CN102408467B - 真空干燥蛋白的方法、制得的蛋白产品和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种真空干燥蛋白的方法和利用该方法制得的蛋白产品和包含该蛋白产品的试剂盒。本发明真空干燥蛋白的方法包括将蛋白与海藻糖及血液抗凝剂混合，在室温条件下真空干燥，利用Co60对干燥后的蛋白进行辐照灭菌。利用本发明的方法制得的蛋白产品包括含有结核杆菌特异性融合蛋白的试剂盒。本发明的真空干燥蛋白的方法干燥温度高、干燥速率大、节能、设备密闭防污染，能够保证物料的生物学活性，适用于生物制品的干燥；所提供的真空干燥产品和真空干燥试剂盒可以用于常温下的结核杆菌检测，方便灵活，灵敏度高，特异性高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种真空干燥蛋白的方法和以该方法制得的蛋白产品和包含该蛋白产品的试剂盒。
背景技术
干燥是从各种物料中去除湿分的过程，各种物料可以是固体、液体或气体，固体又可分大块料、纤维料、颗粒料、细粉料等等，而湿分一般是物料中的水分，也可以是其它溶剂。在生物药品和生物制剂中，溶剂为各种缓冲液和水分。常用的干燥法从物料温度是否变化，可以分为恒温干燥、加热干燥和低温干燥。在生物制品中，常用的为恒温干燥和低温干燥。
比较常用的低温干燥主要为真空冷冻干燥。真空冷冻干燥是先将湿物料在共晶点(三相点)温度以下冻结，使水分(液体)变成固态的冰，然后在适当的真空度下，使冰直接升华为水蒸汽，再用真空系统中的冷凝器将水蒸汽冷凝，获得干燥的制品以达到长期保存的目的。该方法具有真空和低温两个特殊的优良条件，具有多个优点，适用范围广。
但是真空冷冻干燥的缺点主要是：干燥速率低、干燥时间长、干燥过程能耗高和干燥设备投资大等。
而相对于真空冷冻干燥，在保持生物样品活性的条件下，采用真空干燥，可以节省能耗，减少设备费用。真空干燥是指在负压下进行的干燥方法，原理是利用真空环境下液体沸点降低的特点来干燥物品。在化工领域和药品领域，真空干燥应用较多；而在生物制品领域，由于生物制品，尤其是蛋白，在常温下容易失去生物活性，因此鲜有人尝试真空干燥。
发明内容
本发明的目的是提供一种常温下真空干燥蛋白的方法，以及采用该方法制得的含有稳定蛋白的产品、容器和试剂盒。
本发明的真空干燥蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)、将蛋白与海藻糖混合，其中蛋白的量为2.5～10μg，海藻糖的添加量是1～5wt％；可以适量添加血液抗凝剂，优选地，添加1wt％的肝素钠；
(2)、将样品分装至容器中，不加盖，置于真空干燥机中真空干燥，温度为20℃～30℃、优选为25℃，真空度＜100Pa、优选为2～100pa，干燥2小时；干燥后，取出样品置于生物安全柜里加盖密封；
(3)、采用Co60在常温下对蛋白质进行辐照灭菌，辐照强度为1kGy、2kGy、4kGy或6kGy，时间为1小时。
优选地，所述步骤(1)中还包括混合有甘氨酸和/或赖氨酸，以避免辐照给蛋白带来的交联现象，其中，甘氨酸、赖氨酸的浓度均为1wt％。
作为优选实施方式，混合样品分装于采血管中，采血管中没有其它添加剂。
作为优选实施方式，本方法中的蛋白是结核杆菌特异性融合蛋白TB1、TB2、TB1和TB2的混合物、或伽马干扰素，其中TB1、TB2蛋白的氨基酸序列如序列号No.1和No.2所示。
本方法提供一种用来检测潜伏性结核杆菌感染的蛋白产品，该蛋白产品包含结核杆菌特异性融合蛋白TB1、TB2、TB1和TB2的混合物，其中TB1、TB2蛋白的氨基酸序列如序列号No.1和No.2所示。
