CZ242096A3

CZ242096A3 - Method of storing ultrasonic gaseous suspensions

Info

Publication number: CZ242096A3
Application number: CZ962420A
Authority: CZ
Inventors: Feng Yan; Michel Schneider; Jean Brochot
Original assignee: Bracco Research Sa
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1995-12-14
Publication date: 1996-11-13
Also published as: DK0744962T4; EP0744962A1; US5827504A; AU3935295A; JPH09509433A; CN1066965C; KR970701066A; IL116328A; JP3958358B2; US5830435A; CA2181340C; NZ295744A; DE69522670T3; DK0744962T3; FI963202A0; DE69522670T2; ATE205404T1; FI963202A; ZA9510721B; NO963327L

Description

Tento vynález se týká suspenzí bublin plynu imobilizováných ve zmrazeném vodném nosném prostředí. Vynález se také^&Z, týká způsobu skladování suspenzí bublin plynu za chladu » a jejich používání jako kontrastních činidel pro ultrazvukové^/ . <

zobrazování lidského a zvířecího těla.

Oblast techniky

Rychlý vývoj ultrazvukových kontrastních prostředků v posledních letech vytvořil řadu rozdílných prostředků, které jsou vhodné při ultrazvukovém zobrazování orgánů a tkáně lidského nebo zvířecího těla. Tyto prostředky jsou určeny především jako intravenózní nebo intraarteriálni injikovatelné prostředky, ve spojení s použitím lékařského echografického vybavení. Tyto nástroje obvykle slouží pro zpracování skupiny B-způsobu vytváření obrazu (založeno na prostorové distribuci zpětného rozptylu vlastností tkáně) a Dopplerova signálu (založeno na zpracování kontinuálních vln nebo pulsního Dopplerova zpracování ultrazvukových ozvěnových signálů, ke stanovení parametrů krve nebo proudící kapaliny). Jiné ultrazvukové zobrazovací metody by mohly být také vhodné z těchto prostředků v budoucnosti, jako ultrazvuková počítačová tomografie (měřeni zeslabení přenosu) nebo difrakční počítačová tomografie (měření parametrů —---------rozptylu-a- zeslabení .při., úhlovém odrazu). Na základě suspenzí ? ’ ’ ^·· - ........ ........

bublin plynu ve vodném nosném prostředí se tyto injikovatelné prostředky mohou v podstatě rozdělit do dvou kategorií, na vodné suspenze, ve kterých mikrobubliny plynu jsou vázány na rozhraní plyn - kapalina neboli mají nestálý obal zahrnující molekuly kapaliny a povrchově aktivní látky volné vázané na rozhraní plynu ke kapalině, a dále suspenze, ve kterých mikrobubliny mají materiálovou hranici neboli hmotný obal vytvořený z přírodních a syntetických polymerů. V případě syntetických polymerů se mikrobubliny označují jako mikrobalonky. Již však existuje jiný druh ultrazvukových kontrastních prostředků a to suspenze porézních částic z polymeru ; .

. . . .J... -#**>*.· nebo jiných tuhých látek, které nesou mikrobubliny plynu^,J* Γ zachycené v pórech mikročástic. Tyto kontrastní prostředky 'seV***: zde pokládají za variantu druhu mikrobalonků. Třebaže je fyzikální rozdíl, oba druhy mikrobublin plynu, pokud jsou v suspenzi, jsou vhodné jako ultrazvukové kontrastní prostředky. Více o těchto rozdílných prostředcích se může zjistit v EP-A-0 077 752 (Schering), EP-A-0 123 235 (Schering), EP-A-0 324 938 (Widder a kol.), EP-A-0. 474 833 (Schneider a kol.), EP-A-0 458 745 (Bichon a kol.),

US-A-4 900 540 (Ryan), US-A-5 230 832 (Unger) a jinde.

Určitá z výše uvedených ultrazvukových kontrastních činidel jsou vyvinuta a komerčně dostupná, zatímco jiná jsou v rozdílných stádiích klinických zkoušek. Avšak i když jsou kontrastní činidla komerčně dostupná nebo na klinických testech, tyto produkty vždy trpí problémy spojenými se skladováním. Problémy skladováni jsou vlastní suspenzím, které v důsledku jejich zvláštní povahy podléhají separaci nebo segregaci fází, agregaci bublin plynu a po delším skladování rovněž srážení různých přísad. Segregace mikrobublin nebo mikrobalonků plynu vychází ze skutečnosti, že suspenze se obvykle připravují z nekalibrovaných mikrobublin, jejichž velikost se mění od přibližné 1 až do zhruba 50 μιη. -Rozsáhlá'většina bublin plynů ve známých 'suspenzích se nachází mezi 1 a přibližně 10 μ®. V důsledku distribuce velikosti mikrobublin, tyto suspenze během skladováni podléhají 'segregaci, při které větší mikrobubliny migrují do horní části, zatímco menší mikrobubliny se koncentrují v nižších částech, co často vede k úplnému oddělení fáze.

Pokusy řešit tento problém použitím činidel zvyšujících viskozitu ukázalo, že míra separace se může snížit, ale nikoli vyloučit. ¹

Agregace mikrobublin plynu je proces, během kterého větší bubliny absorbují menší bubliny, a tak dochází .k^růstu^^ velikosti bublin. Se separací fáze se tento procesurychluje^, a suspenze s mikrobublinami, které mají průměrnou velikošfSSW^^-^’^^' například od 2 do 8 um, po určité době mohou vyvinout suspenzi s velikostí mikrobublin například od 5 do 12 μτη nebo i větší. To je obzvláště nežádoucí v případech, kdy suspenze kalibrovaných mikrobublin a suspenze zamýšlené pro vytvoření sytosti v levém srdci se koncentrují. 2měna velikosti není pouze důsledkem stárnutí echogenických vlastností kontrastního prostředku, ale také zanechává prostředek nepoužitelný, pro určité aplikace, jako pro aplikace založené na průchodu mikrobublin plícemi.„Mikrobubliny-s velikostínad-10gm .„pravděpodobně—neprocházejl^pTicnínTi^-kapilárami, a proto kromě vytváření riskantních stavů jsou takové suspenze méně vhodné pro zobrazování levého srdce.

Jiný problém se suspenzemi plynu a jejich skladováním přichází š difúzí plynu, která probíhá při relativně nízkých rychlostech, ale která se urychluje při separaci fáze. Nevyhnutelný únik plynu ze suspenze mikrobublin je tak dále urychlován a v extrémních případech může vést k úplnému vyčerpání plynu z prostředí. Proto spojený účinek těchto různých mechanismů na destrukci suspenze plynu má za výsledek velmi rychlou degradaci prostředku.

