는 진공 건조법, 진공 및 분무의 조합 적용을 포함하는 다양한 변형의 분무-건조법뿐만 아니라, 드럼 건조법 및 기타 박층 건조법을 들 수 있다.
당 또는 당-유사 물질을 함유하는 제제가 J.F. Carpenter, J.H. Crowe, Biochemistry 28, 3916 - 3922 (1989); K. Tanaka, T. Taladu, K. Miyajima, Chem. Pharm. Bull. 39 (5), 1091 - 94 (1991), DE-C-3520228, EP-B-0229810, WO 91/18091, EP-B-0383569, US 5,290,765 에 기재되어 있다. 건조 당 제제의 제조에 있어, 배경 기술에 기재된 방법에서는 다음 단점 및 문제점이 발견되었다: 실질적으로 충분히 건조된 당 제제의 제조는 상당한 양의 에너지의 사용없이는 불가능하다. 이는 특히 최종 용기에서의 제제에 적용된다. 이를 위해 가온/ 열을 가하는 것은 가능하나, 사용된 생물질의 안정성에 대해 매우 위험하다고 판단되어야 된다. 이에 대한 대안으로서, 낮은 열 투여로 충분한 건조를 얻기 위하여 급격히 증가된 처리시간 또는 극히 얇은 박층 두께가 사용될 수 있다. 두 방법 모두 목적을 달성하지 못한다. 긴 처리시간은 경제적으로 매우 바람직하지 않고, 더욱이 서서히 물이 고갈되는 기질(matrix)내에서 생물학적 활성 물질의 긴 잔류시간은 그 물질을 불안정화시켜서 또한 위험하다. 박층 두께의 건조는 많은 경우 경제적으로 경쟁력있는 생산 수율을 얻을 수 없다. 즉, 시간 및/또는 건조 면적의 단위당 단지 최소량의 산물만이 얻어진다. 더욱이, 매우 크고 개방된 건조 지역상에서 생물질의 처리는 종종 약학적 및 진단학적 용도에 필요한 무균상태로 실시되기가 어렵다. 실온보다 낮거나 약간 높은 온도에서 진공 수단에 의해 진행되는 건조법이 더 바람직하다. 그러나, 많은 경우 건조 저장-안정성 당 제제를 생산하는 것이 실제적으로 거의 불가능하다. 당 용액이 점점 점성을 가지도록 건조될때 진한 페이스트가 형성된다. 물의 잔류량 또는 이들 물질에 남아있는 잔류 수분은 경제적으로 합리적인 기간내에 제거될 수 없고, 많은 경우 건조는 안정화에 적합하지 않은 고 레벨에서 정지된다. 분해(degradation)는 예컨대 저장 물질의 활성 감소, 응집 생성물의 형성, 또는 저 분자량 분해 산물의 발생에 의해 스스로 증명된다. 단백질등의 안정화를 위해 적합한 낮은 잔류 수분 함량은 물질학적 매개변수에 기초하여 확인할 수 있다. 단백질등의 안정화를 위해 적합한 제제는 유리상(glass-like), 즉 유리 전이 온도가 예상 저장 온도위에 존재하는 무정형 구조(amorphous structure)를 가져야 한다는 사실은 상기 문헌으로 부터 알 수 있다. 유리 전이 온도란 무정형 고체가 유리상태로 부터 진한 점성 상태로 또는 그 역으로 변화하는 온도를 말한다. 이 공정에서 점성의 급격한 변화와 동시에 단백질 및 다른 분자들의 확산 계수 및 동적 이동성의 급격한 변화가 발생한다. 경도 및 모듈과 같은 물리학적 매개변수뿐만 아니라, 부피, 엔탈피 및 엔트로피와 같은 열역학적 상태함수도 변한다. 예컨대 당을 함유하는 물질의 유리 전이 온도와 그것의 잔류 수분 함량은 서로 물리학적으로 연결되어서, 잔류 수분량의 증가는 유리 전이 온도의 감소를 이끌고 그 역도 가능하다. 따라서, 예컨대 차동 주사 열량계(DSC)에 의한 유리 전이 온도의 측정을 이용하여 제제가 안정화에 적합한 잔류 수분 함량을 가지는지 여부와, 상기와 같이 건조법이 성공적인지 아닌지 여부를 추론할 수 있다. DSC를 사용한 유리 전이 온도의 측정에 더하여, X-선 회절 조사 및 광학 전자 현미경 관찰에 의해 무정형 구조의 존재도 또한 증명될 수 있다.
따라서, 저장 온도보다 높은 유리 전이 온도를 가지고 낮은 잔류 수분을 함유하는 생물학적 또는 약학적 확성 물질용 안정화 기질을 제공하고, 그러한 안정화 기질의 경제적인 제조방법을 제공하는 것이 요구된다.
도 1a는 개개 말토스-L-페닐알라닌 혼합물의 유리 전이 온도를 도시한다.
도 1b는 개개 말토스-L-페닐알라닌 혼합물의 잔류 수분 함량을 도시한다.
도 2는 진공-건조된 (a) 페닐알라닌(수분함량 1.2 %/ 결정), (b) 말토스(수분함량 4.0 %, Tg = 50 ℃) 및 (c) 본 발명에 따른 방식으로 제조된 페닐알라닌 및 말토스(수분함량 0.7 %, Tg = 88 ℃)의 분말 회절도(diffractograms)를 도시한다.
회절도는 종래의 기구(Phillips 1730 X-선) 및 연관 소프트웨어로 기록되었다. 측정 온도는 25 ℃, 각 해상도(2θ )는 0.05 ℃이다. 측정 조건은 40 kV 튜브 볼트 및 40 mA 전류강도에서 1s/각 이다.
도 3은 (a) 잔류 수분 함량, 및 (b) 본 발명에 따른 말토스/페닐알라닌 제제의 유리 전이 온도의 시간 함수이다.
본 발명은 13 개의 실시예 및 10 개의 비교예로 예증되고, 하기에서 설명된다. 본 방법에서 당을 함유하는 물질들의 건조를 진공-건조에 의해 급격히 개선 및 가속화하고, 관계된 치료 및 진단용 생물질의 안정화에 적합한 조제 및 방법이 발견되었다. 또한, 안정화의 목적을 충족시키면서 최적화된 건조 특성을 보유하는 완전히 신규한 조성물이 보여진다.
이러한 조성물은 바람직하게, 무극성 잔기를 갖는 하나 이상의 쌍극성 이온 (예를 들면, 페닐알라닌과 같은 아미노산) 및 이 쌍극성 이온의 첨가로 유리 전이 온도가 크게 증가하는 당을 포함한다. 대안적으로, 다양한 특별히 선택된 아미노산 또는 그의 유도체들의 혼합물이 역시 사용될 수 있다. 이러한 혼합물은 무극성 잔기를 갖는 쌍극성 이온 및 극성 잔기를 갖는 쌍극성 이온으로 구성되어 있다. 당이 또한 이 혼합물에 첨가될 수 있다.
작용 가설로서, 특히 당 또는 극성 쌍극성 이온성 물질 (예를 들면, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 시트룰린, 라이신) 및 무극성 쌍극성 이온성 물질 (예를 들면, 페닐알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 발린, 알라닌, 글리신, 트립토판, 시스테인) 또는 그의 유도체 (예를 들면, 아세틸페닐알라닌 에틸 에스테르)의 혼합물이 본 발명에 따라 목적한 결과를 산출한다는 것이 발견되었다. 방법을 변형하고, 실시예에서 기술된 물질의 목록을 연장하는 것이 쉽게 가능하다.
특히 바람직한 생물학적 또는 치료적 활성 물질은 항체 (단클론성 또는 다클론성), 효소 및 인간단백질 또는 인간펩티드 예컨대, 재조합 인간 에리트로포에틴 (rh-EPO), 재조합 인간 과립구 콜로니 자극 인자 (rh-G-CSF) 또는 재조합 플라즈미노겐 활성 인자 (rPA), nGF, PTH, 울라리타이드(ularitide), 플라즈미드, 바이러스, GUP, BP-5이다.
활성 물질이 없는 제제를, 어떤 방식에서 아미노산의 첨가가 당 기질의 건조를 변화시키는지 결정하기 위해 사용하였다. 실시예 1은 페닐알라닌 및 아르기닌의 말토스에의 첨가가 이러한 첨가제의 첨가량에 의존하여 그 건조 성질을 개선한다는 것을 보여준다. 이러한 보조 물질의 특정한 첨가가 유리 전이 온도가 65℃ 이상 증가하고, 대응하는 잔류 수분 함량이 동일 건조 조건에서 쉽게 1% 미만으로 감소하는 것을 가능케 한다. 실시예 1은 이 경우에서 사용된 방법이 48 시간 이내에 전혀 열의 적용 없이 원하는 결과를 초래한다는 것을 보여준다. 본 발명에 따라 첨가되는 보조 물질이 없는 말토스는 이러한 조건에서 7-8%의 잔류 수분 함량을 가지고, 유리 전이 온도 (Tg) 는 실온 미만이며, 따라서 이 시스템은 단백질 등을 안정화하는데 적합하지 않다.
