CZ20001897A3

CZ20001897A3 - Způsob výroby N2-(1(S)-karboxy-3-fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolinu

Info

Publication number: CZ20001897A3
Application number: CZ20001897A
Authority: CZ
Inventors: Tadashi Moroshima; Yoshifumi Yanagida; Yoshihide Fuse; Yasuyoshi Ueda
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 1998-09-22
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2000-10-11
Also published as: IL136271A0; SI20271A; CN1286695A; KR20010032238A; JP4307733B2; ATE346086T1; PL340685A1; RU2220152C2; HUP0100831A3; CN1200946C; HUP0100831A2; EP1035131B1; CZ292494B6; WO2000017229A1; EP1035131A1; EP1035131A4; DE69934084D1; ES2277446T3; US6271393B1; CA2311407A1

Description

123 00 PRAHA 2, Bá&ova 2

Způsob výroby Ν²-(1(S)-karboxy-3-fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolinu

Oblast techniky

Předmětný vynález se týká způsobu výroby vysoce kvalitního Ν²-(1(S)-karboxy-3-fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolinu vzorce (2) (v tomto popisu dále označovaného také jako lisinopril(2)) ve vysokých výtěžcích, přičemž tento způsob je zároveň výhodný z ekonomického hlediska při provedení v průmyslovém měřítku.

Ν²-(1(S)-karboxy-3-fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin (2) (lisinopril) je sloučenina, která je velmi užitečná jako prostředek proti vysokému krevnímu tlaku.

(2)

Dosavadní stav techniky

Lisinopril (2) je možné snadno připravit hydrolýzou Ν²- (1 (S) -alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl) -N^s-trifluoracetyl-Llysyl-L-prolinu obecného vzorce (1):

e β

(1) kde R je alkylová skupina, pomocí zásady v přítomnosti vody a následnou neutralizací všech zásaditých složek přítomných v hydrolyzační směsi pomocí kyseliny. Avšak aby bylo možné izolovat lisinopril (2) z reakční směsi,, je v tomto případě nutné oddělit lisinopril (2) od solí (tj. soli kyseliny trifluoroctové vzniklé při hydrolýze a soli vytvořené při neutralizaci použité zásady kyselinou), které jsou ve směsi přítomny ve velkých množstvích.

Jedním z takových postupů je například postup popsaný v EP 168769 nebo v J. Org. Chem. 1988, 53, 836-844, který zahrnuje hydrolýzu N²-(1(S)-ethoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-Ν^δtrifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu hydroxidem sodným, okyselení reakční směsi kyselinou chlorovodíkovou a odstranění všech vzniklých sloučenin, které jsou ve směsi přítomné spolu s produktem hydrolýzy, jako je chlorid sodný, kyselina trifluoroctová a/nebo její sodná sůl pomocí kolony naplněné měničem iontů, zahuštění eluátu obsahujícího organickou zásadu (přičemž elučnim činidlem při tomto postupu je buď vodný amoniak nebo směs pyridin-voda), upravení pH pomocí kyseliny chlorovodíkové na hodnotu odpovídající izoelektrickému bodu a izolaci lisinoprilu (2) krystalizací z konečného vodněethanolového roztoku obsahujícího sůl aminu vytvořenou při ···· předchozí úpravě pH roztoku na hodnotu odpovídající izoelektrickému bodu.

Shora popsaný postup však není komplikovaný pouze svým provedením, ale rovněž nízkou produktivitou, protože při nezbytném odstranění velkého množství solí výměnou iontů je získán zředěný eluát, takže vedle potřebné výbavy pro práci ve velkém měřítku se spotřebuje velké množství energie při dlouhém ohřevu velkého množství eluátu při jeho zahušťování. Dále množství odpadní vody, kterou je nutno čistit, včetně odpadní vody vzniklé při regeneraci kolon pro výměnu iontů, je enormně vysoké. Dále se mohou při použití kolon pro výměnu iontů vyskytnout vážné problémy, konkrétně může snadno dojít k růstu různých mikroorganismů uvnitř kolon. Vzhledem k těmto nevýhodám není možné shora popsaný postup označit z hlediska průmyslové výroby jako výhodný.

Podle jiného příkladu popsaného ve zveřejněné japonské patentové přihlášce Kokai Hei-08-253497 se například N²- (1 (S) -ethoxykarbonyl-3-fenylpropyl) -N⁶-trifluoracetyl-Llysyl-L-prolin hydrolyzuje tetrabutylamoniumhydroxidem, který je organickou zásadou. Následně je hydrolyzační směs neutralizována kyselinou trifluoroctovou, což je organická kyselina, takže může dojít ke vzniku organické soli, konkrétně tetrabutylamoniumtrifluoracetátu, jako jediné solné složky a lisinopril (2) je ze směsi izolován krystalizací z vodněethanolové směsi při pH izoelektrického bodu, přičemž je v této směsi přítomno celé množství vzniklé organické soli.

Avšak ani tento právě popsaný příklad není možné označit jako výhodný z hlediska hospodárnosti, bezpečnosti a průmyslové praxe, a to kvůli použití speciálních činidel jako je tetrabutylamoniumhydroxid a kyselina trifluoroctová.

Proto lze říci, že dosud není znám jednoduchý, účinný a průmyslově výhodný způsob oddělení Ν²-(1(S)-karboxy-3fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolinu (2) od výše uvedené(ých) soli (í) .

Předmětný vynález popisuje jednoduchý, účinný a průmyslově výhodný způsob oddělení lisinoprilu (2) a solí vzniklých při hydrolýze Ν²- (1(S)-alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-N^strifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu a následné neutralizaci reakční směsi.