Při některých přístupech k zobrazení ultrazvukem je jedním ze žádoucích aspektů těchto kontrastních prostředků pro mikrobubliny nebo částice, které obsahují plyn, aby byly distribuovány v těsném oknu velikosti. Příčina toho je uvedena výše. Účinnost těchto prostředků při zvyšováni kontrastu v obrazech vytvářených lékařským ultrasonografickým vybavením je založena především na vysoce zvýšeném rozptylu přicházející ultrazvukové energie a za druhé na modifikovaném zeslabení vlastností tkání obsahujících tyto prostředky, a na rozdíl od toho představuje měřítko relativní amplitudy signálu dosažené z oblastí, které jsou perfundovány kontrastním prostředkem, ve srovnání s amplitudou signálu V* - z oblastí, které neobdržely kontrastní prostředek. Zvýšením ’ ” se rozumí zvýšení kontrastní hodnoty pozorované po podání ''⁵ ’ ' kontrastního prostředku, v porovnání s kontrastem pozorovaným před jeho podáním. Jak již bylo uvedeno výše, typ vybavení umožňujícího zobrazováni má přímý prospěch z těchto prostředků a je v úzké souvislosti s echografickými nástroji (B-způsob nebo Dopplerův způsob). Rozdílné vlastnosti zeslabení odezvy tkání obsahujících prostředek v porovnání ke tkáním, které prostředek neobsahují, se může také využít ke zlepšení diagnostické hodnoty procesu zobrazování. Kromě toho závislost frekvence ultrazvuku jak na vlastnostech rozptylu,,· tak na vlastnostech zeslabení u prostředku, se může použít k dalšímu zvýšení prostorového rozlišení tkáně. V tomto případě fyzikální zákony ovládající tuto frekvenční závislost systematicky závisí na velikosti mikrobublin nebo částic. Tak použitý algoritmus je mnohem účinnější, pokud působí na ozvěnový signál pocházející z mikrobublin nebo částic s těsnou distribucí velikosti. Jako příklad se uvádí, že jeden takový pokus využívá nelineární oscilace mikrobublin k detekci echofrekvence složek při druhé harmonické nebo základní excitační frekvenci. Protože tkáně neobsahující kontrastní prostředek neprojevují stejné nelineární chování jako mikrobubliny,.._.ta.to metoda je schopna zvýšit významně kontrast mezi oblastmi obsahujícími a oblastmi neobsahujícími ¹kontrastní prostředek. Toto zvýšení je mnohem zřetelnější pro daný počet částic na jednotku objemu, když velikosti jsou úzce distribuovány. Avšak příprava produktů s takovou úzkou distribucí velikosti je časově náročná a pokud se takové kalibrované suspenze již dodávají, měl by se výrazně usnadnit další vývoj a použití tohoto technického postupu. 0 spolehlivé skladování takových prostředků s nezměněnou distribucí velikosti je tak také velký zájem.

Další' obtíže se skladováním vodné suspenze plynu jsou, založeny na zkušenosti s .ultrazvukovými kontrastními · prostředky, které obsahují fosfolipidy jako stabilizátory^ mikrobublin plynu.'V důsledku hydrolýzy fosfolipidů se* koncentrace stabilizátoru (povrchově aktivní látky) během skladování konstantně snižuje, co způsobuje ztrátu obsahu mikrobublin a degradaci echogenních vlastností suspenze. Tak problém skladování ultrazvukových kontrastních prostředků obsahujících suspenze mikrobublin plynu zůstává otevřen.

Skladování vodných suspenzí plynu za studená, dosahované zmrazením, je známo po určitou dobu v potravinářském •průmyslu.' Například”US-A-4 347“707*(Generál Food Cořp. ) uvádí~__ skladování zplyněného ledu s vysokým obsahem plynu a dobrou stabilitu, při skladování, který se vyrábí metodou, při které se zplyněný led připravuje stykem vodné kapaliny s plyny tvořícími hydrát za tlaku a teploty tak, že se vytvoří plynný hydratovaný komplex suspendovaný v kapalině a teplota a tlak se kontrolovatelně snižují k produkci například uhličitanového ledu s obsahem 85 až 110 ml oxidu uhličitého na gram.

Podle tohoto dokumentu zplyněný led má vysoký obsah plynu, prodlouženou stabilitu při skladování, je vhodný pro komerční distribuci ve zmrazeném stavu a když se vnese do vody, skýtá intenzivní šumění.

To znamená, že zmrazování suspenzí plynu za účelem jejich skladováni po prodloužené časové období a opětovné použití zabezpečených suspenzí by nezbytné nebylo vhodné pro ultrazvukové kontrastní prostředky, protože suspendovaný plyn má sklon unikat z nosného prostředí během rozmrazování.

Další obtížnost se zmrazenou plynovou suspenzí mikrobublín spočívá ve skutečnostiže expanze nosného prostředí během zmrazováňí vytváří vnitřní síly, které jednoduše zničí nebo , rozdrtí obal mikrobublín při uvolňování zachyceného plynu a dovolí, aby plyn unikl bud během skladování nebo později během rozmrazování suspenze. Tento problém je obzvláště obtížný, pokud suspenze mikrobublín mají materiálovou hranici· nebo hmotný obal. . .. '. /

Podstata vynálezu

Krátce uvedeno, vynález se týká zmrazených suspenzí bublin plynu imobilizovaných ve zmrazeném vodném nosném prostředí, přičemž nosné prostředí obsahující bubliny plynu s vhodnými přísadami je fyziologicky přijatelnou nosnou látkou.,Imobilizované bubliny plynu jsou mikrobubliny, které;, jsou vázány nestálým obalem nebo hmotnou membránou, a suspenA . \7·_ί;.

ze, pokud se vyskytují v kapalné formě, jsou injikovatelné žijícím bytostem a jsou vhodné jako kontrastní prostředky pro ultrazvukové zobrazování krevního řečiště a tkáně lidských a zvířecích pacientu.

L ix

Podle tohoto vynálezu teploty zmrazováňí suspenze jsou od -1 do -196 °C, výhodné od -10 do -76 °C, zatímco velikost mikrobublín plynu je pod 50 μπι, výhodně pod 10 μπι. Zvláště vhodné jsou suspenze, ve kterých je velikost mikrobublín od 2 do 9 μπι, přičemž suspenze mikrobublín s velikostí od 3 do 5 μια jsou vhodnější.

---------s ohledem na.. ro.zdíl_v_ biologické degradovatelnosti mezi suspenzemi obsahujícími mikrobalonky nebo mikrobubliny plynu s hmotným obalem, ve kterém je membrána zhotovena ze syntetického nebo přírodního polymeru nebo proteinu, a suspenzemi obsahujícími mikrobubliny plynu s nestálými obaly, zmrazené suspenze s nestálými obaly jsou výhodnější, zvláště pokud se použijí lamelární fosfolipidy ve formě monomolekulárních nebo vícemolekulárních membránových vrstev.

Ύ

Tento vynález se také týká způsobu skladování suspenzí mikrobublin, kde suspenze je umístěna do chladicího zařízení, a kde mikrobubliny jsou zmobilizovány v nosném prostředí . .

ochlazením na teplotu pod teplotou zmražení suspenze,••;výhb'<ině^%'«>^áií*_<za teploty od -I do -196 °C, výhodněji od -10 ďó -76 °C^ přičemž mrazicí podmínky se udržují pó*delší časové' oMolSí ^r'** Podle potřeby se zmrazená suspenze může udržovat v atmosféře inertního plynu nebo směsí plynů, z nichž alespoň jeden je enkapsulován do mikrobublin. Plyn se s výhodou vybírá z plynů obsahujících halogen, vzduchu, kyslíku, dusíku, oxidu uhličitého nebo jejich směsí.

Použití injikovatelných suspenzí podle tohoto vynálezu pro ultrasonické echografické zobrazování orgánů a tkání a pro' přípravu ultrazvukových kontrastních prostředků je také popsáno.

Přehled obrázků na výkresech obr. 1 znázorňuje diagram změny koncentrace bublin (podle zjištěného počtu) v rozmražené suspenzi mikrobublin SF₆ a vzduchu, který obsahuje 5 % C_SF₁₂, ve vodném nosném prostředí jako funkci teploty skladování.

Na obr. 2 je vynesena změna celkového objemu plynu z rozmražených suspenzí mikrobublin SF₆ a vzduchu, který obsahuj e 5 % C₅F₁₂, ve vodném nosném prostředí jako funkce teploty skladování.

Na obr. 3 je v grafické formě předložena změna absorbance rozmražených suspenzí mikrobublin jako funkce použitého vnějšího tlaku a teploty skladování.

Obr. 4 je diagramem ukazujícím změnu relativní absorbance jako funkci použitého vnějšího tlaku na rozmražené suspenze po skladování při rozdílných teplotách.

V· <· *

Obr.

mikrobublin (obr. 5B) z 3, 4 a 6 μιη je diagramem ukazujícím distribuci velikosti v číselném (obr. 5A) a objemovém procentu plynu kalibrovaných mikrobublin s průměrnou velikostí '*

Obř. 6 je diagramem ukazujícím distribuci velikosti mikrobublin v číselném (obr. 6A) a objemovém procentu plynu (obr. 6B) z nekalibrováných mikrobublin.

