SK283664B6 - Spôsob prípravy suchých, čiastočne amorfných produktov, zmesi substancií získané týmto spôsobom, ich použitie a diagnostické prostriedky a terapeutické prípravky obsahujúce tieto zmesi - Google Patents

Spôsob prípravy suchých, čiastočne amorfných produktov, zmesi substancií získané týmto spôsobom, ich použitie a diagnostické prostriedky a terapeutické prípravky obsahujúce tieto zmesi Download PDF

Info

Publication number
SK283664B6
SK283664B6 SK509-98A SK50998A SK283664B6 SK 283664 B6 SK283664 B6 SK 283664B6 SK 50998 A SK50998 A SK 50998A SK 283664 B6 SK283664 B6 SK 283664B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
drying
substances
mixtures
derivatives
glass transition
Prior art date
Application number
SK509-98A
Other languages
English (en)
Other versions
SK50998A3 (en
Inventor
Markus Mattern
Gerhard Winter
Original Assignee
Roche Diagnostics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7775640&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK283664(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Roche Diagnostics Gmbh filed Critical Roche Diagnostics Gmbh
Publication of SK50998A3 publication Critical patent/SK50998A3/sk
Publication of SK283664B6 publication Critical patent/SK283664B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/443—Oxidoreductases (1) acting on CH-OH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F26—DRYING
    • F26B—DRYING SOLID MATERIALS OR OBJECTS BY REMOVING LIQUID THEREFROM
    • F26B5/00—Drying solid materials or objects by processes not involving the application of heat
    • F26B5/04—Drying solid materials or objects by processes not involving the application of heat by evaporation or sublimation of moisture under reduced pressure, e.g. in a vacuum

Abstract

Spôsob výroby suchých, čiastočne amorfných produktov, obsahujúcich biologický, najmä terapeuticky aktívny materiál, ktoré predstavujú makroskopicky homogénne zmesi substancií, pričom tieto zmesi substancií sú zvolené tak, že obsahujú aspoň po jednej substancii zo skupiny (i) sacharid alebo amfotérny ión s polárnym zvyškom a ich deriváty a (ii) amfotérny ión s nepolárnym zvyškom a jeho deriváty, spočíva v tom, že sa pripraví roztok biologického alebo terapeuticky aktívneho materiálu a substancií (i) a (ii) a tento roztok sa suší pri teplote produktu vyššej, ako je teplota mrazu tohto roztoku. ŕ