Podstata vynálezu

Nejprve byla zkoumána použitelnost postupu, který zahrnoval hydrolýzu Ν²-(1(S)-alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-N^etrifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu pomocí anorganické zásady, jakou je hydroxid sodný a neutralizaci reakční směsi anorganickou kyselinou, jakou je kyselina chlorovodíková, nebo organickou kyselinou, jakou je kyselina trifluoroctová, za vzniku anorganické soli, jakou je chlorid sodný, nebo soli organické kyseliny, jakou je sodná sůl kyseliny trifluoroctové a izolaci Ν²-(1(S)-karboxy-3-fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolinu *

krystalizaci z rozpouštědla jako je voda nebo ethanol, přičemž velké množství výše uvedených solí zůstalo rozpuštěno v tomto rozpouštědle. Výsledkem bylo zjištění, že jak výtěžek izolovaných krystalů lisinoprilu (2), tak míra odstranění solí byly nedostatečné. Bylo rovněž zjištěno, že přítomnost velkého množství takových solí zpomaluje tvorbu krystalizačních center a růst krystalů lisinoprilu (2) a způsobuje zhoršení vlastností krystalů, díky čemuž je snížena možnost jejich odfiltrování ze směsi. Takto bylo tedy zjištěno, že tento postup má svá omezení.

··

Avšak-v případě, kdy byla při krystalizaci lisinoprilu (2) snížena koncentrace soli, byl pozorován sklon k vylepšení výše popsaných aspektů. Přepokládalo se, že předběžné snížení koncentrace soli je nezbytné a napomáhá izolaci·lisinoprilu (2) pomocí krystalizace. Výsledkem dalšího, z tohoto hlediska prováděného intenzivního výzkumu byl závěr, že z hlediska eliminace dvou různých druhů solí, konkrétně soli organické kyseliny vzniklé z kyseliny trifluoroctové ‘Uvolňující se při hydrolýze a anorganické zásady použité pro hydrolýzu a anorganické soli vzniklé při neutralizaci z anorganické zásady a použité anorganické kyseliny, je potřeba'pro každou sůl vyvinout optimální postup oddělení podle takových vlastností jako je rozpustnost v daném rozpouštědle a interakce s lisinoprilem (2).

Předmětný vynález se tedy týká způsobu výroby N⁴-(1(S)-karboxy-3-fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolinu vzorce (2):

(2) z N²- (1 (S) -alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl) -N⁵-triíluoracetyl-Llysyl-L-prolinu obecného vzorce (1):

(1) ve kterém R je alkylová skupina, který zahrnuje:

první stupeň: podrobení N²- (1(S)-alkoxykarbonyl-3fenylpropyl)-N^s-trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu (1) alkalické hydrolýze v systému rozpouštědel, který je vybrán ze skupiny zahrnující směsné roztoky skládající se z vody a hydrofilního organického rozpouštědla a vodu, pomocí anorganické zásady, jejíž množství je n molárních ekvivalentů (n > 3) na mol výše uvedené sloučeniny (1), druhý stupeň: neutralizace produktu hydrolýzy anorganickou kyselinou jejíž množství je od (n-1) do n molárních ekvivalentů (n > 3) a oddělení a izolace anorganické soli vytvořené v reakční směsi ze shora uvedené anorganické zásady a anorganické kyseliny vysrážením ze systému rozpouštědel vhodného pro snížení rozpustnosti anorganické soli, přičemž uvedený systém rozpouštědel je vybrán ze skupiny zahrnující hydrofilní organické rozpouštědlo, směsné rozpouštědlo vytvořené z vody a hydrofilního organického rozpouštědla a vodu a třetí stupeň: krystalizace lisinoprilu (2), který se nachází ve směsi, ze které byly odstraněny anorganické soli, při jeho izoelektrickém bodu, přičemž uvedený systém rozpouštědel je vybrán ze skupiny zahrnující hydrofilní organické rozpouštědlo, směsné rozpouštědlo vytvořené z vody a hydrofilního organického rozpouštědla a vodu, čímž dojde k izolaci lisinoprilu (2) ve formě krystalů, zatímco soli, jež jsou tvořeny hlavně organickou solí odvozenou od kyseliny trifluoroctové, zůstávají rozpuštěné v matečném louhu.

Postup podle tohoto vynálezu tedy umožňuje snadno a účinně oddělit a izolovat lisinopril (2) se sníženým obsahem soli ze směsi obsahující lisinopril (2) a sůl.

V prvním stupni je veškerý N²-(1(S)-alkoxykarbonyl-3fenylpropyl)-N⁶-trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolin (1) hydroiyzován pomocí n molárních ekvivalentů (n > 3) anorganické zásady v sytému rozpouštědel vybraného ze skupiny zahrnující směsné rozpouštědlo vytvořené z vody a hydrofilního organického rozpouštědla a vodu.

V obecném vzorci (1) :

(1) (kde R je alkylová skupina), který představuje N-(l(S)-alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl)N°-trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolin, kde

R je skupina hydrolvzovatelná za alkalických podmínek, výhodně alkylová skupina, výhodněji alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, nejvýhodněji ethylová skupina.

Používaný N²-(1(S)-alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-Ν^δtrifluoracetyl-L-lysyl-L-prolin (1) je možné připravit postupy ··· » · popsanými např. ve zveřejněné japonské patentové přihlášce Kokai Hei-01-254651, ve zveřejněné japonské patentové přihlášce Kokai Hei-05-201882, v EP 168769 nebo v J. Org. Chem., 1988, 5.3, 836-844.

Skupina anorganických zásad používaných pro hydrolýzu N²- (1 (S) -alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl) -N^s-trifluoracetyl-Llysyl-L-prolinu zahrnuje mimo jiné. hydroxidy a uhličitany alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin. Jako konkrétní příklady takových zásad je, mimo jiné, možné uvést hydroxidy alkalických kovů jako je hydroxid sodný a hydroxid draselný; uhličitany alkalických kovů jako je uhličitan sodný a uhličitan draselný; a hydroxidy kovů alkalických zemin jako je hydroxid hořečnatý a hydroxid vápenatý. Je možné použít i další anorganické zásady, mezi nimiž se výhodně používají zásadité sodné a zásadité draselné sloučeniny. Z praktického hlediska se tyto zásady výhodně používají ve formě vodných roztoků. Obecně výhodné je použití těchto zásad ve formě vodných roztoků okoncentraci od 5 do 50 hmotnostních procent, výhodně od 20 do 48 hmotnostních procent. Uvedené zásady je možné používat samostatně nebo v kombinaci dvou nebo více těchto zásad. První stupeň tak může být výhodně prováděn např. pomocí jednoho molárního ekvivalentu hydrogenuhličitanu sodného a (n-1) molárních ekvivalentů (n > 3) hydroxidu sodného.