该蛋白产品通过以下方法真空干燥而得：
(1)、将蛋白、海藻糖和肝素钠混合，其中蛋白的量为2.5～10μg，海藻糖的添加量是1～5wt％，肝素钠的添加量是1wt％；
(2)、将样品分装至容器中，不加盖，置于真空干燥机中真空干燥，温度为20℃～30℃、优选25℃，真空度＜100Pa、优选2～100Pa，干燥2小时；干燥后，取出样品加盖密封；
(3)、采用Co60在常温下对蛋白质进行辐照灭菌，辐照强度为1kGy、2kGy、4kGy或6kGy，时间为1小时。
优选地，所述步骤(1)中还包括混合有甘氨酸和/或赖氨酸，以避免辐照给蛋白带来的交联现象，其中，甘氨酸、赖氨酸的浓度均为1wt％。
作为优选实施方式，TB1、TB2或伽马干扰素干燥在真空采血管中；TB1、TB2可以干燥在同一个真空采血管中，也可以干燥在不同的真空采血管中。
本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括采用本发明方法制得的含有结核杆菌特异性融合蛋白TB1、TB2、或TB1和TB2混合物的容器、和含有伽马干扰素的容器，其中TB1、TB2或TB1和TB2混合物或伽马干扰素通过本发明的真空干燥方法干燥在容器中；优选地，TB1和TB2干燥在同一个容器中；优选地，所述容器是没有任何添加剂的采血管；其中TB1、TB2蛋白的氨基酸序列如序列号No.1和No.2所示。优选地，该试剂盒用于检测潜伏性结核杆菌感染。试剂盒中的伽马干扰素用作检测时的标准品。
在本发明的具体实施方式中，采用TB1和/或TB2刺激血样，通过检测伽玛干扰素的含量来说明TB1和/或TB2蛋白的活性，主要是基于以下原理：
机体感染结核杆菌以后，存于血液中的记忆性淋巴细胞会在再次接触结核杆菌特异性抗原时，产生和分泌伽玛干扰素。通过对该细胞因子的定量检测，可以对疾病的感染状况进行判断。本发明的蛋白产品TB1、TB2分别包括结核杆菌的CFP-10和ESAT-6区，这两个区域在卡介苗和大多数非结核杆菌中普遍缺失，因此CFP-10和ESAT-6区编码的蛋白是不能激活卡介苗和大多数非结核杆菌感染的感染者的免疫细胞，而仅能激活带有ESAT-6和CFP-10区的结核杆菌感染者的免疫细胞。因而应用基因工程技术将ESAT-6和/或CFP-10区修饰后表达成为TB1和/或TB2，与新鲜采取的抗凝剂抗凝的全血充分混合后孵育，结核杆菌感染者的全血细胞中的免疫细胞被激活，释放细胞因子如伽玛干扰素等；24小时以后，收集血浆，并应用酶联免疫法检测其中的伽玛干扰素的含量，即可判断TB1和/或TB2的活性。如果TB1和/或TB2有活性，即能刺激细胞释放伽玛干扰素，若TB1和/或TB2失活，则不能刺激细胞释放伽玛干扰素。
全血刺激实验按照以下步骤进行：
1、收集新鲜采集的肝素钠抗凝的全血；储存于室温，并于16小时内进行样品刺激；进行每一种刺激的全血量不要少于0.85毫升。
2、全血刺激步骤(无菌操作)：
1)、保持水浴箱37℃恒温状态；将肝素钠抗凝的全血上下充分混匀20次，取1毫升全血加入至含有TB1和TB2蛋白的真空采血管中，盖紧盖子；剧烈晃动采血管以充分混合刺激剂和抗凝全血，直到管壁上有泡沫出现；将混匀后的采血管放到试管架上，立即放入至37℃的水浴箱中，并保持采血管直立向上；
2)、将采血管置于37℃水浴箱中孵育24小时；
3)、将采血管中孵育后的样品倒入1.5ml离心管中，10,000～13,000rpm离心5分钟；
4)、将上清移入新的试管中，进行后续检测。
