CZ129296A3 - Beverage, process of its preparation and the use of ltp from crops - Google Patents

Description

Nápoj, způsob jeho výroby a použití LTP z obilovin

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká pěnivého nápoje, jako je pivo, způsobu výroby pěnivého nápoje a použití přídavných látek, vytvářejících pěnu.

Dosavadní stav techniky

Nápoje mají důležitou roli v našem denním životě, nikoli pouze k nezbytnému dodání tekutiny a výživy, ale rovněž jako stimulační činidlo. Kromě chuti jsou pro vysoce kvalitní nápoje důležité i skladební vlastnosti, jako viskozita a pěnivost.

Na trhu je nyní dostupných mnoho pěnivých nápojů, např. pivo, mléčné koktejly a některé nealkoholické nápoje. Trvá však potřeba nových pěnivých nápojů, stejně jako potřeba zlepšené kvality známých pěnivých nápojů.

Mnoho úsilí bylo věnováno zkoumání a isolaci činidel tvořících u piva pěnu a zlepšování pěnivých vlastností piva.

Po více než 50 let bylo známo, že pěnivé vlastnosti piva jsou určovány jeho obsahem peptidů (bílkovin), který činí u typického piva kolem 3-4 mg/ml, a že volné tuky a detergentní zbytky mohou být škodlivé pro stabilitu pivní pěny.

Vyjasnění toho, které složky na bázi proteinů jsou u piva zapojeny do stabilizace pěny, se týkaly mnohé výzkumy (citace 1, 2, 4, 17), aniž by však na tuto otázku byla získána jednoznačná odpověď. Několik tříd

- 2 proteinů piva o různé molekulové hmotnosti (cit. 2, 11, 20) bylo nabídnuto jako látky, důležjté pro pěnu.

Profil molekulových hmotností pivních proteinů se rozprostírá od malých polypeptidů až po velikost asi 150 000 Daltonů. Celkově bylo zjištěno, že pivní proteiny o molekulových hmotnostech do asi 100 000 Daltonů mají příznivý účinek na stabilizaci pivní pěny, zatímco malé polypeptidy, zvláště pak polypeptidy, mající molekulovou hmotnost nižší než 5 000 Daltonů, jsou považovány za látky, které pěnu ovlivňují záporně (cit. 6,19). Výzkumy Sharpeho a spolupracovníků (cit.15) dále navrhly, že stabilita pivní pěny odpovídá poměru polypeptidů s vysokou molekulovou hmotností vůči polypeptidům s nízkou molekulovou hmotností. Vzhledem k důležitosti specifických proteinů konstatoval Yokoi se spoluautory (cit. 20), že protein (peptid) Z, albumin z ječmene o velikosti 40 000 Daltonů, vykazuje pro stabilitu pěny nejdůležitější roli. To je v nesouladu s výsledky Hollemanse a Toniese (cit. 11), kteří prokázali, že úplné a selektivní odstranění tohoto proteinu z piva pomocí specifických, imobilizovaných protilátek mělo na stabilitu pěny pouze menší účinek.

V pivní pěně byly jako koncentrované rovněž nalezeny složky o vysoké molekulární hmotnosti, pocházející z kvasnic a zejména cukerné povahy (cit. 10, 12).

Většina z výše uvedených závěrů byla získána z frakcionace pivních proteinů a stanovení schopnosti různých frakcí vytvářet stálou pěnu. Žádné ze zkoumání nezahrnovalo jakékoli kroky ke zlepšení kvality pivní pěny.

Pokud se týká pivní pěny, existují dva důležité parametry, schopnost vytvářet pěnu a schopnost pěnu stabilizovat.

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že zvláštní skupina proteinů, označená jako LTP z obilovin, vykazuje schopnost vytvářet u nápojů pěnu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká nápoje, obsahujícího proteiny a/nebo peptidy, které jsou charakterizované znaky podle nároku 1.

Obilné LTP jsou proteiny nebo peptidy z obilovin, označované jako proteiny, přenášející tuky (lipid transfer proteins). Tabulka I ukazuje sekvence mnoha obilných LTP a LTP z jiných rostlin. Tyto proteiny jsou dále popsány Molinou a spoluautory (cit. 13).

Homologní jsou proteiny o 50-110 aminokyselinách a zejména o 80-100 aminokyselinách, vykazující nejméně z 60 % a lépe z 80 % sekvenční homologii s obilnými LTP.

Důležité jsou zejména strukturní vztahy. Homologní proteiny proto s výhodou obsahují nejméně 6 cysteinových skupin a lépe 8 cysteinových skupin k vytvoření 3 nebo 4 disulfidových můstků.

Upřednostňovanými homologními proteiny jsou TLTP, SLTP, CLTP, CB-A, CB-B a CB-C.

V předkládaném vynálezu se dává přednost LTP z obilných zrn.

Zvláště upřednostňovaným obilným LTP je ječmenný LTP z ječmenných zrn, v Tabulce I označený jako BLTP (barley LTP) a v příkladech označovaný také jako LTP1.

- 4 BLTP je zásaditým proteinem, hojným v aleuronní vrstvě (výživové vrstvě) ječmenných zrn (qit. 14,16). Má molekulovou hmotnost 9 694 Daltonů, zahrnující 91 aminokyselinových zbytků včetně 8 zbytků cysteinu (cit. 18); jeho sekvence aminokyselin již byla stanovena (cit. 18). Byl klonován a rovněž byla stanovena nukleotidová sekvence cDNA (cit. 14).

V následujícím popisu vynálezu označuje výraz obilný LTP nebo jeho podskupiny, jako ječmenný LTP, rovněž homologní látky, jak byly definovány výše, vykazující sekvenční homologii s uvedenou LTP skupinou. Výraz obilný LTP nebo jeho podskupiny označuje dále i modifikovaný podíl (frakci) obilného LTP, který lze získat z obilného LTP nebo jeho homologů zahřátím, varem a/nebo rmutováním LTP. Obilný LTP s výhodou není plně denaturovaný, tj. některé struktury jsou přítomny vzhledem ke schopnosti cysteinových zbytků vytvářet disulfidové můstky.

Pokud je obilný LTP podroben kroku zahřátí, povaření a/nebo rmutování jak je popsáno dále a jak je obvyklé při vaření piva, udržuje si v zásadě vše ze své primární sekvence, zatímco sekundární a terciární struktury se více či méně mnění a může dojít k novému uspořádání některých nebo i všech disulfidových můstků. Při vaření piva je často oxidována aminokyselina methioriin ječmenného LTP1. Autoři předkládaného vynálezu rovněž pozorovali tvorbu LTP-dimerů a -oligomerů, pravděpodobně cestou nového uspořádání jednoho nebo více z disulfidových můstků, přítomných v LTP. Jak je popsáno dále, LTP se může také spojovat s dalšími složkami, přítomnými za podmínek kroku vaření, např. s hordeinovými fragmenty, chmelem a tuky.

Tabulka 1 : Přehled aminokyselinových sekvencí rostlinných bílkovin, přenášejících tuky (LTP)

BLTP: -LNCGQVDSKMKPCL17V--QGGPGPSGECCNGVnDLIINQA0SSGUnQ'l'VCI.C-LI<GIARGlllHLMLNHAASlPSKCNVNVPYTISPDIDCSRIY (I.TP1) ϊ

	Z	cn	2 .x	z	Z	z		o		>
>	>	>		*4		*4	»4	64	>	>	>
CZ	z	z	z	z	z	X	z	E-	P	X
Vi y	cn	co Q	cn u	cn , z 1	cn Z	5	Č	e	co	δ	g
X >4		u 4	X 4	O >	o >	P	P		y	ě	g
2	cn	Vi	cn	cn	cn	E'	E-	z	cn	w	É-
X	H	X	<	X	X	Z	Z	P	z	X	X
cn	to	cn	cn	co	to	cn	cn	cn	cn	co	cn
64	4	4	4	•4	64	»4	*4	>	64	64	64
E-	E>	E-	X	E-	X	z	z	X	z	X	z
	- >·					' *4	- > ·	z -		>-	.· *->-···.
CL	z	z	z	z	z	z	z	z	z	z	z
_3	4	>	z	>	>	•4	64	>	64	X	64
Z	to	cn	z	co	co	a	>	z	z		z
> z	>	> z	> P'	> P	> P	> P	> P	•4	> z	> P	> P
O z	o z	z z	Z z	Z z	Z z	O z	o z	Z X	z >	o	z e
Z	cn	cn	z	to	cn	z	>	X	cn	co	X
x	z	X	X	z	z	z	z	X	z	X	z
·—i	4	4	4	»—1	»~t	z	z	64	«4
M	CO	cn	CO	z	z	cn	cn	Z	Z	z	z
tf	<	X	w	X	X	en	ω	ω	X	X	X
X	<	<	X	X	X	X	<		X	<	X
z	z	z	z	z	z	X	X	u	z	z	X
Ω	z	z	z	z	z	a	o	8	z	z	z
z	<	X	X	X	X	O	z	z	>	a
z	z	z	z	z	z	z	z	z	a	z	z
X	z	z	z	1	J	*4	•4	64		•4	UJ
z	z	z	z	1	1	E-		z	z	z	P
z	cn	z	cn	1	!	Z	z		z	z	P
64	>	4	>	>	z	Z	>	cn	6-^		>
Z	z	z	z	X	to	Z		z	X	<	X
z	<	z	Vi	z	z	X	X	cn	z	z	z
<	<	X	X	X	X	X	X	cn	X	X	X
4	<	X	X	>	X	<	X	X	X	<	E-
z	z	z	cn	cn	cn	X	E-	1	cn	cn	o
z	z	z	z	z	z	z	Z	z	z	z	z
		X	z Vi z	z	>4	64	>				a
z	z	z	z	Z	z	z	z	μ	z	Z
	z	z	z	z	z	z	P	z	r*	z	o
z	z	z	z	z	z	z	z	z	z	z	z
X	<	<	X	P	X	X	X	4	X	X	X
CO	X	4	X	X	X	X	*4	X	E-
o	z		z	o	o	z		z	Z	z	čz
X	z	z	z		z	z	z	z	c	CZ
	a	o	o	o	a	a	a	a	. a	a	a
CZ)	<	x	X	<.	X	X		a	X	X	t-2
o	4	4	e*	C-4		cn	>	?►	E-	i*	P
co	4	4	4	čo	cn	ř*	t-*			E-	t-
X		CJi	ž		o	z	X	ž	X	X	CZ
X	X	<.	X	X	X	X	X	>	X	X	X
o	x	<	X	X	X		«1	X	cn	<	X
2		<	x	z	z		z	®	z	X
z	z	z	z	X	X	z	z	X		z	2
	X	J	*3	Z '	z			z			-3
z	Vi	Vi	cn	Sl	z	z		s	z	X	z
X	z	z	z	z	z	o	z	z	z	CZ
>	>	>	>	>	>	>	>	z	>	64	>
D	z	z	z	z	z	z	z	P	z	z	>
χ	ω	ω	w	cn	w	X	X	r*	P	co	2
8	z	z	CH	z	z	z	z	z	Z	z	z
z	z	z	z	z	z	£	z	z	z	z
z	<	cn	z		cn	X	z	co	P
o	X	X	x	X	X	z	o	z	co
	VI	Vi	Vi	cn	X	en	cn	cn	«3	co	X
X	X	X	z	X	X	X	X	X	!		>
z	z	z	X	Vi	z	cn	b<	z	1	1	X
CL	to	<	X	Ě-	X	X	P	cn	z	1	>
O	8	z	z	z	z	>	a	Ω	z	X
o	1	X	cn	z	8	X	Z	CZ	co	>
ot	z	z	z	z	z	P	P	8	z	a
1	z	z	z	z	z	E-	P	P	z	CZ
1	1	1	1	1	t	t	1	1	1	l	cn
>	X	-c	X	X	X	«3		X			a
>-	>	>	.>	>·	>-	z	X	X		>	>
cn	Vi	E-	X	X	cn	z	X	z	z	z	z
	4		z	X	1—1	*4	>	>	X	64	«□
o	z	z	z	z	z	Z	z	z	z	Z	z
X	z	X	z	X	z	cn	cn	X	z	X	X
z	X	z	z	z	cn	X	cn	X	X	X	X
>	4	>	41	z	Z '	z	z	X			a
X	<	X	X	X	X	cn	X	z	z	z	X
Vi	Vi	.. Vi	cn	cn	cn	.....cn	z	Σ	X	cn	z
O	- χ-	Z	cn	cn	cn	z	_Z -	-Q---	-fr.·-	-cn -
>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>
z	σ	σ	Cí	σ		o	σ	E·	o	z	o
8	8	8	S	8	§					z
O	cn	t-	cn		cn	§	z	X		£
4	a	4	•4	►4	14	>	>	>	z	4	a
1	x	I	X	X	•x	t	1	X	X	z	>
»,	Φβ	z	z
X	X	t-.	H	co		X	z	z	z	z	z
6·*	E--	ar	' - Z		(N	t	1	1	E-		E-
	Z	-4	<0	s	3	s	ffi	m	é*		a
2	Z	z	z	z	Z	z	z	z	cn	z