Pro hydrolýzu N²-(1(S)-alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-N⁶trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu (1) je třeba použít n molárních ekvivalentů anorganické zásady. Obecně není množství použité zásady menší než 3 molární ekvivalenty (n > 3) , vztaženo na N²-(1(S)-alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-N⁶trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolin (1). Tuto anorganickou zásadu • ···

je možné do směsi přidávat najednou na začátku reakce nebo postupně nebo po částech, takže hodnotu pH během hydrolýzy je možné udržovat na vybrané hodnotě nebo skokově měnit. Hodnota pH konečné reakční směsi je výhodně 12 nebo více.

I když je obecně možné provádět hydrolýzu ve vodném systému, je rovněž možné provádět hydrolýzu ve směsném roztoku, který se skládá z vody a hydrofilního organického rozpouštědla, které obsahuje další organická rozpouštědla v množství, které nemá žádný nepříznivý vliv. Hydrofilní organické rozpouštědlo, které má obsahovat roztok není nijak omezeno a obecně je možné uvést jednosytné alkoholy obsahující 1 až. 4 atomy uhlíku jako je methanol, ethanol, propanol, isopropanol a ťerc..butylalkohol, přičemž v tomto případě je výhodné aby substituent R v obecném vzorci (1) představujícím N²- (1 (S) -alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl) -N⁶-trifluoracetyl-Llysyl-L-prolin je alkylová skupina shodná s alkylovou skupinou výše uvedeného alkoholu. Nej výhodněji je možné použít ethanol, přičemž v tomto případě je výhodné aby R v obecném vzorci (1) byl-ethylová skupina. Pokud je používáno směsné rozpouštědlo skládající se z vody a hydrofilního organického rozpouštědla, zejména směsné rozpouštědlo skládající se z vody a výše uvedeného alkoholu, je směšovací poměr vyjádřený v hmotnostních dílech jednotlivých složek obecně 1:1 až 1:99, výhodně 1:1· až 1:9, výhodněji 1:1 až 1:7.

Pokud se týče pracovní teploty během hydrolyzačního stupně, není vyžadována zvlášť vysoká teplota. V praxi je možné tuto reakci provádět obecně při teplotě nepřesahující 70 °C, výhodně při teplotě nepřesahující 60 °C, při které rozpouštědlo nebude v pevném stavu, výhodně při teplotě od 0 do 50 °C, výhodněji při teplotě přibližně 30 °C.

• φ φ φ φ φ • φ

Ve druhém stupni je reakční směs z prvního stupně neutralizována anorganickou kyselinou, jejíž množství se pohybuje od (n-1) do n molárních ekvivalentů (n > 3) , a anorganická sůl vzniklá ve výsledné směsi ze shora uvedené anorganické zásady a anorganické kyseliny je odstraněna vysrážením ze systému rozpouštědel, který je vhodný pro snížení rozpustnosti anorganické soli tím, že je vybrán ze skupiny zahrnující hydrofilní organické rozpouštědlo, směsné rozpouštědlo tvořené vodou a hydrofilním organickým rozpouštědlem a vodu.

Základní množství anorganické kyseliny pro neutralizaci reakční směsi je (n-1) molární ekvivalent, vztaženo na množství (n molárních ekvivalentů) anorganické zásady použité v prvním stupni pro hydrolýzu N²-(1(S)-alkoxykarbonyl-3fenylpropyl)-N⁵-trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu. Důvodem proč je používáno o jeden molární ekvivalent anorganické kyseliny méně je skutečnost, že jeden mol anorganické zásady je spotřebován při hydrolýze trifluoracetylové skupiny N²—(1(S)— alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl) -N⁶-trif luoracetyl-L-lysyl-Lprolinu (1), přičemž vznikající kyselina trifluoroctová a anorganická zásada spolu vytvářejí sůl organické kyseliny. Proto pokud se použije anorganická kyselina v uvedeném množství, dojde vedle již vzniklého jednoho molárního ekvivalentu organické soli, který byl vytvořen z kyseliny trifluoroctové a anorganické zásady, ke vzniku (n-1) molárního ekvivalentu anorganické soli, čímž je zneutralizováno veškeré množství anorganické zásadité složky za tvorby uvedených solí. V tomto případě je hodnota pH výsledné směsi v těsném okolí izoelektrického bodu lisinoprilu (2), přičemž tato hodnota pH je obecně 5,2 ± 0,4.

’ · -i·' '

- tr

I když neexistuje žádné omezení pro používanou anorganickou kyselinu, z praktického hlediska je výhodné použití silné kyseliny. To je důvodem proč mezi ostatními kyselinami je výhodné použít kyselinu chlorovodíkovou a kyselinu sírovou, přičemž zvlášť výhodné je použití kyseliny chlorovodíkové. Tyto kyseliny je možné použít samostatně nebo ve směsi dvou nebo více těchto kyselin. I když je možné použít tyto kyseliny v jejich neředěné formě, je možné je použít i ve formě roztoků připravených zředěním vodným médiem.

Pokud je-používána kyselina, která je silnější než kyselina trifluoroctová, výhodně kyselina chlorovodíková, může být okyselování výhodně provedeno do míry přesahující uvedený izoelektrický bod a množství použité anorganické kyseliny, vztažené na množství použité anorganické zásady (n molárních ekvivalentů), se pohybuje v rozmezí od více než (n-1) do n molárních ekvivalentů, přičemž může vzniknout stejné množství molárních ekvivalentů anorganické soli jako je množství použité anorganické kyseliny. V tomto případě kyselina trifluoroctová, která se neúčastní reakce s anorganickou zásaditou složkou, při které vzniká sůl, snižuje pH reakční směsi pod hodnotu pH odpovídající izoelektrickému bodu lisinoprilu (2).

Naopak, pokud je používána anorganická kyselina v množství mimo rozsah od ne méně než (n-1) molární ekvivalent do n molárních ekvivalentů nebo pokud je používána kyselina slabší než kyselina trifluoroctová v množství větším než (n-1) molární ekvivalent, ale ne vyšším než n molárních ekvivalentů, nedojde v tomto stupni k úplnému odstranění anorganické zásadité složky nebo anorganické kyselé složky, ale naopak tato složka zůstává částečně přítomná ve směsi a v dalším stupni, kterým je izolace lisinoprilu (2) krystalizací, je ··.···::·· : · · .