本发明的有益之处在于：真空干燥的干燥温度高、干燥速率大、节能、设备密闭防污染，能够保证物料的生物学活性，适用于生物制品的干燥；所提供的真空干燥产品和真空干燥试剂盒可以用于常温下的结核杆菌检测，方便灵活，灵敏度高，特异性高。
附图说明
图1是回收的ESAT-6、CFP-10片段的凝胶电泳图；
图2是质粒载体pET-28b-LFnCHis的质粒图谱。
具体实施方式
结合具体实施方式，说明本发明，但本发明并不局限于此。
实施例一TB1、TB2基因的克隆与表达
TB1蛋白由前导蛋白和结核杆菌特异性蛋白CFP-10融合而成，TB2蛋白由前导蛋白和结核杆菌特异性蛋白ESAT-6融合而成，其中前导蛋白内容参见中国发明专利：02810886.8。
1、TB1、TB2基因表达载体构建。
委托DNA2.0公司(美国)按照序列No.3和序列No.4合成基因CFP-10和ESAT-6，分别连接至载体pj51中构建成质粒pj51：8775-cfp和pj51：8776-esat。
用StuI和XhoI双酶切上述扩增的质粒，回收ESAT-6、CFP-10片段，结果见图1。
构建质粒载体pET-28b-LFnCHis。构建过程：在Lfn核酸序列的5’端加上CCATG序列，以形成NcoI(CCATGG)酶切位点，3’端加上AGGCCT序列，形成StuI(AGGCCT)酶切位点，并确保开放读码框不变。全序列合成含有NcoI和StuI酶切位点的Lfn序列。用NcoI和StuI双酶切合成的含有NcoI和StuI酶切位点的Lfn序列，回收片段，然后与同样以StuI和NcoI双酶切的pET-28b(+)载体连接，构建成质粒载体pET-28b-LfnCHis。构建方法为常规分子克隆操作。Lfn的核苷酸序列和氨基酸序列分别为序列号No.5、No.6所示序列。质粒载体pET-28b-LFnCHis的质粒图谱见图2。
用StuI、XhoI双酶切载体质粒pET-28b-LFnCHis，并回收。将回收的载体片段pET-28b-LFnCHis与回收的ESAT-6或者CFP-10用T4连接酶连接，形成质粒pET28b-LfnCFP10和pET28b-LfnESAT6，转化大肠杆菌DH5α。挑选阳性克隆，酶切鉴定。
2、重组载体诱导表达。
将含有重组质粒pET28b-LfnCFP10和pET28b-LfnESAT6的DH5α菌种接种到3ml的LB培养基中，在37℃下，摇床过夜摇菌培养。用OMEG质粒提取试剂盒提取质粒pET28b-LfnCFP10和pET28b-LfnESAT6，转化大肠杆菌ER2566。挑取单克隆，接种到3ml的LB培养基中，37℃摇菌培养。到OD＝0.6时加入IPTG，终浓度为1mM，在37℃下200rpm诱导4小时，离心收集细菌沉淀。加入50μl的PBS缓冲液，重新悬浮，等体积加入50μl的2×浓缩的加样缓冲液，沸水浴5分钟。用12％聚丙烯酰胺胶电泳分析蛋白表达量。
3、重组蛋白纯化。
通过预试验得知该蛋白为包涵体。
从冻存的含有质粒pET28b-LfnCFP10和pET28b-LfnESAT6的大肠杆菌ER2566中挑取100μl甘油菌接种到200ml的LB培养基中，37℃下、200rpm过夜摇菌培养。取100ml菌液接种到1L的发酵培养基中，37℃下、200rpm培养，当OD＝0.8～1.2时加入IPTG，诱导4小时，离心，收集沉淀。
沉淀细菌用PBS重悬浮2次，离心收集沉淀。
使用的缓冲液：
1)、悬浮细胞缓冲液：40mM PBS，pH＝8.0；
2)、包涵体洗涤液：含0.5M尿素的40mM的PBS，pH＝8.0；
3)、包涵体溶解液：含8M尿素、2％NLS、500mM NaCl的100mM三乙醇胺，pH＝8.0；