수크로스, 및 본 발명에 따라 안정성, 부분 무정형 생성물의 제조에 적합한 아미노산 군으로부터의 아미노산으로 구성된, 본 발명에 따른 제제의 제조는 수크로스를 함유하는 조제에서 수크로스의 고유한 이점이 완전한 효과를 나타내면서, 특정 단점을 피하는 것이 가능하다. 문헌에서 언급한 다른 당과 비교하여, 수크로스는 적절하게 표준화된 수분 함량에서 상대적으로 낮은 유리 전이 온도를 갖는다. 따라서, 수크로스를 함유하는 건조 제제의 제조에 있어서, 실질적으로 의도한 저장 온도를 상회하는, 높은 Tg를 달성하는 것이 특히 어렵다. 또한, 수크로스를 증발 건조에 의해 무정형 형태로 전환하기는 어렵고, 당은 쉽게 결정화하여 활성 생물질을 안정화하는데 바람직하지 않은 결정성 구조를 형성한다. 또한, 저장 중, 무정형 수크로스 덩어리들이 상대적으로 신속하게 다량의 결정을 형성하고, 일정 저장 기간 후에 완전하게 결정화할 수 있다는 것을 관찰할 수 있다. 상기 방법에서 그러한 제제는 또한 그 안정화 성질을 상실한다. 수크로스 사용에서 모든 이러한 문제점, 위험성 및 결핍은 본 발명에 따른, 적절한 군의 아미노산 첨가에 의해 제거될 수 있다. 이러한 맥락에서 페닐알라닌 및 아르기닌 (실시예 2) 의 사용이 특히 바람직하다. 비교예 A에서, 순수한 당 덩어리들은 심지어 보다 긴 건조 기간을 사용해도 효과적으로 건조할 수 없다는 것이 보여진다. 아미노산 및 당의 개선된 건조 효과는 개별 아미노산 뿐 아니라 아미노산 혼합물에서도 달성될 수 있다. 실시예 3 및 4는 말토스 및 수크로스 시스템에서 이에 대응하는 결과를 산출한다. 개선된 건조 효과를 갖지 않는 아미노산 (예를 들어 히스티딘)이 또한 발견되었다 (비교예 B). 실시예 5는 아미노산에 더하여, 그의 구조적으로 관련된 유도체 역시 건조 효과를 개선하였다는 것을 보여준다. 특정 아미노산의 선택은 실시예 6에 자세하게, 그러나 제한적으로나 완전히 포괄적이지는 않게 기술되어 있다. 모든 아미노산이 아니라, 특정 아미노산만이 목적한 효과를 초래한다는 것에 주목해야 한다. 또한 효과의 범위는 다양하여, 특히 바람직한 배합물 또는 제제가 언급될 수 있다. 이는 무엇보다 페닐알라닌, 트립토판, 루이신 및 이소루이신이다. 또한, 실시예 1 및 6으로부터 개선된 건조 효과를 유지하면서 아미노산을 혼합하는 것이 가능함을 추정할 수 있다. 아르기닌 단독으로는 긍정적 효과를 보이지 않지만, 페닐알라닌과의 혼합물에서는 효과가 나타난다.
당 기질의 부재 하에서도 실온 이상의 유리 전이 온도를 갖는 제제를 아미노산에 의해 수득하는 것이 가능한지를 결정하기 위해 진공 건조 중의 아미노산의 성질을 조사하였다. 놀랍게도 순수한 아미노산 단독으로는 결정성 구조를 형성하지만, 특정 아미노산 염 및 아미노산의 혼합물은 유리상 기질을 형성한다는 것이 발견되었다 (비교예 C 및 실시예 7). 무정형 구조를 만들기 위해 서로 다른 아미노산을 특정하게 선택하는 것이 필요하다. 놀랍게도, 아미노산이 명백히 다른 성질을 갖는 2개의 군으로 나누어질 수 있다는 것이 발견되었다. 각 군에서 하나 이상의 아미노산을 선택하고, 대응하는 혼합물을 제조하고 이를 건조하는 것이 필요하다. 당-아미노산 혼합물의 조제에서와 같이 이 경우 또한, 본 발명에 따른 제제를 수득하기 위해 특정한 혼합비를 가질 필요가 있다 (실시예 7). 이에 따라, 활성 생물질 안정화에 적합한 무정형 성분의 기질이 수득된다.
단백질에 대해 예시된, 생물학적 활성 물질 안정화라는 실제의 목표에 관해 개선된 건조의 유효성은 실시예 8-12 및 비교예 D-J에 자세히 입증되어 있다. 실시예 8 및 9는 비교예 D-G와 함께 rh-G-CSF의 안정화를 설명하고, 실시에 10 및 비교예 H는 에리트로포에틴, 실시예 11, 12 및 비교예 I, J는 락테이트 탈수소효소의 안정화를 설명한다. 보조 물질 없이 진공건조된 제제 및 기타 제제에 비하여 놀라울 만큼 실질적으로 개선된 본 발명에 따른 제제의 저장 안정성이 단백질(rh-G-CSF, 실시예 8, 9 및 비교예 D, E 및 F, G), 당단백질(rh-EPO, 실시예 10 및 비교예 H) 및 효소(LDH, 실시예 11, 12 및 비교예 I, J)의 저장 기간에 기초하여 예시된다. 다양한 온도에서의 저장 조건 하의 다양한 rh-G-CSF 제제이 변화가 실시예에 나타나 있다. 본 발명에 따른 제제, 즉, 부분 무정형 유리상 제제만이 수℃ (냉장고) 내지 40℃ 의 저장 온도 범위에서 6 개월 후에, 현저한 분해를 보이지 않는다(실시예 8, 9). 대응하는, 보조 물질 없이 진공건조된 제제는 (비교예 D) 실온 및 상승된 저장 온도(40℃)에서, 20%까지의, 단량체의 현저한 감소를 보인다. 비무정형이지만 다소 진한 점성의 제제는 실온에서 5주 후에 이미 단량체 농도에서 현저한 감소를 보인다 (비교예 D+E). 결정성 제제 (비교예 G 및 J) 또한 현저하게 단축된 저장 기간을 보인다. 실시예 8과 비교예 E를 비교함으로써 안정화제로서 아미노산의 말토스에의 첨가가, 10% 이하의 G-CSF의 단량체가 10배 이상 응집되는, 상승된 저장 온도(40℃)에서 저장 기간을 증가시킨다는 것을 볼 수 있다. 실시예 9를 비교예 G와 비교하면 아미노산의 선택이 또한 크게 증가되는 저장 기간에 중요하다는 것이 나타난다. 당단백질 EPO에서 단량체의 비율 비교 (실시예 10, 비교예 H)는 실온 및 상승된 저장 온도에서 본 발명에 따른 제제가 보조 물질 없이 진공건조된 EPO 보다 훨씬 우수하다는 것을 보여준다. 본 발명에 따른 제제 (실시예 11 및 12)로서 민감한 효소 LDH의 5주 저장은, 보조 물질 없이 진공건조된 LDH (비교예 I) 및 결정성 제제 (비교예 J)와 비교하여, 본 발명에 따른 제제만이 활성의 큰 손실 없이, 실온 또는 보다 높은 저장 온도 (30℃)에서 저장될 수 있다는 것을 보여준다. 이와 관련하여, 샘플의 제조 직후의 본 발명에 따른 제제에 의한 효소의 추가적인 안정화는 (보조 물질 없는 제제의 경우 65%, 결정성 제제의 경우 10%인 것과 비교하여 0 주에서의 활성 〉80%) 주목할 만하다. 본 발명에 따른 혼합물의 건조 방법의 전형적 시간 진행이 실시예 13에 예시되어 있다. 2 가지 이상의 아미노산의 본 발명에 따른 혼합물을 제조하여 급속 건조 유리상 제제를 성취하기 위하여, 하나 이상의 아미노산 및 그 유도체를 하기 2개의 군의 각각에서 선택하여야 한다.
군 1: 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 시트룰린, 라이신, 오르니틴
군 2: 페닐알라닌, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 발린, 알라닌, 글리신, 트립토판, 아세틸페닐알라닌 에틸 에스테르, 시스테인, 사르코신.
한 가지 아미노산의 단독 사용 또는 2개 군 중 단지 한 군으로부터의 수 가지의 아미노산의 사용은 본 발명에 따른 유리한 제제를 산출하지 못한다. 본 발명에 따른 물질 혼합물은, 예시된 대로, 무극성 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 또는 그 유도체를 포함하는 다양한 양의 쌍극성 이온을 생물학적 또는 치료적 활성 물질의 안정화제 용액과 혼합함에 의해 발견될 수 있다. 이어서, 실온에서 건조된 혼합물이 쌍극성 이온성 첨가제에 의해 상승된 유리 전이 온도를 갖는지 확인하기 위해 DSC를 사용한다. 이러한 방법에서, 유리 전이 온도는 본 발명에 따른 첨가제가 없는 제제와 비교하여 10℃, 바람직하게는 20℃, 특히 바람직하게는 40℃ 상승되었다. 본 발명에 따라 유리한 제제는 부분적으로 무정형이고, 4℃ 이상, 바람직하게는 20℃ 이상 및 특히 바람직하게는 40℃ 이상의 유리 전이 온도를 가지며, 6% 이하, 바람직하게는 4% 이하의 대응하는 잔류 수분 함량을 가진다. 이의 부피 밀도에 대응하는 겉보기 밀도는 대응하는 동결건조물보다 10% 이상, 바람직하게는 50% 높다. 이는 그, 깨지기 쉬운, 유리상의, 조밀하고, 부분적으로 무정형인 구조를 2주 이상, 바람직하게는 2개월, 특히 바람직하게는 1년 동안 유지한다. 또한, 그 건조 시간 (즉, 동일한 잔류 수분이 달성되는 시간)은 무극성 잔기를 가진 쌍극성 이온 또는 한 가지 탄수화물만을 함유하는 물질의 혼합물과 비교하여 바람직하게 25% 감소되고, 특히 바람직하게 반 또는 심지어 사분의 일로 감소된다. 이러한 물질 혼합물은 또한 분쇄되거나, 달리 가공되어 예를 들면, 치료제 또는 진단법에 통상의 보조 물질 및 담체와 배합되어 사용될 수 있다. 치료제는, 통상의 보조 물질 및 첨가제에 더하여 하나 또는 수 가지의 치료적 활성제를 함유하는 치료 제제이다. 이는 정제, 캡슐 또는 액체 (예를 들면, 멸균한 물 또는 완충액)의 첨가로 치료적 활성 용액 (예를 들면, 주사액)을 제조할 수 있는 고체 물질의 형태로 존재할 수 있다. 또한, 이는 다양한 가공에 의한 고체 물질, 예를 들면, 비 분무제, 흡입제 또는 경피 분말 등으로서의 투여에 특히 적합하다.