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka spôsobu stabilizácie biologických materiálov pomocou sušenia bez zmrazovania a prípravkov na uskutočňovanie tohto spôsobu. Pritom sa cieľavedome opisujú zvolené zmesi cukrov a aminokyselín a ich deriváty, ako i zmesi rôznych aminokyselín a ich deriváty, pomocou ktorých je možné po výrobe suchých, čiastočne amorfných produktov pomocou sušenia bez zmrazovania dosiahnuť obzvlášť výhodnú stabilizáciu peptidov, proteínov, glykoproteínov, protilátok a podobných substancií.
Doterajší stav techniky
Výroba prípravkov biologicky aktívnych a terapeutických substancií, ako sú peptidy, proteíny, glykoproteíny, nukleotidy, plazmidy, bunkové fragmenty, vírusy atd’., ktoré sú stabilné pri skladovaní (najmä pri izbovej teplote), na diagnostické a terapeutické účely má dnes veľký, stále rastúci význam.
Sú opísané rozličné formulácie a spôsoby výroby suchého biologicky alebo terapeuticky aktívneho materiálu. Pod suchým materiálom sa rozumejú látky a zmesi látok, ktoré majú zvyškovú vlhkosť nanajvýš 8 % hmotn., výhodne nanajvýš 4 % hmotn., obzvlášť výhodne nanajvýš 2 %. Lyofilizačné postupy sú veľmi rozšírené [F. Franks, Cryo Lett. 11, 93 - 110, (1990); M. J. Pikal, Biopharm. 3 (9), 26 -
- 30 (1990); M. Hora, Pharm. Research 8 (3), 285 - 291 (1992); F. Franks, Jap. J. Freezing Drying 38, 15 - 16, (1992)], majú však nevýhody. Spotrebujú veľké množstvá energie, vyžadujú použitie čiastočne škodlivých chladív (Frigene) , trvajú dlhý čas. Pre veľký počet substancií, najmä pre proteíny, je krok zmrazovania, potrebný na lyofilizáciu, škodlivý, t. j. destabilizujúci. Preto je tento spôsob pre mnoho biologických materiálov úplne nepoužiteľný.
Alternatívami pre lyofilizáciu pri výrobe suchých proteínových prípravkov sú spôsoby, pri ktorých sa materiál suší pomocou využitia tepla a/alebo vákua [F. Franks, R. M. H. Hatley: Stability and Stabilization of Enzymes; Eds. W. J. J. van den Teel, A. Harder, R. M. Butlaar, Elsevier Sci. Publ. 1993, str. 45 - 54; B. Roser, Biopharm, 4(9), 47 -
- 53 (1991); J. F. Carpenter, J. H. Crowe, Cryobiol. 25, 459 -
- 470 (1988)]. Tuje možné uviesť napríklad vákuové sušenie s použitím alebo bez použitia zvýšenej teploty, sušenie rozprašovaním v najrôznejších modifikáciách vrátane kombinovaného využitia vákua a techniky rozprašovania, ako i sušenie na valcoch a iné spôsoby sušenia v tenkej vrstve.
V J. F. Carpenter, J. H. Crowe, Biochemistry 28, 3916 -
- 3922 (1989); K. Tanaka, T. Taluda, K. Miyajima, Chem. Pharm. Bull. 39 (5), 1091 - 94 (1991), DE-C-3520228, EP-B-0229810, W0 91/18091, EP-B-0383569, US 5 290 765 sú opísané prípravky, ktoré obsahujú cukry alebo cukornaté látky. Pri výrobe suchých prípravkov obsahujúcich cukry je možné pri spôsoboch opísaných v doterajšom stave techniky stanoviť nasledujúce nevýhody, prípadne problémy. Výroba skutočne dostatočne suchých prípravkov obsahujúcich cukry nie je možná bez signifikantného energetického nároku. To platí obzvlášť pre prípravky v konečnom balení. Pritom sa počíta s použitím tepla/horúčavy, ktoré sa však musí vzhľadom na stabilitu použitých biologických materiálov hodnotiť veľmi kriticky. Aby sa dosiahlo dostatočné vysušenie pri malom dodávaní tepla, je možné alternatívne využiť prudko predĺžené časy procesov alebo extrémne tenké hrúbky vrstiev. Obidva postupy však nevedú k cieľu. Dlhé časy procesov sú ekonomicky veľmi nevýhodné, okrem toho je dlhé zotrvanie biologickej účinnej látky v matrici, ktorá len pomaly stráca vodu, destabilizujúce, a teda taktiež kritické. Sušenie tenkých hrúbok vrstiev nevedie v mnohých prípadoch k ekonomicky významnému výťažku produktu, t. j. za časovú jednotku a/alebo na sušiacu plochu sa získajú len minimálne množstvá produktu. Okrem toho je spracovanie biologických materiálov na veľmi veľkých otvorených sušiacich plochách ťažko realizovateľné na sterilitu častokrát žiaducu pri farmaceutickej a diagnostickej aplikácii.
Sušenia, ktoré prebiehajú pomocou vákua pri nízkej teplote alebo pri teplote nepatrne zvýšenej v porovnaní s izbovou teplotou, sú šetrné. Výroba suchých prípravkov, obsahujúcich cukry, stabilných pri skladovaní, je však v mnohých prípadoch prakticky ťažko uskutočniteľná. Pri vysúšaní roztokov cukrov vznikajú vo zvýšenej miere viskózne, húževnaté látky. Množstvo zvyškovej vody zostávajúce v týchto látkach alebo zvyškovú vlhkosť nie je možné odstrániť za ekonomicky výhodný čas, v mnohých prípadoch sa sušenie na vysokej úrovni, nevhodnej na stabilizáciu, zastaví. Degradácia sa prejavuje napríklad stratou aktivity uskladneného materiálu, tvorbou agregačných produktov alebo výskytom produktov degradácie s nízkou molekulovou hmotnosťou. Nízky obsah zvyškovej vody, vhodný na stabilizáciu proteínov atď. je možné rozoznať na základe fyzikálnych meraných veličín. Z citovanej literatúry vyplýva, že prípravky vhodné na stabilizáciu proteínov atď. majú preukazovať sklovitú, t. j. amorfnú štruktúru, ktorej teplota skleného prechodu je vyššia ako žiadaná teplota uskladnenia. Teplota skleného prechodu je teplota, pri ktorej amorfná tuhá látka prechádza zo sklovitého stavu do húževnatého viskózneho stavu a naopak. Pritom sa vyskytujú prudké zmeny viskozity a s tým spojené zmeny koeficientu difúzie a kinetickej mobility proteínov a iných molekúl. Fyzikálne parametre, ako tvrdosť a modul, sa menia práve tak ako termodynamické stavové veličiny objem, entalpia a entropia. Teplota skleného prechodu napríklad látky obsahujúcej cukry a jej obsah zvyškovej vody sú fyzikálne navzájom spojené tak, že stúpajúce množstvá zvyškovej vody vedú ku klesajúcim teplotám skleného prechodu a naopak. Tým je možné z merania teploty skleného prechodu vyvodzovať napríklad pomocou „differential scanning calorimetrie“ (DSC)), či prípravok má obsah zvyškovej vody vhodný na stabilizáciu, prípadne ako sa rozvádza, či je postup sušenia úspešný alebo nie. Okrem stanovenia teploty skleného prechodu pomocou DSC je možné dokázať existenciu amorfných štruktúr aj pomocou skúmania rontgenovej difrakcie, pomocou optických pozorovaní a pozorovaní elektrónovým mikroskopom.
Žiaduce je preto dať k dispozícii stabilizačnú matricu na biologicky alebo farmaceutický aktívne materiály s teplotou skleného prechodu vyššou, ako je teplota uskladnenia, ktorá obsahuje malú zvyškovú vlhkosť, a spôsob málo nákladnej výroby takých stabilizačných matríc.
Podstata vynálezu
Prekvapivo sa zistilo, že pomocou pridania amfotérnych iónov s nepolámymi zvyškami k látkam obsahujúcim sacharidy sa dá ich správanie pri sušení pozitívne zmeniť tak, aby predtým zle schnúce materiály, ktoré náležité nemali žiadne dostatočne stabilizujúce vlastnosti, bolo možné teraz veľmi rýchlo sušiť a aby spôsobovali vynikajúcu stabilitu biologicky, najmä terapeuticky aktívnych materiálov, formulovaných v nich.
Ďalej sa zistilo, že prekvapivo aj formulácie bez sacharidov pozostávajúce zo zmesi určitých amfotémych iónov je možné veľmi rýchlo sušiť a že majú veľmi dobré stabilizujúce vlastnosti. Pritom sa musí použiť amfotémy ión s polárnym zvyškom spoločne s amfotémym iónom s ncpolámym zvyškom. Takými amfotérnymi iónmi sú prednostne aminokyseliny a ich deriváty, obzvlášť prednostne farmaceutický znesiteľné aminokyseliny. Pod amfotérnymi iónmi sa rozumejú nízkomolekulové zlúčeniny, ktorých molekulová hmotnosť je menšia ako 10 kDa, prednostne menšia ako 5 kDa (1 Da (dalton) = 1,660.10-27 kg). Opisujú sa spôsoby, ktoré bez použitia zvýšenej teploty, t. j. pri izbovej teplote umožňujú sušiť prípravky podľa vynálezu tak, aby sa pre prípravky na stabilizáciu biologicky aktívnych, najmä terapeuticky aktívnych substancií dosiahli vhodné teploty skleného prechodu. Biologicky aktívnymi substanciami sú okrem terapeuticky účinných substancií i také, ktoré sa používajú v biolotechnologických procesoch, ako je napríklad fermentácia. Taktiež také látky, ktoré sa používajú napríklad na ochranu rastlín alebo ako insekticídy. Takým biologicky, najmä terapeuticky aktívnym materiálom môže napríklad byť jedna alebo viac substancií zvolených zo skupín zahŕňajúcich proteíny, peptidy, glykoproteíny, lipoproteíny, enzýmy, koenzýmy, biologické membrány, protilátky, fragmenty protilátok, bunky, zložky buniek, vírusy, zložky vírusov, vakcíny, DNA, RNA, PNA, plazmidy, vektory, feromóny, biologické terapeutiká a diagnostika a ich deriváty. Biologicky aktívnymi substanciami nie sú mienené žiadne potraviny samy osebe.
Zvláštne výhody tu opísaných prípravkov a spôsobov spočívajú v tom, že
- sa upúšťa od zmrazovania počas sušenia,
- uskutočňovanie sušenia je možné pomocou lyofilizačných zariadení už existujúcich v chemicko-farmaccutickom priemysle bez akéhokoľvek prestavovania,
- plnenie, obzvlášť výhodné na aseptickú výrobu, sa môže bez zmeny uchovávať v nádobách obvyklých v obchode, napríklad v sklených fľaštičkách,
- prevádzkové časy sú rádovo ako pri lyofilizačných postupoch a omnoho menšie,
- môžu sa použiť toxikologický neškodné pomocné látky, môžu sa ušetriť všetky množstvá energie potrebnej na zmrazovanie a použitie chladív zhoršujúcich životné prostredie sa môže prudko znížiť,
- získané produkty predstavujú dobre viditeľný, rýchlo sa znovu rozpúšťajúci „koláč“,
- pomocou rýchleho dosiahnutia čiastočne amorfného stavu biologický materiál menej degraduje ako pomocou spôsobov opísaných v doterajšom stave techniky.
Zistilo sa, že zvláštne výhody tu opísaných receptúr z určitých zmesí cukrov a aminokyselín, ako i určitých zmesí aspoň 2 aminokyselín pôsobia tiež, keď sa použijú v rámci iných postupov sušenia, ktoré sa vyhýbajú zmrazovaniu. Aj pri sušení rozprašovaním, sušení na valcoch atď. sa úplne prejavuje pôsobenie prísad urýchľujúcich sušenie, ako i vlastnosť prípravkov vytvárať amorfné alebo čiastočne amorfné systémy.
Podstatné je to, že sú k dispozícii pomocou DSC a/alebo rôntgenovej štruktúrnej analýzy alebo iných vhodných spôsobov dokázateľne signifikatné amorfné podiely a prípravok nemá úplne kryštalický charakter. Kryštalické prípravky nie sú vhodné na to, aby sa dosiahla dostatočná stabilita citlivých biologických látok. Úplne amorfné prípravky sú vhodné na stabilizáciu, a preto principiálne podľa vynálezu obzvlášť však čiastočne amorfné prípravky.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. la: Teploty skleného prechodu jednotlivých zmesí maltózy a L-fenylalanínu.
Obr. lb: Obsah zvyškovej vody v jednotlivých zmesiach maltózy a L-fenylalanínu.
Obr. 2: Difraktogramy práškov vo vákuu sušených
a) fenylalanínu (obsah vody 1,2 %/kryštalický),
b) maltózy (obsah vody 4,0 %, TB = 50 °C) a
c) fenylalanínu a maltózy pripravených spôsobom podľa vynálezu (obsah vody 0,7 %, Te = 88 °C). Difraktogramy sa snímali pomocou konvenčného prístroja (Phillips 1730 X-ray) a príslušného softvéru. Teplota merania: 25 °C, uhol rozlíšenia (2Θ) 0,05°, podmienky merania: 1 s na uhol pri napätí elektrónky 40 kV a prúde 40 mA.
Obr. 3: Časový' priebeh
a) obsahu zvyškovej vody a
b) teploty skleného prechodu prípravku z maltózy a fenylalanínu podľa vynálezu.
Podrobný opis vynálezu
V 13 príkladoch a 10 porovnávacích príkladoch je vynález exemplárne vyložený a ďalej sa vysvetľuje. Pritom sa objavili formulácie a spôsoby, ktoré prudko zlepšujú a urýchľujú sušenie látok obsahujúcich cukry pomocou vákuového sušenia a sú vhodné na stabilizáciu relevantných terapeutických a diagnostických biologických materiálov. Ďalej sa objavujú úplne nové zloženia, ktoré spĺňajú účel stabilizácie za zachovania optimalizovaných charakteristík sušenia.
Zloženia obsahujú prednostne buď aspoň jeden amfotémy ión s nepolárnym zvyškom (napríklad aminokyselinu, ako fenylalanín) a cukor, pričom teplota skleného prechodu cukru je pomocou prísady tohto amfotémeho iónu zreteľne zvýšená. Alternatívne sa môžu použiť aj zmesi rôznych špeciálne zvolených aminokyselín alebo ich deriváty. Tieto zmesi sa skladajú z jedného amfotémeho iónu s nepolárnym zvyškom a z jedného amfotémeho iónu s polárnym zvyškom. K týmto zmesiam sa môžu pridávať aj ešte cukry.
Ako pracovná hypotéza sa objavilo, že výsledky žiadané podľa vynálezu poskytujú obzvlášť zmesi cukru alebo polárnej látky tvoriacej amfotérne ióny (napríklad arginínu, kyseliny asparágovej, kyseliny glutámovej, histidínu, citrulínu, lyzínu) a nepolárnej látky tvoriacej amfotérne ióny (napríklad fenylalanínu, izoleucínu, metionínu, valínu, alanínu, glycínu, tryptofánu, cysteínu) alebo ich deriváty (napríklad acetylfenylalanínetylester). Je možné ľahko obmieňať spôsob i rozširovať zoznamy látok opísané na základe príkladov.
Obzvlášť prednostnými biologicky alebo terapeuticky aktívnymi materiálmi sú protilátky (monoklonálne alebo polyklonálne), enzýmy a ľudské proteíny, prípadne ľudské peptidy, ako napríklad rekombinantný ľudský erytropoetín (rh-EPO), rekombinantný ľudský faktor stimulujúci kolónie granulocytov (granulocyten colony stimulating factor (rhG-CSF)) alebo rekombinantný aktivátor plazminogénu (rPA), nGF, PTH, ularitidy, plazmidy, vírusy, GUP, BP-5.
Na prípravkoch bez účinnej látky sa dopracovalo k tomu, akým spôsobom prísada aminokyselín zmení sušenie matríc obsahujúcich cukry. V príklade 1 je znázornené, že prísada fenylalanínu a arginínu k maltóze zlepšuje jej správanie pri sušení v závislosti od pridaného množstva týchto prímesí. Teplota skleného prechodu sa dá pomocou cieľavedomej prísady týchto pomocných látok zvýšiť o viac ako 65 K za rovnakých podmienok sušenia, korešpondujúci obsah zvyškovej vody sa dá znížiť ľahko na menej ako 1 %. Z príkladu 1 vyplýva, že pritom použitý spôsob vedie počas h bez akéhokoľvek pôsobenia tepla k žiadanému výsledku. Maltóza bez pomocných látok pridaných podľa vynálezu má za týchto podmienok obsah zvyškovej vody 7-8 %, teplota skleného prechodu (Te) je nižšia ako izbová teplota, a teda tento systém nie je vhodný na stabilizáciu proteínov atď.