•3 «3 XI X o O XX

X X O o ->>->. > > o o .Ε .E *č> “o

N N Dl Dl Η H _φ φ '3 ’□ >O >C3 ¢0 CO a a < CD

I I

CD 00 O O φ

OJ o

o

E o

a »03 a

u.

o

N

-co a

M φ

a φ

E >o φ

>»

C

Φ n

Φ >

co

N

O cn

C φ N Q.

Φ _N N řř

Φ.® •=T =

ZA >o _ CO »o co a

N

E g O

MLTP označuje LTP z kukuřice CB-C označuje LTP z ricínových bobů

RiLTP označuje LTP ze zrn rýže TLTP označuje LTP z rajských jablek

RaLTP označuje LTP z indiánského prosa (ragi) SLTP označuje LTP ze špenátu

Cw18 označuje LTP z listů ječmene CLTP označuje LTP z mrkve

Cw21 označuje LTP z listůječmene

- 6 Modifikovaný obilný LTP může být s výhodou získán zahříváním obvyklého obilného LTP ye vodném roztoku po dobu až 3 hodin při teplotě mezi 50 a 95 °C nebo varem při atmosferickém tlaku po dobu až 2 hodin a/nebo rmutováním jako obvyklým krokem vystírání při výrobě piva.

V následujícím textu výraz obilný LTP rovněž označuje jeho homology nebo modifikovaný obilný LTP a modifikované homology, pokud není uvedeno jinak.

Nápojem může být jakákoli tekutina k pití, jako mléčné nápoje, ovocné nápoje a pivo.

á:

Vzhledem k tomu, že malé množství, tj. přibližně 50 mg/l, je přítomno ve známých pivech, je tento známý stav techniky vyloučen z rozsahu v nároku 1.

Výroba piva či pivovarnický postup, jak je znám z předchozího stavu techniky, je podrobně popsán v literatuře, jako v publikaci D.E. Briggse, J.S. Hougha R. Stevense a T. W. Younga Malting and Brewing Science, díl I, Chapman a Halí, London 1981, a v dílu II J.S. Hougha, D.E. Briggse, R. Stevense a T.W. Younga, Chapman a Halí, 1982, popisujícím mnohé varianty surovin a postupů. Obecně postupy sledují kroky A) až D).

A) Volba surovin a příprava

Suroviny zahrnují:

Vodu, cukry a proteiny (přítomné v obilninách jako jsou ječmen, pšenice, rýže, kukuřice, čirok); cukr, sirupy, sladové extrakty; enzymy, vznikající v průběhu sladování obilnin (tj. ječmene a pšenice) nebo

- 7 mikrobiální produkce; přichucovací složky (pražený slad, chmel a jiné rostlinné materiály nebo šťávy).

Obilné suroviny mohou být:

Sladovány; rozemlaty; separovány (k vytvoření složek o specifické chuti a enzymových aktivitách).

B) Rmutování a výroba mladiny

Zahrnuje:

Extrakci řízeným prohříváním (daná teplota a čas) připravených surovin; povaření a oddělení mladiny od nerozpustných materiálů.

C) Kvašení mladiny

Kvašení probíhá po přídavku kvasné suspenze ke studené, provzdušňované mladině. Za řízených teplotních podmínek bude metabolismus kvasinek (kvašení) přeměňovat mladinu na pivo, obsahující určité složky, produkované kvasinkami, jako složky alkoholové a příchuťové. Tento krok může být řízen výrobními podmínkami: teplotou a dávkováním kvasinek, stejně jako množením kvasinek.

Ď) Čiření a dohotovení

Po době uchovávání a zrání jsou zfiltrovany zbývající kvasinky a proteinovo/taninové usazeniny a doplněny jsou oxid uhličitý, barvicí a jiné korigující přídavné látky, jako jsou stabilizační činidla a přichucovací složky.

- 8 Sládci obecně vědí, že piva, vyráběná pouze ze sladovaného ječmene nebo pšenice, m^jí silnou schopnost vytvářet pěnu (schopnost tvorby pěny) a vykazují lepší stálost než piva, vařená s přídavky.

Analýzy obsahu obilného LTP v dřívějším pivu o největší známé schopnosti tvořit pěnu ukazují, že koncentrace obilného LTP je mnohem nižší než 300 mg/l.

Kvalita pivní pěny záleží jak na postupu vaření, tak i na použitých surovinách. Vzhledem k tomu, že se předkládaný vynález zásadně týká surovin, obsah obilného LTP v pivu, mající druhou původní závažnost, většinou odpovídá obilnému LTP v sladině, vytvořené podle standardní rmutovací metody Evropské pivovarnické konvence (EBC, European Brewery Convention), nazývané rovněž kongresní sladina. Pro nesledované obilniny lze použít stejný extrakční postup, pokud je to nezbytné včetně přídavku normálních hladin pivovarnické enzymové aktivity.

Obilným LTP, přítomným ve známé sladké sladině, určené k výrobě piva, je prvotně LTP1 nebo mírně modifikovaný LTP1. Stupeň modifikace závisí na způsobu, kterým se provádí. Pokud se kongresní sladina, vyrábí podle standardního rmutovacího postupu EBC, je přibližně 90 % přítomného obilného LTP v kongresní sladině naměřeno testem ELISA na základě nárůstu protilátek vůči nemodifikovanému LTP 1, přičemž se ELI SA provádí standardními postupy, kterébudou popsány dále.

Koncentrace obilného LTP je ve známém pivu nižší než X a mnohem nižší než X1, přičmž X a X1 označují hladiny, které lze získat v pivu, vařeném ze surovin, které za použití standardního rmutovacího postupu EBC poskytují kongresní sladinu o koncentraci obilného LTP,

- 9 která odpovídá 125 gg/ml, respektive 150 gg/ml obilného LTP, měřeného testem ELISA na základě vzestupu protilátek vůči nemodifikovanému LTP1.

Výraz první sladina (rmut) označuje sladinu, získanou v prvním filtračním kroku po rmutování. První filtrační krok je obvyklým filtračním krokem před promytím filtračního koláče.

Výraz sladká sladina označuje sladinu, získanou po konečném kroku filtrace, tj. po promytí filtračního koláče vodou.

Výraz kongresní sladina označuje sladinu, vyrobenou standardním rmutovacím postupem EBC.

Výraz mladina označuje konečnou sladinu po rmutování, filtraci a povaření.

Veškerý obilný LTP, přítomný v mladině, může být prvotně nalezen v pivě z ní vyrobeném. 1 ml mladiny normálně poskytuje přibližně 1 až 2 ml piva.

To znamená, že mladina s koncentrací obilného LTP 125 pg/ml může poskytovat pivo o koncentraci nejvýše 125 μg/ml obilného LTP.

Standardní rmutovací metoda EBC je podrobně popsána v publikaci Analytica-EBC, ve čtvrtém vydání z roku 1987, na straně E59, vydané nakladatelstvím Brauerei und Getranke-Rundschau, CH-8047 Zůrich, Švýcarsko.

- 10 Nápoj podle vynálezu zahrnuje s výhodou nejméně 25 pg/ml obilného LTP, zatímco zvolená koncentrace obilného LTP a zejména LTP z obilných zrn činí 100 pg/ml nebo více.

Obilný LTP může být rozpoznán podle své sekvenční struktury.