4)、IMAC平衡液：含8M尿素、2％NLS、5mM咪唑、500mM NaCl的100mM三乙醇胺，pH＝8.0；
5)、洗柱缓冲液：同平衡液相同；
6)、洗脱液1：含500mM咪唑、8M尿素和2％NLS、500mM NaCl的100mM三乙醇胺，pH＝8.0；
洗脱液2：含500mM咪唑、500mM NaCl的100mM三乙醇胺，pH＝8.0。
纯化过程：
I、样品准备
1)、重悬浮50g细胞于500ml细胞悬浮液中；
2)、用APV均质仪匀浆；
3)、12000rpm，4℃离心30min；
4)、取1ml离心上清SDS-PAGE分析，并弃去上清，沉淀用300ml包涵体洗涤液洗涤；
5)、重复步骤4)；
6)、将洗涤沉淀用100ml包涵体溶解液，搅拌过夜溶解；
7)、4℃下、12000rpm离心溶解过夜的包涵体溶解液30min；
8)、离心得到的上清用0.45μm和0.22μm滤膜过滤。
II、蛋白的柱纯化
纯化过程初步分为两步，第一步为螯合层析，使用GE Healthcare公司的螯合SepHarese FF树脂，第二步为除热源，使用GE Healthcare公司的SepHadex G-25树脂。
其中，螯合层析的步骤为：
1)、用0.5N NaOH洗柱；
2)、用注射用水冲洗柱床；
3)、用0.1N硫酸镍溶液活化树脂；
4)、用注射用水冲洗柱子；
5)、用柱平衡缓冲液平衡柱子；
6)、以0.5ml/min的速率上样；
7)、用洗柱缓冲液冲洗柱子；
8)、用洗脱液2洗脱柱子上收集的蛋白。
除热源的过程为：
(1)、用1N NaOH浸泡柱床2h，用注射用水洗柱到流出液为中性；
(2)、将预去除热源的蛋白液上样到G-25树脂柱中；
(3)、用PBS缓冲液洗柱，收集洗脱液；即得到除去热源的TB1或TB2蛋白。
实施例二TB1、TB2蛋白的真空干燥
(1)取洁净的离心管，将5wt％海藻糖、1wt％肝素钠、10μgTB1、10μgTB2、1wt％甘氨酸、1wt％赖氨酸加入至离心管中，在生物安全柜里，加入1ml PBS溶解，在振荡器上混匀；
(2)在生物安全柜里，将上述混合好的样品分装至无添加剂的真空采血管里。将分装好的样品，不加盖，置于上海恒一科学仪器有限公司DZF-6050B型真空干燥箱中，罩上真空罩，关紧进气阀，打开真空泵；在25℃、真空度为70Pa的条件下，真空干燥2小时。干燥完成后，打开进气阀，关掉真空泵，取出样品；在生物安全柜里，盖上采血管的帽子；
(3)采用Co60对蛋白质进行辐照灭菌；辐照强度为2kGy，时间为1小时。
实施例三真空干燥后的TB1、TB2蛋白的性能测定
采用实施例二的方法，对9个TB1+TB2蛋白样品进行真空干燥，再刺激同一份血样。通过测量采用TB1+TB2蛋白刺激后释放到血浆中的伽马干扰素的含量，评价真空干燥时海藻糖对TB1+TB2蛋白的保护作用。其中，刺激血样样本量为1ml，未干燥的TB1+TB2蛋白作为对照。
表1：未干燥的和真空干燥的TB1和TB2蛋白的性能比较
从9份样本的数据可以看出，在真空干燥后，TB蛋白活性保持不变。
为验证真空干燥后TB蛋白的稳定性，进行了29份样本的实际检测，下表数据显示在37℃条件下，0天、3天、7天加速试验的结果。在干燥后，有少数样品的刺激值下降，但加速试验数值显示干燥后的蛋白稳定性加强。
表2：真空干燥的TB蛋白的稳定性试验
实施例四伽马干扰素的真空干燥
对于伽马干扰素的真空干燥，干燥方法见实施例二。具体的海藻糖浓度、伽马干扰素的含量和干燥参数见表3。含有不同浓度海藻糖的样品在真空干燥后的干扰素含量检测数据见表4。