Výrobou prípravkov podľa vynálezu zo sacharózy a jednej aminokyseliny zo skupiny aminokyselín vhodných podľa vynálezu na výrobu stabilizujúcich, čiastočne amorfných produktov sa dosiahne zabránenie určitých nevýhod formulácie so sacharózou, zatiaľ čo sa výhody vlastné sacharóze môžu úplne prejaviť. Sacharóza má v porovnaní s inými, v literatúre uvedenými cukrami relatívne nízku teplotu skleného prechodu pri primerane normovaných obsahoch vody. Preto je pri výrobe suchých prípravkov obsahujúcich sacharózu obzvlášť ťažké dosiahnuť vysoké Tj,, ktoré sú zreteľne vyššie ako žiadaná teplota uskladnenia. Ďalej je ťažké premeniť sacharózu pomocou sušenia odparovaním úplne na amorfnú formu, cukor ľahko vykryštalizuje, a tým ľahko vytvára kryštalickú štruktúru nevýhodnú na stabilizáciu biologických účinných látok. Okrem toho sa pozorovalo, že amorfná sacharóza v priebehu skladovania porovnateľne rýchlo tvorí vo veľkej miere kryštály a po uplynutí určitých časov skladovania môže úplne kryštalizovať. Aj pri tomto procese stráca taký prípravok svoje stabilizujúce vlastnosti. Všetky tieto problémy, riziká a nedostatky spojené s použitím sacharózy sa môžu odstrániť podľa vynálezu pomocou prísady aminokyselín vhodnej skupiny. Obzvlášť prednostné je pritom použitie fenylalanínu a arginínu (príklad 2). V porovnávacom príklade A sa ukázalo, že taktiež s použitím dlhších časov sušenia a zvýšenej teploty sa nedajú čisté cukry účinne sušiť. Účinok aminokyselín a cukru zlepšujúci sušenie sa dá dosiahnuť tak pomocou jednotlivých aminokyselín, ako aj pomocou zmesí aminokyselín. Príklady 3 a 4 na to poskytujú príslušné výsledky na maltózových a sacharózových zmesiach. Našli sa aj aminokyseliny, ktoré nemajú žiadne účinky zlepšujúce sušenie, napríklad histidín (porovnávací príklad B). V príklade 5 sa ukazuje, že okrem aminokyselín môžu aj ich štruktúrne podobné deriváty mať účinky zlepšujúce sušenie. Výber určitých aminokyselín sa podrobne, i keď nie obmedzujúco alebo úplne obsiahle opisuje v príklade 6. Je možné zachytiť, že pri ďalšom nespôsobuje každá aminokyselina požadovaný účinok, ale len určité aminokyseliny. Aj miera účinkov je rozdielna, takže sa môžu menovať obvzlášt prednostné kombinácie alebo prípravky. Týmito sú predovšetkým fenylalanín, tryptofán, leucín a izoleucín. Z príkladu 1 a 6 sa dá ďalej odvodiť, že je možná zmes aminokyselín za zachovania účinku zlepšujúceho sušenie. Arginín samotný neprejavuje žiadny pozitívny účinok, ale len v zmesi s fenylalanínom.
Správanie aminokyselín pri vákuovom sušení sa skúmalo s cieľom zistiť, či aj bez matrice obsahujúcej cukry' pomocou aminokyselín je možné získať prípravky, ktoré majú teplotu skleného prechodu vyššiu ako izbová teplota. Prekvapivo sa zistilo, že čistá aminokyselina samotná vytvára len kryštalické štruktúry, zatiaľ čo určité soli aminokyselín a zmesi aminokyselín vytvárajú sklovité matrice (porovnávací príklad C a príklad 7). Na výrobu amorfných štruktúr je treba voliť cieľavedome rôzne aminokyseliny. Prekvapivo sa zistilo, že je možné rozdeliť aminokyseliny do 2 skupín, ktoré majú zjavne rozdielne vlastnosti. Je potrebné vybrať z každej skupiny aspoň jednu aminokyselinu a pripraviť vhodnú zmes a túto sušiť. Tak ako pri formulácii zmesí cukrov a aminokyselín je aj tu potrebný určitý pomer zmiešania na to, aby sa získali prípravky podľa vynálezu (príklad 7). Potom sa získa matrica s amorfnými po dielmi, ktorá je vhodná na stabilizáciu biologických účinných látok.
Účinnosť zlepšeného sušenia vzhľadom na vlastný cieľ, stabilizáciu biologicky aktívneho materiálu, exemplárne znázornená na proteínoch, sa podrobne dokladá v príkladoch 8 - 12 a v porovnávacích príkladoch D - J. Príklady 8 a 9 s porovnávacími príkladmi D - G opisujú stabilizáciu rh-G-CSF, príklad 10 a porovnávací príklad H stabilizáciu erytropoetínu a príklady 11 a 12 ako i porovnávacie príklady I a J stabilizáciu laktátdehydrogenázy. Na základe časov uskladnenia proteínu (rh-G-CSF, príklady 8 a 9, prípadne porovnávacie príklady D, E a F, G), glykoproteínu (ΛΕΡΟ, príklad 10 a porovnávací príklad H) a enzýmu (LDH, príklady 11, 12 a porovnávací príklad I a J) sa príkladne ukazuje prekvapivo veľmi zlepšená stabilita pri skladovaní prípravkov podľa vynálezu v porovnaní s prípravkami sušenými vo vákuu bez pomocných látok a ďalšími prípravkami. Zmeny rozličných prípravkov rh-G-CSF za skladovacích podmienok pri rozličných teplotách sa znázorňujú v príkladoch. Len prípravky podľa vynálezu, t. j. čiastočne amorfné, sklovité, neprejavujú po 6 mesiacoch žiadnu pozoruhodnú degradáciu v rozsahu teplôt uskladnenia od niekoľkých °C (chladnička) až do 40 °C (príklady 8 a 9). Vhodné prípravky sušené za vákua bez pomocných látok (porovnávací príklad D) prejavujú pri izbovej teplote a zvýšenej teplote (40 °C) zreteľný úbytok monoméru až do 20 %. Prípravky, ktoré nie sú amorfné, ale húževnaté, viskózne, ktoré sú skladované pri teplote vyššej ako teplota skleného prechodu, prejavujú už pri izbovej teplote po 5 týždňoch signifikantné úbytky koncentrácie monoméru (porovnávací príklad D a E). Kryštalické prípravky (porovnávací príklad G a J) ukazujú práve tak signifikantné skrátené časy uskladnenia. Z porovnania príkladu 8 a porovnávacieho príkladu E sa ukazuje, že pri zvýšenej teplote uskladnenia (40 °C) prísada aminokyselín k maltóze ako stabilizátorov viac ako zdesaťnásobí čas uskladnenia, pri ktorom menej ako 10 % monomérov G-CSF agreguje. Porovnanie príkladu 9 s porovnávacím príkladom G ukazuje, že aj voľba aminokyselín je rozhodujúca pre veľmi predĺžený čas uskladnenia. Porovnanie podielu monoméru pri glykoproteíne EPO (príklad 10, porovnávací príklad H) ukazuje, že prípravky podľa vynálezu pri izbovej teplote a zvýšenej teplote uskladnenia sú v porovnaní s EPO sušeným vo vákuu bez pomocných látok zreteľne výhodnejšie. Pri 5-týždňovom skladovaní citlivého enzýmu LDH ako prípravkov podľa vynálezu (príklady 11 a 12) v porovnaní s LDH sušeným vo vákuu bez pomocných látok (porovnávací príklad 1) a kryštalickým prípravkom (porovnávací príklad J) sa ukazuje, že len prípravky podľa vynálezu sa môžu skladovať pri izbovej teplote alebo pri vyšších teplotách uskladnenia (30 °C) bez prudkej straty aktivity. Pozoruhodná pritom je aj prídavná stabilizácia enzýmu pomocou prípravku podľa vynálezu priamo po príprave vzoriek (aktivita pri 0 týždňoch > 80 % oproti 65 % pri prípravku bez pomocných látok, prípadne 10 % pri kryštalickom prípravku). Typický časový priebeh procesu sušenia jednej zmesi podľa vynálezu je exemplárne znázornený v príklade 13.
Na výrobu zmesí aspoň dvoch aminokyselín podľa vynálezu na získanie rýchloschnúcich, sklovitých prípravkov je treba vždy zvoliť aspoň jednu aminokyselinu a jej deriváty z týchto uvedených 2 skupín:
Skupina 1: arginín, kyselina asparágová, kyselina glutámová, histidín, citrulín, lyzín, omitín;
Skupina 2: fenylalanín, izoleucín, leucín, metionín, valín, alanín, glycín, tryptofán, acetylfenylalanínetylester, cysteín, sarkozín.
Výhradné použitie len jednej aminokyseliny alebo niekoľkých aminokyselín len z jednej z obidvoch skupín nevedie k výhodným prípravkom podľa vynálezu. Zmesi látok podľa vynálezu sa môžu, ako sa exemplárne znázorňuje, nájsť tak, že sa k roztoku stabilizátora biologicky alebo terapeuticky aktívnych látok primieša v rozličných množstvách amfotérny ión s nepolámym zvyškom, napríklad fény lalanín alebo jeho deriváty. Zmesi sušené pri izbovej teplote sa hneď potom preskúmajú pomocou DSC, či majú zvýšenú teplotu skleného prechodu pomocou prísady amfotémeho iónu. Teplota skleného prechodu sa pritom zvýšila v porovnaní s prípravkami bez prísad podľa vynálezu o 10 K, výhodne o 20 K, obzvlášť výhodne o 40 K. Výhodné prípravky podľa vynálezu sú čiastočne amorfné, majú teplotu skleného prechodu vyššiu ako 4 °C, výhodne vyššiu ako 20 °C, obzvlášť výhodne vyššiu ako 40 °C a majú vhodné zvyškové vlhkosti menšie ako 6 %, výhodne menšie ako 4 %. Ich zdanlivá hustota zodpovedajúc sypnej hustote je aspoň o 10 %, výhodne o 50 % vyššia ako hustota príslušných lyofílizátov. Zachovávajú si svoju krehkú, sklovitú, kompaktnú, čiastočne amorfnú štruktúru počas aspoň 2 týždňov, výhodne 2 mesiace, obzvlášť výhodne 1 rok. Okrem toho je ich čas sušenia (t. j. okamih, v ktorom sa dosiahne rovnaká zvyšková vlhkosť) v porovnaní so zmesami látok, ktoré obsahujú len jeden sacharid alebo amfotérny ión s nepolámym zvyškom, menší najmä o 25 %, obzvlášť výhodne menší o 50 % alebo dokonca o 75 %. Tieto zmesi látok sa môžu aj mlieť alebo ďalej spracovávať iným spôsobom, napríklad používať v terapeutických prostriedkoch alebo diagnostikách v kombinácii s obvyklými pomocnými látkami a nosičmi. Terapeutické prostriedky sú terapeutické prípravky, ktoré obsahujú jedno alebo niekoľko terapeuticky účinných agens okrem obvyklých pomocných látok a prísad. Môžu byť vo forme tabliet, kapsúl alebo tuhých látok, z ktorých sa pomocou prídavku kvapaliny (napríklad sterilnej vody alebo tlmivého roztoku) vyrábajú terapeuticky účinné roztoky (napríklad infúzne roztoky). Ďalej sú obzvlášť vhodné na aplikáciu ako tuhé látky pomocou rozličných spôsobov, napríklad ako nosný sprej, inhalačný prostriedok alebo transdermálny prášok atď.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Vákuové sušenie zmesí maltózy, L-arginínu a L-fenylalanínu
Pripravil sa roztok s obsahom 50 mg monohydrátu maltózy a 0,1 mg polysorbátu 80 v 1 ml. K nemu sa potom pridávali stúpajúce množstvá L-arginínu a L-fenylalanínu v rovnakých podieloch. Takto pripravené roztoky sa sterilné filtrovali (0,22 pm nitrocelulózový filter) a potom vždy 1 ml roztoku sa plnil do 2 ml fľaštičiek a nasadili sa lyofílizačné zátky. Takto pripravené vzorky sa rovnakým spôsobom sušili vo vákuu pri 20 “C a za zníženého tlaku 48 h. Po vysušení sa stanovil obsah vody vzoriek podľa Karla Fischera a teplota skleného prechodu sa zistila pomocou diferenčnej termickej analýzy (Perkin Elmer DSC7 - rýchlosť nahrievania vzoriek = 10 K/min.). Výsledky merania ukazujú, žc správanie maltózy pri sušení sa pomocou prídavku určitých množstiev aminokyselín zreteľne mení. Od 7,5 mg každej aminokyseliny obsah vody vo vzorkách zreteľne klesá a teplota skleného prechodu primerane stúpa. Pri 10 mg L-arginínu a 10 mg L-fenylalanínu sa dosiahnu hodnoty, ktoré už nie je možné zvyšovať ďalším zvyšovaním podielov aminokyselín v suchom produkte. K roztoku cukru s 50 mg monohydrátu maltózy a 0,1 mg polysorbátu 80 v 1 ml sa pridávali stúpajúce množstvá aminokyselín. Výsledné produkty po vysušení mali tu uvedené obsahy vody a teploty skleného prechodu.
Tabuľka 1
L-Arginln [mg/ml] L-Fenylanilin [mg/ml] Obsah zvyškovej vody [»1 Teplota skleného prechodu [ec]
0 0 7,68 12,86
1 1 7,95 12, 47
2/5 2,5 7,71 12,91
5 5 7,75 13,67
7,5 7,5 3,55 52,04
10 10 0,54 80,57
12,5 12,5 0,76 73,14
Príklad 2
Vákuové sušenie zmesí sacharózy, L-argininu a L-fenylalanínu
K roztoku sacharózy, ktorý obsahoval 50 mg sacharózy a 0,1 mg polysorbátu 80 v 1 ml, sa pridávali stúpajúce množstvá L-arginínu a L-fenylalanínu v rovnakých podieloch. Vzorky sa pripravili ako v príklade 1, sušili a analyzovali. Pri množstvách do 10 mg aminokyseliny sa získali dokonale kryštalické produkty. Až od 10 mg L-arginínu a 10 mg L-fenylalanínu na 1 ml bolo možné identifikovať čiastočne amorfné produkty so skleným prechodom. V tomto príklade sa pomocou prídavku aminokyselín nielen zlepšuje správanie roztoku pri sušení, ale i systém pomocou tohto prídavku prechádza do čiastočne amorfného stavu. K roztoku cukru s 50 mg sacharózy a 0,1 mg polysorbátu 80 v 1 ml sa pridávali stúpajúce množstvá aminokyselín. Výsledné produkty po vysušení mali tu uvedené obsahy vody a teploty skleného prechodu.
Tabuľka 2
L-Arginín [mg/ml] L-Fenylanilín [mg/ml] Obsah zvyškovej vody [%] Teplota skleného prechodu [*C]
0 0 2,97 kryštalický
1 1 1,11 kryštalický
2,5 2,5 3,46 kryštalický
5 5 6,11 kryštalický
10 10 3,43 18,56
15 15 1,53 53,70
20 20 1,60 58,78
Porovnávací príklad A
Vákuové sušenie čistých roztokov cukrov
Pripravil sa roztok monohydrátu maltózy a roztok sacharóz}' s koncentráciou 50 mg/ml. Tieto roztoky cukrov sa potom filtrovali, plnili a analyzovali, ako je opísané v príklade 1. Mohlo sa ukázať, že ani pri 72-hodinovom sušení pri 50 °C za zníženého tlaku nie je možné vysušiť 50 mg cukru v 2 ml fľaštičke na uspokojivú zvyškovú vlhkosť tak, aby sklený prechod bol nad 25 °C. Produkt maltózy mal húževnatú konzistenciu a obsah zvyškovej vody 6,4 %. Teplota skleného prechodu bola 20 °C. Pri sacharóze bolo ešte 6,0 % zvyškovej vody, sklený prechod pri 14 °C. Na porovnanie sa čisté roztoky cukrov tiež 48 h sušili pri 20 °C za zníženého tlaku. Výsledné produkty boli ešte viac vlhké a sklený prechod bol preto ešte nižšie ako pri vzorkách sušených pri 50 °C. Tento pokus zreteľne ukazuje, že len pomocou prísady určitých aminokyselín je možné vrstvy cukrov sušiť v injekčných fľaštičkách alebo v podobných bale niach pomocou vákuového sušenia na malé zvyškové vlhkosti. Zlepšené správanie pri sušení pomocou prídavku aminokyselín sa tak stáva zreteľným.
Tabuľka 3
Sušenie Maltóza Obsah zvyškovej vody Maltóza Teplota skleného prechodu Sacharóza Obsah zvyškovej vody Sacharóza Teplota skleného prechodu
72 h pri 50 «,4 1 20,0 *C 6,0 Š 14,0 *C
48 h pri 20 *C 8, 9 % 6,1 *C 9,3 í -1,8 eC
Príklad 3
Vákuové sušenie zmesi maltózy a L-fenylalanínu a zmesí maltózy a L-izoleucínu
V tomto pokuse sa teraz pripravili binárne zmesi aminokyselín a monohydrátu maltózy. Má preskúmať, Či tu použité aminokyseliny majú vlastnosti zlepšujúce sušenie a aká je závislosť efektu zlepšujúceho sušenie od množstva pri jednotlivých aminokyselinách. K roztoku, ktorý obsahoval v 1 ml 50 mg monohydrátu maltózy, sa pridávali stúpajúce množstvá L-fenylalanínu alebo L-izoleucínu. Takto pripravené roztoky sa sterilné filtrovali (0,22 pm nitrocelulózový filter) a potom vždy 1 ml roztoku sa plnil do 2 ml fľaštičiek a nasadili sa lyofilizačné zátky. Takto pripravené vzorky sa za vákua sušili pri 20 °C za zníženého tlaku 48 h. Po vysušení sa stanovil obsah vody vo vzorkách podľa Karla Fischera vždy 4-krát a teplota skleného prechodu sa zistila pomocou diferenčnej termickej analýzy pri dvoch vzorkách z každej zmesi (Perkin Elmer DSC7 - rýchlosť zahrievania vzoriek = 10 K/min.).
a) Výsledok maltóza-L-fenylalanín