Koncentraci obilného LTP lze měřit za použití testu ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, stanovení za pomoci enzymu, vázaného na imunosorbent), určeného pro LTP. Takový ELISA test pro obilný LTP není dostupný na trhu, ale může být vyroben podle standardních postupů, zahrnujících kroky:

a) vytvoření protilátky vůči obilnému LTP imunizací zvířete, získání séra a vyčištění protilátky,

b) biotinylace protilátky, a

c) vytvoření standardní křivky LTP prostřednictvím kompetitivního postupu ELISA, za účasti složky, která má být měřena, např. spektrofotometricky.

Metody ELISA jako takové jsou obecně známé odborníkům v oboru a představují nejběžnější medody, které jsou nyní používány k měření biologických složek.

Obecné informace o testech ELISA lze nalézt v citaci č. 23.

Nápoj podle vynálezu obsahuje rovněž hordein, glutelin, další albuminy jako protein Z, získatelný z piva a/nebo chmelových složek, jako z chmelových iso-α kyselin a jiných hořkých zbytků v chmelu. Tyto

- 11 složky vykazují účinek stabilizace pěny i účinek vytváření pěny, působící synergicky vzhledem k obilnému LTP.

Nápoj může rovněž obsahovat cukry, tuky a/nebo mastné kyseliny. Tyto složky zlepšují chuť a obsah (podstatu) nápoje.

Některé z výše uvedených složek, např. hordein, chmel a tuky, se mohou spojovat s LTP, pokud jsou společně vařeny. Pěnivé schopnosti obilného LTP, modifikovaného varem s chmelovými složkami a/nebo s triglyceridy, jsou zlepšené.

Nápoj může rovněž obsahovat v malých množstvích další složky, jako stabilizační činidla (alginové kyseliny, alginát, karagenan, glyceridy, klovatinu, pektin), umělá sladidla, dochucovací činidla, barviva, vitamíny, minerály, konzervační Činidla, činidla vyvolávající šumivost, antioxidační činidla a enzymy, zejména enzymy odbourávající proteiny a enzymy odbourávající cukry.

Pokud je nápojem podle tohoto vynálezu pivo, obsah obilného LTP je s výhodou vyšší než 5 hmotnostních %, zvláště pak vyšší než 10 hmotn. % a nejlépe vyšší než 15 hmotn. % celkového obsahu proteinu. Hmotnost modifikovaného obilného LTP je počítána jako hmotnost odpovídajícího množství nemodifikovaného obilného LTP, tj. hmotnost dalších složek, vázaných na obilný LTP, není zahrnuta.

Předkládaný vynález rovněž zahrnuje způsob výroby nápoje, obsahujícího protein a/nebo peptid. Tento způsob je charakterizován v nároku 11.

Obilný LTP může být přidáván v jakékoli formě, za předpokladu, že je alespoň částečně rozpustná.

- Ϊ2 V praxi může být přidáván ve formě rozemletého nebo drceného obilného materiálu, nebo yje formě extraktu obilných materiálů.

Takový extrakt může býtzískán jakoukoli cestou, např. povařením a/nebo rmutováním obilovin nebo obilného materiálu v kapalině a pokud je to žádoucí, vyčištěním filtrací a volitelně frakcionaci filtrátu. Kapalina může s výhodou obsahovat také chmel a/nebo tuky, zejména triglyceridy. Extrakt může být rovněž vysušen, např. lyofilizací nebo rozprašovacím sušením.

Obilný LTP může být například získán v modifikované formě z piva, jak je popsáno v následujících příkladech.

Obilný LTP může být rovněž získán z mikroorganismů, např. kvasinek, hub nebo bakterií, obsahujících sekvenci DNA, která kóduje LTP v genomu. Vzhledem k tomu, že je známo množství DNA sekvencí, kódujících obilné LTP, odborník v oboru bude schopen za použití známých technik začlenit (inkorporovat) takovou sekvenci DNA do genomu bakterií, kvasinek nebo hub. Z kvasinek může jít například o Saccharomyces carlsbergensis nebo cerevisiae.

Obilný LTP může být vyráběn např. mikroorganismem, produkujícím obilný LTP, v nápoji v kroku kvašení.

Pokud není“ nápoj⁼ kvašen,“obilný LTP ⁼sě“s “výhodou přidává' vě formě vyčištěného rozpustného extraktu.

Obilný LTP lze přirozeně přidat ve formě vyčištěného rozpustného extraktu i do kvašeného nápoje, ale vzhledem k tomu, že výroba kvašených nápojů normálně zahrnuje krok filtrace, nemusí být nezbytné extrakt obilného LTP čistit.

- 13 Obilný LTP může být přidáván ve kterémkoli výrobním kroku, všechen najednou nebo pc\ částech, spojitě nebo nespojitě.

Pokud je nápojem pivo, může být obilný LTP přidáván např. v kroku přípravy sladu nebo sladového extraktu vytvořením sladu z obilných zrn, která jsou kultivována pro získání vysokého obsahu LTP, např. použitím genetického přenosu.

Obilný LTP může být přidáván také během přípravy sladiny, např. ve formě rozemletého nebo rozdrceného obilného materiálu, zejména obilných zrn, která se přidávají před krokem rmutování.

Předkládaný vynález také zahrnuje použití obilného LTP jako pěnu tvořící přísady do nápoje. Toto použití je nárokováno v nárocích 21 až 23.

Pokud se obilný LTP používá podle vynálezu, může být s výhodou kombinován s dalšími složkami včetně proteinů, ale obilný LTP přednostně tvoří nejméně 15% a lépe 25% hmotnosti celkového obsahu proteinů. Hmotnost modifikovaného obilného LTP se počítá jako hmotnost nemodifikovaného obilného LTP, tj. hmotnost dalších složek, vázaných na obilný LTP, není zahrnuta.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje věž na pěnu pro 1,65 I piva, vyrobenou z borokřemičitého skla.

Obrázek 2 znázorňuje gelovou filtraci pokleslé pěny z třetí flotace ležáckého piva na Sephadexu G-75 (5 cm x 87 cm, 1700 ml), ekvilibrované 50 mM roztokem octanu amonného o pH 4,5. Na ose x je vyneseno množství eluentu v ml, na ose y na levém okraji grafu

- 14 absorbance při 280 nm a na ose y na pravém okraji grafu množství proteinu v mg/ml. _t

Obrázek 3 znázorňuje závislost schopnosti vytvářet pěnu (vynášené v ml na ose y) na koncentraci podílu LMW, vynášené v pg/ml na ose x, při testech stanovení pěny.

Obrázek 4 znázorňuje závislost poločasu existence pěny (na ose y, v sekundách) na koncentraci podílu HMW, vynášené v gg/ml na ose x.

Obrázek 5 znázorňuje v části A elektroforézu podílů HMW, LMW a *. ječmenného LTP1 v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti SDS. Použit , byl 20% homogenní gel, systém Phast a barvení pomocí barviva Coomassie Blue R 350. M1 a M2 jsou markéry pro určení molekulových hmotností. V části B je znázorněna technika western blotting, jíž byly podrobeny HMW, LMW a ječmenný LTP1 za použití specifických , protilátek vůči ječmennému LTP1.

Obrázek 6 znázorňuje iontově výměnnou chromatografií LMW na sloupci S-Sepharosy Fast Flow (5x7 cm, 135 ml), ekvilibrovaném 20 mM roztokem octanu sodného o pH 4,9. Na ose x je vyneseno množství eluentu v ml, na ose y v levé části grafu absorbance při 280 nm a na aoe y v pravé části grafu gradient chloridu sodného (udaný jeho molaritou). Křivka.....označuje gradient ŇaČI, křivka — absorbanci při

280 nm.

Obrázek 7 znázorňuje schopnost tvořit pěnu, měřenou ve stanoveních tvorby pěny, prováděných v destilované vodě, obsahující rostoucí koncentrace spojených podílů, tedy poolu I (hordein/glutelinových fragmentů), poolu III (pivního LTP1) anebo LTP1,

- 15 isolovaného z ječmene. Schopnost tvořit pěnu (v ml) je vynesena na ose y, množství přidaného proteinu (v mg/ml) na ose x. Koncentrace rozpuštěného proteinu byla vypočítána na základě analýzy aminokyselin.

Obrázek 8 znázorňuje schopnost tvořit pěnu, měřenou ve stanoveních tvorby pěny, prováděných v pivu, obsahujícím rostoucí koncentrace spojených podílů, tedy poolu I (hordein/glutelinových fragmentů), poolu III (pivního LTP1) anebo LTP1, isolovaného z ječmene. Schopnost tvořit pěnu (v ml) je vynesena na ose y, množství přidaného proteinu (v mg/ml) na ose x. Koncentrace rozpuštěného proteinu byla vypočítána na základě analýzy aminokyselin.

Obrázek 9 znázorňuje schopnost tvořit pěnu, naměřenou při stanoveních tvorby pěny, prováděných ve vodných roztocích, obsahujících rostoucí koncentrace ječmenného LTP1 buď samotného, nebo v přítomnosti poolu I v koncentraci 0,4 mg/ml. Schopnost tvořit pěnu (v ml) je vynesena na ose y, množství přidaného proteinu (v mg/ml) na ose x. Koncentrace rozpuštěného proteinu byla vypočítána na základě analýzy aminokyselin.

Obrázek 10 znázorňuje schopnost tvořit pěnu, naměřenou při stanoveních tvorby pěny, prováděných ve vodných roztocích, obsahujících rostoucí koncentrace poolu Ili buď samotného, nebo v přítomnosti poolu I v koncentraci 0,4 mg/ml. Schopnost tvořit pěnu (v ml) je vynesena na ose y, množství přidaného proteinu (v mg/ml) na ose x. Koncentrace rozpuštěného proteinu byla vypočítána na základě analýzy aminokyselin.

Obrázek 11 znázorňuje průběh gelové filtrace poolu III, isolovaného z třetí flotace ležáckého piva na Sephadexu G-50, ekvilibrovaném 20 mM roztokem octanu sodného, 0,1 M roztokem NaCI,

- 16 pH 4,9. Na ose x jsou uvedena čísla frakcí, na ose y hodnoty absorbance při 280 nm. ₄

Obrázky 12A a 12B ukazují ¹H NMR spektra LTP1 z ječmenných zrn (A) a LTP1 z pivní pěny (B).

Příklady provedení vynálezu

Výroba sladu

Slad, používaný v následujících příkladech, byl vyráběn jako ležácký slad (lehký slad).