Podrobný popis vynálezu

Λ '·'&

Podle tohoto vynálezu se získává zmrazená suspenze . mikrobublin plynu, ve které jsou mikrobubliny imobilizovány „ ve zmrazeném vodném nosném prostředí, které kromě mikrobublin obsahuje obvyklé přísady. Vodná nosná látka je fyziologicky přijatelná a suspenze, která v kapalné formě je injikovatelná r-' do žijící bytosti, je vhodná jako ultrazvukový kontrastní prostředek pro zobrazování krevního řečiště a tkáně lidských a zvířecích pacientů. Mikrobubliny zmobilizovaného plynu vázané nestálým obalem nebo hmotnou membránou se zachycují mezi molekulami zmrazeného nosného prostředí, jehož teplota je od -1 do -196 °C, výhodně od -10 do -76 °C. Použité přesné teplotní rozmezí bude záviset na volbě plynu v mikrobublinách, ale také na druhu a jakosti použitých přísad. Tak

.............například..v. případě, .vzduchu, nebo dusíku může teplota ležet kdekoli od -1 do -196 °C, zatímco v případě C₄F_g bude teplota od -1 do -5 °C. Pokud se jako případy použijí kopolymery polyoxypropylenu a polyoxyethylenu nebo se použije polyethylenglykol, v závislosti na celkovém přítomném množství v suspenzi, nejvyšší přijatelná teplota může být -5 °C nebo rovněž -10 °C na místo -1 °C.

Velikost většiny mikrobublin v suspenzi je obvykle pod 50 μκι, ale velikost mikrobublin pro intravenózně injekčně zaváděné kontrastní prostředky bude výhodně pod 10 μπ.

Pro většinu aplikací by požadavky uspokojovaly

.. . ... . . -4 4. -v , .

suspenze s mikrobublinami, ktere mají distribuci velikosti od 2 do 9 μιη, avšak pokud se nakládá se suspenzemi kalibroványcíi’^ mikrobublin, velikosti mohou být kdekoli v tomto uvedeném rozmezí, například do 2 do 4 μιη, od 3 do 5 μιη, od 4 do 6 μη, od 5 do 7 μιι, od 6 do 8 μη nebo od 7 do 9 μιιι. Přitom však mikrobubliny s rozmezím velikosti od 3 do 5 μη jsou výhodné.

Tak tento vynález také poskytuje zmrazené suspenze mikrobublin s velmi úzkou distribucí velikosti. Obvyklá distribuce velikosti mikrobublin ze suspenzí kalibrovaných mikrobublinbude jak je ilustrováno na obr. 5, kde distribuce , .

je dána hranicemi číselné distribuce mikrobublin (jak šě <*·· stanoví Coulerovým čítačem), viz obr. 5A, a hranicemi objemové distribuce mikrobublin (jak se stanoví Coulerovým čítačem), viz obr. 5B. Na rozdíl od suspenzí obsahujících kalibrované mikrobubliny, suspenze obsahující nekalibrované bubliny plynu budou mít obvykle číselnou a objemovou distribuci velikosti, která je podobná distribuci jak je znázorněna na obr. 6A a obr. 6B. Z těchto obrázků se snadno zjistí, že echografické odezvy suspenzí připravených z kalibrovaných mikrobublin plynu budou mnohem rovnoměrnější, co poskytne menší rozptyl, a proto ostřejší zobrazení než v případě suspenzí s nekalibrovanými mikrobublinami. Jak již bylo uvedeno, tyto kalibrované suspenze jsou velmi žádoucí, ale jejich použití je tak dalece velmi omezeno. Tak tyto žádoucí suspenze jsou nyní snadno dostupné jednoduchým převedením zmrazených suspenzí, které se mohou skladovat při nízkých teplotách po prodloužené časové období bez nežádoucí ztráty jejich počáteční echogenicity.

I

Další výhoda tohoto vynálezu vychází ze skutečnosti, že za účelem vytvoření echosignálových složek při dvojnásobné základní frekvenci, druhá harmonická frekvence zobrazování vyžaduje nelineární oscilaci kontrastního prostředku. Takové chování využívá ultrazvukovou excitační hladinu, abyse; překročil určitý akustický práh při určité hloubce tkáně f' Během nelineární oscilace nastává frekvenční konverze, co způsobuje přeměnu akustické energie ze základní excitační frekvence až na její druhou harmonickou frekvenci. Tyto významné energie přenášené do mikrobublin během tohoto typu zobrazování vyžadují mikrobubliny dostatečně odolné k přečkání těchto podmínek. Vynález poskytuje snadný a obvyklý přístup k suspenzím, které obsahují mikrobubliny s dobrou odolností vůči změnám tlaku, které se mohou nyní připravit í' v předstihu, skladovat a používat, když je zapotřebí. ‘

Jak již bylo zmíněno, zmrazené suspenze podle tohoto vynálezu mohou obsahovat kromě mikrobublin plynu také přísady, mezi které se zahrnují různé povrchově aktivní látky, přípravky zvyšující viskozitu, stabilizátory a podobně. Mezi povrchově aktivní látky se mohou zahrnout povrchově aktivní látky, které vytvářejí film a které nevytvářejí film, včetně fosfolipidů v lamelární nebo laminární formě, které jsou známé ke stabilizaci mikrobublin s nestálým plynem a kapalným obalem. Lamejární fosfolipidy mohou být ve formě monomolekulárních nebo vícemolekulárních vrstev nebo liposomů.

V závislosti na typu mikrobublin, to znamená s nestálým obalem nebo hmotnou membránou, nosné prostředí může zahrnovat jako přísady hydratační přípravky a/nebo hydrofilní stabilizující sloučeniny, jako je polyethylenglykol, cukry, jako je galaktóza, laktóza nebo sacharóza, dextran, škrob a jiné polysacharidy nebo jiné obvyklé přísady, jako je polyoxypropylenglykol a polyoxyethylenglykol a jejich kopolymery, ethery alifatických alkoholů s polyoxyaíkylenglykoly, estery mastných kyselin s polyoxyalkylovaným sorbitanem, mýdla, glycerol-polyalkylkenstearát, glycerol-polyoxyethylenricinoleát, homopolymery a kopólyměrý polýálkylenglykolů, polý“,.,. ethoxylovaný sojový olej a ricinový olej, stejně jako jejichý , hydrogenované deriváty, ethery a estery sacharózý nebo jiných ' •i cukrů s mastnými kyselinami a alifatickými alkoholy, ktere^^ ' jsou popřípadě polyoxyalkylované, monoglyceridy, diglyceridy, a triglyceridy* nasycených nebo nenasycených mastných kyselin a také glyceridy sojového oleje a sacharózý. Povrchově aktivní látky mohou být filmotvorné nebo nefilmotvorné a mohou zahrnovat polymerovatelné ampifilní sloučeniny typu linoleyl-lecitinů nebo polyethylendodekanoátu. Výhodně povrchové aktivní látky jsou filmotvorné a ještě výhodněji jde o fosfolipidy zvolené z kyseliny fosfatidové, fosfatidylcholinu, , fosfatidylethanolaminu, fosfatidylserinu, fosfatidylglycero~lu’fósfaťfdýlinóšitóiu, karďiolipinu, sfingomyelínu nebo jejich směsí. Kromě filmotvorných povrchově aktivních-látek zmíněných výše, suspenze mohou dále obsahovat až 50 % hmotnostních nelaminárních povrchově'aktivních látek, které jsou zvoleny z mastných kyselin, esterů a etherů mastných kyselin a alkoholů s polyoly, jako jsou polyalkylenglykoly, polyalkylenované cukry a jiné cukry, a polyalkylénováný glycerol. Mezi obzvláště vhodné látky se zahrnuje dicetylfosfát, cholesterol, ergosterol, fytosterol, sitosterol, lanosterol, tokoferol, propylgallát, askrobylpalmitát a butylovaný hydroxytoluen.