表3：不同浓度海藻糖的真空干燥的最佳保护浓度试验
其中，
第一行：伽玛干扰素真空干燥样品编号，8批；
第二行：伽玛干扰素干燥环境(保藏环境)。-80℃保藏即长期保持在低温冰箱中的原液，理论环境下，干扰素可以长期保存而活性不发生变化；
第三行：干扰素含量(ng)；
第四行：干扰素原液的加样体积，40μl；
第五行：真空干燥机干燥时温度(-80℃即未干燥，保藏于低温冰箱中作为活性对照)；
第六行：真空干燥机干燥时的监测湿度；
第七行：真空干燥时监测到物料温度(干燥机温度探头监测到干扰素原液中的实际温度)；
第八行：真空干燥机运行时的压力，70pa；
第九行：干燥时间，全过程2小时，即可干燥完全；
第十行：干燥后干扰素保持温度，4℃(产品最终保藏状态、加速试验37℃)；
第十一行：存放时间；
第十二行：保藏的干燥干扰素用量。
表4：不同海藻糖浓度的样品真空干燥后干扰素含量检测数据
表中：
2-7行表示4℃保藏环境下海藻糖相对于低温保藏的对比数据；
8-9行表示-80℃环境下保藏干扰素的活性对照；
10-17行表示37℃保藏环境下海藻糖相对于低温保藏对比数据。
对比数据显示：在4℃环境下，海藻糖对干扰素有保护作用。在1wt％、2.5wt％、5wt％浓度环境下，整体数值均高于未加海藻糖的干扰素原液；而在37℃环境中，除2.5wt％浓度下，海藻糖对干扰素有保护作用。综上所述，在1wt％～5wt％浓度范围内，海藻糖对干燥过程均有保护作用。从检测的数值来看，1wt％与5wt％的海藻糖保护性能接近。
实施例五真空干燥后的伽马干扰素的性能测定
对样品进行加速试验，加速试验的条件见表5。加速过程：使用96孔酶标板，按照表6第一列的干扰素的含量，分别包被若干块，备用。各取一块板，在4℃、37℃、-80℃下放置三天(加速)，然后使用常规的酶联免疫法检测干扰素的含量。因为在-80℃环境中，干扰素理论上保持永久稳定，故通过4℃、37℃放置后的干扰素与-80℃保藏的干扰素的含量的检测值相比较，得出稳定性。加速后干扰素的含量数据见表6。
表5、真空干燥的含5wt％海藻糖的伽玛干扰素的加速试验
表6：加速后的干扰素含量数据
从以上数值可以看出，按照常理，同样环境中，数值应该一致。在37℃存放三天后(相当于4℃环境储存6个月)理论上数值应该小于正常产品存放条件下(4℃)的数值，但在加了同样浓度海藻糖后，同一批次的干燥条件下，37℃3天的数据明显好于4℃3天加速的数据，海藻糖对干扰素的保护作用是非显而易见的。
实施例六本发明的试剂盒的检测灵敏度与特异性
按照实施例二和四的真空干燥方法制备蛋白产品，并制备试剂盒。本试剂盒由分装在采血管中的TB1+TB2蛋白产品、真空干燥的干扰素、干扰素检测用Elisa板、相关的洗液等组成。
检测释放出的干扰素也可以使用其它的方法，只要是检测干扰素含量的方法即可。
敏感性：痰培养阳性是细菌学上判断为阳性的金标准，痰培养阳性说明病人受结核杆菌感染。由于痰培养阴性并不能说明该病人没有被结核杆菌感染，所以痰培养阴性在计算敏感性上没有意义。
敏感性定义为在实际确定的阳性样本中被检出阳性的比例，用公式表示为：敏感性＝痰培养阳性中检测阳性例数/(痰培养阳性中检测阳性例数+痰培养阳性中检测阴性数)×100％。
在2009年7～12月期间共收集了427例为痰培养阳性，对其中的286例痰培养阳性样本用该试剂盒进行检测，结果见表7所示。
表7、培养结果与本试剂盒检测结果比较
敏感性＝痰培养阳性中检测阳性例数/(痰培养阳性中检测阳性例数+痰培养阳性中检测阴性数)×100％＝244/(244+42)×100％＝85.3％.