Výsledky merania jasne ukazujú pozitívny vplyv L-fenylalanínu na správanie maltózy pri sušení. Už malé množstvá L-fenylalanínu sú dostatočné na to, aby sa teplota skleného prechodu skla cukru pri nemeniacich sa podmienkach sušenia zvýšila o približne 50 °C (obr. la a lb). Pri 10 mg/ml L-fenylalanínu dosahuje efekt zlepšujúci sušenie maximum. Pomocou prídavku väčších množstiev L-fenylalanínu už nie je možné žiadne zlepšenie. Teplota skleného prechodu sa tak zvýšila pomocou prísady L-fenylalanínu v porovnaní s čistou maltózou o približne 80 °C. Pri veľkých množstvách L-fenylalanínu (10 - 20 mg/ml) nie je možné v tomto pokuse poznať žiadne rozdiely, čo sa týka správania pri sušení. Toto sa mení ale pri skrátených časoch sušenia. Tu je možné vidieť so stúpajúcimi množstvami L-fenylalanínu zvyšovanie sa sklených prechodov aj v rozsahu 10 - 20 mg L-fenylalanínu v 1 ml. Tabuľka 4 ukazuje množstvo L-fenylalanínu v roztoku cukru a z toho vyplývajúci obsah zvyškovej vody a teplotu skleného prechodu Tj.
Tabuľka 4 ___
L-Fenylalanin [mg/ml] Obsah zvyškovej vody [«) Teplota skleného prechodu [*CJ
0 B,91 6,1
5 3,21 62, 8
7/5 0,95 77, 7
10 1, 12 86,0
15 0,99 85,2
20 0,99 88,2
Okrem toho sa zaznamenali difraktogramy práškov za vákua sušeného fenylalanínu a maltózy a zmesi fenylalanínu a maltózy podľa vynálezu (obr. 2a, 2b, 2c). Čistý fenylalanín ukazuje typický difraktogram kryštalickej látky (obr. 2a), zatiaľ čo maltóza ukazuje difraktogram amorfnej látky (obr. 2b). Len pri zmesi podľa vynálezu dochádza k tvorbe čiastočne amorfných štruktúr, viditeľné na diskrétnych difrakčných maximách na širokom signále pozadia (obr. 2c).
b) Výsledok maltóza a L-izoleucín
K zásobnému roztoku s 50 mg monohydrátu maltózy v 1 ml sa pridávali rôzne množstvá L-izoleucínu a jednotlivé zmesi sa sušili pri 20 °C. So stúpajúcim množstvom aminokyseliny sa efekt zlepšujúci sušenie stáva zreteľný. Pomocou prídavku 20 mg/ml L-izoleucínu (pomer zmiešania 5 : 2 (hmotn. diely)) sa dá zvýšiť TB produktu maltózy o približne 20 °C. Tabuľka 5 znázorňuje množstvo L-izoleucínu v roztoku cukru a z toho vyplývajúci obsah zvyškovej vody a teplotu skleného prechodu Tg.
Tabuľka 5
Izoleucin [mg/ml] Obsah zvyškovej vody [%J Teplota skleného prechodu [*C]
0 8,91 6,1
5 7,84 13,7
10 7,52 17,7
15 6,77 19,4
20 5,34 24,7
Príklad 4
Vákuové sušenie sacharózy a L-leucínu
V nasledujúcich pokusoch sa pripravili binárne zmesi sacharózy s rôznymi aminokyselinami. Malo sa preskúmať, či použité aminokyseliny majú na sacharózu účinok zlepšujúci sušenie. K roztoku, ktorý obsahoval 50 mg sacharózy v 1 ml, sa pridávali zvyšujúce sa množstvá L-leucínu. Roztoky sa spracovali tak, ako je opísané v príklade 3. Výsledok: sacharóza - L-leucín
Sacharóza vytvára s malými množstvami L-leucínu kryštalický produkt. Táto tvorba kryštálov mohla byť tiež pozorovaná už v príklade 2 s L-argininom a L-fenylalanínom. Sacharóza tvorí teda pri zmiešaní s určitými aminokyselinami kryštalické produkty. Čistý cukor a zmesi s väčšími podielmi L-leucínu tvoria systémy so skleným prechodom. To znamená, že existuje čiastočne amorfná štruktúra. Tak sa stáva jasným to, že až koncentrácie od 15 mg/ml L-leucínu zlepšujú vlastnosti čistej sacharózy pri sušení a sklený prechod sa môže zvýšiť pomocou prídavku tejto aminokyseliny o približne 18 °C. L-Leucín je teda aminokyselinou s účinkom zlepšujúcim sušenie. Tabuľka 6 znázorňuje množstvo L-leucínu v roztoku cukru a z toho vyplývajúci obsah zvyškovej vody a teplotu skleného prechodu Τε konečných produktov.
Tabuľka 6 __
L-Leucín [mg/ml] Obsah zvyškovej vody <»] Teplota skleného prechodu í ’C]
0 9,34 -1, 8
5 6,23 kryštalický
10 6,50 kryštalický
15 5,81 16,4
20 5,02 16,1
Porovnávací príklad B
Vákuové sušenie zmesí sacharózy a L-histidínu
Pokusy sa uskutočňovali ako v príklade 4. Miesto L-leucínu sa použil L-histidín. Zmes sacharózy a L-histidínu vytvára pri vákuovom sušení amorfné produkty, pri ktorých nie je možné pozorovať žiadny účinok zlepšujúci sušenie. Nezávisle od pomeru zmiešania sa sušia štruktúry zle a obsahy zvyškovej vody a sklené prechody zmesí sú rádovo rovnaké ako výsledky čistej sacharózy. Teda L-histidín nemá žiadny účinok zlepšujúci sušenie. Tabuľka 7 znázorňuje množstvo L-histidínu v roztoku cukru a z toho vyplývajúci obsah zvyškovej vody a teplotu skleného prechodu TE konečných produktov.
Príklad 6
Vákuové sušenie iných zmesí cukrov a aminokyselín
V tomto pokuse sa pripravili binárne zmesi monohydrátu maltózy' alebo sacharózy s L-aminokyselinou. Pritom sa k roztoku cukrov pridávali aminokyseliny v pomere zmiešania 5 : 2 až 1 : 1. Malo sa preskúmať, či daná aminokyselina má pri príslušných cukroch účinok zlepšujúci sušenie. Príprava, spracovanie a sušenie roztokov sa uskutočňovalo ako v príklade 4. Jednotlivo išlo o nasledujúce zmesi.
a) Zmesi s monohydrátom maltózy
Tabuľka 10
Tabuľka 7
I.-Histidín [mg/ml 1 Obsah zvyškovej vody [»] Teplota skleného prechodu [*C]
0 9, 34 -1,8
5 11,23 -1,4
20 9,18 -2, 6
Príklad 5
Vákuové sušenie zmesí sacharózy a L-tryptofánu a zmesí sacharózy a N-acetyl-L-fenylalanínetylesteru (APE)
V tomto pokuse sa pripravil jeden roztok s 10 mg L-tryptofánu v 1 ml a jeden roztok s 3 mg ΑΡΕ v 1 ml (APE má len obmedzenú rozpustnosť vo vode). K obidvom roztokom sa pridávali stúpajúce množstvá sacharózy. Takto získané roztoky sa ako v príklade 3 spracovali a sušili. Na porovnanie sa pri tomto pokuse sušil aj roztok sacharózy (50 mg/ml) za rovnakých podmienok sušenia. Tento mal v konečnom produkte obsah zvyškovej vody 9,98 % a teplotu skleného prechodu -6,25 °C.
a) Tabuľka 8 znázorňuje množstvo sacharózy v roztoku L-tryptofánu (10 mg/ml) a z toho vyplývajúci obsah zvyškovej vody a teplotu skleného prechodu konečných produktov.
Tabuľka 8
Sacharóza [mg/mlJ Obsah zvyškovej vody Γ%] Teplota skleného prechodu l*C]
20 3,09 37, 30
40 4,19 22,51
60 5, 37 14,44
b) Tabuľka 9 znázorňuje množstvo sacharózy v roztoku APE (3 mg/ml) a z toho vyplývajúci obsah zvyškovej vody a teplotu skleného prechodu konečných produktov.
Tabuľka 9
Sacharóza (mg/ml] Obsah zvyäkovej vody («i Teplota skleného prechodu [ *CJ
10 6,15 13,3
40 8,33 1,4
Výsledky ukazujú, že obe skúmané látky, L-tryptofán a APE, majú účinok zlepšujúci sušenie. Pomocou L-tryptofánu sa dá zvýšiť teplota skleného prechodu čiastočne amorfného produktu pri nemeniacich sa podmienkach približne o 45 °C. Pomocou APE je možné zvýšenie teploty skleného prechodu pri nemeniacich sa podmienkach o 20 °C.
Použitá aminokyselina Množstvo AMK [mg/ml] Množstvo cukru [mg/ml] Obsah zvyškovej vody Teplota skleného prechodu [*C]
- - 50 8, 91 6,1
L-Arginin 10 50 8, 10 10,3
L-Arginín 20 50 8, 63 7,1
L-Leucin 20 50 5,42 20,9
L--Leucin 20 20 1,87 56,05
L--Histidin 20 50 9,78 5,3
L-Izoleucín 20 20 3, 12 37,9
L-Metionin 15 30 7,45 9, 7
L-Metionin 20 20 2,70 34,4
L-Valin 20 20 4,93 18,8
b) Zmesi so sacharózou
Tabuľka 11
Použitá aminokyselina Množstvo AMK [mg/ml] Množstvo cukru [mg/ml] Obsah zvyškovej vody [%] Teplota skleného prechodu [’C]
- 50 9,34 -1,8
L-Alanin 15 30 6, 04 2,8
L-Alanín 20 20 4, 46 11,7
L-Glycin 20 20 4,47 5,3
L-Fenylalanin 20 50 1,12 62,7
L-Serin 15 30 11,77 -15,1
L-Serin 20 20 10,61 -14,4
AMK - aminokyselina
Výsledky sušenia ukazujú, že L-histidín nemá žiadny pozitívny vplyv na správanie cukrov pri sušení (tabuľka 10). L-Serín dokonca ešte viac zhoršuje sušenie cukrov (tabuľka 11). L-Leucín, L-izoleucín a L-metionín majú účinok zlepšujúci sušenie (tabuľka 10). Tento sa stáva zrejmým, keď sa k roztoku cukrov pridávajú stúpajúce množstvá týchto aminokyselín. Pri L-valíne a L-alaníne je možné zistiť zlepšenie sušenia len pri veľkých množstvách aminokyseliny v produkte; L-arginín a L-glycín majú slabý pozitívny vplyv. Veľmi dobrý účinok L-fenylalanínu na správanie pri sušení sa stáva jasným aj pri binárnej zmesi so sacharózou (tabuľka 11). Produkt sa suší dobre a má veľmi vysokú teplotu skleného prechodu.
Porovnávací príklad C
Vákuové sušenie roztokov aminokyselín alebo roztokov soli aminokyselín
Z jednotlivých aminokyselín alebo solí jednotlivých aminokyselín sa pripravili roztoky a sterilné sa filtrovali (0,22 pm nitrocelulózový filter). Vždy 1 ml roztoku sa plnil do 2 ml fľaštičiek a nasadili sa lyofilizačné zátky. Takto pripravené vzorky sa za vákua sušili pri 20 °C za zníženého tlaku 48 h. Po vysušení sa stanovil obsah vody vo vzorkách podľa Karla Fischera a teplota skleného prechodu sa zistila pomocou diferenčnej termickej analýzy (Perkin Elmer DSC7 - rýchlosť zohrievania vzoriek = 10 K/min.). Jednotlivo sa nasledujúce roztoky sušili a výsledkom boli tu uvedené obsahy zvyškovej vody a výsledky merania DSC.
a) Aminokyseliny
Tabuľka 12
Aminokyselina Koncentrácia [mol/1] [mg/ml] Obsah zvyškovej vody Výsledok merania DSC [•Cl
L~Alanin 0,24 21, 33 0,81 kryštalický
L-Arginin 0,24 41,30 0,52 kryštalický
L-Cltrulin 0,24 42,05 4/9 kryštalický
L-Cystein 0,24 29,08 2,61 kryštalický
Glycirt 0,24 18,02 0,76 kryštalický
L-Histidin 0,12 18,62 0,77 kryštalický
L-izoleucín 0,12 15,74 1,10 kryštalický
L-Leucin 0,12 15,74 1,62 kryštaLický
1-Ly2ín 0,24 35,09 0,79 kryštalický
L-Metionín 0,12 17,91 1,57 kryštalický
L- Fenylalanín 0,12 19,82 1,53 kryštalický
1-Prolin 0,24 27,63 19,93 kryštalický
L-Serin 0,24 25,22 0,44 kryštalický
L-Treonln 0,24 28,59 0,45 kryštalický
L-Valin 0,24 28,12 0,57 kryštalický
b) Soli aminokyselín porovnávacom príklade C. Jednotlivo sa pripravili a sušili nasledujúce binárne zmesi.
Tabuľka 14
Molový pomer zmiešania L-Arginin L-Fenylalanin Obsah zvyškovej vody m Teplota skleného prechodu l'C]
[mol/1] [mg/ml] [mol/1] [mg/ml]
1:1 0, 12 20,90 0,12 19,82 2,27 59,5
2; 1 0,16 27,67 0,08 13,21 9,32 1/7
3:1 0,18 31,35 0,06 9,91 9,40 2,8
4:1 0,192 33,44 0,048 7,928 9,96 1/3
5:1 0,20 34,83 0,04 6,61 10,73 0,0
6:1 0,206 35,88 0, 034 5,61 10,03 1,3
7:1 0,21 36,58 0,03 4,96 11,38 1/0
1:2 0, 06 10,45 0,12 19,82 2,85 47,2
1:3 0,04 6,97 0,12 19,82 3,43 46,2
1:4 0,03 5,23 0,12 19,82 3,66 43, 45
Tento pokus ukazuje, že pomocou zmiešania dvoch aminokyselín, ktoré samotné sušené poskytujú kryštalické produkty, je možné pripraviť čiastočne amorfné štruktúry. Tieto sa sušia pri zvolených pomeroch zmiešania tak dobre, že výsledkom sú čiastočne amorfné štruktúry s vysokou teplotou skleného prechodu a malým obsahom zvyškovej vody.
Je zaujímavé, že existuje optimálny pomer zmiešania s najvyššou teplotou skleného prechodu. V tomto pokuse sa pripravil ešte jeden roztok, ktorý obsahoval L-arginín a L-izoleucín po 0,15 M.
Tabuľka 13
Aminokyselina Koncentrácia Hodnota pH Obsah zvyškovej vody Výsledok merania DSC [-C]
[mol/1] [mg/ml]
L-Arginín HC1 0,25 0,30 43,55 10,93 2,70 6,46 3,51
L-Arginín H3P0< 0,25 0,15 43,55 14,70 6,81 3,3 5,17
L-Arginin HzSO, 0,25 0,15 43,55 14,71 2, 89 3,24 6,67
I-Argínín HN03 0,25 0,30 43,55 18, 90 2,58 2,66 kryšta- lický
L-Arginin Kyselina octová 0,25 0,30 43,55 18,0 5,24 11,04 kryštalický
Kyselina L-aspa rágová NaOH 0,12 0,12 15,97 4,8 9, 65 9,78 27,7
Kyselina L-glutámová NaOH 0,12 0,12 17,66 4,8 5,14 14,69 5,5
L-Ornitín HC1 0,24 40, 47 5,39 0,4 kryštalický
Výsledok ukazuje, že aminokyseliny sú po vákuovom sušení kryštalické. Len soli zásaditých a kyslých aminokyselín vytvárajú počas týchto podmienok sušenia amorfné štruktúry, ktoré sa však veľmi zle sušia a ich teplota skleného prechodu za zvolených podmienok je nižšia ako izbová teplota.
Príklad 7
Vákuové sušenie zmesí L-arginínu a L-fenylalanínu a jednej zmesi L-arginínu a L-izoleucínu
V tomto pokuse sa pripravili, spracovali a sušili rozličné zmesi L-arginínu a L-fenylalanínu a skúmali sa ako v
Tabuľka 15
Molový L-Arginín L-Izoleucín Obsah Teplota
pomer zvyško- skleného
zmieša- [mol/1] [mg/ml] [mol/1] [mg/ml] vej vody prechodu
nia
1:1 0,15 |26,13 0,15 119,68 1,05 53,27
Výsledkom bol produkt s teplotu skleného prechodu 53,27 °C a obsahom zvyškovej vody 1,05 %. Zmiešaním dvoch aminokyselín sa mohla vytvoriť tak dobre schnúca čiastočne amorfná štruktúra; teplota skleného prechodu sa zvýšila približne o 50 °C, v porovnaní so soľami arginínu s minerálnymi kyselinami (porovnávací príklad C).
Príklad 8 rh-G-CSF sušený za vákua v receptúre maltózy obsahujúcej L-arginín a L-fenylalanín
Pripravil sa roztok s 50 mg maltózy, 10 mg L-fenylalanínu a 10 mg L-arginínu v 1 ml. Okrem toho obsahoval tento roztok 0,1 mg polysorbátu 80 a 0,35 mg rh-G-CSF v 1 ml. Hodnota pH receptúry sa nastavila pomocou kyseliny chlorovodíkovej na 7,4. Za aseptických podmienok sa pripravil roztok obsahujúci proteín a sterilné sa filtroval (polyvinylidéndifluoridový filter 0,22 pm). Potom sa vždy 1 ml roztoku plnil do 2 ml fľaštičiek. Naplnené fľaštičky s lyofilizačnými zátkami sa potom izotermicky sušili 48 h pri 20 °C a za zníženého tlaku. Vznikol suchý produkt s obsahom zvyškovej vody 1,16 % a teplotou skleného prechodu 75 °C. Takto pripravené vzorky sa skladovali pri rôznych teplotách a po rôznych časoch uskladnenia sa posúdila stabilita proteínu.
Pri rh-G-CSF je podiel vzniknutého diméru v pripravenom produkte dobrým kritériom na posudzovanie stability produktu. Preto sú množstvá monoméru a diméru zistené pomocou gélovej permeačnej chromatografie (na podmien ku 4 jednoduché merania) mierou pre stabilizujúci účinok našich prípravkov pripravených sušením. Pri gélovej permeačnej chromatografíi sa molekuly proteínu oddelia na základe veľkosti svojich častíc v rozpustenom stave, t. j. vysokomolekulové zložky (diméry) sa separujú od monomérov rh-G-CSF. Skúmanie (HP-SEC) sa uskutočňovalo v aparatúre HPLC od Shimadzu s použitím ochladzovateľného automatického vzorkovača (Waters TM 717). Ako oddeľovacia kolóna sa použila kolóna TSK-Gel G2000 SW (7,5 x 300 mm) od firmy TosoHaas. Detekcia oddelených zložiek prebiehala fotometrický pri 214 nm (Fotometr Shimadzu LC-GA). Ako elučný prostriedok sa použil 0,1 M sodnodraselný fosfátový tlmivý roztok pH 6,2, pomocou ktorého sa nastavil prietok 0,6 ml/min. pri izbovej teplote. Skúmané vzorky sa rozpustili v dvakrát destilovanej vode tak, aby sa znovu pripravila východisková koncentrácia (prídavok 1 ml). Tieto rozpustené vzorky sa potom uschovávali v automatickom vzorkovači ochladenom na 6 °C až do skúmania. Vstrekované množstvo jednej vzorky bolo 20 μΐ (= 7 μg G-CSF), čas prietoku jednej vzorky 32 min. Vyhodnotenie výsledkov prebiehalo s použitím pracovného štandardu G-CSF. Aby bolo možné produkty prídavné kvalitatívne posudzovať, uskutočňovala sa okrem toho pri každom stanovení obsahu SDS-gélová elektroforéza s farbením pomocou „silver stain“. Výsledky k SDS-gélovej elektroforéze sú znázornené v príklade 8b, obr. 9. Vo vodných roztokoch denaturuje protein pri teplote medzi 45 a 47 °C v priebehu niekoľkých hodín, Pomocou tejto receptúry sa podarilo v priebehu týždňov stabilizovať protein dokonca pri teplote uskladnenia 50 °C.