Je třeba vzít v úvahu, že tento vynález není omezen pouze na suspenze mikrobublin plynu s nestálým obalem. Běžně se mohou použít jakékoli vhodné částice naplněné plyny, jako jsou porézní částice, liposomy nebo mikrobalonky, které mají obal vytvořený z fosfolipidů, syntetických nebo přírodních polymerů nebo proteinů. Tak bylo stanoveno, že mikrobalonky připravené s albuminem nebo liposomovými váčky mohou být vhodné skladovány po prodloužené časové období ve zmrazeném stavu. Rozmražené suspenze obsahující tyto mikrobalonky , projevují přijatelné echogenicity, co ukazuje na relativně malou ztrátu mikrobublin. Suspenze, ve kterých jsou mikrobub-.

liny stabilizovány sorbitolem nebo neiontovými povrchově < ·τ ** ^?· ' - ’·“^τ aktivními látkami, jako kopolymery polyethylenu a polypropy- 1 ?

lénu (komerčně známé jako Pluronic') projevují naprosto dobrou zobrazovací kapacitu po skladování. ,

Přísady používané pro suspenze podle tohoto vynálezu mohou dále obsahovat přípravky zvyšující viskozitu a/nebo stabilizátory, které jsou zvoleny ze lineárních a zesítěných polysacharidů nebo oligosacharidů, cukrů, hydrofilních polymerů a jodovaných sloučenin. V takovém případě hmotnostní eř* poměr těchto sloučenin k povrchové aktivním látkám je od přibližně 1:5 do 100:1. ?

Suspenze podle tohoto vynálezu se připravují -¾ s rozdílnými plyny nebo směsmi plynů a obvykle obsahují od ¹ ý

10⁷ do 10⁸ mikrobublin na ml, od IQ⁸ do 10⁹ mikrobublin na ml _;·?

nebo od 10⁹ do 10¹⁰ mikrobublin na ml. Tyto koncentrace * zůstávají stejné po prodlouženém skladování, to znamená několik měsíců, a pokud se připravuje suspenze s SF_g, C^Fg nebo jejich směsmi nebo směsmi vzduchu s SF_g nebo C^F·^, koncentrace se nezmění ani po opakovaných cyklech zmrazování a roztáni.

. . ..... .. - Když. mikrobubliny^v suspenzi mají. hmotnou membránu, .... membrána je zhotovena ze syntetického nebo přírodního polymeru nebo proteinu. Polymer, který tvoří obal nebo hraniční membránu injikovatelných mikrobalonků, se může zvolit z většiny hydrofilních, biologicky degradovatelných, fyziologicky snášenlivých polymerů. Mezi takovými polymery se <

· mohou jmenovat polysacharidy s omezenou rozpustností ve vodě, polylaktidy a polyglykolidy a jejich kopolymery, kopolymery laktidů a laktonů, jako je e-kaprolakton, 5-valerolakton a polypeptidy. Veliká všestrannost při výběru syntetických polymerů je proto výhodná, protože u alergických pacientů se může požadovat, aby se vyhnulo použití mikrobalonkú zhotov©“ ných z přírodních proteinů (albumin, želatina). Mezi vhodné polymery se zahrnují póly (ortho) esterykopolymery kyseliny mléčné a kyseliny glykolové, polytDíL-laktid-kó-fi-'^·'^’·'·^^·^' -kaprolakton), poly(D,L-laktid-ko-S-valerolakton), poly(D,L-laktid-ko-g-butyrolakton), polyalkyl-kyanakryláty, polyamidy, polyhydroxybutyrát, polydioxanon, poly-p-aminoketony, polyfosfazeny a polyanhydridy. Polyaminokyseliny, jako je póly(kyselina glutamová) a póly(kyselina asparagová) se mohou také použít, stejně jako jejich deriváty, to znamená parciální estery s nižšími alkoholy nebo glykoly. Vhodný příklad takových polymerů je póly-(terč.-butylglutamát).

Jestliže je membrána zhotovena z proteinového materiálu, proteinem je albumin.

I když ve spojení s .vhodnými povrchově aktivními'. látkami a stabilizátory se mohou použít samotné plyny obsahující halogen, vzduch, kyslík, dusík nebo oxid uhličitý, nyní je také navrženo používat směsi plynů obsahujících halogen se vzduchem, kyslíkem, dusíkem a s oxidem uhličitým. Plyny obsahující halogen jsou plyny zvolené z fluoridu sírového, tetrafluormethanu, chlortrifluormethanu, dichlordifluormethanu, bromtrifluormethanu, bromchlordifluormethanu, dibromdifluormethanu, dichlortetrafluorethanu, chlorpentafluorethanu, hexafluorethanu, hexafluorpropylenu, oktafluorpropanu, hexafluorbutadienu, oktafluor-2-butenu, oktafluorcyklobutánu, dekafluorbutanu, perfluorcyklopentanu, dodekafluorpentanu nebo jejich směsí a výhodně jsou zvoleny z fluoridu sírového, tetrafluormethanu, hexafluorethanu, hexafluorpropylenu, oktafluorpropanu, hexafluorbutadienu, oktafluor-2-butenu, oktafluorcyklobutanu, dekafluorbutanu, perfluorcyklopentanu *

f a dodekafluorpentanu.

Tento vynález se také týká způsobu skladování suspenzí mikrobublin, při kterém se suspenze umístí do chladicího , . ,_t ~ zařízení, jako je chladnička, a mikrobubliny se imobílizují v nosném prostředí ochlazením na teplotu pod teplotou zmrazení suspenze, výhodně na teplotu od -1 do -196 C a výhodněji od -10 do -76 °C, přičemž chladicí podmínky se udržují během prodlouženého časového období. Podle potřeby se zmrazená suspenze udržuje v atmosféře inertního plynu nebo směsi plynů, z nichž alespoň jeden je enkapsulován v mikrobublinách. Plyn se s výhodou zvolí z plynů obsahujících halogen, vzduchu, kyslíku, dusíku, oxidu uhličitého nebo jejich směsí.

Bylo nalezeno, že plyny nebo směsi plynů používané pro

A zmrazenou suspenzi podle tohoto vynálezu mají mít teplotu varu, která je nižší než -18 °C. To znamená, že suspenze připravené s plyny obsahujícími halogen, jako se samotným C₄F₈ nebo C₅F₁₀, budou mít velmi malou stabilitu při skladováni a ztratí prakticky veškerou svojí echogenicitu po ·» zmrazení. Tó je obzvláště překvapující, protože všechny jiné plyny obsahující halogen produkují velmi stabilní zmrazené suspenze, které přečkají několik cyklu zmrazování a roztáni bez významné ztráty echogenicity. Rovněž přidáváním těchto plynů s malým množstvím jiných halogenovaných plynů nebo rovněž odpařením halogenované látky, která je za teploty místnosti kapalná, jako je C₅F·^, se připraví smési, které by nemohly, být,..skladovány,, zmrazené . Naproti tomu smícháním vzduchu s určitým množstvím těchto plynů se připraví suspenze, které mají velmi dobrou stabilitu při skladování a velmi dobrou echogenicitu po několika cyklech zmrazení a roztáni.

Jak již bylo zmíněno výše, injikovatelné suspenze podle tohoto vynálezu, pokud jsou v kapalném stavu, jsou vhodné jako kontrastní prostředky pro ultrazvukové zobrazování orgánů a tkání. Před použitím se samozřejmě suspenze musí rozmrazit a popřípadě udržovat za teploty místnosti po určité časové období á potom podat pacientovi. Pacient se poté prohlíží pomocí ultrazvukové„sondy a^vy^vóřít^^'.

se obraz vyšetřované oblasti?

Do rozsahu tohoto vynálezu také spadá způsob přípravy ultrazvukových echografických kontrastních prostředků ze zmrazených injikovatelných suspenzí podle tohoto vynálezu. Pojmem příprava se rozumí, že se dosti koncentrované suspenze (obsahující například 10¹⁰ až 10¹¹ nebo více'mikrobublin na mililitr) kalibrovaných nebo nekalibrováných mikrobublin skladují ve zmrazeném stavu během časového období a pokud je zapotřebí, rozmražená suspenze se popřípadě' zředí na požadovanou koncentraci'přidáním stejné nebo rozdílné ’ _ 'fyziologicky přijatelné kapalné nosné látky. Počítá se^také s tím, že se v tomto okamžiku mohou přidat další přísady nebo přídavné chemikálie.