놀랍게도, 탄수화물을 함유하는 물질에 무극성 잔기를 갖는 쌍극성 이온(zwitterions)을 첨가하면 그들의 건조 성질을 긍정적인 방식으로 변화시켜, 이전에 약하게 건조되어 적합한 안정화 성질을 가지지 못했던 물질이 이제 매우 신속히 건조되어 그안에 조제된 생물학적, 특히 치료학적 활성 물질의 우수한 안정성을 생성할수 있다.
더욱이, 놀랍게도 각 쌍극성 이온의 혼합물로 구성된 무탄수화물 조제도 또한 매우 신속히 건조되어 매우 양호한 안정화 성질을 가질 수 있다고 밝혀졌다. 이 경우, 극성 잔기를 갖는 쌍극성 이온은 무극성 잔기를 갖는 쌍극성 이온과 함께 사용되어야 된다. 그러한 쌍극성 이온은 바람직하게는 아미노카르복실산 및 그 유도체, 특히 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 아미노산이다. 쌍극성 이온은 분자량이 10 kDa 이하, 바람직하게는 5 kDa 이하인 저분자 화합물로 이해된다. 고온의 적용없이, 즉 실온에서, 생물학적, 특히 치료학적 활성 물질의 안정화용 제제를 위해 적합한 유리 전이 온도가 도달되는 방식으로 본 발명에 따른 제제가 건조되어 지도록 하는 방법이 기술된다. 생물학적 활성 물질은 치료학적 활성 물질에 더하여 또한 예컨대 발효와 같은 생물공학적 공정에 사용되는 것들뿐만 아니라 예컨대 식물 예방에 또는 살충제로서 사용되는 물질들도 포함한다. 그러한 생물학적, 특히 치료학적 활성 물질은 예컨대 단백질, 펩티드, 당단백질, 지방단백질, 효소, 조효소, 생체막, 항체, 항체 단편, 바이러스, 바이러스 성분, 백신, DNA, RNA, PNA, 플라스미드, 벡터, 페로몬, 생물학적 치료제 및 진단제와 그들의 유도체로 이루어진 군중의 한개 또는 수개의 물질로부터 선택될 수 있다. 생물학적 활성 물질은 식품 그자체를 포함하는 것으로 이해되지는 않는다.
여기 기술되는 제제 및 방법의 특별한 이점은 다음과 같다:
(1) 건조동안 동결을 피할 수 있고,
(2) 어떠한 재장치없이 화학-약학 산업계에서 이미 구할 수 있는 동결-건조 플랜트에서도 건조를 실시할 수 있고,
(3) 변화없이 무균 제조에 특히 유리한, 예컨대 유리병과 같은 상업적 용기에 충전이 가능하고,
(4) 처리시간이 동결-건조법과 같은 차수이거나 더 적고,
(5) 독물학적으로 허용가능한 보조물질이 사용될 수 있고,
(6) 동결에 필요한 모든 양의 에너지가 절약될 수 있고 환경적으로 유해한 냉각제의 사용이 급격히 감소될 수 있고,
(7) 얻어지는 산물은 쉽게 보일 수 있는 "케이크"로서, 이는 다시 신속히 용해될 수 있고,
(8) 부분 무정형 상태가 신속히 얻어지므로, 생물질이 배경기술에서 기재된 방법에서 보다 덜 분해된다.
여기에 기재된 조제, 즉 당 및 아미노산의 개개 혼합물뿐만 아니라 적어도 2 아미노산의 개개 혼합물의 특유한 이점은 동결공정없는 그들이 다른 건조법의 틀내에서 사용될 때에도 유효하다는 것을 주목해야 한다. 첨가제의 건조 촉진 효과뿐만 아니라 무정형 또는 부분 무정형 계를 형성하는 제제의 성질은 분무-건조, 드럼-건조등에도 똑같이 적용될 수 있다.
본질적인 특징은 DSC 및/또는 X-선 구조 분석법 또는 다른 적당한 방법으로 검출시 상당한 양의 무정형 물질이 존재한다는 사실과, 제제가 완전 결정형 특성을 가지지 않는다는 사실이다. 결정형 제제는 민감한 생물질을 위해 적합한 안정성을 성취하기에는 적합하지 않다. 완전 무정형 제제는 안정화에 적합하고, 따라서 원칙적으로 본 발명에 따르나 부분 무정형 제제는 특별히 그렇다.
(실시예 1)
말토스-L-아르기닌-L-페닐알라닌 혼합물의 진공 건조
ml당 50 mg 말토스1수화물 및 0.1 mg 폴리소르베이트 80 의 함량을 갖는 용액을 제조하였다. 다음 거기에 동일 비율(g/g)로 증가량의 L-아르기닌 및 L-페닐알라닌을 첨가하였다. 이 방식으로 제조된 용액을 여과(0.22 ㎛ 질산셀룰로스 필터)에 의해 멸균시킨 다음, 각 경우 1 ml 용액을 2 ml 유리병에 채우고, 냉동-건조 마개를 그위에 위치시켰다. 이 방식으로 제조된 샘플을 감압하에 20 ℃에서 48시간동안 동일 방법으로 진공-건조시켰다. 건조후에, 샘플의 수분 함량을 Kar1-Fischer에 따라 결정하고, 유리 전이 온도를 차동 온도분석법(Perkin Elmer DSC7 - 샘플의 가열율 = 10 K/분)에 의해 결정하였다. 측정된 결과는 일정량의 아미노산의 첨가가 말토스의 건조 성질을 크게 변화시킨다는 것을 보여준다. 각 아미노산의 7.5 mg 이상에서 샘플의 수분 함량은 상당히 감소하고, 이에 대응하여 유리 전이 온도는 증가한다. 10 mg의 각 L-아르기닌 및 L-페닐알라닌에서 건조 생성물중 아미노산의 비율을 더 증가시켜도 값이 더 증가될 수 없는 값에 이른다. ml당 50 mg 말토스1수화물 및 0.1 mg 폴리소르베이트 80을 함유하는 당 용액에 증가량의 아미노산을 첨가하였다. 건조후에 결과 생성물은 하기의 수분 함량 및 유리 전이 온도를 가졌다.
(실시예 2)
수크로스-L-아르기닌-L-페닐알라닌 혼합물의 진공 건조
ml당 50 mg 수크로스 및 0.1 mg 폴리소르베이트 80을 함유하는 수크로스 용액에 동일 비율(g/g)로 증가량의 L-아르기닌 및 L-페닐알라닌을 첨가하였다. 샘플을 실시예 1에서와 같이 제조하고, 건조한후, 분석하였다. 각 아미노산의 최고 10 mg 까지의 양으로 완전 결정 생성물이 얻어졌다. 유리 전이를 갖는 부분 무정형 생성물은 오직 ml당 10 mg L-아르기닌 및 10 mg L-페닐알라닌이상에서 확인될 수 있었다. 본 실시예에서 아미노산의 첨가에 의해 용액의 건조 성질이 향상되었을 뿐만 아니라, 이 첨가에 의해 시스템도 부분 무정형 상태로 전환되었다. ml당 50 mg 수크로스 및 0.1 mg 폴리소르베이트 80을 함유하는 당 용액에 증가량의 아미노산을 첨가하였다. 건조후에 결과 생성물은 하기의 수분 함량 및 유리 전이 온도를 가졌다.
(비교예 A)
순수 당 용액의 진공 건조
50 mg/ml의 농도를 갖는 말토스1수화물 및 수크로스 용액을 제조하였다. 그다음 이들 당 요액을 실시예 1에서와 같이 여과하고, 충전하고, 분석하였다. 감압하에 50 ℃에서 72시간동안 건조시킨 때에도, 유리 전이가 25 ℃이상에 있을 정도로 만족스런 잔류 수분 함량이 되도록 2 ml 유리병내의 50 mg 당을 건조시키는 것이 불가능하다는 것을 볼 수 있다. 말토스 생성물은 점성 밀도와 6.4 % 잔류 수분 함량을 가졌다. 유리 전이는 20 ℃에서 있었다. 수크로스 6.0 % 잔류 수분이 여전히 존재하는 경우, 유리 전이는 14 ℃에서 있었다. 비교로서, 순수 당 용액을 또한 감압하에 20 ℃에서 48시간동안 건조시켰다. 결과 생성물은 50 ℃에서 건조된 샘플보다 더 수분이 많고, 따라서 유리 전이도 더 낮았다. 이 실험은 오직 일정한 아미노산의 첨가만으로도 주사병 또는 유사 용기내의 당 층을 진공 건조에 의해 낮은 잔류 수분 함량으로 건조시키는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 따라서, 아미노산의 첨가에 의한 건조 성질의 향상은 명백해 진다.