VÝROBA KONGRESNÍ SLADINY ZA POUŽITÍ STANDARDNÍHO RMUTOVACÍHO POSTUPU EBC

Mletí g sladu bylo rozmělněno mletím a do rmutovací kádinky bylo převedeno 50 g mouky.

Mletí bylo prováděno v Buhler-Miagově kotoučovém mlýně o vzdálenosti mezi kotouči 0,2 mm.

Rmutování

Rmutovací lázeň byla udržována na teplotě přibližně 45°C.

200 ml destilované vody o teplotě asi 46°C bylo nalito do rmutovací kádinky za míchání skleněnou tyčinkou a současném zabránění nabalování. Bylo zajištěno, aby teplota rmutu činila přesně 45°C.

- 17 Kádinka byla okamžitě umístěna do rmutovací lázně a do pohybu bylo uvedeno míchadlo. Teplota rmutu byla udržována na 45°C přesně po dobu 30 minut. Poté byla během 25 minut zvyšována rychlostí 1°C za minutu.

Po dosažení teploty 70°C bylo přidáno dalších 100 ml destilované vody o teplotě 70°C a teplota 70°C byla udržována 1 hodinu. Rmut byl ochlazen na laboratorní teplotu během 10 až 15 minut. Míchadlo bylo promyto malým množstvím destilované vody, vnější strana kádinky byla osušena a obsah kádinky byl doplněn přidáním destilované vody na 450,0 g.

Filtrace

Obsah kádinky byl pečlivě zamíchán skleněnou tyčinkou a okamžitě zcela vyprázdněn na filtrační papír.

Prvních 100 ml filtrátu bylo vráceno do nálevky.

Filtrace byla skončena tehdy, když se filtrační papír zdál být suchý, anebo v případě pomalé filtrace po 2 hodinách.

ANALYTICKÉ POSTUPY

Identifikace ječmenného LTP1 (metoda Western blotting)

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s obsahem SDS (dodecylsíranu sodného) byla prováděna po 15 minutovém povaření v dithiothreitolu za použití aparátu Pharmacia Phast-System a 20% homogenních gelů. Poté bylo prováděno blotování (převedení skvrn vzorků) na nitrocelulózu v aparátu Phast-System po dobu 30 minut při 70°C. Po promytí vodou byla nitrocelulóza 30 minut inkubována s

-18telecím sérem k blokování nespecifické vazby a poté byla přes noc inkubována se specifickýngi protilátkami vůči LTP1 (připravenými podle popisu v Příkladu 8). K určení (detekci) vazby specifických protilátek byl použit Promega Wester blot AP systém (katalog, číslo W3930). Jako substrát alkalické fosfatázy, který vytváří barevnou reakci, byla použita směs tetrazoliové nitro-modře a 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfátu.

Stanovení sekvence aminokyselin od N-konce

Stanovení sekvence aminokyselin od N-konce bylo prováděno na sekvenátoru Applied Biosystems, modelu 470 A, pracujícím v plynné fázi, za použití programu poskytovaného výrobcem. Aminokyseliny ze sekvenátoru, označené fenylthiohydantoinem, byly identifikovány v uspořádání on line pomocí HPLC na reverzní fázi za použití fenylthiohydantoinového analyzátoru Applied Biosystems, model 120A.

Aminokyselinová složení byla stanovena na analyzátoru aminokyselin LKB, modelu Alfa Plus, po hydrolýze v 6 M HCI, probíhající 24 hodin při 110°C ve evakuovaných zkumavkách.

Stanovení obsahu cukrů

Obsah cukrů byl stanoven metodou podle citace 7 (za použití fenolu a kyseliny sírové).

Stanovení množství proteinů

Obsah proteinů byl stanoven na základě analýzy aminokyselin nebo metodou podle Bradforda (citace 5).

Stanovení pěny

- 19 K měření schopnosti tvořit pěnu a poločasu trvání pěny u 10 ml vzorků byl použit optoelektrický systém stanovení pěny (citace 8, 9), využívající analýzu digitálního videozáznamu. Schopnost tvořit pěnu (P) je vyjádřena množstvím pěny v ml, původně vytvořené na ml vzorku. Poločas trvání pěny (F) je doba v sekundách, během níž sloupec pěny poklesne na polovinu svého původního objemu. Obsah pěny je dán schopností tvořit pěnu (P), vynásobenou objemem vzorku v ml. Před provedením stanovení pěny byly podíly (frakce) nebo spojené podíly (pooly), získané po chromatografií, dialyzovány vůči destilované vodě v dialyzačních membránách Spectra/por® (oddělujících složky do velikosti 3500 Daltonů), nebo lyofilizovány k odstranění octanu amonného. Stanovení pěny byla prováděna souběžně vždy ve čtyřech shodných vzorcích.

Pro stanovení pěny u lahvového piva, obsahujícího CO₂, byl použit Analyzátor stability pěny, System Carlsberg (citace 21). Poločasem usazování pěny, stanovovaným touto metodou, je poločas (v sekundách) rozpadu pěny zpět na pivo po předchozí plné přeměně 150 g piva na pěnu. Tento rozpad je, po počáteční klidové (lag) fázi v trvání asi 30 sekund, dějem prvního řádu (citace 22).

Příklad 1

Isolace a vyčištění (purifikace) obilného LTP z ječmenných zrn (LTP1)

Postup a)

Čistý ječmenný LTP1 byl isolován z 25 kg ječmenné mouky (odrůdy Alexis, sklizené v Dánsku v r. 1992) extrakcí prostřednictvím 250 I vody po dobu 2 hodin při pH 6,5. Směs byla ponechána přes noc při teplotě 2°C k usazení nerozpustného materiálu. Supernatant byl

- 20 zahuštěn ultrafiltrací na 7 I a poté byl přidán síran amonný až do 40% nasycení roztoku. Po 2-3 ^hodinách při 2°C byla sraženina odstraněna odstředěním a k supernatantu byl přidán síran amonný do 75% nasycení roztoku. Výsledná suspenze byla po 16 hodinách při 2°C odstředěna a poskytla tak sraženinu, kterou lze uchovávat při teplotě 2°C několik týdnů. Čtvrtina sraženiny byla rozpuštěna v 500 ml vody, zahřáta na 100 °C a okamžitě ochlazena v ledu. Roztok byl odstředěn k odstranění jakýchkoli usazených látek a dialyzován vůči destilované vodě v dialyzačních membránách Spectra/por® (oddělujících složky do velikosti 3 500 Daltonů). Po odstředění bylo pH dialyzátu upraveno na 7,0 přídavkem NaOH a dialyzát byl podroben iontově výměnné chromatografií na sloupci CM celulózy (5 cm x 25 cm, 500 ml), ekvilibrované 20 mM fosfátem sodným o pH 7,0. Metoda Western blotting identifikovala ječmenný LTP1, který byl vymyt gradientem chloridu sodného (od 0,0 M až do 0,1M roztok). Podíly s obsahem LTP1 byly spojeny, dialyzovány vůči destilované vodě v dialyzační membráně Spectra/por® a naneseny na sloupec S-Sepharosy Fast Flow (5 cm x 15 cm, 300 ml), ekvilibrované v 20 mM pufru Hepes o pH 7,0. Ječmenný LTP1 byl vymyt použitím gradientu NaCI (0,0 - 0,3 M NaCI) ve stejném pufru. Podíly, obsahující ječmenný LTP1 zjištěný metodou Western blotting, byly spojeny, dialyzovány vůči destilované vodě v dialyzační membráně Spectra/por® a lyofilizovány. Sekvenování aminokyselin od N-konce, poskytnuvší sekvenci Leu-Asn-*-Gly-Gln-Val-Asp-Ser-, kde hvězdička označuje prázdné místo, odpovídající cysteinu nalezenému v této poloze u LŤP1, prokázalo, že isolovaný LŤP1 byl čistý.

Postup b)

Podobný jako postup a) kromě toho, že byl vypuštěn krok zahřívání.

- 21 Žádný rozdíl nebyl u LTP, připraveného podle postupů a) či b), pozorován ve schopnostech tvořit pěnu nebo imunoreaktivitě.

Příklad 2

Vyčištění (purifikace) LTP1 z pivní pěny

Spojitá věž na pěnu byla byla vyrobena z borokřemičitého skla, jak je znázorněno na obrázku 1. Pěna byla vytvářena z 15 I (nebo z 1,65 I, v kterémžto případě byla všechna množství chemikálií, uváděných dále, snížena s faktorem 9) ležáckého piva výstřelkováním dusíkem v množství 450 ml/min přes noc. Dusík byl před zaváděním do věže na pěnu nasycován vodní parou. Pěna, shromažďovaná u výpustě, byla nechána prudce poklesnout (zhroutit se) a naředěna destilovanou vodou na původní objem piva. Poté byla znovu zavedena do věže na pěnu. Druhá a třetí flotace byla prováděna podle předcházejícího popisu a pěna, shromážděná z třetí flotace ležáckého piva, obsahovala 35 % celkového obsahu pěny v původním pivu.

Složky, obsažené ve zhroucené pěně z poslední flotace, byly rozděleny podle molekulových hmotností gelovou filtrací na Sephadexu G-75 ve sloupci (5 cm x 87 cm), ekvilibrovaném 50 mM roztokem octanu amonného o pH 4,5. Gelovou filtrací zhroucené pěny z třetí flotace na Sephadexu G-75 byla zjištěna tři maxima (píky), vykazující absorbanci při 280 nm (obrázek 2). Dvě z maxim byla označena jako HMW a LMW, jak je uvedeno v obrázku 2. HMW podíl se skládal přibližně z 90 % cukrů a 10 % proteinů, zatímco LMW podíl byl složen z 90 % proteinů a 10 % cukrů. Bylo zjištěno, že třetí maximum obsahuje nízkomolekulární složky jako aminokyseliny, isohumulony a cukry.