Příklady provedeni vynálezu

Vynález je ilustrován příklady, které jsou uvedeny dále.

Příklad 1 mg diarachídoylfosfatidylcholinu (DAPC), 2,4 mg kyseliny dipalmitoylfosfatidové (DPPA) (obě sloučeniny jsou od firmy Avanti Polar Lipids, USA) a 3,94 g polyethylenglykolu (PEG 4000 od firmy Siegfried) se rozpustí ve 20 ml terč.-butanolu za teploty 60 °C ve skleněné nádobě s kulatým dnem. Čirý roztok se rychle ochladí na teplotu -45 °C a lyofilizuje. Alikvoty, o hmotnosti 25 mg získaného bílého koláče, se zavedou do skleněných lahviček o objemu 10 ml. Lahvičky se uzavřou kaučukovými zátkami, odvzdušní a plní zvoleným plynem nebo směsí plynů (viz tabulka 1). Uzávěrem se jako injekce vnese fyziologický roztok (0,9 % chloridu sodného) v množství 5 ml na lahvičku a lyofilizáty se rozpus? ti intenzivním třepáním.

'-.--i f '· ' «' £/. ••itiíWslOfcsae.XIÍ ' ’ \V^:ííB

τ.-ηζΛ .-A*.

ví:.:.

·'< 4 •-ί-'Λ'

-«ΪΛ,ί.„ .

,«.,,Λ± .-Λ*..· X ~=f 9 '•í.tiP-.i

Suspenze mikrobublin se“vnese do studeného skladovačího prostoru (teplota -18 °C). 0 tři dny později se suspenze nechá roztát za teploty místnosti (23 °C), analyzuje se s ohledem na koncentraci bublin (za použití přístroje Coulter Multisizer) a stanoví se absorbance při vlnové délce 700 nm a zředění 1:50. Absorbance při 700 nm se měří podle celkové turbidity suspenze bublin.

Tabulka 1

Plyn nebo Teplota varu Rozpustnost Absorbance Získáno (%) směs plynů ( C) ve vodě (% z počáteční bublin t.

hodnoty)

vzduch	-195	0,0167	33	14
^SF6	-63,8	0,005	57	23
^C3^F8	-36,7	«0,005	59	54
^C4^F8	-6	0,016	11 * T	8
^C4^F10	-1,7	<0,005	7	4
vzduch s
^{5 % C}5^F12	-195	0,0167	71	49
.vzduch, s.	- —..... - -		.......-
10 % c₅f₁₂	-195	0,0167	55	34
vzduch s
io % c₄f₈	-195	0,0167	50	30
vzduch s
10 -s C4F10	-195	0,016	52	32

Tabulka 1 - pokračování

Plyn nebo Teplota varu Rozpustnost Absorbance Získáno (%)

směs plynů	(°c.)	ve vodě*	(% z počáteční bublin
hodnoty)	i.
SF₆ s				r -i · ý - · .* - A* •^r ”»· · ·.- ··. -· • stíí.^ > _r. .j* -i· ·· * ’
^{5 % C}5^F12	-63,8	0,0.05	⁶²	^;4,1
^C3^F8 ^s			- -.	... ....v .... ' > > · v :<&> jif ·ή···
^{5 % C}5^F12 C₄Fg S	-36,7	«0,005	84	71
⁵ * ^C5^F12 ^C4^F10 ^s	-6	0,016	7	6
^{5 % C}5^F12	-1,7	<0,005	1	1 *
xenon s
^{5 % C}5^F12	-108,1	0,108	38	17

vyjádřeno Jako Bunsenův koeficient .

“V - -.·

Výsledky uvedené v tabulce 1 ukazují, že stabilita . zmrazování závisí na teplotě varu a rozpustnosti plynu ve vodě. Méně bublin se dostane y 'případě, plynů s teplotou varu nad -18 °C. Ξ přihlédnutím k plynům s teplotou varu pod -18 °C, nižší rozpustnost ve vodě vede k vyššímu získání bublin. Je také zajímavé poznamenat, že přídavek malého množství plynu o vysoké molekulové hmostnosti s malou rozpustností ve vodě, jako dodekafluorpentanu (CgF-^), zlepšuje získání bublin po roztáni v případě plynů s nízkými teplotami varu, ale nikoli v případě plynů s teplotou varu nad -18 °C. Konečně mikrobubliny plněné C₄F₈ a C₄F₁₀ samostatně nebo ve směsích s malými množstvími dodekafluorpentanu mají velmi malou stabilitu ke zmrazení a roztaní. Avšak pokud se tyto plyny použijí v kombinaci se suspenzemi mikrobublin vzduchu obsahujícími směsi, projevují lepši výsledky s ohledem na echogenicitu nebo ztrátu mikrobublin než suspenze, které obsahují vzduchové mikrobubliny.

Příklad 2 i

Suspenze SF_g mikrobublin, připravená jak je popsáno v příkladu 1, se pomalu zmrazí (přibližně během 30 minut) na teplotu -18 °C a rychle (během 1 minuty) na teplotu -45 ,;°C. ' Jiné suspenze SF_g mikrobublin se před zmrazením udržují ža teploty místnosti, až všechny bubliny vystoupí na povrch.^& '

Ještě jiné suspenze se zmrazí, zatímco bubliny jsou homogenně distribuovány v roztoku. Zmrazené suspenze se skladují za teploty -18 a -45 °C po dobu 1 měsíce a potom se rozmrazí.

Tabulka 2

Test Koncentrace bublin Objem bublin (% z počáteční (% z počáteční hodnoty) hodnoty)

pomalé zmrazení (-18 °C)	16	39
rychlé zmrazení (-45 °C)	24	51
dekantace (-18 °C)	14	34
homogenizace (-13 °C)	24	61

Výsledky v tabulce 2 ukazují, že rychlost zmrazení má relativně malý vliv na konečný výsledek. Výtěžek v případě homogenní suspenze je lepší než v případě dekantovaných mikrobublin.

Příklad 3

Multilamelární liposomy (MLV) se připraví rozpuštěním 4,5 g hydrogenovaného sojového fosfatidylcholinu (HSPC od firmy Nattermann) a 0,5 g dicetylfosfátu (Fluka, Švýcarsko) lipidu .· *' ίΓμ,. .

* s a.*

Wt '*·*+ vnese ve směsi chloroformu a methanolu v poměru 2:1. Rozpouštědla se potom odpaří dosucha v bance s kulatým i dnem za použití í

rotační odparky. Výsledný lipídový film se vysuší ve vakuovém exikátoru. Po přidání 100 mol destilované vody se suspenze inkubuje za mícháni při teplotě 70 °C po dobu 30 minut... Lipósómová suspenze se upraví na konečnou koncentraci 25 mg'na mililitr přidáním destilované vody. ^;

Alikvot liposomové suspenze o objemu 100 ml se do utěsněného skleněného reaktoru, který je vybaven vysoko otáčkovým mechanickým emulgátorem (Polytron). Plynná fáze v reaktoru je tvořena vzduchem obsahujícím 5 % C₅F₁₂ (jak se stanoví měřením hustoty). Po homogenizaci (během.1 minuty při frekvenci otáček 10 000 za minutu) se získaná mléčná suspenze zavede do dekantačni nálevky. Po 6 hodinách může být vidět bílá vrstva bublin na povrchu roztoku. Nižší fáze (obsahující liposomy) se zachytí, přidá se malé množství čerstvé vody ’a vrstvamikrobublin se _znovu homqg.enizuje_._...P_os.tup________— (dekantace) se opakuje a· připraví se čtyři vzorky s rozdílnou velikostí mikrobublin (viz WO 94/09829). Vzorky se zmrazí za teploty -18 °C a o 24 hodin později se nechají roztát při teplotě místnosti.