特异性：
理论上，评价特异性的人群应该是没有感染结核分枝杆菌的健康人。实际上，由于缺乏寻找这类人群的金标准，国际上一般选用结核低流行区没有暴露危险的结核菌素试验(简称TST)阴性人群。TST指：人体感染结核菌一段时间后，结核菌素即可显示阳性反应；因而TST试验被广泛用于结核病流行病学调查、监测结核感染、结核病的鉴别诊断，结核菌素试验阳性，只能说明受检者已经感染了结核杆菌。
由于中国普遍实施卡介苗接种，而卡介苗会导致TST假阳性的产生，所以TST阳性者不能纳入特异性评价人群。本研究中选用TST阴性人群用于评价该产品的特异性。
特异性＝TST阴性中检测阴性例数/(TST阴性中检测阴性例数+TST阴性中检测阳性例数)×100％
招募了710名TST试验者，对其中的466例TST阴性血样用本试剂盒进行了检测，结果如下：
表8、结核菌素试验阴性样本中本试剂盒检测结果
特异性＝TST阴性中检测阴性例数/(TST阴性中检测阴性例数+TST阴性中检测阳性例数)×100％＝398/(398+68)×100％＝85.4％。
Claims (7)
1.一种真空干燥蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）、将蛋白、海藻糖及肝素钠混合，其中蛋白的量是2.5～10μg，海藻糖的添加量是1～5wt%，肝素钠的添加量是1wt%；
（2）、将样品分装至采血管中，采血管中没有其它添加剂，不加盖，置于真空干燥机中真空干燥，温度为20℃～30℃，真空度2～100pa，干燥2小时；干燥后，取出样品置于生物安全柜里加盖密封；
（3）、采用Co60在常温下对蛋白质进行辐照灭菌，辐照强度为1kGy、2kGy、4kGy或6kGy，时间为1小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中还包括混合有1wt%甘氨酸和/或赖氨酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，真空干燥温度为25℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白为结核杆菌特异性融合蛋白TB1、结核杆菌特异性融合蛋白TB2、结核杆菌特异性融合蛋白TB1和结核杆菌特异性融合蛋白TB2的混合物、或伽马干扰素，其中结核杆菌特异性融合蛋白TB1和结核杆菌特异性融合蛋白TB2的氨基酸序列分别是序列号No.1和No.2所示的序列。
5.一种根据权利要求1～4任一项所述的方法制得的蛋白产品。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：含有根据权利要求4所述的方法制备的结核杆菌特异性融合蛋白TB1、结核杆菌特异性融合蛋白TB2、或结核杆菌特异性融合蛋白TB1和结核杆菌特异性融合蛋白TB2混合物的容器，和含有根据权利要求4所述的方法制备的伽马干扰素的容器。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有结核杆菌特异性融合蛋白TB1和结核杆菌特异性融合蛋白TB2混合物的容器和含有伽马干扰素的容器。
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