(실시예 3)
말토스-L-페닐알라닌 및 말토스-L-이소루이신 혼합물의 진공 건조
이 실험에서는 아미노산 및 말토스1수화물의 2원 혼합물을 제조하였다. 이 경우에 사용된 아미노산이 건조를 향상시키는 성질을 가지는지와 향상된 건조효과가 어떻게 개별 아미노산의 양에 의존하는지를 시험하려고 하였다. ml당 50 mg 말토스1수화물을 함유하는 용액에 증가량의 L-페닐알라닌 또는 L-이소루이신을 첨가하였다. 이 방식으로 제조된 용액을 여과(0.22 ㎛ 질산셀룰로스 필터)에 의해 멸균시킨다음, 각 경우 1 ml의 용액을 2 ml 유리병에 채우고, 동결건조 마개로 캡핑하였다. 이 방식으로 제조된 샘플을 감압하에 20 ℃에서 48 시간동안 진공-건조시켰다. 건조후에 각 샘플의 수분 함량을 Kar1-Fisher에 따라 4중으로 결정하고, 유리 전이 온도를 각 혼합물의 두 샘플의 차동 온도분석법(Perkin Elmer DSC7 - 샘플의 가열율 = 10 K/분)에 의해 결정하였다.
a. 결과 말토스-L-페닐알라닌
측정 결과는 말토스의 건조 성질에 대한 L-페닐알라닌의 양성 효과를 명백히 보여준다. 이미 소량의 L-페닐알라닌은 약 50 ℃ 에 의한 일정한 건조 조건하에 당 유리의 유리 전이 온도를 증가시키기에 충분하다(도 1a 및 1b). 향상된 건조 효과는 10 mg/ml L-페닐알라닌에서 최대치에 도달한다. 더 많은 양의 L-페닐알라닌을 첨가하여도 더 이상의 향상을 이룰 수 없다. 따라서, L-페닐알라닌의 첨가는 순수 말토스에 비해 약 80 ℃ 만큼 유리 전이 온도를 증가시켰다. 다량의 L-페닐알라닌(10-20 mg/ml)으로도 건조 성질에 대한 차이점을 이 실험에서 발견할 수 없었다. 그러나, 이것은 단축된 건조 기간에는 변한다. 이 경우 유리 전이 온도의 증가는 또한 10 - 20 mg/ml 범위의 증가량의 L-페닐알라닌에서 볼 수 있다. 표 4는 당 용액중 L-페닐알라닌의 양과 결과의 잔류 수분 함량 및 유리 전이 온도(Tg)를 보여준다.
추가로, 진공-건조된 페닐알라닌, 말토스 및 이들의 본발명에 따른 혼합물의 분말 회절도를 기록하였다(도 2a, 2b, 2c). 순수 페닐알라닌은 결정형 물질의 전형적인 회절도를 보여주는 반면(도 2a), 말토스는 무정형 물질의 회절도를 보여준다(도 2b). 오직 본 발명에 따른 혼합물의 경우에만 넓은 배경(background) 신호상에 별개의 회절 최대치로서 인식가능한 부분 무정형 구조가 형성된다(도 2c).
b. 결과 말토스-L-이소루이신
ml당 50 mg 말토스1수화물을 함유하는 원액에 다양한 양의 L-이소루이신을 첨가하고, 개별 혼합물을 20 ℃에서 건조시켰다. 아미노산의 양이 증가함에 따라 건조효과가 향상됨이 명백히 보여진다. 20 mg/ml L-이소루이신의 첨가(혼합비 5:2 중량)는 말토스의 Tg를 약 20 ℃만큼 증가시킨다. 표 5는 당 용액중 L-이소루이신의 양과 결과의 잔류 수분 함량 및 유리 전이 온도 Tg를 보여준다.
(실시예 4)
수크로스-L-루이신의 진공 건조
다양한 아미노산을 함유하는 수크로스의 2원 혼합물을 다음 실험에서 제조하였다. 그 목적은 사용된 아미노산이 수크로스에 대해 향상된 건조 효과를 가지는지를 확인하는 것이다. ml당 50 mg 수크로스를 함유하는 용액에 증가량의 L-루이신을 첨가하였다. 용액을 실시예 3에 기술된 대로 처리하였다.
결과 수크로스-L-루이신
수크로스는 소량의 L-루이신으로 결정형 생성물을 형성한다. 이러한 결정의 형성은 또한 L-아르기닌 및 L-페닐알라닌에 의한 실시예 2에서도 관찰될 수 있었다. 따라서, 수크로스는 그것이 일정한 아미노산과 혼합시 결정형 생성물을 형성한다. 순수 당 및 큰 비율의 L-루이신과의 혼합물은 유리 전이를 갖는 시스템을 형성한다. 이는 부분 무정형 구조가 존재함을 의미한다. 이는 오직 15 mg/ml이상 농도의 L-루이신만이 순수 수크로스의 건조 성질을 향상시키고, 유리 전이가 이 아미노산의 첨가에 의해 약 18 ℃만큼 증가될 수 있다는 것을 의미한다. 그러므로, L-루이신은 향상된 건조 효과를 갖는 아미노산이다. 표 6은 당 용액중 L-루이신의 양과 최종 생성물의 결과 잔류 수분 함량 및 유리 전이 온도(Tg)를 보여준다.
(비교예 B)
수크로스-L-히스티딘 혼합물의 진공 건조
실험은 실시예 4에 기재된 대로 실시하였다. L-루이신대신에 L- 히스티딘을 사용하였다. 혼합물 수크로스-L-히스티딘은 진공 건조시 무정형 생성물을 형성하고, 여기서 향상된 건조 효과는 관찰되지 않는다. 구조는 혼합비와 독립적으로 약하게 건조되고, 혼합물의 잔류 수분 함량 및 유리 전이는 순수 당의 결과에서와 동일 차수의 크기였다. 결론적으로 L-히스티딘은 향상된 건조 효과를 가지지 않는다. 표 7은 당 용액중 L-히스티딘의 양과 최종 생성물의 결과 잔류 수분 함량 및 유리 전이 온도(Tg)를 보여준다.
(실시예 5)
수크로스-L-트립토판 및 수크로스-N-아세틸-L-페닐알라닌 에틸에스테르(APE) 혼합물의 진공 건조
ml당 10 mg L-트립토판을 함유하는 용액과 ml당 3 mg APE를 함유하는 용액을 이 실험에서 제조하였다(APE는 오직 제한된 수용성을 가진다.). 둘다의 용액에 증가량의 수크로스를 첨가하였다. 이 방식으로 얻어진 용액을 실시예 3에 기재된 대로 처리하고 건조시켰다. 수크로스 용액(50 mg/ml)을 이 실험의 비교로서 동일 건조 조건하에 건조시켰다. 이것은 최종 생성물에서 9.98 %의 잔류 수분 함량 및 -6.25 ℃의 유리 전이를 가졌다.
a. 표 8은 L-트립토판 용액(10 mg/ml)중 수크로스의 양과 최종 생성물의 결과 잔류 수분 함량 및 유리 전이 온도를 보여준다.
b. 표 9는 APE 용액(3 mg/ml)중 수크로스의 양과 최종 생성물의 결과 잔류 수분 함량 및 유리 전이 온도를 보여준다.
그 결과는 시험된 두 물질, L-트립토판 및 APE 모두 향상되 건조 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 부분 무정형 생성물의 유리 전이 온도는 L-트립토판을 사용여 일정한 건조 조건으로 약 45 ℃ 만큼 증가될 수 있다. APE를 사용하여 일정한 건조 조건으로 유리 전이 온도를 20 ℃ 만큼 증가시키는 것이 가능하다.
(실시예 6)
다른 당-아미노산 혼합물의 진공 건조
이 실험에서 한가지 L-아미노산과 말토스1수화물 또는 수크로스의 2원 혼합물을 제조하였다. 이 경우에 5:2 내지 1:1의 당 대 아미노산의 중량비로 아미노산을 당 용액에 첨가하였다. 그 목적은 각각의 아미노산이 대응하는 당과 함께 향상된 건조 효과를 나타내는지를 확인하는 것이다. 용액을 실시예 4에 기재된 대로 제조하고 처리하고 건조시켰다. 상세하게는 이들을 다음 혼합물들 이었다:
a. 말토스1수화물을 함유하는 혼합물
b. 수크로스를 함유하는 혼합물
건조 결과에서 L-히스티딘이 당의 건조 성질에 어떠한 양성 효과도 나타내지 않음을 알 수 있다. L-세린은 당의 건조를 더욱 악화시키기까지 한다(표 11). L-루이신, L-이소루이신 및 L-메티오닌은 향상된 건조 효과를 갖는다(표 10). 이는 상기 아미노산의 양을 증가시켜 당 용액에 첨가하였을 때 분명해진다. 생성물 중에 아미노산 다량이 있을 때 L-발린 및 L-알라닌만이 건조를 향상시킴을 알 수 있다 ; L-아르기닌 및 L-글리신은 약한 양성 효과를 나타낸다. 건조 양태에 대한 L-페닐알라닌의 매우 우수한 효과는 수크로스와의 2원 혼합물로서 또한 명백해진다(표 11). 생성물은 잘 건조되고 매우 높은 유리 전이를 갖는다.
(비교예 C)
아미노산 용액 또는 아미노산염 용액의 진공 건조
각 아미노산 또는 각 아미노산 염의 용액을 제조하고, 여과하여 살균한다(0.22 μm 질산셀룰로스 필터). 각 용액 1 ml를 2 ml 의 유리병에 분배하고 동결-건조 마개로 막는다. 상기 방법으로 제조된 샘플을 감압하에 20 ℃에서 48 시간 동안 진공-건조한다. 건조 후에, 샘플의 수분 함량을 Karl-Fisher법으로 결정하고 유리 전이 온도를 차동 온도분석법으로 결정한다(Perkin Elmer DSC7 - 샘플의 가열율 = 10 K/분). 하기 용액을 건조하고 일정한 잔류 수분 함량 및 DSC 측정 결과를 얻는다 :
a. 아미노산
b. 아미노산염
결과로부터 진공 건조 후 결정형 형태 내에 아미노산이 존재함을 알 수 있다. 그러나, 거의 건조되지 않고 유리 전이 온도가 선택된 조건 하에서 실온 이하인 상기 건조 조건에서, 염기성 및 산성 아미노산염만이 무정형 구조를 형성한다.