~ : :: :

” ··* nezbytná další neutralizace, která může způsobit nežádoucí potíže, které mohou spočívat např. v tom, že sůl vytvořená v tomto případě může znečistit krystaly produktu nebo může zhoršit krystalizovatelnost požadovaného produktu.

Doba přidávání veškerého množství anorganické kyseliny ve shora popsaném postupu není nijak omezena, ale obecně není kratší než 15 minut, obvykle není kratší než 20 minut, výhodně není kratší než 30 minut. Z hlediska produktivity apod. není tato doba obvykle delší než 20 hodin, obvykle není delší než 10 hodin, výhodně není delší než 5 hodin.

Co se týče systému rozpouštědel vhodného pro snížení rozpustnosti anorganické soli a vyvolání vysrážení této soli vzniklé v reakční směsi při její neutralizaci, je účinné použít hydrofílní organické rozpouštědlo, jakožto rozpouštědlo, ve kterém je tato sůl málo. rozpustná, a je rovněž výhodné vytvoření směsného systému rozpouštědel složeného z hydrofilního organického rozpouštědla a vody nebo dále záměna tohoto média za hydrofílní organické rozpouštědlo. Skupina organických rozpouštědel vybraných z tohoto hlediska není nijak omezena, ale zahrnuje zejména mimo jiné jednosytné alkoholy obsahující 1 až 4 atomy uhlíku jako je methanol, ethanol, propanol, isopropanol a terc.-butylalkohol; aceton, tetrahydrofuran, acetonitril apod. Je možné rovněž použít ostatní hydrofílní organická rozpouštědla. Výhodnými rozpouštědly jsou zejména jednosytné alkoholy obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a z důvodů minimalizace možných nepříznivých účinků na lidský organismus v případě, že by výsledný produkt obsahoval stopy rozpouštědla, je zvlášť výhodné použít ethanol. Uvedená rozpouštědla je možné použít samotná nebo ve vzájemné kombinaci dvou nebo více těchto rozpouštědel. Některé anorganické soli je rovněž možné odstranit vysrážením z vody.

*1^ ' · «

Množství hydrofilního rozpouštědla používaného pro shora popsaný postup není možné specifikovat, protože je závislé mimo jiné na druhu hydrofilního organického rozpouštědla a na anorganické soli, která má být odstraněna. Jako příklad je možné uvést, že pokud se použije organické rozpouštědlo jakožto rozpouštědlo, ve kterém je anorganická sůl málo rozpustná, vzrůstá procentický podíl odstraněné anorganické soli se vzrůstajícím procentickým podílem tohoto organického rozpouštědla. Z tohoto hlediska je hmotnostní poměr mezi vodou a hydrofilním organickým rozpouštědlem obecně od 4:1 do 1:99, výhodně od 1:1 do 1:99, výhodněji od 3:7 do 1:99. Některé anorganické soli je rovněž možné odstranit vysrážením z vody. Jako příklady takových solí je mimo jiné možné uvést síran draselný nebo síran vápenatý. Druh anorganické soli je možné zvolit na základě rozpustnosti ve vodě a organických rozpouštědlečh s odkazem na monografie a jiné publikace týkající se dané oblasti techniky nebo na základě jednoduchých pokusů. Zvolenou anorganickou sůl je možné vytvořit zvolením vhodné kombinace anorganické zásady a anorganické kyseliny.

Zatímco vytvořená anorganická sůl se sráží .rychle, lisinopril (2) vyžaduje dlouhou dobu pro vytvoření krystalizačních center a růst krystalů, takže je možné přednostně vysrážet anorganickou sůl pro její oddělení a odstranění z reakční směsi. Dále'je výhodné volit vhodnější podmínky; např. je výhodné udržovat teplotu na nízké úrovni, např. v rozmezí od 0 do 30 °C.

Ve shora uvedeném postupu je výhodnější a účinnější použít pro neutralizaci anorganickou kyselinu, která je silnější než kyselina trifluoroctová v množství uvnitř intervalu od více než (n-1) molární ekvivalent do n molárních ekvivalentů, vztaženo na anorganickou zásadu (n molárních ekvivalentů),

·· ;

9* •999 ·« ·»9 »· čímž se dosáhne takového okyselení směsi, při kterém je překročena hodnota pH odpovídající izoelektrickému bodu. Konkrétně v tomto rozsahu použití anorganické kyseliny ve zvýšeném množství zlepšuje uvedený účinek a použití stejného množství molárních ekvivalentů (n molárních ekvivalentů) anorganické kyseliny jako je množství anorganické zásady je nejvýhodnější. Tímto způsobem je možné přednostně vysrážet anorganickou sůl a následné ji oddělit filtrací, což je výsledek snížení rychlosti tvorby krystalizačních center a růstu krystalů lisinoprilu (2) a zlepšení jeho rozpustnosti, čímž není zároveň umožněno žádné nebo téměř žádné vysrážení lisinoprilu (2).

Sraženinu anorganické soli, která se v tomto stupni vytvoří z výsledné směsi, je možné oddělit/odstranit snadným a jednoduchým způsobem pomocí běžných separačních technik jako je odstředivé oddělování nebo tlaková filtrace.

Ve třetím kroku je lisinopril (2) obsažený ve výsledné reakční směsi po odstranění anorganické soli ponechán krystalizovat z hydrofilního organického rozpouštědla, směsného rozpouštědla složeného z vody a organického rozpouštědla, nebo z vody při pH odpovídajícímu jeho izoelektrickému bodu, čímž dochází k izolování krystalů lisinoprilu (2), zatímco soli, které jsou většinou tvořeny organickými solemi odvozenými od kyseliny trifluoroctové, zůstávají rozpuštěné v matečném louhu.