Tabulka 3

Počáteční	Průměr	Koncentrace	Absorbance při 700
průměr	Dn po zmrazení	bublin {% z po-	nm (% z počáteční
Dn (μη)	a roztáni	čáteční hodnoty)	hodnoty)
2,5	2,5	19	20
4,6	4,5	60	68
6,0	6,2	86	100
7,6	8,1	76	91

Z dosažených výsledků (tabulka 3) je zřejmé, že zpracování zmrazením a roztáním nemá vliv na střední průměr mikrobublin. Experimenty ukazují, že mikrobubliny s větším průměrem (<2,5 μιη) odolávají zpracování zmrazením a roztáním lépe než mikrobubliny s menším průměrem. Dále se pozorovalo, že v určitých případech rychlost rozmrazování může ovlivnit _ konečnou koncentraci mikrobublin přítomných ve vzorku. Přesným vztah je stále nejasný, avšak vyskytují se údaje o tom, že' J ztráta mikrobublin je v obráceném poměru k rychlosti * rozmrazování. Předběžné výsledky ukazují, že lepší výsledky s ohledem na koncentraci mikrobublin (podle jejich počtu) a celkový objem plynu v suspenzi se dostanou při urychleném rozmrazováni, to znamená rozmrazování prováděném na vodné lázni za teploty 25 °C, než když se vzorky nechají za teploty 5 nebo 20 °C rozmrazovat postupně. Největší ztráta objemu plynu se pozoruje u vzorků, které jsou rozmrazovány za teploty 5 °C.

* J

Příklad 4

Experiment popsaný v příkladu 3 se opakuje za použití, směsi povrchově aktivních látek na místo multilamelárního liposomu. Směs povrchově aktivních látek se dostane rozpuštěním 1 g dípalmitoylfosfatidylglycerolu (DPPG Na, soli od .· firmy Avanti Polar Lipids, USA) a 3 g Pluronic^^R^ F_g8 (kopolymer polyoxyethylenu a polyoxypropylenu s molekulovou hmotností 8400) v 80 ml destilované vody. Po zahřátí na teplotu přibližně 70 °C se dostane čirý roztok. Tento roztok se ochladí na teplotu místnosti a jeho objem se doplní na 100 ml glycerolem. Roztok povrchově aktivní látky se zavede do utěsněného skleněného reaktoru, kam byl vložen emulgátor Polytron. Po homogenizaci (během 1 minuty při frekvenci otáček 10 000 za minutu) se získá mléčná suspenze s vrstvou pěny v horní části. Pěna se odloží a dostane se nižší fáze, která obsahuje IQ⁹ mikrobublin na mililitr. Tato fáze se ponechá několik hodin předtím, než se zachytí bílá vrstva mikrobublín. Zachycené mikrobubliny se znovu homogenizují v destilované vodě, dvakrát dekantují a zpracují zmrazováním a roztáním jak již bylo popsáno. Když se porovnají charakteristiky mikrobublín před a po zmrazení, nepozorují se žádné výzpamné. .změny-v bublin na ml, po průměru Dn (před

Přiklad 5 celkové'koncentraci bublin (před 1,3 ^1,25 ^{x 1θ8} bublin,na>1) a ve střednim*M^^S4í&4.^

4,0 μπι/ po 3,9 μη).

-í“ '·'··

Bubliny SF_g se připraví, jak je popsáno v příkladu 1, a dekantují, jak je popsáno v příkladu 3. Během odstranění nižší vodné fáze se do nálevky zavede ekvivalentní objem plynného SF_g. Vrstva bublin se znovu suspenduje v destilované vodě, 0,9% roztoku'chloridu sodného, 3% vodném roztoku glycerolu a 100 mg/ml roztoku trehalosy. Koncentrace bublin a absorbance při vlnové-délce 700 nm (po zředěni)' se stanoví ______—před-a-po··zpracování'zmrážováňxm^_a roztáním. '

Tabulka 4

Suspendacní Absorbance při Koncentrace bublin prostředí 700 nm (% z počáteč- (z počáteční ní hodnoty) hodnoty)

destilovaná voda	69	66
0,9% NaCl	86	92
3% glycerol	92	96
100 mg/ml trehalosy	89	73

Výsledky v tabulce 4 ukazují vynikající získání mikrobublin nezávisle na suspendačním prostředí. Je důležité poznamenat, že se zde získají mikrobubliny v rozsahu od 66 do %, co se muže zdát jako nesrovnalost s předchozími výsledky uvedenými v tabulkách 1 a 2. Avšak v tomto případě I především mikrobubliny jsou kalibrovány, to znamená, že jsou stabilnější než nekalibrované, a dále velikost použitých mikrobublín je nad 4 μπι.

Příklad 6 . .· . i, .-·?-,· -•'i.*·’·.*.

, ·. . ' :^r’* '· r }?*

Dekantované SF_g mikrobubliny se dostanou 'jak je ’ popsáno v příkladu 5. Vrstva mikrobublín se suspenduje při rozdílných koncentracích mikrobublín v 0,9% roztoku chloridu sodného, potom zmrazí na teplotu -18 °C, skladuje po dobu přibližné 4 měsíců a nechá roztát za teploty místnosti.

Tabulka' 5

Koncentrace bublin objem bublin Průměr bublin (x 10⁸/ml) (μΐ/ml) (μη).

nativní zpracované* nativní zpracované’ nativní zpracované

1,9	1,9	(1,9)	6,8	6,0	(5,5)	3,1	3,0	(2,9)
3,9	3,7	(3,3)	14,7	11,5	(9,4)	3,1	2,8	(2,6)
5,9	5,7	(5,4)	22,6	20,4	(18,6)	3,1	3,0	(3,0)
7,7	7,6	(6,1)	28,3	24,6	(17,0)	3,0	2,9	(2,7)

Zpracováním se míní zmrazování a roztáni. V závorkách jsou uvedeny výsledky dosažené po druhém zpracování zmrazováním a roztáním.

Výsledky shromážděné v tabulce 5 ukazují nevýrazný účinek koncentrace bublin na odolnost ke zpracováni zmrazováním a roztaním. Rovněž druhé zpracování zmrazováním a roztátím, které se provádí po uskutečněném skladování, nemá účinek na konečnou koncentraci, co ukazuje, že tyto suspenze jsou odolné k opakovaným cyklům zmrazování a roztáni rovněž po skladování bez velké ztráty počtu bublin a poškození echogenicity vzorků. ' .

Příklad 7 . ’ . . ... «». t·,

Mikrokuličky albuminu, zpracované působením ultrazvu* , .. . „. , , '.·:·· . - · ku, se pripravi za použiti způsobů, který je popsán . ^A v EP-A-0 324 928 (Widder). Uvedeno v krátkosti,' 5 ml ’”‘^ř' ’ '* sterilního 5% roztoku lidského albuminu (od Blood Transfusion Service Švýcarského červeného kříže, Bern, Švýcarsko) se zavede do kalibrované injekční stříkačky o objemu 10 ml.

Ultrazvuková sonda (model 250 od firmy Branson Ultrasonic ,

Corp., USA) se spustí do roztoku na značku 4 ml. Působení ultrazvuku se provádí po dobu 30 sekund při nastavení energie 7. Potom se ultrazvuková sonda vyzvedne až na značku 6 (to znamená nad hladinu roztoku) a působení ultrazvuku se provádí to** μ pulzním- způsobem'' (0’, 3‘ s/cyklus) po dobu 4£_ &ekund_._Po_pds.tr.a.-:__.___________ ' není’ vrstvy pěny se dostane suspenze mikrokuliček albuminu, která obsahuje 1,5 x 10⁸ bublin na mililitr, s číselným středním průměrem 3,6 μια. Suspenze se zmrazí na teplotu. -18 °C a nechá za této teploty přes noc. Den poté se suspenze nechá roztát za teploty místnosti. Suspenze analyzovaná před a po zpracování zmrazovánim a roztáním má tyto charakteristické vlastnosti:

Tabulka 6

Vzorek Absorbance Koncentrace bublin Průměr (se vzduchem) 700 nm (x l0⁸/ml) Dn (um) nativní po zmrazení a roztáni

0,25

0,13

1,4

0,4

3,6

6,3

Výsledky v tabulce 6 ukazují určitý stupeň destrukce mikrobublin obsahujících vzduch cyklem zmrazování a rozmrazování. Pokud se na místo čistého vzduchu připravují albuminové bubliny se směsí vzduchu obsahující přibližně 5 % objemových ^c5^f12 ^{nebo c}3^f8' stabilita mikrokuliček proti ztrátě poctu ...

bublin zmrazováním a roztánim_se zřetelně zlepšuje (viz f ’ ' . . „ . „a/s .-..Λ···., tabulka 7). Z výsledků dosažených s iaikrokuličkami albuminu může být také zřejmé,- že cykly zmrazování a roztáni v případě vzduchových mikrobublin jsou škodlivé pro nižší konec velikostí shluků mikrobublin, to znamená, že mikrobubliny se střední velikostí přibližně 5 tím nebo více mají lepší odolnost a schopnost přetrvat než menši mikrobubliny.