(실시예 7)
L-아르기닌-L-페닐알라닌 혼합물 및 L-아르기닌-L-이소루이신 혼합물의 진공 건조
본 실험에서 L-아르기닌 및 L-페닐알라닌의 다양한 혼합물을 비교예 C 에서와 같이 제조, 처리, 건조한후, 시험하였다. 특히 하기 2원 혼합물을 제조하고 건조하였다 :
본 실험으로부터, 단독으로 건조되었을 때 결정형 생성물이 생성되는 2 개의 아미노산을 혼합함으로써 부분 무정형 구조를 생성할 수 있다는 것을 알 수 있다. 선택된 혼합 비율에 있어서, 이들은 건조가 매우 잘 되어 높은 유리 전이 온도 및 낮은 잔류 수분 함량을 갖는 부분 무정형 구조가 생성된다.
가장 높은 유리 전이를 갖는 최적 혼합비가 있다는 것이 흥미롭다. 이러한 실험 중에서 0.15 몰/l L-아르기닌 및 L-이소루이신을 함유하는 다른 용액을 제조할 수 있다.
이 경우에, 생성물은 53.27 ℃의 유리 전이 및 1.05 % 의 잔류 수분 함량을 갖는다. 2 개의 아미노산을 혼합함으로서 잘 건조되는 부분 무정형 구조를 형성할 수 있다 ; 유리 전이 온도는 무기산의 아르기닌 염과 비교했을 때 약 50 ℃ 정도 증가한다(비교예 C).
(실시예 8 )
L-아르기닌 및 L-페닐알라닌을 함유하는 말토오스 조제에서 진공-건조된 rh-G-CSF
ml 당 50 mg 의 말토오스, 10 mg 의 L-페닐알라닌 및 10 mg 의 L-아르기닌을 함유하는 용액을 제조한다. 또한, 이 용액은 ml 당 0.1 mg 의 폴리소르베이트 80 및 0.35 mg 의 rh-G-CSF 를 함유한다. 염산으로 조제의 pH 값를 pH 7.4 로 맞춘다.
단백질성 용액을 무균 조건에서 제조하고 여과 멸균한다(폴리비닐 디플루오라이드 필터 0.22 μm). 그리고 각 경우에 용액 1 ml를 2 ml 유리병에 분배한다. 동결 건조 마개로 막은 채워진 유리병을 감압하에 20 ℃에서 48 시간 동안 등온 건조시킨다. 건조 생성물은 잔류 수분 함량이 1.16 % 이고, 유리 전이 온도가 75 ℃ 이다. 상기 방법으로 제조된 샘플을 다양한 온도에서 저장하고 다양한 저장 기간 후에 단백질 안정성을 평가한다.
rh-G-CSF 의 경우에, 제조 생산물 중에 형성된 이량체의 비율은 생산물의 안정성을 평가하는데 우수한 기준이 된다. 따라서 배제 크로마토그래피(조건 당 4 회 단일 측정)로 결정된 단량체 및 이량체의 양은, 건조에 의해서 생산된 본 제제의 안정화 작용을 위한 측정이다. 배제 크로마토그래피에서 단백질 분자는 용해된 상태에서 입도에 따라 분리, 즉, 고분자 성분(이량체)이 rh-G-CSF 단량체로부터 분리된다. 냉각 가능한 오토샘플러(Waters TM 717)를 사용하여 Shimadzu 의 HPLC 시스템에서 시험(HP-SEC)을 수행한다. TosoHaas 사의 TSK 겔 G2000 SW(7.5×300)을 분리 칼럼으로 사용한다. 분리된 성분을 214 nm에서 측광법(Shimadzu 측광기 LC-GA)으로 검출한다. pH 6.2 의 0.1 m 소듐-포타슘 포스페이트 완충액을 실온에서 0.6 ml/분의 유속으로 도입되는 가동 용매로 사용한다. 다시 초기 농도가 되는 방법으로 재증류수로 시험될 샘플을 용해한다(1 ml을 가함). 상기 용해된 샘플을 시험을 실시할 때까지 오토샘플러에 6 ℃로 냉각한다. 주입 샘플의 양은 20 μm(= 7 μm G-CSF), 샘플의 시험 시간은 32 분이다. 생성물을 G-CSF 워킹 스텐다드(working standard)를 사용하여 계산한다. 추가로 정량적으로 생산물을 평가하기 위하여, 은 염색한 SDS 겔 전기 영동을 추가로 각 정량 결정에 수행한다. SDS 겔 전기 영동을 결과를 실시예 8b 도 9에 나타내었다. 수성 용액 중에서, 단백질은 45 ℃ 내지 47 ℃사이의 온도에서 수 분 동안 완전히 변성된다. 이러한 조제에서 단백질을 50 ℃의 온도에서 저장할 때도 수 주 동안 안정화시킬 수 있다.
a. L-아르기닌 및 L-페닐알라닌을 함유하는 진공 건조 말토오스 조제에서의 rh-G-CSF 의 안정성.
압출 크로마토그래피의 결과, 이러한 조제가 그와 같은 진공-건조 제제에서 오랜 시간에 걸쳐 단백질 rh-G-CSF 을 안정화시킬 수 있다는 것을 분명하게 나타내고 있다. 실험은 L-아르기닌 및 L-페닐아랄닌을 함유하는 진공-건조된, 부분적으로 무정형인 말토오스 조제에서 유리전이 온도 이하로 rh-G-CSF 를 안정화시킬 수 있다는 것을 보여준다.
b. 활성 물질 rh-G-CSF 를 함유한 모든 조제의 SDS 겔 전기영동의 결과의 검토.
첫째로, SDS 를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔이 제조되는데, 그의 분리 겔은 15 % 아크릴아미드을 함유하고, 그의 수집 겔은 3 % 아크릴아미드와 1 % 소디움도데실술페이트 (SDS) 를 함유한다. 샘플의 제제는 한개의 혼합 샘플이 세개의 사출 병에서 제조될 정도이다. 계속해서, 이러한 샘플 용액은 디티오트레이톨(DTT)와 브로모페놀 블루를 함유하는 샘플 완충액으로 희석되어, 150 ㎍/ml 의 rh-G-CSF 농도를 얻는다. 샘플은 예열된 가열 블록에서, 95 ℃ 에서, 5 분 동안 변성된다. 단백질 "크로마토그래피 MW 18000-300000 용 Combithek 검정 단백질" (Boehringer Mannheim) 은 검정 단백질로서 사용된다. 이들은 제조되어 정확하게 rh-G-CSF 샘플로서 처리된다. 또한, 비교하기 위한 rh-G-CSF 상용 표준이 제조된다. 겔 전기영동은 Midget 겔 전기영동 장치 (Pharmacia-LKB 2050) 및 수반하는 전압기로 수행된다. 전기영동 완충액가 채워진 후, 20 ㎕ 샘플 (즉, 3 ㎍ rh-G-CSF) 이 각 겔 포켓에 채워진다. 겔 전기영동 챔버을 밀폐하고 수냉기를 작동시킨 후, 80 V 전압을 사용하는데, 수집 겔이 통과된 후에 130 V 로 증가된다. 브로모페놀 블루 밴드가 겔의 말단에 도달하기 전에 바로, 전기영동이 종결된다. 겔을 챔버에서 제거하고, 재증류수로 간단하게 세척한다. 그 다음, Daiichi 2D 은 염색 II 키트를 사용해서 지시에 따라 은염색이 수행된다. 염색이 완결된 후, 겔을 시각적으로 평가한다.
이러한 조사에서, 실시예 8 과 9 의 조제는 단지 단량체를 나타내고 있다. 비교예 D 및 F 에서, 이량체는 또한 단량체에 추가해서 존재하고, 실시예 E 에서, 삼량체가 추가적으로 검출된다. 비교예 G 의 결정형 L-발린-L-글리신 제제에서, 분자 질량이 단량체의 질량보다 더 작은 두개의 분해 생성물 그리고 분자 질량이 단량체와 이량체 사이인 분해 생성물의 두개의 약한 밴드를 볼 수 있다.
이러한 민감한 방법으로, 〉1 % 의 양으로 존재하는 단량체의 분해 및 집합 생성물을 잘 가시화할 수 있다.
(비교예 D)
다른 보조 물질 첨가없는 rh-G-CSF의 진공 건조
본 실험에서 단백질 rh-G-CSF 를 희석된 인산 버퍼(약 0.01m)내에 0.35 mg/ml의 농도로 함유하는 용액을 제조하였다. 실시예 8 에서 언급된 방법에 따라 상기 단백질 용액은 제조, 처리 및 분석한다. 상기 제조에 있어서, 최종 생성물의 잔류 수분 함량 및 유리 전이 온도는 기술적 이유로 정하기가 어려웠다. 보조 물질 없이 진공 건조된 rh-G-CSF의 안정성 데이터.
KS= 냉장고 온도 = 4 - 6℃
RT= 실온 = 20-22℃
순수 단백질을 위한 안정성 데이터는 실시예 8에 있어 조제 보조 물질의 명백한 안정화 효과를 나타낸다. 또한 상기 조제의 경우, 은 염색을 가진 SDS 겔 전기 이동이 각 연구에 있어 수행되었다. 결과는 실시예 8b 에 나와 있다.