a) Stabilita rh-G-CSF v maltózovej receptúre sušenej vo vákuu s L-arginínom a L-fenylalanínom
Tabuľka 16
Obsahy monoméru uvedené v %, získané v HP-SEC
Cas uskladnenia [týždne] Teplota uskladnenia
TCH IT 30 *C 40 *C 50 *C
0 - 99,83 Ä - - -
5 99,94 % 99,93 % 99,86 % 99,89 % 99,87 %
13 99,83 % 99,86 % 99,88 % 99,83 % 99,83 %
26 99,76 % 99,75 % 99/55 % 99,36 % 99,21 %
39 99,68 % 96,73 % 96,40 % 93,81 % 89,27 %
52 96,34 % 94,81 % 94,70 % 91,27 % 86,27 %
TCH = teplota chladničky
PT = izbová teplota = 20 - 22 °C
Výsledky gélovej permeačnej chromatografie jasne ukazujú, že pomocou tejto receptúry je možné protein rh-G-CSF v takom prípravku sušenom za vákua stabilizovať dlhší čas. Pokus ukazuje, že je možné dlhší čas stabilizovať rh-G-CSF v čiastočne amorfnej, za vákua sušenej receptúre maltózy, obsahujúcej L-arginín a L-fenylalanín, pod teplotou skleného prechodu.
b) Prehľad výsledkov SDS-gélovej eletroforézy všetkých receptúr, ktoré obsahovali účinnú látku rh-G-CSF
Najprv sa pripravili polyakrylamidové gély obsahujúce SDS, ktorých oddeľovací gél obsahoval 15 % akrylamidu a ktorých zberný gél obsahoval 3 % akrylamidu a 1 % dodecylsulfátu sodného (SDS). Príprava vzoriek prebiehala tak, že z 3 injekčných fľaštičiek sa pripravila 1 zmiešaná vzorka. Hneď potom sa tento skúšobný roztok zriedil skúšobným tlmivým roztokom obsahujúcim ditiotreitol (DTT) a brómfenolovú modrú, takže vznikla koncentrácia 150 pg/'ml rh-G-CSF. Vzorky sa denaturovali 5 minút pri 95 °C v predhriatom vyhrievacom bloku. Ako porovnávacie proteíny sa použili proteíny „Combithek Eichproteine ftir die Chromatographie MG 18000-300000“ od Boehringer Mannheim. Tieto sa pripravili a spracovali presne tak ako vzorky rh-G-SCF. Okrem toho sa pripravil pracovný štandard rh-G-CSF, ktorý' sa použil na porovnanie. Gélová elektroforéza sa uskutočňovala pomocou miniatúrnej jednotky na gélovú elektroforézu (Midget Gelektrophoresis Unit, Pharmacia - LKB 2050) a pomocou príslušnej jednotky napätia. Keď sa naplnil elektroforetický tlmivý roztok, do každého gélového zásobníka sa naplnilo 20 μΐ vzorky (t. j. 3 pg rh-G-CSF). Po uzavretí elektroforetickej komory a nastavení vodného chladenia sa vložilo napätie 80 V, ktoré sa zvýšilo na 130 V, keď pretiekol zberný gél. Skôr ako pás brómfenolovej modrej dosiahol koniec gélu, elektroforéza sa ukončila. Gély sa odstránili z komory a premyli dvakrát destilovanou vodou. Potom sa uskutočňovalo farbenie „silver stain“ pomocou Daiichi 2D-silver-stain II Kit podľa tam sa nachádzajúceho návodu. Po ukončení farbenia sa uskutočňovalo optické posudzovanie gélov.
Tabuľka 17
Výsledok gélovej elektroforézy
Stopa Prípravok Vizuálny výsledok
1 Porovnávacie proteíny
Príklad 8: Maltúrová receptúra obsahujúca L-arginín a L-fenylalanín len monoméry
3 Porovnávací príklad D: Sušenie bez pomocných látok monoméry a diméry
4 Porovnávací príklad E: Čistá maltózová receptúra monoméry, diméry a triméry
5 Porovnávacie proteíny
6 Príklad 9: Receptúra bez cukrov, obsahujúca L-arginín a L-fenylalanín len monoméry
7 Porovnávací príklad F: L-Argininová receptúra s kyselinou fosforečnou monoméry a diméry
8 Porovnávací prikLad G: Kryštalická receptúra L-vallnu a L-glycínu monoméry, diméry a produkty degradácie
Receptúry príkladov 8 a 9 ukazujú pri tejto skúške len monoméry. Pri porovnávacom príklade D a F je možné okrem monoméru rozoznať ešte diméry, v príklade E okrem toho prídavné triméry. V kryštalickom prípravku L-valínu a L-glycínu porovnávacieho príkladu G sa pozorujú okrem toho ešte 2 produkty' degradácie, ktorých molekulová hmotnosť je menšia ako molekulová hmotnosť monoméru, a 2 slabé pásy produktov degradácie, ktorých molekulová hmotnosť je medzi molekulovou hmotnosťou monoméru a diméru.
Na základe tejto citlivej metódy sa mohli stať veľmi dobre viditeľnými produkty degradácie a agregácie monoméru, ktoré sa nachádzali v množstvách > 1 %.
Porovnávací príklad D
Vákuové sušenie rh-G-CSF bez prídavku pomocných látok
Pri tomto pokuse sa pripravil roztok, ktorý obsahoval len protein rh-G-CSF s koncentráciou 0,35 mg/ml v zriedenom fosfátovom tlmivom roztoku (približne 0,01 m). Tento proteínový roztok sa pripravil, spracoval a analyzoval tak, ako je opísané v príklade 8. Pri tomto prípravku nebolo z technických dôvodov možné pri konečných produktoch stanoviť obsah zvyškovej vody a teplotu skleného precho du. Údaje o stabilite rh-G-CSF sušeného vo vákuu bez pomocných látok
Tabuľka 18
čas uskladenia Teplota uskladnenia
[týždne] CHT IT 40 *C
0 - 97,84 % *
5 94,90 % 94,53 % 93,96 %
13 91,31 % 89,66 % 78, 23 %
26 90,06 % 73,60 % 52,22 8
TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C IT = izbová teplota = 20-22 °C
Údaje o stabilite čistého proteínu jasne ukazujú stabilizujúci účinok pomocných látok receptúry opísanej v príklade 8. Aj pri tejto receptúre sa pri každej skúške uskutočňovala SDS-gélová elektroforéza s farbením pomocou „silver stain“. Výsledky pozri v príklade 8b.
Porovnávací príklad E rhG-CSF v čistej maltózovej receptúre sušenej vo vákuu
Pripravil sa roztok, ktorý obsahoval v 1 ml 50 mg monohydrátu maltózy, 0,1 mg polysorbátu 80 a 0,35 mg rhG-CSF. Hodnota pH receptúiy sa nastavila pomocou roztoku hydroxidu sodného na 7,4. Východiskový roztok a konečné produkty sa pripravili, spracovali a analyzovali tak, ako je opísané v príklade 8. Ako ukazuje už príklad 1, je ťažké vysušiť maltózu bez prísady aminokyselín za 48 h na malé zvyškové vlhkosti. Preto vznikajú produkty s obsahom zvyškovej vody 10,43 % a teplotou skleného prechodu -2 °C. Pri teplotách uskladnenia, teda nad skleným prechodom, neexistovalo žiadne amorfné, krehké sklo, ale vysokoviskózna, húževnatá elastická hmota. Stabilita rhG-CSF v maltózovom prípravku bez aminokyselín, sušenom vo vákuu.
Tabuľka 19
Uvedené sú obsahy monomérov v %, získané v HP-SEC
čas uskladnenia [týždne] Teploty uskladnenia
TCH IT 30 *C 40 *C 50 *C
0 - 97,99 % - -
5 98,26 % 96,82 % 93,91 % 67,45 i 42,63 »
13 97,15 % 90,49 % 73,70 % 30,05 % 18,52 %
26 97,05 í 88,23 % 71,32 * 22,30 % 15,27 %
K výsledkom SDS-gélovej eletroforézy pozri príklad 8b. Výsledok ukazuje, že nie je výhodné uschovávať rhG-CSF v cukrovej zmesi bez aminokyselín. Stabilita je zreteľne nižšia ako pri sypkom materiáli sušenom vo vákuu (porovnávací príklad D) a pri optimalizovanej receptúre sušenej vo vákuu (príklad 8).
Tento pokus ukazuje jasne nutnosť prísady aminokyselín k cukrom pri vákuovom sušení na to, aby sa získali produkty s vysokými sklenými prechodmi, v ktorých sa potom proteín stabilizuje pomocou amorfnej štruktúry pomocnej látky. Skladovanie produktov pod teplotou skleného prechodu sa ukazuje ako nutnosť na stabilizáciu účinnej látky. Je treba ešte poznamenať, že vo vzorkách, ktoré boli uskladnené pri 40 a 50 °C, úplne vykryštalizovala maltóza už po 4 týždňoch. Takým fyzikálnym zmenám vo vzorkách v priebehu skladovania je treba zabrániť; urýchľujú úbytok obsahu monoméru.
Príklad 9 rh-G-CSF v receptúre L-arginínu a L-fenylalanínu bez cukrov, sušenej vo vákuu
Pripravil sa roztok, ktorý obsahoval v 1 ml 20 mg L-arginínu a 20 mg L-fenylalanínu, 0,1 mg polysorbátu 80 a 0,35 mg rh-G-CSF. Po nastavení hodnoty pH na 7,4 pomocou kyseliny chlorovodíkovej sa roztok spracoval, sušil a analyzoval tak, ako je opísané v príklade 8. Po ukončení sušenia bol k dispozícii homogénny produkt s teplotou skleného prechodu 77,0 °C a obsahom zvyškovej vody 1,30 %. Stabilita rh-G-CSF v receptúre arginínu a fenylalanínu, sušenej vo vákuu.
Tabuľka 20
Uvedené sú podiely monoméru získané v HP-SEC
Cas uskladnenia [týždne) Teploty uskladnenie
TCH IT 30 eC 40 *C 60 *C 80 *C
0 - 99,57 % - -
4 99,36 % 99,36 % 99,50 % 99,81 % 95,56 í 1,44 %
13 99,17 % 99,31 % 99,40 1 99,64 %
26 99,64 % 98,62 % 96,52 % 91,06 % - -
39 99, 64 % 94,18 % 88,99 % 79,05 % -
TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C IT = izbová teplota = 20-22 °C
Výsledky skúmania trvanlivosti ukazujú jasne, že je možné s touto receptúrou dlhší čas proteín rh-G-CSF stabilizovať v čiastočne amorfnom, vo vákuu sušenom arninokyselinovom prípravku, pokým teploty uskladnenia sú zreteľne nižšie ako teploty' skleného prechodu (porovnaj aj porovnávací príklad C). Uskladnenie pri 80 °C v porovnaní s uskladnením pri 60 °C ukazuje tento fenomén vzhľadom na sklený prechod pri 77 °C.
Aby bolo možné doplnkovo posudzovať produkty kvalitatívne, uskutočňovala sa okrem toho s každým stanovením obsahu SDS-gélová eletroforéza s farbením „silver stain“. Výsledky tejto SDS-gélovej elektroforézy sú znázornené v príklade 8b. Rovnaká receptúra sa uskladňovala aj pri rôznych teplotách 1 rok. Výsledok je znázornený v tabuľke 20a.
Obsah vody rc] Obsah monoméru G-CSF [%]
Štart 0,77 82,1 99, 82
po 52 týždňoch:
CHT 1,20 79,52 98,34
IT 2,08 69,47 94,81
30 eC 2,21 67,91 94,70
40 ’C 2,32 67,36 91,27
50 *C 2,40 68,63 86,26
TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C
IT = izbová teplota = 20-22 °C
Pokus ukazuje, že je možné rh-G-CSF stabilizovať v čiastočne amorfnej, vo vákuu sušenej receptúre L-arginínu a L-fenylalanínu pod teplotou skleného prechodu.
Porovnávací príklad F rh-G-CSF v L-arginínovej receptúre s kyselinou fosforečnou, sušenej vo vákuu
Pripravil sa roztok, ktorý obsahoval v 1 ml 40 mg L-arginínu, 0,1 mg polysorbátu 80 a 0,35 mg rh-G-CSF. Po nastavení hodnoty pH pomocou kyseliny fosforečnej na 7,4 sa roztok spracoval, sušil a analyzoval, ako je opísané v príklade 8. Vysušený konečný produkt mal obsah zvyškovej vody 3,59 % a teplotu skleného prechodu 8,6 °C. Tento produkt bol teda po ukončení sušenia k dispozícii nie ako krehké, amorfné sklo, ale ako vysokoviskózna, húževnatá plastická hmota. Stabilita rh-G-CSF v L-arginínovej receptúre, sušenej vo vákuu.
Tabuľka 21
Podiely monoméru v % získané v HP-SEC
Cas uskladnenia [týždne] Teploty uskladnenia
-20 *C TCH IT 30 ’C 40 *C 60 *C 8 0 C
0 - 99,60? - - -
4 95,57% 99,60% 99,37% 99,34% 99,20% 89,46% 31,81%
13 99,75% 98,17% 98,06% 97,31% 93,41% -
33 99,28% 99,30% 99,21% 97,86% 93,02% -
Nedosahuje sa stabilizujúci efekt, ktorý sa dosahuje v suchom, čiastočne amorfnom skle (príklad 8 a 17). Toto ukazuje význam vhodnej zmesi pomocných látok na to, aby sa ich správanie pri sušení v priebehu vákuového sušenia zlepšilo, a tak sa získali pri izbovej teplote čiastočne amorfné sklá. Predovšetkým pri vyšších teplotách (30 a 40 °C) sa toto stáva zreteľným. Stabilita je v porovnaní s účinnou látkou sušenou vo vákuu bez pomocných látok v tejto zmesi zvýšená (porovnaj porovnávací príklad D). Aby bolo možné prídavné kvalitatívne posudzovať produkty, uskutočňovala sa okrem toho pri každom stanovení obsahu SDS-gélová elektroforéza s ľarbením „silver stain“. Výsledky tejto SDS-gélovej elektroforézy sú znázornené v príklade 8.
Porovnávací príklad G rh-G-CSF v kryštalickej receptúre L-valínu a glycínu, sušenej vo vákuu
K roztoku, ktorý obsahoval v 1 ml po 20 mg L-valínu a glycínu a 0,1 mg polysorbátu 80, sa pridalo 0,35 mg rh-G-CSF na 1 ml a hodnota pH roztoku sa nastavila pomocou roztoku hydroxidu sodného na 7,4. Hotový zmiešaný roztok sa spracoval, sušil a analyzoval tak, ako je opísané v príklade 8. Skúška po ukončení sušenia ukazuje, že pri hotových vzorkách išlo o kryštalický produkt s obsahom zvyškovej vody 0,82 %.
Stabilita rh-G-CSF v kryštalickej, vo vákuu sušenej receptúre L-valínu a glycínu.
Tabuľka 22
Podiely monoméru uvedené v %, získané v HP-SEC
Tento výsledok zreteľne ukazuje, že kryštalická aminokyselinová receptúra dokonca pri nízkych obsahoch zvyškovej vody nie je schopná stabilizovať rh-G-CSF. V porovnaní s rh-G-CSF sušeným vo vákuu bez pomocných látok zreteľne ukazuje destabilizujúci účinok takého prípravku (pozri porovnávací príklad D).
Aby bolo možné produkty prídavné kvalitatívne posudzovať, uskutočňovala sa okrem toho pri každom stanovení obsahu SDS-gélová elektroforéza s farbením „silver stain“. Výsledky tejto SDS gélovej elektroforézy sú znázornené v príklade 8b.
Príklad 10
Vákuové sušenie erytropoetínu v sacharózovej receptúre obsahujúcej L-arginín a L-fenylalanín
Pripravil sa roztok obsahujúci v 1 ml 50 mg sacharózy, po 10 mg L-arginínu a L-fenylalanínu a 0,1 mg polysorbátu 80. Do tohto roztoku sa pridalo 5000 U erytropoetínu (EPO) na 1 ml a hodnota pH sa pomocou kyseliny fosforečnej nastavila na 7,2. Roztok sa spracoval a sušil tak, ako je opísané v príklade 8. Vznikol suchý, čiastočne amorfný produkt s obsahom zvyškovej vody 0,56 % a teplotou skleného prechodu 86,6 %. U EPO je podiel vzniknutého diméru v pripravenom produkte dobrým kritériom na posudzovanie stability produktu. Preto sú množstvá monoméru a dirnéru zistené pomocou gélovej permeačnej chromatografie (na podmienku 3 jednoduché merania) mierou pre stabilizujúci účinok našich prípravkov pripravených pomocou sušenia.
Pri gélovej permeačnej chromatografii sa molekuly proteínu oddelia na základe veľkosti ich častíc v rozpustenom stave, t. j. vysokomolekulové zložky (diméry) sa separujú od monomérov EPO. Skúška (HP-SEC) sa uskutočňovala v aparatúre HPLC od Shimadzu s použitím automatického vzorkovača (Gilson Abimed 231). Ako oddeľovacia kolóna sa použila kolóna TSK-Gel G3000 SWXL (7,8 x x 300 mm) od firmy TosoHaas. Detekcia oddelených zložiek prebiehala fotometrický pri 280 nm (Merck Fluorescence Spectrophotometer 820 FP). Ako clučný prostriedok sa použil 0,4IM sodno-draselný fosfátový tlmivý roztok s chloridom sodným pH 7,3, pomocou ktorého sa nastavil prietok 0,6 ml/min. pri izbovej teplote. Vzorky určené na skúmanie sa rozpustili v dvakrát destilovanej vode tak, aby sa znovu pripravila východisková koncentrácia (prídavok 1 ml). Tieto rozpustené vzorky sa potom uschovávali v automatickom vzorkovači až do skúmania. Vstrekované množstvo jednej vzorky bolo 100 μΐ (= 2 pg EPO), čas prietoku jednej vzorky 25 min.