Pro krystalizaci lisinoprilu (2), který je obsažen ve směsi získané po odstranění anorganické soli ve druhém stupni, za podmínek odpovídajících izoelektrickému bodu není obecně třeba žádných zvláštních úprav, pokud se tato směs již nachází v izoelektrickém bodu při neutralizaci v předchozím stupni, což je výsledkem použití (n-1) molárního ekvivalentu

9 9 4 · · · ··«· • · · 9 · 9 9 9 9 · · · ··· · · · · · ·· · • · ···· «« c· ·· ·· anorganické kyseliny. Pokud je uvedená směs okyselena natolik, že je překročena hodnota odpovídající izoelektrickému bodu, což je výslédek použití anorganické kyseliny v množství od více než (n-1) molární ekvivalentu do n molárních ekvivalentů, je třeba pomocí přiměřeného množství zásady dosáhnout izoelektrického bodu, čímž se zvýší procentický podíl zkrystalizovaného lisinoprilu (2). Při tomto postupu se obecně používá zásada v množství [(počet použitých molárních ekvivalentů anorganické kyseliny) - (n-1)] molárních ekvivalentů. Neutrální sůl, která se tvoří v tomto případě je, jak bylo uvedeno výše, tvořena převážně organickou solí odvozenou kyseliny trifluoroctové a je tak možné způsobit účinnou krystalizaci lisinoprilu (2) a následně jeho účinné oddělení a izolaci, zatímco výše uvedená sůl zůstává v rozpuštěném stavu v rozpouštědle, ze kterého krystalizuje lisinopril (2).

Skupina zásad používaných pro úpravu pH směsi na hodnotu odpovídající izoelektrickému bodu není nijak zvlášť omezena, ale uvedená zásada může být vybrána ze skupiny anorganických zásad, která je shodná se skupinou zásad pro použití v prvním hydrolyzačním stupni. Dále jsou pro toto použití vhodné například i hydrogenuhličitany alkalických kovů jako je hydrogenuhličitan sodný a hydrogenuhličitan draselný a uhličitany kovů alkalických zemin jako je uhličitan hořečnatý a uhličitan vápenatý. Dále je možné rovněž použít vodný amoniak a organické zásady jako jsou například aminy jako triethylamin a pyridin. Avšak výhodně se používají zásadité sloučeniny sodíku a zásadité sloučeniny draslíku. Uvedené sloučeniny je možné použít samostatně nebo v kombinaci dvou či více těchto sloučenin.

·· ···· »· ·» ·.· ··

Rozpouštědlem používaným pro krystalizaci lisinoprilu (2), které se používá v tomto stupni je například voda, hydrofilní organické rozpouštědlo nebo jejich směs. Z hlediska zlepšení odstranitelnosti organické soli vzniklé z kyseliny trifluoroctové a uvedené zásady a krystalizovatelnosti lisinoprilu (2) je zvlášť výhodné použití směsných rozpouštědel složených z vody a hydrofilního organického rozpouštědla. Uvedené používané hydrofilní rozpouštědlo je možné nahradit hydrofilním rozpouštědlem vybraným ze stejné skupiny hydrofilních organických rozpouštědel jako ve druhém stupni. Avšak použití stejného systému rozpouštědel jako . v druhém stupni je výhodné, protože je takové použití jednoduché a hospodárné. Je rovněž možné a výhodné nahradit hydrofilní organické rozpouštědlo vodou.

I když není možné konkrétně specifikovat koncentraci lisinoprilu (2) pro jeho krystalizaci, protože tato koncentrace je závislá na pracovní teplotě, druhu použité zásady a jejím množství, složení krystalizačního rozpouštědla a na koncentraci soli (i) přítomných ve směsi, přičemž pro další zlepšení výtěžku krystalizace v krystalizačním stupni je výhodné, aby koncentrace roztoku byla co možná nej vyšší. Avšak z hlediska zamezení kontaminace krystalů solí(emi) je rovněž důležité, aby koncentrace roztoku nebyla příliš vysoká. Při praktickém provedení tohoto vynálezu je-dolní hranice koncentrace výhodně vyšší než 5 procent, výhodněji vyšší než 10 procent, zatímco horní hraníce koncentrace je výhodně maximálně 40 procent, výhodněji maximálně 30 procent. Obvykle je možné krystalizaci provádět při koncentraci od přibližně 10 do 25 procent.

Z hlediska podpory dobrého růstu krystalů je důležitá také koncentrace solí, které jsou při krystalizaci lisinoprilu (2)

přítomné ve směsi a které obsahují hlavně organickou sůl odvozenou od kyseliny trifluoroctové. Ačkoli tato koncentrace závisí, mimo jiné, na pracovní koncentraci, teplotě a postupu stejně jako na typu neutrálních solí přítomných ve směsi a skutečně ji nelze obecně specifikovat, neměla by tato koncentrace solí v obecném případě přesáhnout 15 hmotnostních procent, výhodně by neměla přesáhnout 10 hmotnostních procent, výhodněji by neměla přesáhnout 8 hmotnostních procent.

Teplota, při které dochází ke krystalizací lisinoprilu (2) nemůže být konkrétně specifikována, protože je závislá na složení krystalizačního rozpouštědla, daném postupu a jiných faktorech. Avšak v praxi se třetí stupeň provádí při teplotě, která nepřesahuje teplotu varu krystalizačního rozpouštědla, ale při které zároveň nedochází k tuhnutí tohoto rozpouštědla.

I když není pro uvedený postup vyžadována zvlášť vysoká teplota, zvýšení teploty během krystalizace vede ke zvýšení rychlosti tvorby krystalizačních center a růstu krystalů lisinoprilu (2). Z tohoto hlediska je postup výhodně prováděn v teplotním rozmezí od 40 do 70 °C, výhodněji při teplotě přibližně 50 °C. Výtěžek krystalů je možné zvýšit ochlazením směsi na konci krystalizace na teplotu nepřevyšující 20 °C, výhodně nepřevyšující 10 °C.

Získané krystaly lisinoprilu (2) je možné snadno izolovat jakýmkoli běžným postupem pro oddělení pevné látky od kapaliny, jako je odstředivé oddělování nebo tlaková filtrace, bez jakéhokoli zvláštního postupu. Tímto způsobem je tedy možné s vysokou účinností získat ve vysokém výtěžku krystaly o vysoké kvalitě.