Tabulka 7

Vzorek (vzduch s

Absorbance 700 nm

Koncentrace bublin Průměr (x 10⁸/ml) Dn (um) ^C5^F12 nativní 0,64 po zmrazení a roztáni 0,39

2,4

1,1

3,7

4,3

Příklad 8

Když se 3 g sacharidových mikročástic SHU-454, komerčního echo-kontrastního prostředku (Echovist^ , Schering, SRN) rekonstituje_v8,5 ,ml roztoku galaktózy. .(s obsahem 200 . mg sloučeniny na ml), jak je doporučeno výrobcem, a získaná látka se podrobí zpracování zmrazováním a roztáním, po roztáni je v roztoku přítomno pouze několik bublin. Jestliže se přidá 10 mg na ml směsi dipalmitoylfosfatidylglycerolu a Pluronic^) F₆₈ v hmotnostním poměru 1:5 k roztoku galaktózy před přidáním mikročástic sacharózy, mohou se dostat stabilní mikrobubliny v koncentraci 2,5 x 10⁸ mikrobublin na mililitr. Po zmrazení a roztáni koncentrace bublin poklesne přibližně o velikost tří řádů, na 2,3 x 10⁵ na mililitr, co ukazuje značnou ztrátu mikrobublin během zpracování. Pokud še však přeď rekonstitucí nahradí vzduch .· v plynné fázi směsí vzduchu s obsahem 10 % C₅F₁₂, bubliny»* jsou stabilnější a také odolnější ke zpracovaní zmrazovamm a roztaním. Ztráta mikrobublin v tomto naposledy uvedeném*'*'' případě činí pouze 2,3 x 10⁸ mikrobublin na mililitr, protože koncentrace poklesla z 3,9 x IQ⁸ na 1,6 x lo⁸ mikrobublin na mililitr.

.ťwí·

Příklad 9

Připraví se mikrobalonky z polymeru za použití | technického postupu popsaného v příkladu 4 EP-A-0 458 745 (Bracco*International) 2' Polymerem použitým při_této př_íp_rayé_______._____________ je poly-PÓMEG, který je popsán v US patentu č. 4 888 398.

Mikrobalonky se suspendují v koncentraci 1,8 x 10⁸ částic na mililitr v destilované vodě, 0,9% roztoku chloridu sodného,

5% roztoku dextrózy a 3% glycerolu. Každá z těchto suspenzí se zmrazí a potom nechá roztát. Nepozorují se žádné zjistitelné změny po roztáni, ani v celkové koncentraci částic, ani ve středním průměru částic.

Příklad 10 l

V baňce s kulatým dnem o objemu 200 ml se rozpustí v 9 ml diethyletheru množství 126 mg vaječného lecitinu a 27 mg cholesterolu. K roztoku se přidají 3 ml o,2-molárního vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného s ionoforem A23187 a výsledný dvoj fázový systém se podrobuje působení ultrazvuku, až přejde na homogenní směs. Tato směs se odpaří I dosucha na rotační odparce Rotavapor a do láhve obsahující I usazeninu lipidu se přidají 3 ml O,2-molárního vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného.

r i

Po chvilce stání se výsledná liposomová suspenze dialýzuje proti fyziologickému roztoku, k odstranění nezachyceného hydrogenuhličitanu, a okyselí. Po další chvilce se roztok promyje destilovanou vodou a poté se několikrát vede kaskádou uhličitanových filtrů. Alikvot suspenze ⁴liposomů ^vs velikostí pod 50 um se potom zmrazí na teplotu -18 °C a skladuje za této teploty. 0 dva týdny později se suspenze nechá roztát za teploty místnosti. Suspenze analyzovaná před a po zpracování zmrazováním a roztaním ukazuje na přijatelně nízkou ztrátu echogenicity a počtu mikrobublin.

Příklad 11 i,

Při postupu z příkladu 3 se opakované použije SF₆a vzduch, který obsahuje 5 % C₅F₁₂, j^ako plYⁿná fáze a vzorky výsledné suspenze se zmrazí při -18, -45, -76 a -196 °C. Po 30 dnech skladování při teplotě odpovídající zmrazovací teplotě se vzorky rozmrazí a suspenze se analyzují. Dosažené výsledky jsou uvedeny v tabulce 8. Koncentrace mikrobublin ve vzorcích před zmrazením činí 11,3 x 10'/ml pro SF6 a 9,8 x 10⁷/ml pro směs vzduchu s obsahem 5 % C5F₁₂, zatímco příslušné objemy plynů ve vzorcích před skladováním jsou 2,9 μΐ/ml a 5,9 μΐ/ral. Průměrný průměr mikrobublin pro oba plyny činí 2,3 μη a 4,2 ^m.

Tabulka 8

Plyn Dosaže- Průměr Dosaže- Teplota Plynná Dosa- Průměr	Dosažená koncentrace bu~ blin -r (x^o⁷)
	ný ob- Dn po jem ply- rožnu táni (μΐ/ml)	ná kon- (°C) centra- ce bublin (x io⁷)	směs vzduchu s 5 % ^C5^F12	žený Dn po objem roztá- 1..... plynu ni (μΐ/ml)
^SF6	2,3 2,4	10,0 -18	ano	5,5	4,6	7,7
^SF6	2,8 2,6	7,9 -45	ano	4,2	4,5	6,2
^SF6	1,8 2,5	6,8 -70	ano	3,9	4,4	5,6
^SF6	0,6 2,0	6,0 -196	ano	2,7	4,0	5,1

Z výsledků vyplývá, že čím jsou nižší teploty při skladování, tím je větší ztráta koncentrace mikrobublin a'Celkového množství plynu 'získaného po rozmražení. Výsledky '“dále ukazují, že pro rozmražené vzorky suspenzí s SFg; průměrný průměr se nejprve zvýší a potom prudce klesá, /jak se teplota snižuje. Pro směs vzduchu s 5 % C₅F₁₂ nastává relativně malá změna v průměru, mikrobublin. Výsledky také ukazují, že průměrný průměr mikrobubliny klesá s poklesem skladovací teploty. Jak je znázorněno na obr. 1 pro suspenze s SFg a směsi vzduchu s C₅F₁₂, dostane se pouze 51,7 % a 52 % počátečního stavu mikrobublin po skladování za teploty -196 °C. Avšak jak je zřejmé z obr. 2, celkový objem plynu získaného po skladování pro SFg je 21,1 % z původního objemu, zatímco pro směs vzduchu s C₅F₁₂ je dosažený objem 46,5 %. Tyto údaje ukazují, že velikost mikrobublin v případě suspenzí připravených s SFg se mění, to znamená že získané mikrobubliny mají snížené průměry.

obr. 3 a 4 ilustruji účinnost zmrazení nebo teploty při skladování na odolnost ke změně tlaku suspenzí mikrobublin, které obsahují směs vzduchu s 5 % CgF^₂· Na diagramu z obr. 3 je představena absorbance (měřeno při vlnové délce 700 nm) jako funkce tlaku aplikovaného na suspenzi po skladování během 3 dnů za rozdílných teplot.

Z tohoto diagramu vyplývá, že pokles teplot při skladování má účinek na vlastnosti suspenze, přičemž změna vlastností _v .

suspenze skladované za teplot od -18 do -76 C je významná, ' zatímco změna pro, vzorky skladované za teplot od -76 do -196 ,*,.