(비교예 E)
순수 말토스 조제 내에서 진공 건조된 rh-G-CSF
ml당 50 mg 의 말토스 1수화물, 0.1mg 의 폴리소르베이트 80 및 0.35mg 의 rh-G-CSF 을 함유하는 용액이 제조되었다. 수산화 나트륨을 사용하여 조제의 pH 값이 7.4로 조정되었다. 시작 용액 및 최종 생성물은 실시예 8 에서 언급된 바와 같이 제조, 처리 및 분석하였다. 실시예 1에서 이미 보인 바와 같이 아미노산들의 첨가 없이 48 시간 이내에 말토스를 낮은 잔류 수분 함량으로 건조하는 것은 어렵다. 그러므로 제품은 10.43%의 잔류 수분 함량 및 유리 전이 온도 -2℃를 가지고 제조되었다. 저장 온도에서 즉, 상기 유리 전이에서 어떠한 무정형의 깨지기 쉬운 유리도 존재하지 않았으며 대신 고 점도의, 글루틴 같은 덩어리가 존재하였다. 아미노산이 없이 진공 건조된 말토스 제조에 있어 rh-G-CSF의 안정성.
SDS 겔 전기영동 결과를 위해 실시예 8b를 참조한다. 상기 결과는 아미노산 없이 설탕 덩어리내에서 rh-G-CSF을 저장하는 것은 유리하지 않다는 것을 보여준다. 안정성은 진공 건조된 벌크(비교예 D) 및 극대화된 진공 건조 조제내에서에 비해 현저히 낮다. 상기 실험은 진공 건조시 명백히 단백질이 보조제의 무정형 지지 구조에 의해 안정화되는 높은 유리 전이를 얻기 위해 설탕에 아미노산을 첨가할 필요성이 있음을 보여준다. 유리 전이 온도 이하에서 제품을 저장하는 것이 활성 물질의 안정화를 위해 필요하다는 것이 증명되었다. 또한 40 및 50℃ 에서 건조된 저장한 상기 샘플들이 4주후에 완전히 결정화 하였다는 것을 주목해야 한다. 저장 기간동안 샘플의 상기와 같은 물리적 변화는 피해야만 한다; 그들은 단량체 함량의 감소를 가속화시킨다.
(실시예 9)
ml 당 진공 건조된 당이 없는 L-아르기닌- L-페닐알라닌 조제내에서의 rh-G-CSF
20mg의 L-아르기닌 및 20mg의 L-페닐알라닌, 0.1mg의 폴리소르베이트 80 및 0.35 mg의 rh-G-CSF를 함유한 용액이 제조되었다. 염산에 의해 pH값을 7.4로 조정한 후에 용액을 실시예 8과 같은 방법으로 제조, 처리 및 분석하였다. 건조가 완료된 후, 유리 전이 온도가 70℃이고 잔류 수분 함량이 1.30%인 균질의 제품이 수득되었다. 진공 건조된 아르기닌- 페닐알라닌 조제 내에서의 rh-G-CSF 안정성
KS= 냉장고 온도 = 4 - 6℃
RT= 실온 = 20-22℃
상기의 안정성 시험결과는, 만일 저장 온도가 유리 전이 온도보다 현저히 낮은 저장 온도(cf. 또한 비교예 C)라면, 상기 조제가 단백질 rh-G-CSF를 부분적으로 무정형의 진공 건조된 아마노산 조제 내에서 장기간 안정화되게 하는 것이 가능하다는 것을 보여 준다. 60℃에서의 저장과 비교하여 80℃에서의 저장은 77℃의 유리 전이 온도에 대한 효과를 보여준다.
추가로 제품을 질적으로 평가하기 위해 은 염색을 가지는 SDS 겔 전기 이동을 각각 함량의 결정을 위해 수행하였다. 이러한 SDS 겔 전기 이동의 결과는 실시예 8b에 나와 있다. 동일한 조제가 또한 1년 동안 여러 온도에서 저장되었다. 결과는 하기의 표 20 a에 나와 있다.
KS= 냉장고 온도 = 4 - 6℃
RT= 상온 = 20-22℃
상기 실험은 진공 건조된 부분적 무정형 L-아르기닌- L-페닐알라닌 조제 내에서의 rh-G-CSF 이 유리 전이 온도 이하에서 안정화 될 수 있음을 보여준다.
(비교예 F)
인산을 함유하는 진공 건조된 L-아르기닌 조제 내에서의 rh-G-CSF
40mg의 L-아르기닌 및 0.1mg의 폴리소르베이트 80 및 0.35 mg의 rh-G-CSF를 함유한 용액이 제조되었다. 인산을 가지고 pH값을 7.4로 조정한 후에 용액을 실시예 8과 같은 방법으로 처리, 건조 및 분석하였다. 건조가 완료된 후, 유리 전이 온도가 8.6℃이고 잔류 수분 함량이 3.59%인, 건조된 최종의 제품이 수득되었다. 상기 제품은 깨지기 쉬운 무정형 유리가 아니었고, 실온에서 완전히 건조된 후, 매우 점도가 높고 비스코플라스틱한 덩어리였다. 진공 건조된 L-아르기닌- 조제내에서의 rh-G-CSF 안정성
어느것도 건조된 부분 무정형 유리(실시예 8 및 17) 내에서 얻어진 안정화 효과를 얻을 수 없었다. 이 결과는 보조 물질을 능숙하게 혼합하여 진공 건조 동안에 그들의 건조 특성을 향상시키고 부분 무정형 유리들을 상온에서 얻는 것이 중요하다는 것을 보여준다. 상기는 고온(30 내지 40℃)에서 부분적으로 명백하다. 보조 물질 없이 진공 건조된 활성 물질(비교예 D)과 비교하여 상기 물질에 있어서 안정성은 증가된다. 추가로 제품들을 질적으로 평가하기 위해서 각각의 함량을 측정하기 위한 은 염색 SDS 겔 전기 이동이 수행되었다. 상기 SDS 겔 전기 이동 결과는 실시예 8b에 나와 있다.
(비교예 G)
결정형 L-발린 글리신 조제 내에서 진공 건조된 rh-G-CSF
ml당 0.35mg의 rh-G-CSF를 ml당 20mg의 L-발린 및 글리신 및 0.1mg의 폴리소르베이트 80를 함유한 용액에 첨가하고 수산화 나트륨을 이용하여 pH 값을 7.4로 조정하였다. 최종 용액을 실시예 8과 같은 방법으로 처리, 건조 및 분석하였다. 건조가 끝난 후의 시험은 마무리된 샘플이 잔류 수분 함량이 0.82%인 결정형 제품이라는 것을 보여준다. 진공 건조된 L-발린 글리신 조제 내에서 rh-G-CSF의 안정성.
KS = 냉장 온도 = 4-6℃
RT = 실온 = 20 - 22℃
상기의 결과는 결정형 아미노산 조제가 심지어 낮은 잔류 수분 함량에서도 rh-G-CSF를 안정화할 수 없다는 것을 명백히 보여준다. 상기 조제의 불안정화 효과는 보조 물질 없이 진공 건조된 rh-G-CSF과 비교하여 명백하게 보여진다. (비교예 D 참조)
상기 제품을 질적으로 평가하기 위해서 은 염색 SDS 겔 전기 이동을 추가로 수행하여 각각의 함량을 측정하였다. 상기 SDS 겔 전기 이동의 결과는 실시예 8 b에 나와 있다.
(실시예 10)
L-아르기닌 및 L-페닐알라닌을 함유한 수크로스 조제내에서의 에리트로포에틴의 진공 건조
ml 당 50mg의 수크로스, 10mg의 L-아르기닌 및 L-페닐 알라닌, 0.1mg의 폴리소르베이트 20을 함유한 용액이 제조되었다. ml당 5000 U 에리트로포이에틴(EPO)을 상기 용액에 첨가하고 인산을 사용하여 pH를 7.2 로 조정하였다. 실시예 8 과 같은 방법으로 용액을 처리 및 건조하였다. 잔류 수분 함량이 0.56% 이고 유리 전이온도가 86.6℃ 인 건조 부분 무정형 제품을 수득하였다. EPO의 경우, 제조된 제품들 내에 형성된 2량체들의 비율은 제품의 안정성을 평가하기 위한 좋은 기준이다. 배제 크로마토그래피에 의해 측정(조건 당 3 단독 측정)된 단량체 및 2량체의 양은 건조에 의해 제조된 상기 조제의 안정화 효과를 위한 수단이다.
배제 크로마토그래피에서, 단백질 분자는 용융 상태에서 그들의 입자 크기 즉, EPO 단량체로부터 분리된 고분자 조성분(2량체)을 기준으로 분리된다. 시험 (HP-SEC)이 자동 샘플 채취 장치(Gilsom Abimed 231)를 사용하여 시마쯔 제 HPLC 시스템 상에서 수행된다. TOSHHAAS(주) 제 TSK 겔 G 3000 SWXL (7.8×300mm)을 분리 칼럼으로 사용하였다. 분리된 조성분들을 광도법적으로 280nm (Merk 형광 분광 광도계 820PF)에 따라서 알아내었다. 염화 나트륨을 함유한 pH 7.3의 0.41m 나트륨-칼륨 포스페이트 완충액을 이동 용액으로 사용하여 유동 속도 0.6ml/min으로 부과하였다. 측정될 샘플을 재증류한 물에 녹여서 초기 농도가 다시 준비되었다.(1ml의 첨가) 상기의 용해된 샘플들은 시험까지 자동 샘플러 내에서 저장되었다. 샘플의 주입양은 100㎕ (2㎍ EPO)이고 샘플의 운용 시간은 25 분이다. EPO 운용 표준을 사용하여 결과를 평가하였다.
진공 건조된 L-아르기닌 및 L-페닐알라닌을 함유한 수크로스 조제내의 EPO의 안정성.