Praktické provedení tohoto vynálezu při použití N²-(1(S)ethoxykarbonyl-3-fenylpropyl) -N⁶-trif luoracetyl-L-lysyl-Lprolinu jakožto výchozí sloučeniny, zásadité sloučeniny sodíku jakožto anorganické zásady a kyseliny chlorovodíkové jakožto anorganické kyseliny probíhá následujícím postupem:

V prvním stupni probíhá hydrolýza ve vodě nebo ve směsi vody a ethanolu, při které se používá n molárních ekvivalentů (n > 3) zásadité sloučeniny sodíku jakožto anorganické zásady;

ve druhém stupni je reakční směs neutralizována pomocí n molárních ekvivalentů kyseliny chlorovodíkové jakožto anorganické kyseliny, přičemž vzniklý chlorid sodný je účinně vysrážen z ethanolu nebo směsi ethanolu s vodou a odstraněn filtrací; a ve třetím stupni je do směsi po odstranění chloridu sodného přidán jeden molární ekvivalent zásadité sloučeniny ’ sodíku a, zatímco vzniklý trifluoracetát sodný zůstává rozpuštěný ve výsledné směsi ethanolu a vody, dochází k účinné krystalizaci lisinoprilu (2) a následné izolaci vzniklých krystalů...

Při dalším výhodném provedení tohoto vynálezu, při kterém se jako anorganická zásada používá např. zásaditá sloučenina draslíku a jako anorganická kyselina se používá kyselina sírová postup probíhá takto:

V prvním stupni probíhá hydrolýza ve vodě nebo ve směsi vody a ethanolu, při které se používá n molárních ekvivalentů (n > 3) zásadité sloučeniny.draslíku jakožto anorganické zásady;

ve druhém stupni je reakční směs neutralizována n-1 molárním ekvivalentem kyseliny sírové jakožto anorganické kyseliny, čímž dojde k upravení směsi do stavu odpovídajícímu izoelektrickému bodu lisinoprilu (2), přičemž vzniklý síran draselný je účinně vysrážen z vody nebo směsi vody a ethanolu odstraněn filtrací; a

• 999 ve třetím stupni dochází k účinné krystalizaci lisinoprilu (2) a následné izolaci vzniklých krystalů, zatímco vzniklý trifluoracetát draselný zůstává rozpuštěný ve výsledné směsi ethanolu a vody.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou zde uvedeny za účelem dalšího vysvětlení předmětného vynálezu aniž by omezovaly jeho rozsah.

Čistota byla zkoušena vysokotlakou kapalinovou chromatografii (HPLC) a vypočítávána metodou absolutní pracovní křivky. Obsah vody byl stanovován metodou Karl Fischer. Obsah chloridu sodného byl stanovován pomocí iontového chromatografu.

Při vysokotlaké kapalinové chromatografii (HPLC) byly používány následující podmínky:

Kolona: Capsule Pack UG-120® (4,6 mm x 25 cm; výrobek firmy Shiseido Co.)

Rozpouštědlo: 60 mM KH₂PO₄ (pH 2,8)/CH₃CN (90:10 objemových dílů)

Průtok: 1,0 mililitr/minuta

Teplota: 50 °C

Detekce: ultrafialovým zářením o vlnové délce 210 nanometrů

Příklad 1

32,0 gramů N²-(1(S)-ethoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-N⁶trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu bylo smícháno s 25,9 gramu vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentraci • · • ··· hmotnostních procent a směs byla přibližně 4 hodiny míchána pro proběhnutí hydrolýzy. Pro úpravu pH na hodnotu 2,8 ± 0,5 bylo k reakční směsi přidáno 20,1 gramu koncentrované kyseliny chlorovodíkové a výsledný roztok byl dvojnásobně naředěn ethanolem a následně zahuštěn na svůj původní objem.

Opakováním postupu zřeďování a následného zahušťování byl snížen obsah vody na 4 ± 2 hmotnostní procenta. K tomuto roztoku bylo přidáno takové množství ethanolu, aby koncentrace lisinoprilu (2) v roztoku byla 22 ± 2 hmotnostní procenta. Výsledná směs byla míchána jednu hodinu, vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta 30 mililitry ethanolu.

K výslednému filtrátu bylo přidáno 16,1 gramu 15 procentního vodného roztoku hydroxidu sodného (čímž bylo pH upraveno na hodnotu 5,8). Tento roztok byl zahřát na teplotu 45 °C, byly k němu přidány očkovací krystaly, směs byla míchána 3 hodiny, ochlazena během dvou hodin na teplotu 5 °C a míchána dalších 12 hodin. Vysrážené krystaly byly izolovány filtrací, promyty třemi 30 mililitrovými podíly obsahujícími 70 hmotnostních procent ethanolu předem vychlazenými na teplotu 5 °C. Získané krystaly byly sušeny ve vakuu při teplotě od 20 do 50 °C a tlaku od 0,133 do 4 kilopascalů (od 1 do -30 milimetrů rtuťového sloupce) a bylo získáno 22,7 až 23,5 gramu (85 až 88 %) dihydrátu lisinoprilu (2), jehož čistota byla alespoň 99 procent a který obsahoval 8,2 hmotnostního procenta vody a maximálně 0,1 hmotnostního procenta chloridu sodného.

Příklad 2

32,0 gramů N²-(1(S)-ethoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-N⁵trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu bylo smícháno s 25,9 gramu • · · · · · · · · · · ···· ·» »« ·« ·* vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentraci hmotnostních procent a směs byla přibližně 4 hodiny míchána pro proběhnutí hydrolýzy. Pro úpravu pH na hodnotu 5,2 ± 0,2 bylo k reakční směsi přidáno 13,9 gramu koncentrované kyseliny chlorovodíkové a výsledný roztok byl dvojnásobně naředěn ethanolem a následně zahuštěn na svůj původní objem.

Opakováním postupu zřeďování a následného zahušťování byl snížen obsah vody na 4 ± 2 hmotnostní procenta. K tomuto roztoku bylo přidáno takové množství ethanolu, aby koncentrace lisinoprilu (2) v roztoku byla 22 ±2 hmotnostní procenta. Výsledná směs byla míchána jednu hodinu, vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta 30 mililitry ethanolu.