Aminokyselinové složení podílu LMW a spojených podílů připomínalo aminokyselinové složení dobře známého ječmenného

- 22 lipid-transfer-proteinu (LTP1), viz citace 18 (tabulka II). Elektroforéza podílu LMW v polyakrylapiidovém gelu s obsahem SDS poskytla při barvení barvivém Coomassie Blue R 350 skvrnu, pokrývající molekulové hmotnosti v rozmezí 6 000 až 18 000 Daltonů (obrázek 5). Technika Western blotting, využívající specifických protilátek vůči ječmennému LTP1 prokázala ječmenný LTP1 (molekulová hmotnost 9 700 Daltonů) jako hlavní složku LMW (obr. 5). To bylo potvrzeno i sekvenováním N-koncových aminokyselin.

Aminokyselinové složení LMW ukázalo ve srovnání se složením ječmenného LTP1 (citace 18) (tabulka II) příliš vysoké hodnoty u Pro a Glx, zapříčiněné pravděpodobně přítomností hordeinových a giutelinových fragmentů; skvrna, získaná barvením stříbrem po elektroforéze v SDS polyakrylamidovém gelu, může představovat takové fragmenty.

Pěnový podíl LMW byl lyofilizován k odstranění octanu amonného. LŤP1 byl z pěnového podílu LMW, získaného z 15 I ležáckého piva, vyčištěn (purifikován) iontově výměnnou chromatografií na S-Sepharose Fast Flow (obr. 6). LMW podíl byl nanesen na sloupec (5 cm x 7 cm, 135 ml), ekvilibrovaný 20 mM roztokem octanu sodného o pH 4,9 a po promytí byl vymyt LTP1 jako široké maximum (pool ll-IV, obr. 6) použitím lineárního gradientu NaCI (0-0,3M) ve stejném pufru. Proteklý podíl a tři pooly (spojené podíly) frakcí s obsahem LTP1, stanoveného metodou ^Wěštěřn’ blotting, byly dialyžóvány vůči destilované vodě v dialyzační membráně Spectra/por® (oddělující složky do 3 500 Daltonů) a lyofilizovány.

Ultrafiltrační zařízení: DDS-GR81PP, Dow Filtrations, Dánsko Spectra/por®: Spectrum Medical Industries, Inc., USA CM-cellulose: Whatman Biosystems Ltd., Anglie Sephadex G-75: Pharmacia, Švédsko

- 23 Pooly z chromatografie LMW na S-Sepharose Fast Flow

		pool	pool II	pool III	poolLMW lV - ·-	LTPIa)
Asx (mol%)		7.8	11.5	14.3	14.5	12.6	16.5
Thr (mol%)		6.1	4.3	3.8	3.7	4.5	3.3
Ser (mol%)		6.7	7.3	7.8	7.8	7.4	8.8
Glx (mol%)		20.7	13.7	10.2	9.6	13.3	6.6
Pro (mol%)		9.6	8.5	7.8	7.9	8.1	6.6
Gly (mol%)		7.1	8.5	9.6	9.6	8.9	9.9
Ala (mol%)		7.3	6.3	5.5	5.8	6.1	4.4
1/2Cys (mol%)		4.3	6.5	7.6	7.5	6.4	8.8
Val (mol%)		6.8	6.9	6.4	6.1	6.6	6.6
Met (mol%)		2.2	1.6	1.3	1.2	1.6	1.1
Ile (mol%)		3.7	4.6	5.1	5.0	4.7	6.6
Leu (mol%)		7.8	7.8	7.4	7.2	7.5	- 6.6
Tyr (mol%)		1.7	2.1	2.5	2.5	2.3	3.3
Phe (mol%)		2.5	1.5	0.6	0.6	1.2	0
His (mol%)		1.2	1.7	1.8	2.0	1.7	2.2
Lys (mol%)		2.0	3.3	3.6	4.1	3.3	4.4
Arg (mol%)		2.5	4.1	4.6	5.0	4.1	4.4

proteiny (mg)	87	33	190	38	392
cukry (mg)	24.0	1.3	0	0	25.6
poločas exist.pěny b) (sek)	356	44	68	54	172
sch o ρ no s t tvo ři t pě n ub)______________
v ml pěny/ml vzorku	1.3	1.1	1.5	0.8	1.3
obsah pěny	378	73	685	63	1260

^a) hodnoty z citace 18 ^b) naměřeno ve vodných roztocích, majících A(280 nm) = 0.5

- 24 Aminokyselinová analýza po kyselé hydrolýze (tabulka II), prováděná u proteklého maxima (píku) a tří poolů (spojených podílů), obsahujících široké maximum, prokázaly u proteklých podílů aminokyselinové složení připomínající hordeiny á gluteliny o vysokém obsahu Glx a Pro, zatímco široké maximum, vymyté gradientem NaCI, bylo považováno spíše za čistý LTP1 podle analýzy aminokyselin (tabulka II) a sekvenování aminokyselin od N-konce; elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti SDS ovšem stále vykazovala ve třech poolech obsahujících široké vymývané maximum stopy sloučenin, barvítelných barvivém Coomassie blue, jejichž molekulové hmotnosti byly v rozmezí 6 000- 18 000 Daltonů. Jak proteklý podíl obsahující hordein/glutelin (pool I), tak podíly LTP1 (pooly Il-IV) vykazovaly dobrou schopnost vytvářet pěnu ve vodě (tabulka II), ale poločas trvání pěny byl u podílů LTP1 velmi malý, na rozdíl od hordein/glutelinových podílů, vytvářejících pěnu o dlouhém poločasu trvání pěny (tabulka II). Výpočet obsahu pěny u čtyř poolů ukázal, že 95% obsahu pěny, nalezeného u LMW, bylo přítomno ve čtyřech poolech (tabulka II).

Příklad 2a

Frakcionace poolu III

Pool III, získaný z ležáckého piva tak jak bylo popsáno v Příkladu 2, byl frakcionován (rozdělen na podíly) podle molekulové hmotnosti gelovou filtrací na Sephadexu G-50 v sloupci (2,6 cm x 67 cm, 330 ml), ekvilibrovaném 20 mM roztokem octanu sodného a 0,1 M roztokem chloridu sodného o pH 4,9. Toto rozdělení poskytlo dvě maxima (píky), vykazující absorbanci při 280 nm, pool A a pool B (obrázek 11). SDS-PAGE (elektroforéza v polyakralamidovém gelu za přítomnosti SDS) v neredukujících podmínkách a metoda Western blotting za použití specifických protilátek vůči ječmennému LTP1 prokázaly, že pool A byl složen převážně z dimerních forem LTP, pozorovány však byly i

- 25 větší multimerní formy. Oproti tomu v poolu B byl nalezen pouze monomerní LTP1. ₄

Příklad 2b ¹H NMR spektra byla zaznamenána pro LTP1, získaný z ječmene (příklad 1b) a LTP1, získaný z pivní pěny. Spektra byla měřena při 37°C (310 °K) a pH 4,0.

Výsledná spektra jsou znázorněna na obrázcích 12A a 12B.

Spektrum (obr. 12A) LTP1 z ječmených zrn vykazuje ¹H NMR spektrum, typické pro globulární protein, u něhož je většina sekundární struktury tvořena a-šroubovicí.

To je zřejmé z převahy H“ jader, majících chemický posun nižší než 4,8 ppm (parts per milion, dílů z milionu). Nadto je rozptyl signálů NMR jasnou indikací toho, že zásadní část proteinu je sbalená (skládaná) a že se jedná o dobře definovanou sekundární strukturu.

Podrobná analýza spekter COSY (coorrelation spectroscopy, korelační spektroskopie), TOCSY (total corr. spectroscopy, celkové korelační spektroskopie) a NOESY (nuclear Overhauser spectroscopy, jaderné Overhauserovy spektroskopie) prokázala, že LTP1 z ječmenných zrn je globulární protein o dobře definované struktuře.

Spektrum (obr. 12B) LTP z pivní pěny je typické pro proteiny, které jsou zásadně nebo částečně nesbalené a v podstatě nemají sekundární a terciální strukturu. Lze tedy usuzovat, že LTP1 isolovaný z piva je více či méně denaturovaný.

- 26 Příklad 3 ι

Purifikace LTP1 z první sladiny

První sladina byla získána při výrobě ležáckého piva z pivovaru Carlsberg (Carlsberg Brewery). Sladina byla odstřeďována na přístroji Sorwall RC3 30 minut při rychlosti 4 000 otáček za minutu k odstranění jakýchkoli nerozpustných látek. Poté byl přidán síran amonný v konečné koncentraci 85 % a po 16 hodinách při 4°C byla výsledná suspenze odstřeďována 30 minut při rychlosti 4 000 ot. za minutu. Sraženina byla rozpuštěna ve 300 ml vody a 2 x 60 ml bylo podrobeno gelové filtraci na sloupci Sephadexu G-75 (5 cm x 87 cm, 1700 ml), ekvilibrovaném 50 mM roztokem octanu amonného o pH 4,5. Eluční průběh byl podobný elučnímu průběhu, získanému při gelové filtraci zhroucené pěny (obr. 2). Spojené podíly LMW byly lyofilizovány (k odstranění octanu amonného), rozpuštěny ve vodě, dialyzovány a podrobeny iontově výměnné chromatografií na S-Sepharose Fast Flow (5 cm x 7 cm), ekvilibrované 20 mM roztokem acetátu sodného o pH 4,9. LTP1 byl eluován zavedením lineárního gradientu NaCl (0 - 0,3 M) ve stejném pufru. Eluční profil se podobal profilu, znázorněnému na obr. 6 pro frakcionaci podílu LMW, isolovaného z pěny. Podíly, tvořící pool lil, byly spojeny a dialyzovány vůči destilované vodě v dialyzační membráně Spectra/por® (oddělující látky o molekulové hmotnosti 3 500 Daltonů). Koncentrace LTP1 (modifikovaná a nemodifikovaná) byla stanovena na základě analýzy aminokyselin.

Příklad 4

Podíly HMW a LMW, získané z ležáckého piva jak bylo popsáno v Příkladu 2, byly testovány vzhledem ke své schopnosti vytvářet pěnu ve vodě. Výsledky jsou zřejmé z tabulky III.