Vyhodnotenie výsledkov sa uskutočňovalo s využitím pracovného štandardu EPO.
Stabilita EPO v sacharózovej receptúre obsahujúcej L-arginín a L-fenylalanín, sušenej vo vákuu
Tabuľka 23
Uvedené sú obsahy monoméru v % získané v HP-SEC
Cas uskladnenia ttýSdne] Teploty uskladnenia
TCH IT 30 ’C 40 ’C 60 ‘C 80 ’C
0 * 94,36 %
4 09,93 % 99,66 « 84,26 « 72,47 % 44,54 « 27,44 t
13 74,14 % 73,91 % 64,90 « 46, 82 t
33 73,75 % 70,04 1 54,93 % 40, 40 % - -
TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C IT = izbová teplota = 20-22 °C
Čas uskladnenia [týždne] Teploty uskladnenia
TCH IT 40 ’C
0 - 100 s -
4 100 % 100 Ž 100 %
9 100 % 100 % 100 %
13 100 % 100 % 100 %
26 100 % 100 % 99, 9 %
TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C IT = izbová teplota = 20-22 °C
Výsledok ukazuje, že je možné stabilizovať EPO pomocou vákuového sušenia s tu zvolenými kombináciami pomocných látok. Aby bolo možné produkty prídavné kvalitatívne posudzovať, uskutočňovala sa okrem toho pri každom stanovení obsahu SDS-gélová elektroforéza s farbením „silver stain“. Príprava gélov, uskutočňovanie elektroforézy a farbenie gélov prebiehalo tak, ako sa opisuje v príklade 8b. Príprava vzoriek prebiehala tak, že z 3 injekčných fľaštičiek sa pripravila 1 zmiešaná vzorka. Hneď potom sa tento skúšobný roztok zriedil skúšobným tlmivým roztokom obsahujúcim brómfenolovú modrú, takže vznikla koncentrácia 20 pg/ml EPO. Vzorky sa denaturovali 5 minút pri 95 °C v predhriatom vyhrievacom bloku. Ako porovnávacie proteíny sa použili „Bio-Rad Štandard Low“. Tieto sa pripravili a spracovali presne tak ako vzorky EPO. Okrem toho sa pripravil pracovný štandard EPO, ktorý sa použil na porovnanie. Gélová elektroforéza sa uskutočňovala pomocou miniatúrnej jednotky na gélovú elektroforézu (Midget Gelektrophoresis Unit), (Pharmacia - LKB 2050) a pomocou príslušnej jednotky napätia. Keď sa naplnil elektroforetický tlmivý roztok, do každého gélového zásobníka sa naplnilo 20 pl vzorky (t. j. 400 ng EPO) . Po ukončení farbenia sa uskutočňovalo optické posudzovanie gélov a gély sa fotografovali. Na základe tejto citlivej metódy sa mohli stať veľmi dobre viditeľnými produkty degradácie a agregácie monoméru, ktoré boli v množstvách > 1 %.
Výsledok elektroforézy
Pri receptúre, tu opísanej, bolo možné pri všetkých vzorkách po 9 týždňoch rozoznať v géli len jeden pás monoméru zodpovedajúci pracovnému štandardu. Toto zdôrazňuje stabilitu proteínu v tomto prípravku.
Porovnávací príklad H
Vákuové sušenie erytropoetínu bez prídavku pomocných látok
V tomto pokuse sa pripravil východiskový roztok, ktorý obsahoval len účinnú látku EPO (50000 U/ml) v zriedenom fosfátovom tlmivom roztoku (približne 5 mM). Roztok sa pripravil, spracoval a sušil ako v príklade 8.
Pri tomto prípravku nebolo z technických dôvodov možné stanoviť pri konečných produktoch obsah zvyškovej vody a teplotu skleného prechodu, pretože existujúce množstvá vo fľaštičke boli príliš malé (približne 0,2 mg). Stabilita proteínu sa posudzovala pomocou gélovej permeačnej chromatografie ako v príklade 10.
Stabilita EPO sušeného vo vákuu bez pomocných látok.
Tabuľka 24
Uvedené sú obsahy monoméru v % získané v HP-SEC
Čas uskladnenia [týždne] Teplota uskladnenia
TCH IT 40 ‘C
0 - 99,5 % -
4 98,6 % 94,4 % θθ,Ο %
9 96,0 % 89,0 % 75,0 %
13 95,7 % 87,C % 76,3 %
26 94,7 % 88,2 % 66,6 %
TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C IT = izbová teplota - 20 - 22 °C
Pri každom stanovení obsahu sa taktiež uskutočňovala SDS-gélová elektroforéza s farbením „silver stain“. Príprava gélov, príprava vzoriek, uskutočňovanie elektroforézy a farbenie gélov sa uskutočňovalo ako v príklade 10. Po farbení gélov bolo možné pri vzorkách každej teploty uskladnenia okrem pásov monoméru zodpovedajúcich pásu pracovného štandardu zreteľne rozoznať pás diméru. Týmto pokusom sa stáva jasným stabilizujúci účinok kombinácie pomocných látok použitej v príklade 10. Stabilita čistej účinnej látky v tomto príklade je zreteľne znížená v porovnaní so stabilitou účinnej látky v receptúre príkladu 10; je možné pozorovať tvorbu diméru. Čím vyššia je teplota uskladnenia, tým zreteľnejším sa stáva ochranný účinok zvolenej kombinácie pomocných látok v pokuse 10.
Príklad 11
Laktátdehydrogenáza v receptúre L-maltózy, L-arginínu a L-fenylalanínu, sušenej vo vákuu
Pripravil sa roztok obsahujúci v 1 ml 50 mg monohydrátu maltózy, 10 mg L-arginínu a 10 mg L-fenylalaninu. K tomuto roztoku sa pridala laktátdehydrogenáza (LDII) tak, že výsledná aktivita proteínu bola 165 U/ml. Hodnota pH roztoku sa nastavila pomocou kyseliny fosforečnej na 7,0. Roztok sa pripravil, spracoval a sušil ako v príklade 8. Po vysušení vznikol homogénny produkt s teplotou skleného prechodu 96 °C a obsahom zvyškovej vody 0,82 %. Hotové vzorky sa uskladnili pri rôznych teplotách a aktivita proteínu sa posudzovala po rôznych časoch uskladnenia. Pri LDH sa určila enzymatická aktivita ako miera na stabilitu proteínu. Toto určenie sa uskutočňovalo fotometrický. V skúšobnom roztoku sa pyruvát redukoval pomocou NADH za katalytického pôsobenia LDH na laktát a NAD. Úbytok obsahu NADH v roztoku bolo možné sledovať fotometrický (λ = = 365 nm; ε= 3,4 cm2/pmol). Aktivita sa merala (spektrofotometr Perkin-Elmer 552 UV/VIS) v 100 alebo 200-krát zriedených východiskových roztokoch v kyvete z plastu (hrúbka absorpčnej vrstvy = 1 cm). Z úbytku za časovú jednotku sa môže vypočítať proteínová aktivita LDH. Stabilita LDH v maltózovej receptúre obsahujúcej arginín a fenylalanín, sušenej vo vákuu. Aktivita východiskového roztoku zodpovedala hodnote 100 %.
Tabuľka 25
Uvedená je aktivita v %, získaná v skúške
Čas uskladnenia (týždne] Teploty uskladnenia
TCH IT 30 *C 40 eC 60 *C
0 - 85,3 % - -
5 87,81 % 87,45 « 81,15 % 80,42 % 64,42 %
13 83,28 % 79,41 % 78,79 1 61,74 %
TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C
IT = izbová teplota = 20-22 °C
Pokus zreteľne ukazuje stabilizujúci účinok receptúry na veľmi citlivý proteín LDH.
Porovnávací príklad 1
Vákuové sušenie laktátdehydrogenázy bez prídavku pomocných látok
V tomto pokuse sa pripravil roztok čistej účinnej látky laktátdehydrogenázy (LDH) s aktivitou 136 U/ml v zriedenom fosfátovom tlmivom roztoku (8 mM). Roztok sa pripravil, spracoval a sušil ako v príklade 8. Pri tomto prípravku nebolo z technických dôvodov možné pri konečných produktov stanoviť obsah zvyškovej vody a teplotu skleného prechodu, pretože existujúce množstvá v jednej fľaštičke boli príliš malé (približne 0,2 mg). Stabilita proteínu sa posudzovala ako v príklade 11. Stabilita LDH bez pomocných látok, sušenej vo vákuu. Aktivita východiskového roztoku zodpovedala hodnote 100 %.
Tabuľka 26
Uvádza sa aktivita v %, získaná v skúške
Čas uskladnenia (týždne] Teplota uskladnenia 40 *C
CHT IT
0 64,52 % -
5 66,54 % 23,03 % 1,57 &
13 50,63 % 6,81 % 0 %
TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C IT = izbová teplota = 20-22 °C
Týmto pokusom sa stáva zreteľným stabilizujúci účinok kombinácie pomocných látok použitých v príklade 11. Stabilita čistej účinnej látky v tomto príklade je v porovnaní so stabilitou účinnej látky v receptúre príkladu 11 zreteľne znížená. Čím vyššia je teplota uskladnenia, tým zreteľnejším sa stáva ochranný účinok zvolenej kombinácie pomocných látok v pokuse 11. Rozdiel medzi stabilitou čistého proteínu a stabilitou proteínu sušeného v kombinácii pomocných látok je najzreteľnejší pri LDH.
Príklad 12
Laktátdehydrogenáza v receptúre L-arginínu a L-fenylalanínu bez cukrov, sušenej vo vákuu
Pripravil sa zásobný roztok s 20 mg L-arginínu a 20 mg L-fenylalanínu v 1 ml. K nemu sa po nastavení hodnoty pH na 7,0 pomocou kyseliny fosforečnej pridala laktátdehydrogenáza (LDH) tak, že vznikol východiskový roztok s proteínovou aktivitou 168 U/ml. Roztok sa pripravil, spracoval a sušil ako v príklade 8. Po vysušení vznikol homogénny produkt s teplotou skleného prechodu 103,9 °C a obsahom zvyškovej vody 1,18 %. Hotové vzorky sa uskladnili pri rôznych teplotách a proteínová aktivita sa posudzovala po rôznych časoch uskladnenia. Analýza proteínu sa uskutočňovala tak, ako v príklade 11. Stabilita LDH v prípravku L-arginínu a L-fenylalanínu bez cukrov, sušeného vo vákuu. Aktivita východiskového roztoku pred sušením zodpovedala hodnote 100 %.
Tabuľka 27
Uvádza sa enzýmová aktivita v % získaná v teste aktivity
čas uskladnenia Teploty uskladnenia
(týždne] TCH IT 30 ’C 40 ’C 60 ‘C
0 - 80,36 % - - -
4 79,70 S 82,08 % 79,34 % 77,62 % 70,54 %
13 82,25 % 76,11 % 75,21 % 73,06 % -
Pokus zreteľne ukazuje stabilizujúci účinok tohto aminokyselinového prípravku v celom skúšobnom teplotnom rozsahu. Stabilita LDH je v porovnaní so sušením čistej účinnej látky (porovnávací príklad I) zreteľne zvýšená.
Porovnávací príklad J Laktátdehydrogenáza v kryštalickej receptúre L-valínu a glycínu, sušenej vo vákuu
Pripravil sa zásobný roztok s 20 mg L-valínu a 20 mg glycínu v 1 ml. K nemu sa po nastavení hodnoty pH na 7,0 pomocou roztoku NaOH pridala laktátdehydrogenáza (LDH) tak, že vznikol východiskový roztok s proteínovou aktivitou 147 U/ml. Roztok sa pripravil, spracoval a sušil ako v príklade 8. Po vysušení vznikol homogénny, dokonale kryštalický produkt s obsahom zvyškovej vody 1,12 %. Hotové vzorky sa uskladnili pri rôznych teplotách a proteínová aktivita sa posudzovala po určených časoch uskladnenia ako v príklade 11. Stabilita LDH v dokonale kryštalickom prípravku L-valínu a glycínu, sušenom vo vákuu. Aktivita východiskového roztoku pred sušením zodpovedala hodnote 100 %.
Tabuľka 28
Uvádza se enzýmová aktivita v % získaná v teste aktivity
Čas uskladnenia (týždne) Teploty uskladnenia
TCH IT 30 ’C 40 *C 60 eC
0 - 9,26 % - -
4 3,69 % 2,11 % 1,09 % 0,80 % 0,0 %
13 0,08 % 0,01 % 0 % 0 % 0 %
Tento pokus zreteľne ukazuje, že kryštalická aminokyselinová receptúra má v priebehu vákuového sušenia veľmi negatívny účinok na enzým. Už v priebehu sušenia, to znamená počas tvorby kryštalickej štruktúry, sa stráca už 90 % aktivity. Aj pri uskladnení pri rôznych teplotách sa nemôže ešte existujúca aktivita zachovať. Po 5 týždňoch sa počiatočné hodnoty vzoriek ešte viac zhoršili. Dokonale kryštalická aminokyselinová receptúra je teda na stabilizáciu LDH úplne nevhodná.
Príklad 13
V tomto pokuse sa sušil vo vákuu roztok čistej maltózy (50 mg/ml) a roztok s maltózou a fenylalanínom (40 mg/ml maltózy a 10 mg/ml fenylalanínu). Zároveň s tým sa pripravili podobné prípravky s prísadou 10 pg/mi rh-ngf alebo 100 (pg/ml PTH (1-37), alebo 500 gg/ml ularitídu. Roztoky sa po príprave sterilné filtrovali a plnili do 2 ml fľaštičiek. Vzorky sa sušili vo vákuu pri 20 °C a po vopred zadaných časoch sa z obidvoch receptúr odobrali vzorky. Pri odobraných vzorkách sa určilo množstvo zvyškového plnenia, obsah vody podľa Karla Fischera a Tc. Počas celého času sušenia sa udržiavala teplota platne 20 °C. Tlak v komore sa znižoval postupne až na približne 10'3 mbar (1 bar = 105 Pa) . Hmotnosť naplnenia fľaštičiek pri obidvoch receptúrach sa 7 h zmenšovala na približne 6 % východiskovej hodnoty, t. j. roztoky sa veľmi rýchle skoncentrovali. Pri receptúre čistej maltózy vzniká najskôr presýtený roztok, ktorý potom prechádza do kaučukovitého stavu. V ďalšom priebehu sušenia je možné rozoznať malú výhodu pri úbytku hmotnosti v prípravku obsahujúcom fenylalanín v porovnaní s čistým roztokom cukru. Po ukončení sušenia je pri vzorkách maltózy ešte približne 5,5 % pôvodnej hmotnosti plnenia vo fľaštičkách, zatiaľ čo pri zmesi maltózy a fenylalanínu ešte približne 4,9 % množstva plnenia.
Tento výsledok sa stáva ešte zreteľnejší, keď sa miesto zmeny čistej hmotnosti pri plnení posudzuje zmena obsahu vody vo vzorkách. Na začiatku sušenia sa roztok skladá z 95,08 % vody, t. j. jedna fľaštička obsahuje približne 965 mg vody. Cieľom je suchý produkt so zvyškovou vlhkosťou 1 - 2 %. Pri množstve tuhej látky 50 mg zodpovedá toto 1 - 2 % potom 0,5 - 1 mg vody na fľaštičku. Podľa toho sa musí počas sušenia asi 99,95 % vyskytujúcej sa vody sublimovať zo vzorky, aby sa získal suchý produkt. V pokročilom štádiu sušenia sa určil obsah vody vzoriek podľa Karla Fischera. Toto sa uskutočňovalo pri vzorkách obsahujúcich fenylalanín pomocou priameho vnesenia vzorky do roztoku metanolu. Veľmi lepivý cukor sa nedá priamo zaviesť do roztoku metanolu. Tento sa rozpustil najskôr v bezvodom DMF. Potom sa určil obsah vody tohto roztoku. Obr. 3 a znázorňuje výsledky takto uskutočneného určenia zvyškovej vody. Veľmi zreteľne sa rozoznáva prevaha prípravku obsahujúceho aminokyseliny. Už po 17 hodinách sušenia sa tu obsah zvyškovej vody znížil na 2,7 %, zatiaľ čo pri maltózovej receptúre bol ešte 13,59 %. Tento výsledok ukazuje výhodu roztoku obsahujúceho fenylalanín. Maltózu nie je možné za týchto podmienok spôsobu vysušiť za 48 hodín. Po ukončení sušenia existuje pri izbovej teplote stále ešte „rubber“ („guma“) s veľkým obsahom zvyškovej vody. Okrem obsahov zvyškovej vody sa určili aj teploty skleného prechodu jednotlivých vzoriek pomocou DSC. Pretože teploty skleného prechodu korešpondujú priamo s obsahom vody vzoriek, preukazuje zmes maltózy a fenylalanínu zreteľne vyššie hodnoty'. Výsledok ukazuje, že Te zmesí aminokyselín a cukrov je už po približne 10 hodinách v rozsahu teploty platne. Príslušné namerané hodnoty sú znázornené na obr. 3b. Pretože v tomto štádiu sušenia sa odparí ešte len veľmi málo vody, je teplota produktu v rozsahu teploty platne. Tak existuje už po 10 hodinách procesu sušenia vo fľaštičkách pri izbovej teplote sklo. V prípade stabilizácie proteínov pomocou takej receptúry to znamená, že proteín je už po 10 hodinách zaliaty v stabilizujúcom skle. Čas, v ktorom zotrváva proteín v skoncentrovanom roztoku alebo v „rubber“, je teda veľmi krátky, čo predstavuje na stabilitu účinnej látky veľkú výhodu. Čistý cukor je sám oproti tomu po ukončení sušenia pri izbovej teplote ešte ako „rubber“ a nemá tak v prípade produktu obsahujúceho proteíny žiadny stabilizujúci účinok na účinnú látku.
Rozličné prípravky obsahujúce proteíny sa neodlišujú fyzikálnymi zvyškovými veličinami od základných receptúr bez účinnej látky.