K výslednému filtrátu bylo přidáno 15 gramů vody. Tento roztok byl zahřát na teplotu 45 °C, byly k němu přidány očkovací krystaly, směs.byla míchána 3 hodiny, ochlazena během dvou hodin na teplotu 5 °C a míchána dalších 12 hodin. Vysrážené krystaly byly izolovány filtrací, promyty třemi mililitrovými podíly obsahujícími 70 hmotnostních procent ethanolu předem vychlazenými na teplotu 5 °C. Získané krystaly byly sušeny ve vakuu při teplotě od 20 do 50 °C a tlaku od 0,133 do 4 kilopascalů (od 1 do 30 milimetrů rtuťového sloupce) a bylo získáno 22,7 až 23,5 gramu (85 až 88 %) dihydrátu lisinoprilu (2), jehož čistota byla alespoň 99 procent a který obsahoval 8,2 hmotnostního procenta vody a maximálně 0,1 hmotnostního procenta chloridu sodného.

Příklad 3

32,0 gramů Ν²-(1(S)-ethoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-N⁶trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu bylo smícháno s 25,9 gramu

vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentraci hmotnostních procent a směs byla přibližně 4 hodiny míchána pro proběhnutí hydrolýzy. Pro úpravu pH na hodnotu 2,8 ± 0,5 bylo k reakční směsi přidáno 20,1 gramu koncentrované kyseliny chlorovodíkové a výsledný roztok byl dvojnásobně naředěn ethanolem a následně zahuštěn na svůj původní objem.

Opakováním postupu zřeďování a následného zahušťování byl snížen obsah vody na 3 ± 2 hmotnostní procenta. K tomuto roztoku bylo přidáno 5,0 gramů vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 48 hmotnostních procent (takže hodnota pH byla upravena na 5,7) a dále takové množství ethanolu·, aby koncentrace, lisinoprilu (2) v roztoku byla 22 ± 2 hmotnostní procenta. Výsledná směs byla míchána jednu hodinu, vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta 30 mililitry ethanolu.

K výslednému filtrátu bylo přidáno 12 gramů vody. Tento roztok byl zahřát na teplotu 45 °C, byly k němu přidány očkovací krystaly, směs byla míchána 3 hodiny, ochlazena během dvou hodin na teplotu 5 °C a míchána dalších 12 hodin. Vysrážené krystaly byly izolovány filtrací, promyty třemi mililitrovými podíly obsahujícími 70 hmotnostních procent ethanolu předem vychlazenými na teplotu 5 °C. Získané krystaly byly sušeny ve vakuu při teplotě od 20 do 50 °C a tlaku od. 0,133 do 4 kilopascalů (od 1 do 30 milimetrů rtuťového sloupce) a bylo získáno 22,7 až 23,5 gramu (85 až 88 %) dihydrátu lisinoprilu (2), jehož čistota byla alespoň 99 procent a který obsahoval 8,2 hmotnostního procenta vody a maximálně 0,1 hmotnostního procenta chloridu sodného.

M23

Příklad 4

100,0 gramů N²-(1(S)-ethoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-N⁶trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu bylo přidáno k míchanému roztoku složenému z 50,4 gramu vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 48 hmotnostních procent a 39,3 gramu ethanolu a tato směs byla přibližně 4 hodiny míchána pro proběhnutí hydrolýzy. K reakční směsi přidáno 62,9 gramu koncentrované kyseliny chlorovodíkové. K výslednému roztoku bylo přidáno takové množství ethanolu, aby koncentrace lisinoprilu (2) v roztoku byla 8 ± 2 hmotnostní procenta a směs byla míchána další hodinu. Vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta dvakrát 40 mililitry ethanolu. K výslednému filtrátu bylo přidáno 75,5 gramu 10 procentního vodného roztoku hydroxidu sodného, takže hodnota pH byla upravena na 6,0..

Tento roztok byl zahřát na teplotu 45 °C, byly k němu přidány očkovací krystaly, směs byla míchána 3 hodiny, ochlazena během dvou. hodin na- teplotu 5 °C a míchána dalších 12 hodin.

Vysrážené krystaly byly izolovány filtrací, promyty třemi 30 mililitrovými podíly obsahujícími 70 hmotnostních procent ethanolu předem vychlazenými na teplotu 5 °C. Získané krystaly byly sušeny ve vakuu při teplotě od 20 do 50 °C a tlaku od 0,133 do 4 kilopascalů (od 1 do 30 milimetrů rtuťového sloupce) a bylo získáno 65,9 až 70,0 gramů (79 až 84 %) dihydrátu lisinoprilu (2), jehož čistota byla alespoň 99 procent a který obsahoval 8,2 hmotnostního procenta vody a maximálně 0,1 hmotnostního procenta chloridu sodného.

• ·' 4 4 4 4 · 4 4 4449 4 99 9

4 9 9 · 9 · 499 99 9

9 9 9 999 9994

4444 44 44 94 4 4

Příklad 5

30,0 gramů N²-(1(S)-ethoxykarbonyl-3-fenylpropyl)-N⁶trifluoracetyl-L-lysyl-L-prolinu bylo smícháno se 17,0 gramy vodného roztoku hydroxidu draselného o koncentraci hmotnostních procent a směs byla přibližně 4 hodiny míchána pro proběhnutí hydrolýzy. Pro úpravu pH na hodnotu 5,2 ± 0,5 bylo k reakční směsi přidáno 6,9 gramu koncentrované kyseliny chlorovodíkové a výsledná směs byla míchána další hodinu. Vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta 15 mililitry vody. Výsledný filtrát byl zahřát na teplotu 45 °C, byly k němu přidány očkovací krystaly, směs byla míchána 3 hodiny, ochlazena během dvou hodin na teplotu 5 °C a míchána dalších 12 hodin. Vysrážené krystaly byly izolovány filtrací, promyty třikrát 15 mililitry vody předem vychlazené na teplotu 5 °C. Získané krystaly byly sušeny ve vakuu při teplotě od 20 do 50 °C a tlaku od 0,133 do 4 kilopascalů (od 1 do 30 milimetrů rtuťového sloupce) a bylo získáno 20,0 až 21,3 gramu (80 až 85 %) dihydrátu lisinoprilu (2), jehož čistota byla alespoň 99 procent a který obsahoval 8,2 hmotnostního procenta vody a maximálně 0,1 hmotnostního procenta síranu draselného sodného.