- 27 Schopnost tvořit pěnu (P) a poločas trvání pěny (F) u směsí HMW a LMW ve vodě

LMW (ug/ml) HMW (ug/ml)

Tabulka III

	0	0,3 0,6
75 P (ml pěny/ml vzorku) F (sek)	0,56±0,04 199±15	0,63±0,04 0,68±0,03 251±67 236±26
150 P (ml pěny/ml vzorku) F (sek)	0,89±0,05 177±14	0,95±0,03 0,97±0,03 251±27 309±30
300 P (ml pěny/ml vzorku) F (sek)	1,34±0,02 185±32	1,34±0,09 1,40±0,01 251±18 251±29
600 P (ml pěny/ml vzorku) F (sek)	1,89±0,08 208±61	1,99±0,15 1,83±0,05 258±65 239±10
LMW	HMW (ua/ml)
	1,2	2,4
75 P (ml pěny/ml vzorku) F (sek)	0,69±0,06 300±3	0,75±0,05 313±71
150 P (ml pěny/ml vzorku) F (sek)	1,04±0,03 267±8	1,09±0,05 293±37
300 P (ml pěny/ml vzorku) F (sek)	1,41±0,05 290±39	1,47±0,06 290±29
600 P (ml pěny/ml vzorku) F (sek)	2,01±0,09 263±102	2,10±0,07 277±24

- 28 Tyto výsledky ukazují, že koncentrace podílu LMW má velký vliv na schopnost tvořit pěnu, £ez ohledu na koncentraci HMW. To je dále dokresleno na obrázcích 3 a 4 za použití hodnot z tabulky III.

Příklad 5

LTP1 byl isolován z pěti odlišných ležá,ckých piv, lišících se schopností tvořit pěnu. LTP byl získán z 1,65 I piva v zásadě tak, jak je popsáno v Příkladu 2, pouze za použití iontově výměnné pryskyřice Mono S místo S-Sepharosy Fast Flow.

Ležácká piva byla vařena s různými odrůdami ječmene podle následujícího přehledu:

A:	Blenheim
B:	Caruso
C:	Grit
D:	Eminant
směs:	směs neznámých odrůd ječmene

Výsledky jsou zřejmé z tabulky IV.

- 29 Tabulka IV: Zkoumání podílů stabilizujících pěnu z ležáckých piv, vařených s různými odrůdami ječmene

slad	schop. tvořit pěnu	. směs3.	A	B	c,.	. D
pivo	ml pěny/mlvzorku poločas trv. pěny	0,72	1,13	1,13	1,44	1,20
	(sek)	181	200	189	258	179
	obsah pěny/1 pivo	715	1130	1130	1440	1200

2. znovunabytí proteinů
flota- (%)	32	21	32	30	31
ce obsah pěny/1 pivo	240	490	360	670	520

HMW	protein (% (hm./hm.)) cukr (% (hm./hm.)	16 84	12 88	8 92	15 85	14 86
	obsah pěny/1 pivo	210	160	190	270	210
LMW	protein (% (hm./hm.))	86	76	71	76	85
	cukr (% (hm./hm.)	14	24	29	24	15

proteklý podíl Mono (% proteinu) S^b podíl eluátu (% proteinu)

40 88

92 92 ^a) nebyl použit chmel ^b) iontově výměnná pryskyřice, Pharmacia, Švédsko

- 30 Příklad 6

Stanovení pěny byla⁴ prováděna u LTP1, isolovaného z ječmenné mouky, jak je popsáno v Příkladu 1, postupu b) a u poolu I a poolu lil, získaných z ležáckého piva tak, jak bylo popsáno v Příkladu 2.

Používanou vodou byla destilovaná voda.

Použitým pivem bylo ležácké pivo Carlsberg.

V každém testu bylo použito 10 ml vody nebo piva a pooly či LTP byly přidány těsně před vyvíjením pěny podle dřívějšího popisu.

Pokud byly ve vodě nebo v pivu rozpuštěny vzrůstající koncentrace isolovaného LTP1, poolu I nebo poolu III, roztoky vykázaly ve stanoveních pěny vzrůstající schopnost tvorby pěny (obr. 7, 8). Zvýšení schopnosti tvořit pěnu bylo méně zřetelné u roztoku piva (obr. 8) než u vodných roztoků (obr. 7), což mohlo být způsobeno přítomností ' složek, souhlasných s pěnovými složkami, v pivu. Při nízkých koncentracích proteinu byl účinek přidání podílu pivního LTP1 (poolu III) vyšší než účinek přidání podílu s obsahem hordein/glutelinových fragmentů (poolu I). Přídavek LTP1, isolovaného z ječmenné mouky, k pivu poněkud zvýšil jak schopnost tvorby pěny (obr. 8), tak i poločas trvání pěny. Kromě toho bylo zjištěno, že působení zvýšených , koncentrací LTP 1 (Příklad 5) na schopnost tvorby pěny je zřetelnější pro LTP1 isolovaný z piva (pooll III) než pro LTP1 isolovaný z ječmene (obr. 8). Rekombinantní pokusy, tj. stanovení pěny prováděná v roztocích 0,4 mg/ml poolu I v destilované vodě s rostoucími koncentracemi LTP1, isolovaného buď z ječmene nebo z piva (pool III), podpořily tato pozorování (obr. 9 a 10). Účinek ječmenného LTP1 na schopnost tvořit pěnu v přítomnosti poolu I byl menší než účinek podobné koncentrace poolu III.

- 31 Příklad 7

- « Stanovení ELISA (pro určení koncentrace LTP1)

Tvorba protilátek vůči ječmennému LTP1

Dva králíci byli imunizováni dávkou 100 pg ječmenného LTP1 (získaného z mouky ječmene Alexis podle popisu v Příkladu 1, postupu a)) na jednu imunisaci podle standardního imunizačního schématu, používaného firmou Dako, Glostrup, Dánsko.

ml séra bylo získáno od každého zvířete 54 dní po první injikaci a poté v měsíčních intervalech.

Sérum, získané z prvního odběru u jednoho zvířete byl použito při níže popsaných pokusech.

Vyčištění (purifikace) protilátek

Imunoglobulinové protilátky třídy G (IgG) byly vyčištěny z ostatních složek séra afinitní chromatografií na materiálu Protein-A-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) podle pokynů výrobce.

Protilátky, rozpoznávající LTP, 1 byly odděleny od. proti látek s jinými specifitami afinitní chromatografií na malém sloupci, připraveném kovalentním navázáním LTP1 z ječmene na Sepharosu. 64 mg ječmenného LTP1 bylo rozpuštěno v 10 ml roztoku 0,1 M NaHCO₃ a 0,5 M NaCI při pH 8,3 a spojeno se 2 g Sepharosy 4B, aktivované pomocí CNBr (Pharmacia, Švédsko), podle pokynů výrobce. 1 ml imunoadsorbentu pak byl upraven do malého sloupce a ekvilibrován 10

- 32 mM fosfátem sodným a 150 mM NaCl o pH 7,3 (PBS₁₀). Podíl IgG, chromatograficky čištěný i na Protein-A-Sepharose, byl nanesen na sloupec, který byl promýván ekvilibračním pufrem až do dosažení absorbance A₂₈₀ v hodnotě 0,002. Navázaný IgG byl eluován 0,5 M roztokem kyseliny mravenčí o pH 2,0, naředěným čtyřmi objemy 10 x PBS₁₀ a pH bylo upraveno na 4,0 pomocí NaOH. Vzorek byl nakonec dialyzován vůči PBS₁₀v membráně Spectra/por®, oddělující molekulovou hmotnost 3500 Daltonů, a biotinylován, jak je popsáno níže.

Biotinylace protilátek mg protilátek v 1 ml PBS₁₀ bylo smícháno s 0,1 ml 1M roztoku pufru (uhličitanu sodného) o pH 9,5. Poté byly protilátky biotinylovány přídavkem 57 μΙ 0,1 M BXNHS (N-hydroxysukcinimidový ester biotinamidokaproátu od firmy Sigma, USA, katalogové číslo B 2643) v DMSO (dimethylsulfoxidu. Směs byla 1 hodinu ponechána stát při laboratorní teplotě. Poté byl nezreagovaný BXNHS odstraněn a pufr byl zaměněn za PBS₁₀ gelovou filtrací, prováděnou podle pokynů výrobce na malém jednorázovém sloupci Sephadexu G-25 (PD-10 firmy Pharmacia, Uppsala, Švédsko), ekvilibrovaném PBS₁₀. Koncentrace protilátek v reagencii byla upravena na 1 mg/ml přidáním PBS₁₀ do celkového objemu 10 ml. Po přídavku 100 mg BSA (hovězího sérového albuminu) byla reagencie uchovávána v alikvotních dávkách při -20°C.

Stanovení za pomoci enzymu, vázaného na imunosorbent (ELISA) pro LTP

LTP byl stanovován pomocí postupu kompetitivního stanovení

ELISA

- 33 Vyčištěný ječmenný LTP byl nejprve adsorbován na vnitřní povrch polystyrénových jamek. J^mky byly upraveny v pruzích po 12, a pruhy byly umístěny v rámečcích, z nichž každý obsahoval 8 pruhů (Nunc Immuno Module C12 Maxisorb firmy Nunc, Dánsko). Ke každé jamce bylo přidáno 200 μί roztoku rozpuštěného LTP1, získaného tak, jak je popsáno v Příkladu 1, postupu a) (100 ng/ml PBS₁₀) a jamky byly inkubovány 16-20 hodin při 4°C. Po inkubaci byla zbývající vazná místa na polystyrénovém povrchu zablokována inkubací 225 μί BSA/PBST (1 mg BSA/ml PBST, kde PBST je PBS₁₀ s přídavkem 0,05 % Tween 20) na každou jamku, trvající 1 hodinu při 37°C. Poté byly jamky vyprázdněny, šestinásobně promyty PBST za pomoci ručního promývacího zařízení, odpovídajícího polystyrénovým pruhům (Nunc Immuno Wash 12 od firmy Nunc, Dánsko) a uchovávány až do použití při -20°C.

Vzorky obsahující LTP1 byly před analýzou vhodně zředěny v BSA/PBSTa ve stejném pufru byly připraveny standardní roztoky LTP1, získané tak, jak bylo popsáno v Příkladu 1, postupu a). Biotinylované protilátky, rozpoznávající ječmenný LTP1, byly přidány v konečné koncentraci 100 ng/ml. Alikvotní části směsí o objemu 200 pg pak byly v jamkách inkubovány 1 hodinu při 37°C. Každý vzorek nebo standardní vzorek byl analyzován ve třech souběžných vyhotoveních. Po inkubaci byly jamky vyprázdněny a promyty tak, jak bylo popsáno dříve.