Claims (27)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob prípravy suchých, čiastočne amorfných produktov, ktoré okrem jednej alebo niekoľkých substancií zo skupín zahŕňajúcich proteíny, humánne peptidy, glykoproteíny, lipoproteíny, enzýmy, koenzýmy, protilátky, fragmenty protilátok, vírusy, zložky vírusov, bunky a zložky buniek, vakcíny, DNA, RNA, PNA a ich deriváty obsahujú zmesi substancií, pričom tieto zmesi substancií sú zvolené tak, že obsahujú aspoň po jednej substancii zo skupiny i) sacharid alebo amfotérny ión s polárnym zvyškom a ich deriváty a ii) amfotérny ión s nepolámym zvyškom a jeho deriváty, vyznačujúci sa tým, že sa pripraví roztok jednej alebo niekoľkých substancií zo skupín zahŕňajúcich proteíny, humánne peptidy, glykoproteíny, lipoproteíny, enzýmy, koenzýmy, protilátky, fragmenty protilátok, vírusy, zložky vírusov, bunky a zložky buniek, vakcíny, DNA, RNA, PNA a ich deriváty a substancii i) a ii) a tento roztok sa suší bez zmrazovania roztoku.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že amfotérnym iónom s nepolámym zvyškom je aminokyselina alebo jej derivát.
  3. 3. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že amfotérnym iónom s polárnym zvyškom je aminokyselina alebo jej derivát.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zmesi substancií sú zvolené tak, že obsahujú jednu alebo niekoľko látok zo skupiny zahŕňajúcej monosacharidy, disacharidy, arginín, kyselinu asparágovú, citrulín, kyselinu glutámovú, omitín, histidín, lyzin a ich deriváty a zo skupiny zahŕňajúcej acetylfenylalanínetylester, alanín, cysteín, glycín, izoleucín, leucín, metionín, fenylalanín, tryptofán, valín, sarkozín a ich deriváty.
  5. 5. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že roztok obsahuje doplnkovo obvyklé pomocné látky zvolené zo skupín zahŕňajúcich tlmivé roztoky, tenzidy, antioxidanty, izotonizačné prostriedky, konzervačné prostriedky.
  6. 6. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sušenie sa uskutočňuje prostredníctvom vákuového sušenia.
  7. 7. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že vákuové sušenie sa uskutočňuje kontinuálnym sušiacim spôsobom.
  8. 8. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sušenie sa uskutočňuje prostredníctvom sušenia rozprašovaním.
  9. 9. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sušenie sa uskutočňuje prostredníctvom sušenia na valcoch.
  10. 10. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sušenie sa uskutočňuje prostredníctvom infračerveného žiarenia, mikrovĺn alebo iných spôsobov radiačného sušenia.
  11. 11. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že amfotérny ión s nepolámym zvyškom je zvolený tak, aby vysušená zmes substancií preukazovala zvýšenú teplotu skleného prechodu v porovnaní so zmesou substancií bez príslušnej prísady.
  12. 12. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že sušenie nastáva v lyofllizačnom zariadení bez predchádzajúceho zmrazovania.
  13. 13. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 7, 11 alebo 12, vyznačujúci sa tým, že sušenie zmesi substancií sa uskutočňuje v jednorazových dávkovacích baleniach.
  14. 14. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že získaná zmes substancií sa hneď potom melie na prášok.
  15. 15. Zmesi substancií obsahujúce okrem jednej alebo niekoľkých substancií zo skupín, zahŕňajúcich proteíny, humánne peptidy, glykoproteíny, lipoproteíny, enzýmy, koenzýmy, protilátky, fragmenty protilátok, vírusy, zložky vírusov, bunky a zložky buniek, vakcíny, DNA, RNA, PNA a ich deriváty, látky zvolené po jednej alebo niekoľkých substanciách z nasledujúcich skupín i) sacharid alebo amfotérny ión s polárnym zvyškom a ich deriváty ii) amfotéme ióny s nepolámym zvyškom a ich deriváty, vyznačujúce sa tým, že zmesi substancií preukazujú pomocou prísady jednej alebo niekoľkých substancií zo skupiny ii) zvýšenú teplotu skleného prechodu v porovnaní so substanciami zo skupiny i) bez príslušnej prísady, pričom lyofilizáty sú výnimkou.
  16. 16. Zmesi substancií, ktoré sa dajú získať spôsobom podľa jedného z nárokov 1 až 14.
  17. 17. Zmesi substancií podľa nároku 15 alebo 16, vyznačujúce sa tým, že sú čiastočne amorfné.
  18. 18. Zmesi substancií podľajedného z nárokov 15 až 17, vyznačujúce sa tým, že teplota skleného prechodu je vyššia ako 4 °C, výhodne vyššia ako 20 °C, a zvyšková vlhkosť je nižšia ako 6 % (hmotn.), výhodne nižšia ako 4 % (hmotn.).
  19. 19. Zmesi substancií podľajedného z nárokov 15 až 18, vyznačujúce sa tým, že majú aspoň o 10 % vyššiu zdanlivú hustotu ako lyofilizáty.
  20. 20. Zmesi substancií podľajedného z nárokov 15 až 19, vyznačujúce sa tým, že majú krehkú, čiastočne amorfnú, sklovitú, kompaktnú štruktúru.
  21. 21. Zmesi substancií podľa jedného z nárokov 15 až 20, vyznačujúce sa tým, že si čiastočne amorfnú štruktúru zachovajú v priebehu časov uskladnenia aspoň 2 týždňov.
  22. 22. Zmesi substancií podľa jedného z nárokov 15 až 21, vyznačujúce sa tým, že ich časy sušenia sú v porovnaní so substanciami zo skupiny i) kratšie aspoň o polovicu.
  23. 23. Diagnostické prostriedky, vyznačujúce sa tým, že obsahujú zmesi substancií podľa jedného z nárokov 15 až 22.
  24. 24. Použitie zmesí substancií podľa jedného z nárokov 15 až 22 na výrobu diagnostík.
  25. 25. Terapeutické prípravky, vyznačuj úce sa tým, že obsahujú zmesi látok podľa jedného z nárokov 15 až 22.
  26. 26. Použitie zmesí substancií podľa jedného z nárokov 15 až 22 okrem obvyklých pomocných látok a prísad na výrobu terapeutických prostriedkov.
  27. 27. Použitie aspoň jednej substancie vybranej zo skupín i) sacharid alebo amfotérny ión s polárnym zvyškom a ich deriváty a ii) amfotérny ión s nepolámym zvyškom a jeho deriváty na stabilizáciu jednej alebo niekoľkých substancií zo skupín zahŕňajúcich proteíny, humánne peptidy, glykoproteíny, lipoproteíny, enzýmy, koenzýmy, protilátky, fragmenty protilátok, vírusy, zložky vírusov, bunky a zložky buniek, vakcíny, DNA, RNA, PNA a ich deriváty, v produkte vzniknutom sušením bez zmrazovania.
SK509-98A 1995-10-25 1996-10-24 Spôsob prípravy suchých, čiastočne amorfných produktov, zmesi substancií získané týmto spôsobom, ich použitie a diagnostické prostriedky a terapeutické prípravky obsahujúce tieto zmesi SK283664B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19539574A DE19539574A1 (de) 1995-10-25 1995-10-25 Zubereitungen und Verfahren zur Stabilisierung biologischer Materialien mittels Trocknungsverfahren ohne Einfrieren
PCT/EP1996/004627 WO1997015288A2 (de) 1995-10-25 1996-10-24 Zubereitungen und verfahren zur stabilisierung biologischer materialien mittels trocknungsverfahren ohne einfrieren