KS = 냉장 온도 = 4-6℃
RT = 실온 = 20 - 22℃
상기 결과들은 상기 경우에 있어 선택된 보조 물질들을 사용하여 진공 건조에 의해 EPO를 안정시키는 것이 가능하다는 것을 보여준다.
추가로 제품을 질적으로 평가하기 위해 각 함량의 결정을 위한 실버 염색 SDS 겔 전기 이동을 수행하였다. 겔의 제조, 전기 이동 과정 및 겔의 염색을 하기 실시예 8b에 언급된 바와 같이 수행하였다. 샘플을 1개의 혼합된 샘플가 3개의 주입병으로부터 제조하는 방법으로 준비되었다. 이어서, 상기 샘플 용액을 브로모페놀 블루를 함유한 샘플 완충액으로 희석하여 EPO농도가 20㎍/ml가 되게 하였다. 샘플을 예열된 가열 블록 내에서 95℃로 5분간 변성시켰다. "바이오-라드 표준열"이 단백질의 조정을 위해 사용되었다. 이것을 제조하고 EPO샘플들로 정확히 처리하였다. 추가로 비교에 사용된 EPO 운용 표준이 제조되었다. 겔 전기영동이 Midget 겔 전기영동 단위(Pharmacia LKB 2050)에 의해 수행되었다. 이것이 전기영동 완충액으로 채워진 후, 20㎕의 샘플(즉, 400ng의 EPO)를 각각의 겔 주머니에 채웠다. 겔 들을 스테이닝후 시각적으로 관찰하여 완료하고 겔을 사진 찍었다. 상기의 민감한 방법을 사용하여 1% 초과의 양으로 존재하는 단량체 제품의 분해 및 집합을 시각화할 수 있다.
전기영동의 결과
여기서 언급한 조제에 있어서, 운용 표준에 해당하는 하나의 단량체 밴드가 9 주 후에 모든 샘플에 있어 겔 내에서 관찰되었다. 이것은 상기 조제에 있어 단백질의 안정성을 강조한다.
(비교예 H)
보조 물질 첨가가 없는 에리트로포이에틴 진공-건조
본 실험에서 희석 인산염 완충액 (약 5 mM) 에서 활성 물질 EPO (50000 U/ml)를 단지 함유하는 출발 용액을 제조한다. 실시예 8 에서와 같이 그 용액을 실시예 8에서 기재한 바대로 제조하고, 처리하여 건조시킨다.
본 조제에서, 기술적 논리로서는 최종 생성물의 유리전이온도 및 잔류 수분 함량을 유리병 내 양이 너무 적기 때문에 (약 0.2 mg), 결정할 수 없다. 단백질의 안정성은 실시예 10에서 기재된 바대로 배제 크로마토그래피 방법으로 평가한다.
보조 물질이 없는 진공-건조 EPO 의 안정성
KS = 냉장고 온도 = 4 ∼ 6 ℃
RT = 실내 온도 = 20 ∼ 22 ℃
각 함량 결정을 위해 은 염색의 SDS 겔 전기영동도 또한 수행한다. 겔의 제조, 샘플의 제조, 전기영동 공정 및 겔 염색을 실시예 10 에서와 같이 수행한다. 겔 염색 후, 작동 표준 밴드에 대응하는 단량체 밴드에 부가하여, 각 저장 온도에서 모든 샘플 중의 이량체 밴드를 명확히 탐지할 수 있다. 이 실험은 실시예 10에서 사용되는 보조 물질 배합의 안정화 효과를 명확히 보여 준다. 이 샘플에서의 순 활성 물질의 안정성은 실시예 10 의 조제에서의 활성 물질의 안정성에 비해 명확히 감소되어, 이량체의 형성을 관찰할 수 있다. 저장 온도가 높을수록, 실험 10 에서의 보조 물질의 선택된 배합의 보호 효과가 더욱 상당해진다.
(실시예 11)
말토스-L-아르기닌 및 L-페닐알라닌을 함유하는 조제에서의 진공-건조된 락테이트 탈수소효소
ml 당, 50 mg 말토스1수소화물, 10 mg L-아르기닌 및 10 mg L-페닐알라닌을 함유하는 용액을 제조한다. 락테이트 탈수소효소 (LDH)를 그 용액에 첨가하여, 그 결과 단백질 활성이 165 U/ml 가 된다. 용액의 pH 값을 인산을 이용하여 pH 7.0 으로 조정한다. 실시예 8 에서와 같이 용액을 제조하고, 처리하여 건조시킨다. 건조 후, 96 ℃ 의 유리전이온도 및 0.82 % 의 잔류 수분 함량을 갖는 균일 생성물이 존재한다. 최종 샘플을 여러 온도에서 저장하고, 단백질 활성을 여러 저장 기간 후 평가한다. LDH 의 경우, 단백질 활성 측정 수단으로 효소 활성을 이용한다. 이 결정법은 광도 측정으로 수행된다. 샘플 용액에서, 피루베이트 및 NADH 를 LDH 의 촉매 작용으로 락테이트 및 NAD 로 환원한다. 용액 중 NADH 함량 감소는 광도 측정으로 추적할 수 있다 (λ = 365 nm ; ε = 3.4 cm2/μmol). 플라스틱 쿠벳 (cuvette) 에서 활성을 100 배 또는 200 배 희석된 출발 용액 중에 측정된다 (경로 길이 = 1 cm) (퍼어킨 엘머 552 UV/VIS 흡광계). 시간 단위 당 감소로써 LDH 의 단백질 활성을 계산할 수 있다. L-아르기닌 및 L-페닐알라닌을 함유하는 진공-건조 말토스 조제에서의 LDH 의 안정성. 출발 용액의 활성은 100 % 값에 대응한다.
KS = 냉장고 온도 = 4 ∼ 6 ℃
RT = 실내 온도 = 20 ∼ 22 ℃
본 실험은 매우 민감한 단백질 LDH 을 위한 조제의 안정화 효과를 명백히 보여 준다.
(비교예 I)
보조 물질의 첨가가 없는 락테이트 탈수소효소의 진공-건조
이 실험에서, 136 U/ml 의 활성을 갖는 순수 활성 물질 락테이트 탈수소효소 (LDH) 용액을 희석된 인산염 완충액에서 제조한다 (8 mM). 실시예 8 에서와 같이 용액을 제조하고, 처리하여 건조시킨다. 이 조제에서, 기술적 논리로서는 최종 생성물의 유리전이온도 및 잔류 수분 함량을 유리병 내 양이 너무 적기 때문에 (약 0.2 mg), 결정할 수 없다. 단백질의 안정성은 실시예 11 에 기재된 바대로 평가한다. 보조 물질 없이 진공-건조된 LDH 의 안정성. 출발 물질의 활성은 100 % 에 대응한다.
KS = 냉장고 온도 = 4 ∼ 6 ℃
RT = 실내 온도 = 20 ∼ 22 ℃
이 실험은 실시예 11 에 사용된 보조 물질 배합의 안정화 효과를 명백히 보여준다. 이 샘플에서의 순수 활성 물질의 안정성은 실시예 11 의 조제에서의 활성 물질의 안정성보다 상당히 낮다. 저장 온도가 높을수록, 실험 11 에서의 보조 물질의 선택된 배합의 보호 효과가 더욱 상당해진다. 보조 물질 배합 중 건조된 단백질 및 순수 단백질의 안정성의 차이는 가장 두드러진다.
(실시예 12)
당이 없는, 진공-건조된 L-아르기닌-L-페닐알라닌 조제에서의 락테이트 탈수소효소
ml 당, 20 ml L-아르기닌 및 20 mg L-페닐알라닌을 함유하는 원액을 제조한다. 락테이트 탈수소효소 (LDH) 를 인산을 이용하여 pH 값을 pH 7.0 으로 조정한 후, 그 용액에 첨가하여, 출발 용액의 단백질 활성이 168 U/ml 가 되도록 한다. 실시예 8 에서와 같이 용액을 제조하고, 처리하여 건조시킨다. 건조 후, 103.9 ℃ 의 유리전이온도 및 1.18 % 의 잔류 수분 함량을 갖는 균일 생성물이 존재한다. 최종 샘플을 여러 온도에서 저장하고, 단백질 활성을 여러 저장 기간에서 평가한다. 실시예 11 에서와 같이 단백질 분석을 수행한다. 진공-건조된, 당이 없는 L-아르기닌-L-페닐알라닌 제제에서의 LDH 의 안정성. 건조 전의 출발 용액 활성이 100 % 값에 대응한다.
본 실험은 조사된 온도 범위 전반에 걸친 이 아미노산 조제의 안정화 효과를 명백히 보여준다. LDH 의 안정성이 순수 활성 물질을 건조하는 것 (비교예 I) 에 비해 상당히 증가된다.
(비교예 J)
결정형 진공-건조 L-발린-글리신 조제 내 락테이트 탈수소효소
ml 당 20 mg 의 L-발린 및 20 mg 의 글리신을 함유하는 원액을 제조한다. 여기에, 출발 용액의 단백질 활성이 147 U/ml 이 되도록, NaOH 용액을 사용하여 pH 값을 7.0 으로 조정한 후, 락테이트 탈수소효소 (LDH) 를 첨가한다. 용액을 실시예 8 에 기재된 방법에 따라 제조, 처리하고 건조시킨다. 건조 후, 잔류 수분 함량이 1.12 % 인 균일한 완전 결정형 생성물이 존재한다. 최종 샘플들을 다양한 온도에서 저장하고, 실시예 11 에 기재된 다양한 저장 기간 후 단백질 활성을 측정한다. 진공-건조 완전 결정형 L-발린-글리신 조제에서 LDH 의 안정성. 건조 전 출발 용액의 활성은 100 % 의 값에 해당된다.