V dalším kroku byly v jamkách inkubovány 10 minut při 20-22°C alikvotní části konjugátu streptavidinu a křenové peroxidázy (Sigma, USA, katal. číslo S 5512) o objemu 200 pg, naředěné na koncentraci 250 ng/ml BSA/PBST. Poté byly jamky opět vyprázdněny a promyty.

Nakonec bylo do každé jamky přidáno 200 μί substrátového roztoku, obsahujícího 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB, 100 pg/ml) a 0,015 % H₂O₂ ve fosfátovo-citrátovém pufru o pH 5,0 a inkubováno 10

- 36 Příklad 9 i

Pivo s vysokou koncentrací LTP1 bylo vyrobeno v pivovaru Čarlsberg 5OL Pilot Plant Brewery za použití 60 % ležáckého sladu a 40 % doplňků (kukuřičné drti). Kukuřičné drti odpovídaly specifikaci pivovaru Čarlsberg, tj. '

voda, %	<12.5
extrakt, suchá hmotn., % P	>89 %
tuk, suchá hmotnost, %	< 1,0 %
na výstupu z bubnového třídiče
Pfungstádter	>2 mm	0 %
	>1,27 mm	<3,5 %
•	<0,25 mm	<5,0 %

Pivovarnický postup zahrnoval dekokční rmutování a vaření mladiny 90 minut s 10% odparem. 15 minut po začátku varu mladiny byl do mladinového kotle přidán surový přípravek LTP1. Tento přípravek byl extrahován z 6 x 25 kg ječmenné mouky odrůdy Alexis, sklizené v Dánsku roku 1992, zahuštěn ultrafiltrací a vysrážen se síranem amonným, jak bylo popsáno dříve. Sraženina byla rozpuštěna v 5 I H₂O, diafiltrována na 850 ml, zahřáta na 100°C a okamžitě ochlazena v ledu. Roztok byl odstřeďován na odstředivce Sorwall RC3 30 minut rychlostí 4000 otáček za minutu. Koncentrace LTP 1 v supernatantu, stanovená testem ELISA, činila 60 mg/ml, a 800 ml bylo přidáno do mladinového kotle. Konečná mladina byla 14,5 % Plato. Řídký zákvas byl kvašen kvasinkami Čarlsberg (Saccharomyces carlsbergensis) ve válcovitých kónických tancích. Prvotní kvašení probíhalo 9 dní a zrání a stabilizace trvaly 10 dní. Nakonec bylo pivo filtrováno a upraveno na 10,6 % Plato.

Schopnost řídkého zákvasu pěnit a tatáž schopnost řídkého zákvasu, vyrobeného ze stejných surovin a za stejných podmínek, ale

- 37 bez přídavku LTP1, byly měřeny za použití analyzátoru stability pěny systému Carlsberg. Poločas trvání pěny u piva s vysokým obsahem LTP1 byla zvýšena na 113 sekund ve srovnání s 93 sekundami, , naměřenýmku piva bez přídavku LTP1.

Příklad 10

Hladiny LTP1 (suma modifikovaných a nemodifikovaných LTP1) v kongresní sladině

Slad byl vyroben z mnoha odrůd ječmene, normálně používaných pro vaření piva. Ječmenné odrůdy byly pěstovány v odlišných lokalitách a byly sklizeny v různých letech.

Slad byl připraven jako slad pro ležáské pivo.

Kongresní sladina byla vyrobena ze vzorků sladu za použití standardní rmutovací metody EBC, jak bylo popsáno výše.

Hladiny LTP1 (suma modifikovaných a nemodifikovaných LTP1) byly ve vzorcích kongresní sladiny stanoveny postupem ELISA, popsaným výše. Celkem bylo analyzováno 82 vzorků sladiny, odpovídajících 41 vzorkům sladu.

Test ELISA byl prováděn tak, jak bylo popsáno v Příkladu 7 a koncentrace LTP1 byla stanovena za použití standardní křivky jako ekvivalentů ječmenného LTP1, tj. bez vynásobení korekčním faktorem.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce VI. Každá hodnota představuje průměr dvou jednotlivých kongresních sladin.

- 38 Tabulka VI

odrůda ječmene	země původu	rok sklizně	LTP v kongresní sladině (mg/l)
Triumph	Francie		65
Ariel			70
neznámá	Austrálie		85
neznámá	Německo	?	108
Alexis	Velká Británie	1992	66
Triumph	Francie	1992	76
Ariel	Dánsko	1992	82
neznámá	Austrálie	?	99
neznámá	Austrálie	?	96
neznámá	Austrálie	?	78
neznámá	Anglie	?	118
Natasha	Francie	1992	118
Halcyon	Francie	1992	78
BL.IIIs	?	1991	92
Natasha	Francie	1992	104
Natasha	Francie	1992	102
Halcyon	Dánsko	1992	109
Caruso	Francie	1993	120
Seňor	Dánsko	1993	70
Alexis-81	Dánsko	1993	82
Jessica	Dánsko	1993	93
Chariot	Dánsko	1993	79
Goldie	Dánsko	1993	84
koke	Dánsko	1993	81
Maud	Dánsko	1993	110
neznámá	Indie	1993	121
neznámá	Indie	1993	103
neznámá s	Anglie -	?	— 110 -
neznámá	Skotsko	?	117
neznámá	?	?	140
Lenka	Dánsko	1992	87
Lenka	Dánsko	1992	98
neznámá	?	1993	61
Natasha	Francie .	1992	76
Halcyon	Dánsko	1992	69
Alexis	Anglie	1992	75
neznámá	Dánsko	1992	100
neznámá	Anglie	1992	99

neznámá	Anglie	1992	93
Alexis	Dánsko , i Dánsko	1992	92
Alexis	1992	91
neznámá	Anglie	1992	102
Alexis	Dánsko	1993	67
Triůmph	Francie	1992	90

Příklad 11

Isolace a vyčištění (purifikace) obilného LTP z pšeničné mouky

Čistý pšeničný LTP1 byl isolován z 30 kg pšeničné mouky extrakcí 270 I vody při pH 7,8 po dobu 4 hodin. Směs byla ponechána přes noc při 4°C k umožnění vysrážení nerozpustného materiálu. 195 I supernatantu bylo zahuštěno ultrafiltrací na 6,9 I a zbylá mouka byla odstraněna odstředěním. Poté byl přidán síran amonný do 80 % nasycení a po 16 hodinách při teplotě 4°C byla výsledná suspenze odstředěna. Jedna čtvrtina sraženiny byla rozpuštěna ve 400 mí vody a dialyzována v dialyzační membráně Spectra/por® (oddělující molekulovou hmotnost 3 500 Daltonů) proti vodě. Dialyzát (1 I) byl odstředěn, jeho pH bylo upraveno na 6,5 a poté byl podroben iontově výměnné chromatografií na sloupci S-Sepharose Fast Flow (5 cm x 15 cm, 300 ml), ekvilibrovaném v 20 mM roztoku Mes (kyselina 2-(N-morfolino)ethansulfonová) o pH 6,5. Pšeničný LTP1 byl eluován gradienten NaCl (0 až 0,1 M) ve stejném pufru.

Podíly, obsahující složku o velikosti 10 kDa byly identifikovány — pomockSDS-PAGE-za použitu zařízenUPhast-System4irmy-Rharmacia;== pak byly spojeny a zahuštěny ve vakuu při 35°C na rotační odparce. Složky koncentrovaného vzorku byly rozděleny gelovou filtrací na Sephadexu G-50 ve sloupci (2,5 cm x 67 cm, 330 ml), ekvilibrovaném 20 mM octanem sodným a 0.1 M NaCl, pH 4,9. Maximum (pík), obsahující protein o velikosti 10 kDa byl určen pomocí SDS-PAGE a sekvenování aminokyselin od N-konce, které prokázalo sekvenci

- 40 lle-Asp-*-Gly-His-Val-Asp-Ser-Leu-Val-, kde hvězdička označuje prázdné místo, odpovídající cysteinu nalezenému v této poloze u pšeničného LTP1, což potvrdilo, že touto složkou byl čistý pšeničný LTP1. Přípravek byl dialyzován v dialyzační membráně Spectra/por® (oddělující molekulovou hmotnost 3 500 Daltonů) a lyofilizován.

Příklad 12

Přidání pšeničného LTP1 během přípravy mladiny

Účinek přidání pšeničného LTP1 během kroku varu sladiny byl zkoumán za použití modelového systému, popsaného v Příkladu 8. Čistý pšeničný LTP (získaný podle postupu v Příkladu 11) (0,5 mg/ml) a/nebo chmelový extrakt (61 mg α-kyseliny/l) byly přidány v počátku varu. Výsledné schopnosti tvorby pěny jsou zřejmé z tabulky VII.

Tabulka VII bez příd. LTP schopn. tvorby přídavek LTP schopn. tvorby pěny (ml/ml) (0,5 mg/ml) pěny (ml/ml)

sladina vařena 1,01±0,04 bez chmelu	LTP přid. k sladině před varem bez chmelu	1,76±0,07
sladina vařena Í,65±Ó,05 s chmelem	LTP přid. k sladině před varem s chmelem	2,28±Ó,Ó8

Příklad 13

Vliv varu na schopnost tvorby pěny u ječmenného a pšeničného LTP1

- 41 Ječmenný nebo pšeničný LTP1 (0,5 mg/ml), získaný podle postupu v Příkladu 1b či 11, byl rózpuštěn v 20 mM roztoku Mes o pH 5.5. Při sonikaci (dezintegraci ultrazvukem byl přidán 2% ethanol (za přítomnosti 2,5 mg/ml trilinoleinu, nebo bez ní). Chmelový extrakt byl přidán .ve výsledné koncentraci 61 mg a-kyselin/l, jak je uvedeno v tabulce Vlil a směs byla vařena 90 minut tak, jak je popsáno v Příkladu 8. Měření pěny byla uskutečněna po přidání podílu HMW (2,5 pg/ml), získaného tak, jak je uvedeno v Příkladu 2.