°C je relativné malá. Tak udržování teplot při skladování pod -76 °C se nezdá, že by poskytlo další výhody. Z pohledu na náklady zahrnující dosažení zvolených teplot pod -76 °C se může pro takové teploty rozhodnout pouze ve výjimečných případech.

Obr. 4 naproti tomu ukazuje, že pokud se suspenze mikrobublin obsahující směs vzduchu s 5 % C₅F₁₂ skladuje po dobu 3 dnů při nízkých teplotách, její odolnost ke změnám tlaku zůstává relativně nezměněna, zatímco stejná suspenze udržovaná během stejného časového období při teplotě 25 °C ztrácí přibližné 10 % své počáteční odolnosti ke změně tlaku.

Přesný postup, důležitost kritického tlaku a měření > absorbance již byly vysvětleny v EP-A-0 554 213, který se zde uvádí jako součást dosavadního stavu techniky.

Příklad 12 *

Dvojrozměrná echografie se provádí za použití výbavy ACUSON 128 XP (Acuson Corp., USA) s prostředky z příkladů 1, á 7 na experimentálních miniprasatech po injekci do periferní žily v množství 0,04 ml/kg tělesné hmotnosti.

Stanoví se zvýšení echo-kontrastu levé ventrikuly v případě nativních vzorků, stejně jako vzorků zpracovaných zmrazováním a roztaním. Nezjistí se žádné významné rozdíly ani v případech vzorků, jako jsou popsány v příkladu 7 pro albuminové mikrokuličky, co ukazuje, že výsledné mikrobubliny jsou z velké části dostatečné pro vytvoření silného a dlouho trvajícího zvýšení ozvěnového signálu.

Claims

1. Zmrazená suspenze bublin plynu imobilizovaná ve zmrazeném vodném nosném prostředí, vyznačující se t í b, že nosné prostředí obsahující bubliny plynu a obvyklé přísady je fyziologicky přijatelnou nosnou látkou, imobilizované bubliny plynu jsou mikrobubliny vázané nestálým obalem nebo hmotnou membránou, suspenze, pokud je v kapalné formě,,je injikovatelná a vhodná jako kontrastní prostředek při ultrazvukovém zobrazování krevního řečiště a tkáně žijících jedinců.

2. Suspenze podle nároku 1, vyznačuj icí se t í m, že teplota zmrazeného prostředí je od -1 do -196 °C, výhodně od -10 do -76 °C.

3. Suspenze podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že velikost většiny mikrobublin je pod 50 μια, výhodné pod 10 μη.

4. Suspenze podle nároku 3,vyznačuj icí se t í m, že velikost mikrobublin je od 2 do 9 μη, výhodně od 3 do 5 μιη.

5. Suspenze podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ιοί se tím, že zahrnuje přísady, jako povrchově aktivní látky, lamelární fosfolipidy ve formé jednomolekulární membránové vrstvy nebo vícemolekulární membránové vrstvy.

6. Suspenze podle nároku 5, vyznačuj ící se t í m, že lamelární fosfolipidy jsou ve formě unilamělárního nebo multilamelárniho liposomu.

7. Suspenze podle nároku 5,vyznačuj ící se t í m, že lamelárními fosfolipidy jsou nasycené fosfolipidy. :

í

8. Suspenze podle nároku 6 nebo 7,vyznačuj ιοί se t í m, že fosfolipidy jsou zvoleny z kyseliny fósfatidové, fosfatidylcholinu, fosfatidylethanolaminu, fosfatidylserinu, fosfatidylglycerolu, fosfatidylinositolu,kardiolipinu, sfingomyelinu nebo jejich směsí.

9. Suspenze podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj í cí se tím, že přísady zahrnují látky, které jsou zvoleny ze souboru, jenž zahrnuje dicetylfosfát, cholesterol, ergosterol, fytosterol, sitosterol, lanosterol, tokoferol, propylgallát, askrobylpalmitát a butylovaný hydroxytoluen.

10. Suspenze podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že přísady zahrnují sorbitol nebo ' neiontovépovrchově'aktivní látky_L jako .kopolymety pplyoxyethylenu a polyoxypropylenu.

AfcJ.

11. Suspenze podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že přísady zahrnují přípravky zvyšující viskozitu a/nebo stabilizátory, které jsou zvoleny ze lineárních'a zesítěných polysacharidů nebo oligosacharidů, cukrů, hydrofilních polymerů a jodovaných sloučenin, kde hmotnostní poměr k povrchově aktivním látkám je od přibližně 1:5 do 100:1,

12. Suspenze podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že přísady dále zahrnují až 50 % hmotnostních nelaminárních povrchově aktivních látek, které jsou zvoleny z mastných kyselin, esterů a etherů mastných kyselin a alkoholů s polyoly.

13. Suspenze nároku 12,vyznačuj ící tím, že polyoly jsou polyalkylenglykoly, polyalkylenované cukry a jiné cukry a polyalkylenovaný glycerol.

14. Suspenze podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje 10⁷ až 10⁸ mikrobublín na mililitr nebo 10⁹ až 10¹⁰ mikrobublín na mililitr.

· ^ v,? ·

15. Suspenze podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, membrána je zhotovena ze syntetického nebo přírodního polymeru nebo proteinu.

16. Suspenze podle nároku 15,vyznačuj ící se t i m, že polymer je zvolen z polysacharidů, polyaminokyselin a jejich esterů, polylaktidů a polyglykolidů a jejich kopolymerů, kopolymerů laktidů a laktonů, polypeptidů, poly(ortho)esterů, polydioxanonu, poly-p-aminoketonů, polyfosfazenů, polyanhydridů, polyalkyl(kyan)akrylátů, polyolefinů, polyakrylátů, polyakrylonitrilú, nehydrolyzovatelných polyesterů, polyurethanů a polymočovin, derivátů poly(kyseliny glutamové) nebo póly(kyseliny asparagové) a jejich kopolymerů s jinými aminokyselinami.

17. Suspenze podle nároku 15,vyznačuj ící , se t í m, že proteinem je albumin.

18. Suspenze podle nároku 1,vyznačuj ící se t i m, že plyn je zvolen z plynů obsahujících halogen, vzduchu, kyslíku, dusíku, oxidu uhličitého nebo jejich směsí.

- - -

19. Suspenze podle nároku. 18,..v y. z n. a č ,uj i c í se t í m, že plyn obsahující halogen· je zvolen ze souboru sestávajícího z SF_g, CF₄, C₂F_g, C₂F₃, C₃F_g, C₃F₈, C₄F_g,

C₄F₈, C₄F_1o, C₅F_1q, C₅F₁₂ a jejich směsí.

20. Způsob skladování suspenzí mikrobublín podle nároků 1 až 19,vyznačující se tím, že zahrnuje tyto stupně:

a) umístění kapalné suspenze do chladicího zařízení,

b) imobilizaci mikrobublin ochlazením na teplotu pod teplotou zmrazení suspenze, výhodně na teplotu od^-l do -196 °C a výhodněji na teplotu od -10 do -76 °C a

c) udržování mrazících podmínek po prodloužené časové období.

21. Způsob podle nároku 20,vyznačující se t í i, že zmrazená suspenze se udržuje v atmosféře inertního plynu nebo směsi plynů, z nichž alespoň jeden je plynem enkapsulovaným v mikrobublinách.

~

22. Způsob podlenároku20, v^ry zn a č u j i c i________ — - — s-e - t í”m;že mikrobubliny obsahují plyn nebo směs plynů, z nichž alespoň jeden má teplotu varu pod -18 °C.

23. Způsob podle nároku 20, vyznačuj ící se t i m, že před svým použitím se suspenze rozmrazí za teploty místnosti během časového období.

24. Injikovatelné suspenze podle nároků 1 až 19, k použití při ultrazvukovém zobrazování orgánů a tkání.

25. Použití injikovatelných suspenzí podle nároků 1 až 19, k přípravě ultrazvukových echografických kontrastních prostředků.