이 실험은 결정형 아미노산 조제가 진공 건조 동안 매우 안좋은 영향을 효소에 미친다는 것을 명백히 나타낸다. 건조 동안 즉, 결정형 지지 구조의 형성 동안 90 % 의 활성은 이미 잃게 된다. 다양한 온도에서 저장되는 경우에도 그대로 존재하는 활성은 유지될 수 없다. 그러므로 완전 결정형 아미노산 조제은 LDH 를 안정화시키기에는 적합하지 않다.
(실시예 13)
본 실험에서는 순수 말토스 용액 (50 mg/ml) 및 말토스와 페닐알라닌을 함유하는 용액 (40 mg/ml 말토스 및 10 mg/ml 페닐알라닌) 을 진공-건조한다. 동시에 유사한 제제들을 제조하여 10 ㎍/ml rh-ngf 또는 100 ㎍/ml PTH(1-37) 또는 500 ㎍/ml 울라리티드를 첨가한다. 용액을 제조 후 멸균 여과하고, 2 ml 유리병에 분배한다. 샘플은 20 ℃ 에서 진공 건조시키고, 미리 결정한 기간이 지난 후 각 조제를 취한다. 잔류 충전량, 카알-피셔법에 따른 수분의 함량, 및 Tg 를 이들 샘플에 대하여 측정한다. 전 건조 시간 동안 플레이트 온도를 20 ℃ 로 유지시킨다. 챔버 내 압력은 약 10-3 mbar 로 점차 감소시킨다. 유리병의 충전 중량은 양 조제 모두에서 초기값의 약 6 % 로 7 시간 내에 감소하며, 즉 용액은 매우 빠르게 농축된다. 순수 말토스 조제에서, 과포화 용액은 초기에 형성되어 고무상 상태가 된다. 더욱 건조시키면, 순수 당 용액 과 비교할 때, 페닐알라닌을 함유한 조제가 질량 감소에 있어서 약간의 잇점이 관찰될 수 있다. 약 5.5 % 인 본래의 충전 중량은 말토스 샘플이 완전히 건조하였을 때 유리병에 그대로 존재하는 반면, 말토스-페닐알라닌 혼합물이 들어있는 유리병에는 약 4.9 % 의 충전량이 존재한다.
이 결과는 샘플 내 수분의 함량의 변화가 충전 중량의 변화 대신 관찰되는 경우 더욱 명백해진다. 건조 과정 초기에는, 용액이 함유하는 수분의 양은 95.08 %, 즉 약 965 mg 수분이 각 유리병에 포함되어 있다. 목적은 잔류 수분 함량이 1 내지 2 % 인 건조 생성물을 얻는 것이다. 50 mg 의 고체가 상기 1 내지 2 % 를 함유함은, 병의 0.5 내지 1 mg 의 수분에 해당된다. 따라서, 존재하는 약 99.95 % 의 수분이 건조하는 동안 샘플으로부터 승화하여야, 건조 생성물이 얻어진다. 건조 단계가 더욱 진행되면 샘플의 수분의 함량은 카알 피셔법에 따라 결정된다. 이것은 페닐알라닌을 함유하는 샘플에 대하여 샘플을 메탄올 용액에 직접 도입함으로써 실행된다. 점성이 매우 강한 당은 메탄올 용액에 직접 이동시킬 수 없다. 이것은 우선 무수 DMF 에 용해시킨다. 그런 다음 이 용액의 수분의 함량을 결정한다. 도 3a 는 이 방법으로 실행된 잔류 수분 측정 결과를 보여준다. 아미노산을 함유하는 조제의 장점이 명백히 보여질 수 있다. 잔류 수분의 함량은 건조 후 단지 17 시간이 지난 후 이미 2.7 % 까지 감소한 반면, 말토스 조제에서는 아직 13.59 % 이다. 이 결과는 페닐알라닌을 함유하는 용액의 장점을 보여준다. 이 과정 조건에서 48 시간 내에 건조 말토스를 얻는 것은 불가능하다. 건조가 완료된 후, 상당한 양의 잔류 수분이 함유된 "고무" 가 RT 에 여전히 존재한다. 각 샘플의 유리전이온도는 잔류 수분의 함량에 더하여 DSC 로 측정한다. 유리전이온도는 샘플의 수분 함량에 직접적으로 상응하므로, 말토스-페닐알라닌을 함유하는 혼합물은 현저하게 증가된 값을 나타낸다. 그 결과는 아미노산-당 혼합물의 Tg 가 약 10 시간 후 이미 플레이트 온도의 범위에 도달했음을 보여준다. 상응하는 측정값은 도 3b 에 나타내었다. 건조 중 이 단계에서는 매우 소량의 수분이 증발하므로, 생성물의 온도 또한 플레이트 온도의 범위에 있다. 그러므로 건조 과정 10 시간 후 유리는 이미 유리병 내에 실온에서 존재한다. 단백질을 이러한 조제로 안정화시키는 경우, 이것은 10 시간 후 단백질이 이미 안정화 유리에 매입되는 것을 의미한다. 농축액 또는 "고무상" 형태로 단백질이 존재하는 기간은 따라서 매우 짧으므로, 활성 물질의 안정성에 있어서 잇점이 크다. 반대로, 순수 당은 실온에서 건조가 완료된 후 여전히 "고무" 로서 존재하므로, 단백질을 함유하는 생성물의 경우 활성 물질에 안정화 효과를 미치지 않는다.
단백질을 함유하는 다양한 조제들의 다른 물리적 파라미터들은 활성 물질이 없는 기본 조제와 다르지 않다.

Claims (13)

  1. 물질 혼합물에 더하여 단백질, 인간 펩티드, 당단백질, 지방단백질, 효소, 조효소, 항체, 항체 단편, 바이러스, 바이러스 성분, 세포 및 세포 성분, 백신, DNA, RNA, PNA와 그 유도체의 군으로부터의 일종 또는 수종 물질을 함유하는 건조 부분 무정형 생성물의 제조방법에 있어서,
    그 물질 혼합물은 (i) 이당류, 또는 아르기닌, 아스파르트산, 시트룰린, 글루탐산, 오르니틴, 히스티딘, 리신 및 그 유도체와 (ii) 아세틸페닐알라닌에틸에스테르, 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린, 사르코신 및 그 유도체의 각 군으로부터 적어도 한 물질이 선택되고,
    그 제조방법은 단백질, 인간 펩티드, 당단백질, 지방단백질, 효소, 조효소, 항체, 항체 단편, 바이러스, 바이러스 성분, 세포 및 세포 성분, 백신, DNA, RNA, PNA와 그 유도체의 군의 일종 또는 수종 물질과 (i) 및 (ii)의 물질로부터 용액을 제조하고, 진공 건조법을 사용하여 그 용액을 동결 없이 건조시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 그 용액은 완충액, 계면활성제, 항산화제, 등장제 및 방부제의 군으로부터 일반 보조물질을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 진공 건조는 연속 건조 공정으로서 실시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 아세틸페닐알라닌에틸에스테르, 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 사르코신은 건조된 물질 혼합물이 해당 첨가 없는 물질 혼합물에 비해 증가된 유리점을 가지도록 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 건조는 선행 동결과정 없이 동결-건조 장치에서 실시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 그 물질 혼합물은 단일 투여량 용기에서 건조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 얻어진 물질 혼합물은 후속적으로 제분되어 분말을 형성하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 부서지기 쉬운 부분 무정형의 유리상 밀집 구조를 갖는 물질 혼합물로서,
    단백질, 인간 펩티드, 당단백질, 지방단백질, 효소, 조효소, 항체, 항체 단편, 바이러스, 바이러스 성분, 세포 및 세포 성분, 백신, DNA, RNA, PNA와 그 유도체의 군으로부터의 일종 또는 수종 물질에 더하여, (i) 이당류, 또는 아르기닌, 아스파르트산, 시트룰린, 글루탐산, 오르니틴, 히스티딘, 리신 및 그 유도체와 (ii) 아세틸페닐알라닌에틸에스테르, 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린, 사르코신 및 그 유도체의 군의 일종 또는 수종 물질으로부터 선택되는 물질을 함유하고;
    군 (ii)의 일종 또는 수종 물질의 첨가로 인해, 동결건조체를 제외하고, 해당 첨가 없는 군 (i)의 물질에 비해 증가된 유리전이온도를 가지며;
    4 ℃ 초과의 유리전이온도 및 6 %(g/g) 미만의 잔류 수분 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 물질 혼합물.
  9. 제 1 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 물질 혼합물.
  10. 제 8 항에 있어서, 동결건조체보다 적어도 10 % 더 높은 겉보기 밀도를 가지는 것을 특징으로 하는 물질 혼합물.
  11. 제 8 항에 있어서, 적어도 6 개월의 저장기간에 걸쳐 부분 무정형의 유리상 구조를 유지하는 것을 특징으로 하는 물질 혼합물.
  12. 제 8 항에 있어서, 건조 기간이 군 (i)의 물질에 비해 적어도 절반으로 줄어드는 것을 특징으로 하는 물질 혼합물.
  13. 비동결 건조법에 의해 수득되는 생성물에서, (i) 이당류, 또는 아르기닌, 아스파르트산, 시트룰린, 글루탐산, 오르니틴, 히스티딘, 리신 및 그 유도체와 (ii) 아세틸페닐알라닌에틸에스테르, 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린, 사르코신 및 그 유도체로부터 선택된 하나 이상의 물질을 사용하여, 단백질, 인간 펩티드, 당단백질, 지방단백질, 효소, 조효소, 항체, 항체 단편, 바이러스, 바이러스 성분, 세포 및 세포 성분, 백신, DNA, RNA, PNA와 그 유도체의 군으로부터의 일종 또는 수종 물질을 안정화시키는 방법.
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