Postup podle předmětného vynálezu umožňuje vyrábět N²(1(S) -karboxy-3-fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin jednoduchým, účinným a průmyslově výhodným způsobem.

ÍÉÍÍÍtóřť

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby N²-(1(S)-karboxy-3-fenylpropyl)-Llysyl-L-prolinu vzorce (2) z N²- (1 (S) -alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl) -N⁶-trifluoracetyl-Llysyl-L-prolinu obecného vzorce (1) (1) ve kterém R je alkylová skupina, vyznačující se tím, že zahrnuje:

první stupeň, který zahrnuje alkalickou hydrolýzu N^;-(1(S)alkoxykarbonyl-3-fenylpropyl) -N^c-trif luoracetyl-L-lvsyl-Lproiinu (1) v systému rozpouštědel, který je vybrán ze skupiny zahrnující směsný roztok skládající se z vody a hýdrofilního organického rozpouštědla a vodu, pomocí anorganické zásady, která se používá v množství n molárních ekvivalentů (n > 3) na mol výše uvedené sloučeniny (1), druhý stupeň, který zahrnuje neutralizaci produktu hydrolýzy pomocí anorganické kyseliny, která se používá v množství od (n-1) do n molárních ekvivalentů (n > 3) a . oddělení a izolaci anorganické soli vytvořené v reakční směsi ze shora uvedené anorganické zásady a anorganické kyseliny tím, že se tato sůl vysráží ze systému rozpouštědel vhodného pro snížení rozpustnosti anorganické soli, přičemž uvedený systém rozpouštědel je vybrán ze skupiny zahrnující hydrofilní organické rozpouštědlo, směsné rozpouštědlo skládající, se z vody a hydrofilního organického rozpouštědla a vodu, a třetí stupeň, který zahrnuje krystalizaci N²—(1(S)— karboxy-3-fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolinu (2), který se nachází ve směsi, ze které byly odstraněny anorganické soli, při jeho izoelektrickém bodu, přičemž uvedený systém rozpouštědel je vybrán ze skupiny zahrnující hydrofilní organické rozpouštědlo, směsné rozpouštědlo skládající se z vody a hydrofilního organického rozpouštědla a vodu, přičemž dojde k izolaci N²- (1(S)-karboxy-3fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolinu (2) ve formě krystalů, zatímco soli, jež jsou tvořeny hlavně organickou solí odvozenou od kyseliny trifluoroctové, zůstanou rozpuštěny v matečném louhu.

Způsob výroby podle nároku 1 vyznačující se tím, že anorganickou zásadou používanou v prvním stupni je hydroxid
2.

alkalického kovu, uhličitan alkalického kovu nebo hydroxid kovu alkalických zemin.
3. Způsob výroby podle nároku 2 -vyznačující se tím, že anorganickou zásadou používanou v prvním stupni je zásaditá sloučenina sodíku nebo zásaditá sloučenina draslíku.

» 1
4. Způsob výroby podle kteréhokoli z nároků 1, 2 nebo 3 vyznačující se tím, že množství anorganické kyseliny používané ve druhém stupni se pohybuje v rozmezí od více než (n-1) do n molárních ekvivalentů (n > 3) a množství zásady používané ve třetím stupni pro úpravu směsi po odstranění anorganické soli do stavu odpovídajícímu uvedenému izoelektrickému bodu je [(molární ekvivalenty použité anorganické kyseliny)-(n-1)] molárních ekvivalentů.
5. Způsob výroby podle nároku 4 vyznačující se tím, že množství anorganické kyseliny používané ve druhém stupni se je n molárních ekvivalentů (n > 3) a množství zásady používané ve třetím stupni pro úpravu směsi po odstranění anorganické soli do stavu odpovídajícímu uvedenému izoelektrickému bodu je jeden molární ekvivalent.
6. Způsob výroby podle nároku 4 nebo 5 vyznačující se tím, že zásadou používanou ve třetím stupni pro úpravu směsi do stavu odpovídajícímu uvedenému izoelektrickému bodu je anorganická zásada vybraná ze skupiny zahrnující hydroxidy alkalických kovů, uhličitany alkalických kovů, • · ·· ·· • · · · • · 9·

Úl hydrogenuhličitany alkalických kovů, hydroxidy kovů alkalických zemin a uhličitany kovů alkalických zemin.
7. Způsob výroby podle nároku 6 vyznačující se tím, že zásadou používanou ve třetím stupni pro úpravu směsi do stavu odpovídajícímu uvedenému izoelektrickému bodu je zásaditá sloučenina sodíku nebo zásaditá sloučenina draslíku.
8. Způsob výroby podle kteréhokoli z nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 vyznačující se tím, že anorganickou kyselinou používanou ve druhém stupni je kyselina chlorovodíková nebo kyselina sírová.
9. Způsob výroby podle kteréhokoli z nároků 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7 nebo 8 vyznačující se tím, že vysrážení anorganické soli ve 'druhém stupni a, krystalizace Ν²- (1 (S·)-karboxy-3fenylpropyl)-L-lysyl-L-prolinu (2) ve třetím stupni probíhá ze směsného systému rozpouštědel složeného z vody a hydrofilního organického rozpouštědla,.
10. Způsob výroby podle nároku 9 vyznačující se tím, že hmotnostní poměr vody a hydrofilního organického rozpouštědla ve směsném rozpouštědle je 4:1 až 1:99.
11. Způsob výroby podle kteréhokoli z nároků 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 vyznačující se tím, že hydrofilním organickým rozpouštědlem je jednosytný alkohol obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

.žák· ň

• « • ·*·
12. Způsob výroby podle nároku 11 vyznačující se tím, že hydrofilním organickým rozpouštědlem je ethanol.
13. Způsob výroby podle kteréhokoli z nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 nebo 12 vyznačující se tím, že substituent R v obecném vzorci (1) je alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.
14. Způsob výroby podle nároku 13 vyznačující se tím, že substituent R v obecném vzorci (1) je ethylová skupina.
15. Způsob výroby podle nároku 1 vyznačující se tím, že anorganickou solí vznikající ve druhém stupni je síran draselný nebo síran vápenatý, přičemž tato sůl je odstraněna vysrážením z vody.