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK50998A3 SK50998A3 (en) 1998-12-02
SK283664B6 true SK283664B6 (sk) 2003-11-04

Family

ID=7775640

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK509-98A SK283664B6 (sk) 1995-10-25 1996-10-24 Spôsob prípravy suchých, čiastočne amorfných produktov, zmesi substancií získané týmto spôsobom, ich použitie a diagnostické prostriedky a terapeutické prípravky obsahujúce tieto zmesi

Country Status (25)

Country Link
US (3) US7172999B2 (sk)
EP (1) EP0857060B1 (sk)
JP (2) JPH11513700A (sk)
KR (1) KR100466670B1 (sk)
CN (1) CN1130196C (sk)
AT (1) ATE212541T1 (sk)
AU (1) AU712489B2 (sk)
BR (1) BR9611265A (sk)
CA (1) CA2235243C (sk)
CZ (1) CZ293456B6 (sk)
DE (2) DE19539574A1 (sk)
DK (1) DK0857060T3 (sk)
ES (1) ES2170274T3 (sk)
HU (1) HU222601B1 (sk)
IL (1) IL124204A (sk)
MX (1) MX9803264A (sk)
NO (1) NO324728B1 (sk)
NZ (1) NZ320276A (sk)
PL (1) PL190657B1 (sk)
PT (1) PT857060E (sk)
RU (1) RU2191003C2 (sk)
SK (1) SK283664B6 (sk)
TR (1) TR199800715T2 (sk)
WO (1) WO1997015288A2 (sk)
ZA (1) ZA968930B (sk)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582728B1 (en) 1992-07-08 2003-06-24 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Spray drying of macromolecules to produce inhaleable dry powders
DE19539574A1 (de) * 1995-10-25 1997-04-30 Boehringer Mannheim Gmbh Zubereitungen und Verfahren zur Stabilisierung biologischer Materialien mittels Trocknungsverfahren ohne Einfrieren
EP0852951A1 (de) * 1996-11-19 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern
EP0913177A1 (de) * 1997-11-03 1999-05-06 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur Herstellung trockener, amorpher Produkte enthaltend biologisch aktive Materialien mittels Konvektionstrocknung, insbesondere Sprühtrocknung
EP0913178A1 (en) * 1997-11-03 1999-05-06 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the manufacture of dry, amorphous products comprising biologically active material by means of convection drying and products obtainable by the process
BR9905867A (pt) * 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Linhagem celular produtora de eritropoietina humana recombinante e a eritropoietina humana recombinante produzida por esta célula
RU2225221C2 (ru) * 1999-04-09 2004-03-10 Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ Эритропоэтина
DE10026698A1 (de) 2000-05-30 2001-12-06 Basf Ag Selbstemulgierende Wirkstoffformulierung und Verwendung dieser Formulierung
WO2001094867A1 (en) * 2000-06-07 2001-12-13 Universal Preservation Technologies, Inc. Industrial scale barrier technology for preservation of sensitive biological materials
GB0017999D0 (en) * 2000-07-21 2000-09-13 Smithkline Beecham Biolog Novel device
EP2260833B1 (en) * 2002-01-16 2012-11-21 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Bilayer pharmaceutical tablet comprising telmisartan and a diuretic
KR100556503B1 (ko) * 2002-11-26 2006-03-03 엘지전자 주식회사 건조기의 건조 시간제어 방법
US8025899B2 (en) * 2003-08-28 2011-09-27 Abbott Laboratories Solid pharmaceutical dosage form
US8377952B2 (en) * 2003-08-28 2013-02-19 Abbott Laboratories Solid pharmaceutical dosage formulation
US20080176209A1 (en) * 2004-04-08 2008-07-24 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
JP4896006B2 (ja) 2004-04-08 2012-03-14 バイオマトリカ， インコーポレイテッド ライフサイエンスのためのサンプル保存とサンプル管理との統合
US20060099567A1 (en) * 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
GB0517688D0 (en) * 2005-08-31 2005-10-05 Cambridge Biostability Ltd Improvements in the stabilisation of biological materials
GB2430880A (en) * 2005-10-04 2007-04-11 Cambridge Biostability Ltd Pharmaceutical compositions stabilized in glassy particles
GB0523638D0 (en) * 2005-11-21 2005-12-28 Cambridge Biostability Ltd Pharmaceutical device for the administration of substances to patients
DK1973406T3 (da) 2005-12-28 2014-06-23 Advanced Bionutrition Corp Fremføringsmiddel til probiotiske bakerier omfattende en tør blanding af polysaccharider, saccharider, polyoler i glasform
US8968721B2 (en) 2005-12-28 2015-03-03 Advanced Bionutrition Corporation Delivery vehicle for probiotic bacteria comprising a dry matrix of polysaccharides, saccharides and polyols in a glass form and methods of making same
US8460726B2 (en) 2006-12-18 2013-06-11 Advanced Bionutrition Corporation Dry food product containing live probiotic
US8466187B2 (en) * 2007-09-18 2013-06-18 Thermolife International, Llc Amino acid compositions
CA2756883C (en) 2009-03-27 2018-01-09 Advanced Bionutrition Corp. Microparticulated vaccines for the oral or nasal vaccination and boostering of animals including fish
EP2236520A1 (en) * 2009-03-31 2010-10-06 Leukocare Ag Stabilizing composition for immobilized biomolecules
MY157343A (en) 2009-05-26 2016-05-31 Advanced Bionutrition Corp Stable dry powder composition comprising biologically active microorganisms and/or bioactive materials and methods of making
TWI505838B (zh) * 2010-01-20 2015-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Stabilized antibody solution containing
US9504750B2 (en) 2010-01-28 2016-11-29 Advanced Bionutrition Corporation Stabilizing composition for biological materials
JP5886763B2 (ja) 2010-01-28 2016-03-16 アドバンスド バイオニュートリション コーポレーション 生物活性物質を含む乾燥ガラス状組成物
EP2598661B1 (en) 2010-07-26 2017-09-27 Biomatrica, INC. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
WO2012018638A2 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
AU2011289272B2 (en) 2010-08-13 2015-02-05 Advanced Bionutrition Corporation Dry storage stabilizing composition for biological materials
CN102408467B (zh) * 2010-09-26 2014-03-05 海口维瑅瑷生物研究院 真空干燥蛋白的方法、制得的蛋白产品和试剂盒
HUE032165T2 (en) 2011-04-13 2017-09-28 Thermolife Int Llc Methods of using N-actyl-beta-alanine
EP3249054A1 (en) 2012-12-20 2017-11-29 Biomatrica, INC. Formulations and methods for stabilizing pcr reagents
EP3942931A1 (en) 2014-06-10 2022-01-26 Biomatrica, INC. Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures
US9868944B2 (en) * 2014-12-19 2018-01-16 Roche Molecular Systems, Inc. Reaction mixtures
WO2016127260A1 (en) * 2015-02-11 2016-08-18 Prevtec Microbia Inc Improved dry matrix for embedding viable escherichia coli, method of making same and use thereof
SG11201708858WA (en) 2015-04-29 2017-11-29 Radius Pharmaceuticals Inc Methods of treating cancer
US10953050B2 (en) 2015-07-29 2021-03-23 Advanced Bionutrition Corp. Stable dry probiotic compositions for special dietary uses
CN108700498B (zh) 2015-12-08 2021-07-13 生物马特里卡公司 降低红细胞沉降速率
CN106831466B (zh) * 2016-12-28 2018-05-22 安徽省虹升生物股份有限公司 一种β-丙氨酸的常规储存方法
JP2020514291A (ja) 2017-01-05 2020-05-21 ラジウス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｒａｄ１９０１−２ｈｃｌの多形性形態
AU2019254473A1 (en) * 2018-04-16 2020-12-03 Merck Patent Gmbh Additives for protein formulations to improve thermal stability
US11643385B2 (en) 2018-07-04 2023-05-09 Radius Pharmaceuticals, Inc. Polymorphic forms of RAD1901-2HCl
CA3187322A1 (en) * 2020-07-13 2022-01-20 Merck Patent Gmbh Viscosity reducing excipients and combinations thereof for highly concentrated protein formulations
US11865139B2 (en) 2020-11-12 2024-01-09 Thermolife International, Llc Method of treating migraines and headaches
CN114480129A (zh) * 2022-01-13 2022-05-13 力因精准医疗产品（上海）有限公司 一种人粪便保存液及使用方法

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3714353A (en) * 1959-08-11 1973-01-30 Upjohn Co THERAPEUTIC COMPOSITIONS COMPRISING A 6 alpha ; 9 alpha -DIFLUORO-11 beta ,17 alpha ,21-TRIHYDROXY-16 alpha -METHYL-1,4-PREGNADIENE-3,20-DIONE AND 21-ACYLATES
US3852461A (en) * 1971-08-04 1974-12-03 Upjohn Co Benzodiapines used as minor tranquilizers
JPS5836954B2 (ja) * 1980-03-31 1983-08-12 栄研化学株式会社 酵素の安定化剤
JPS5967228A (ja) 1982-10-07 1984-04-16 Green Cross Corp:The 寒冷不溶性グロブリンの凍結乾燥方法
JPS6197229A (ja) * 1984-10-18 1986-05-15 Chugai Pharmaceut Co Ltd 安定なエリトロポエチン製剤
US4732889A (en) * 1985-02-06 1988-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of rheumatoid arthritis
US4788072A (en) * 1985-08-15 1988-11-29 Toshimitsu Kawamura Method of dehydrating foods
US4808617A (en) 1985-12-18 1989-02-28 Bristol-Myers Company Lyophilized or precipitated cephalosporin zwitterion and salt combination
US5051406A (en) * 1987-03-04 1991-09-24 Nippon Hypox Laboratories Incorporated Pharmaceutical composition using albumin as a carrier and process for producing the same
DE3729863A1 (de) 1987-09-05 1989-03-16 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilisierte erythropoietin-lyophilisate
US4886742A (en) * 1987-06-15 1989-12-12 Coulter Corporation Enzyme immunoassay for detecting HIV antigens in human sera
DE3801179A1 (de) 1988-01-18 1989-07-27 Hoechst Ag Stabilisierung von cephalosporinderivaten durch trocknung mit einem stabilisator sowie stabile zubereitungsformen mit cephalosporinderivaten
JPH0761955B2 (ja) 1988-04-28 1995-07-05 国立予防衛生研究所長 凍結乾燥ａ型肝炎ワクチン
US5202117A (en) 1988-08-24 1993-04-13 Koichiro Tsuji Method of treating thrombi with g-csf
JPH0296536A (ja) 1988-09-29 1990-04-09 Green Cross Corp:The プラスミノゲン乾燥製剤
JP2739584B2 (ja) 1989-01-06 1998-04-15 株式会社ミドリ十字 ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター乾燥製剤
US5186944A (en) * 1989-02-15 1993-02-16 Eimei Company Ltd. Therapeutic medicament for thrombosis
CA2028848A1 (en) * 1989-04-11 1990-10-12 Tapan Audhya Lyophilized peptide formulations
JPH0775519B2 (ja) 1989-10-06 1995-08-16 東洋製罐株式会社 ドライパック包装食品の製造方法
GB9001987D0 (en) * 1990-01-29 1990-03-28 Janssen Pharmaceutica Nv Improved cyclodextrin based erythropietin formulation
JPH0813750B2 (ja) 1990-03-01 1996-02-14 持田製薬株式会社 経口用トロンビン製剤
US5200399A (en) * 1990-09-14 1993-04-06 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Method of protecting biological materials from destructive reactions in the dry state
US5217741A (en) 1991-01-25 1993-06-08 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Solution containing whey protein, whey protein gel, whey protein powder and processed food product produced by using the same
AU659645B2 (en) 1991-06-26 1995-05-25 Inhale Therapeutic Systems Storage of materials
JP2818834B2 (ja) * 1991-08-12 1998-10-30 大塚製薬株式会社 ＩＬ−１α安定化医薬製剤
DE4141351A1 (de) 1991-12-14 1993-06-17 Basf Ag Stabile pulverfoermige vitamin- und/oder carotinoid-praeparate und verfahren zu deren herstellung
SE9201073D0 (sv) 1992-04-03 1992-04-03 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
IL105553A (en) 1992-05-06 1998-01-04 Janssen Pharmaceutica Inc Solid dosage forms consisting of a porous network of matrix that releases a substance that dissipates rapidly in water
IT1254359B (it) 1992-05-11 1995-09-14 Serono Cesare Ist Ricerca Composizioni farmaceutiche contenenti il-6
US6582728B1 (en) 1992-07-08 2003-06-24 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Spray drying of macromolecules to produce inhaleable dry powders
JP3168550B2 (ja) * 1992-12-02 2001-05-21 株式会社林原生物化学研究所 脱水剤およびそれを用いる含水物の脱水方法並びにその方法で得られる脱水物品
DE4242863A1 (de) * 1992-12-18 1994-06-23 Boehringer Mannheim Gmbh Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von G-CSF
US5354934A (en) * 1993-02-04 1994-10-11 Amgen Inc. Pulmonary administration of erythropoietin
ES2218543T3 (es) 1994-03-07 2004-11-16 Nektar Therapeutics Procedimiento y preparacion para la administracion de insulina por via pulmonar.
US5955448A (en) * 1994-08-19 1999-09-21 Quadrant Holdings Cambridge Limited Method for stabilization of biological substances during drying and subsequent storage and compositions thereof
FR2719479B1 (fr) * 1994-05-04 1996-07-26 Sanofi Elf Formulation stable lyophilisée comprenant une protéine: kit de dosage.
ATE299892T1 (de) 1994-05-18 2005-08-15 Nektar Therapeutics Methoden und zusammensetzungen für die trockenpuderarznei aus interferonen
IL116085A (en) * 1994-12-16 1999-12-31 Ortho Pharma Corp Spray dried erythropoietin
CA2218074C (en) 1995-04-14 2002-10-08 Mohammed Eljamal Powdered pharmaceutical formulations having improved dispersibility
US5728678A (en) 1995-06-06 1998-03-17 Nestec Ltd. Method and composition for providing nutrition to a renal failure patient
DE19538687A1 (de) 1995-10-17 1997-04-24 Boehringer Mannheim Gmbh Stabile pharmazeutische Darreichungsformen enthaltend Parathormon
DE19539574A1 (de) * 1995-10-25 1997-04-30 Boehringer Mannheim Gmbh Zubereitungen und Verfahren zur Stabilisierung biologischer Materialien mittels Trocknungsverfahren ohne Einfrieren

Also Published As

Publication number Publication date
TR199800715T2 (xx) 1998-08-21
JP2007236975A (ja) 2007-09-20
RU2191003C2 (ru) 2002-10-20
CA2235243C (en) 2003-04-22
NO981868D0 (no) 1998-04-24
JPH11513700A (ja) 1999-11-24
NO981868L (no) 1998-06-25
EP0857060A2 (de) 1998-08-12
US20030059468A1 (en) 2003-03-27
CN1130196C (zh) 2003-12-10
PT857060E (pt) 2002-07-31
DK0857060T3 (da) 2002-05-13
US20010055617A1 (en) 2001-12-27
CN1205628A (zh) 1999-01-20
ATE212541T1 (de) 2002-02-15
MX9803264A (es) 1998-09-30
HU222601B1 (hu) 2003-08-28
CZ293456B6 (cs) 2004-05-12
PL190657B1 (pl) 2005-12-30
HUP9901314A2 (hu) 1999-07-28
DE19539574A1 (de) 1997-04-30
PL326358A1 (en) 1998-09-14
SK50998A3 (en) 1998-12-02
KR19990067082A (ko) 1999-08-16
ZA968930B (en) 1998-04-24
WO1997015288A3 (de) 1997-05-29
HUP9901314A3 (en) 2000-02-28
US20070020289A1 (en) 2007-01-25
CZ117998A3 (cs) 1998-11-11
BR9611265A (pt) 1999-05-04
US7172999B2 (en) 2007-02-06
AU7298496A (en) 1997-05-15
ES2170274T3 (es) 2002-08-01
IL124204A (en) 2001-10-31
KR100466670B1 (ko) 2005-09-07
NZ320276A (en) 1999-11-29
NO324728B1 (no) 2007-12-03
EP0857060B1 (de) 2002-01-30
DE59608684D1 (de) 2002-03-14
AU712489B2 (en) 1999-11-11
CA2235243A1 (en) 1997-05-01
WO1997015288A2 (de) 1997-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK283664B6 (sk) Spôsob prípravy suchých, čiastočne amorfných produktov, zmesi substancií získané týmto spôsobom, ich použitie a diagnostické prostriedky a terapeutické prípravky obsahujúce tieto zmesi
JP2007236975A6 (ja) 凍結しない乾燥過程により生物材料を安定化するための調製物及び方法
KR100491281B1 (ko) 저당함량을가지는안정한알부민무함유재조합인자Vlll의제제
EP0682944B1 (fr) Formulation stable lyophilisée comprenant une protéine; kit de dosage
Izutsu et al. Excipient crystallinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying
US8648177B2 (en) Lyophilization methods, compositions, and kits
KR20010006562A (ko) 펩티드, 단백질 및 핵산의 안정한 약학 투여 형태물
AU659997B2 (en) Stable pharmaceutical compositions containing a fibroblast growth factor
US20020103126A1 (en) Stable pharmaceutical form of administration for peptides, proteins and nucleic acids
TW387988B (en) Preparations and processes for stablizing biological materials by means of drying processes without freezing
Lückel et al. A strategy for optimizing the lyophilization of biotechnological products
MXPA99009550A (en) Stable pharmaceutical administration forms of peptides, proteins and nucleic acids

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20111024