Tabulka Vlil

	povaření	přídavné látky	schopnost tvorby pěny
ječmenný LTP1	-	-	0,78±0,02
	90 minut	-	0,61±0,03 . 33-
	90 minut	chmel	1,40±0,05
	90 minut	chmel+trilineolin	1,92±0,05
obilný LTP1	-	-	0,80±0,04
	90 minut	=	1,02±0,03
	90 minut	chmel	1,85±0,06
	90 minut	chmel+trilineolin	1,83±0,07

- 42 Citovaná literatura

1) Anderson, F.B. & Harris, G.: Nitrogenous constituents of brewing materials. XII. Foam-stabilizing substances in beer. J. Inst. Brew. 69:383-388 (1963).

2) Asano, K.& Hashimoto, N.: Isolation and characterization of foaming proteins of beer. J. Am. Soc. Brew. Chem. 38: 129-137(1980).

3) Bernhard, W.R. & Sommerville, C.R.: Coidentity of putative amylase inhibitors from barley and finger millet with phospholipid transfer _s proteins inferred from amino acid sequence hormology. Arch.Biochem. Biophys.269: 695-697(1989).

4) Bishop, L.R.: Haze- and foam-forming substances in beer. J. Inst. Brew. 81: 444-449 (1975).

5) Bradford, M.M.: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitiés of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976).

6) Dále, C.J. & Young, T.W.: Low molecular weight nitrogenous components and their influence on the stability of beerfoam. J. Inst. Brew. 98: 123-127 (1992). , . . . . . .. .

7) Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K. Rebers, P.A. & Smith, F.: Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28: 350-356 (1956).

8) Haugsted, C. & Erdal, K.: Head hunting. Proč. Eur. Brew. Conv., 23rd Congress. Lisbon 1991, str. 449-456.

- 43 9) Haugsted, C., Pedersen, M.B. & Erdal, K.: An optoelectrical foam assay systém. Monatsschr. Brauwissenschaft 43: 336-339 (1990).

10) Hejgaard, J. & Sórensen, S.B.: Characterization of a protein-rich beer fraction by two-dimensional immunoelectrophoretic techniques. Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg 40: 187-203 (1975).

11) Hollemans, M. & Tonies, A.R.J.M.: The role of specific proteins in beer foam. Proč. Eur. Brew. Conv., 22nd Congress. Zúrich 1989, str , 561-568.

12) Mohan, S.B., Smith, L., Kemp, W. & Lyddiatt, A.: An 15 immuno- Chemical analysis of beer foam. J. Inst. Brew. 98: 187-192 (1992).

13) Molina, A., Segura, A. & Garcia-Olmedo, F.: Lipid transfer proteins (nsLTPs) from barley and maize leaves are potent inhibitors of bacterial and fungal plant pathogens. FEBS Letters 316: 119-122 (1993).

14) Mundy, J. & Rogers, J.C.. Selective expression of a probable amylase/protease inhibitor in barley aleurone celíš: Comparison to the barley amylase/subtilisin inhibitor. Planta 169: 51-63 (1986).

15) Sharpe, F.R., Jacques, D., Rowsell, A.G. & Whitear, A.L.. Rapid methods of measuring the foam-active nitrogenous components of worts and beers. Proč. Eur. Brew. Conv., I8th Congress Copenhagen 1981, str. 607- 614 (1981).

16) Skriver, K., Leah, R., Muller-Uri, F., Olsen, F.-L. & Mundy, J.: Structure and expression of the barley lipid transfer protein gene Ltpl. Plant. Mol. Biol. 18: 585-589 (1992).

17) Slack, P.T. & Bamforth, C.W.: The fractionation of polypeptides from barley and beer by hydrophobic interaction chromatography: The influence of their hydrophobicity on foam stability. J. Inst. Brew. 89: 397-401 (1983).

18) Svensson, B., Asano, K., Jonassen, I., Poulsen, F.M., Mundy, J. & Svendsen, I.: A IO kD barley seed protein homologous with an α-amylase inhibitor from indián finger millet. Carlsberg Res. Commun.51: 493-500 (1986).

19) Whitear, A.L.: Basic factors that determine foam stability. The Institute of Brewing. Australia and New Zealand Section. Proc.15th _r. Conv. New Zealand 1978, str. 67-75.

20) Yokoi, S., Maeda, K., Xiao, R., Kamada, K. & Kamimura, M.: Characterization of beer proteins responsible for the foam of beer. Proč. Eur. Brew. Conv.22nd Congress. Zurich 1989, str. 503-512, (1989).

21) Hallgren, L., Rosendal, I. and Rasmussen, J.N.: Experiences with a new foam stability analyzer, System Carlsberg, J. Am. Soc. Brew. Chem. 49: 78-86 (1991).

22) Rasmussen, J.N.: Automated analysis of foam stability. Carlsberg

Res. Commun 46: 25-36 (1981). ... = » ... _ .. .

23) P. Vaag: The Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) in the Beverage Industries: Principles and Practice. In Analysis of Nonalcoholic Beverages. Modem Methods of Plant Analysis, vol. 8 (Eds. Linškens, H.F. and Jackson, J.F.), Springer-Věrlag, Berlin 1988.

Zastupuje:

Claims (23)

1. Nápoj, obsahující proteiny a/nebo peptidy, vyznačující s é ' .t í m, že obsahuje obilný LTP a/nebo jeho homology, definované jako proteiny o 50-110 aminokyselinách, s výhodou pak 80-100 aminokyselinách, vykazující nejméně 60 %, lépe 80% či větší sekvenční homologii s obilným LTP, a/nebo obsahuje modifikovaný podíl obilného LTP, získatelný z obilného LTP a/nebo homologů zahřátím, povařením a/nebo rmutováním obilného LTP a/nebo homologů ve vodě při pH mezi 3 a 7, za předpokladu, že koncentrace obilného LTP a/nebo homologů a/nebo modifikovaného podílu obilného LTP těchto látek je nejméně rovna X a s výhodou pak nejméně X1, přičemž nápojem je pivo a X a X1 označují hladiny, získatelné u piva vařeného ze suroviny bez dalšího přidání látek obsahujících LTP a tato surovina při použití standardního rmutovacího postupu EBC poskytuje kongresní sladinu o koncentraci obilného LTP, která odpovídá 125 pg/ml, respektive 150 pg/ml nemodifikovaného LTP1.

2. Nápoj podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje ječmenný LTP a/nebo homology, jak zde byly definovány, a/nebo podíl modifikovaného obilného LTP, získatelný z ječmenného LTP.

3. Nápoj podle nároku 1 nebo 2, v y z n a č u j í c í se t í m, že tento nápoj jě kvašený.

4. Nápoj podle nároku 1, 2 nebo 3 , v y z n a č u j í c í se tím, že koncentrace v nápoji činí nejméně 25 pg/ml a s výhodou více než 100 pg/ml.

5. Nápoj podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se

- 46 t í m, že dále obsahuje obilné skladovací proteiny jako je hordein a/nebo glutelin či jejich fragmenty»

6. Nápoj podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, v y z n a č u j i c i se t i m, že dále obsahuje další albuminy, jako je protein Z, získatelný z , piva.

*

7. Nápoj podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, v y z n a č u j i c i se t i m, že dále obsahuje cukry.

8. Nápoj podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se t i m, že dále obsahuje tuky a/nebo mastné kyseliny.

^:

9. Nápoj podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, vyznačující se t i m, že tímto nápojem je pivo.

10. Nápoj podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, vyznačující se t i m, že dále obsahuje chmelové složky, jako jsou chmelové iso-a kyseliny a jiné hořké pryskyřice z chmele.

11. Způsob výroby nápoje s obsahem proteinů a/nebo peptidů, vyzná čující se t i m, že se obilný LTP a/nebo jeho homology, v

definované jako proteiny o 50-110 aminokyselinách, s výhodou pak ₅ 80-100 aminokyselinách, vykazující nejméně 60 %, lépe 80% či větší sekvenční homologii s obilným LTP, a/nebo peptidovo/proteinový podíl, získatelný z obilného LTP a/nebo homologů zahřátím, povařením a/nebo rmutováním obilného LTP a/nebo homologů ve vodě při pH mezi 3 a 7, přidá do nápoje spojitě nebo v jednom či ve více výrobních krocích, za předpokladu, ze koncentrace obilného LTP a/nebo homologů a/nebo modifikovaného podílu obilného LTP těchto látek je nejméně rovna X a s výhodou pak nejméně X1, přičemž nápojem je pivo a X a X1 označují

- 47 hladiny, získatelné u piva vařeného ze suroviny bez dalšího přidání látek obsahujících LTP i a tato surovina při použití standardního rmutovacího postupu EBC poskytuje kongresní sladinu o koncentraci obilného LTP, která odpovídá 125 pg/ml, respektive 150 pg/ml nemodifikovaného LTP1.

12. Způsob výroby podle nároku 11 a zahrnující krok rmutování, vyznačující se tím, že se obilný LTP a/nebo homology a/nebo modifikovaný podíl obilného LTP této látky přidávají před krokem rmutování.

13. Způsob výroby podle nároku 11 a zahrnující krok povaření, vyznačující se tím, že se obilný LTP a/nebo homology a/nebo modifikovaný podíl obilného LTP této látky přidávají před krokem povaření.

14. Způsob výroby podle kteréhokoli z nároků 11 až 13, vyznačující se tím, že obilným LTP je ječmenný LTP.

15. Způsob výroby podle kteréhokoli z nároků 11 až 14, vyznačuj i c i s e t i m , že se obilný LTP a/nebo homology a/nebo modifikovaný podíl obilného LTP této látky přidávají ve formě částečně nebo v zásadě rozpustné přídavné látky.

16. Způsob výroby podle kteréhokoli z nároků 11 až 15, vyznačující se tím, že se obilný LTP a/nebo homology a/nebo modifikovaný podíl obilného LTP této látky přidávají v množství nejméně 25 pg/ml a s výhodou větším než 100 pg/ml.

17. Způsob výroby podle kteréhokoli z nároků 11 až 16, kde nápojem je pivo a výroba zahrnuje kroky

- 48 i) přípravy sladu nebo sladového extraktu, ii) přípravy mladiny, t iii) zakvašení mladiny, iv) vyčeření a dokončení piva, vyznačující se t i m, že se obilný LTP a/nebo homology a/nebo modifikovaný podíl obilného LTP této látky přidávají předem nebo v průběhu jednoho či více z kroků i,) ii), iii) a iv).

18. Způsob výroby podle nároku 17, v y z n a č u j i c i se tím, že se obilný LTP a/nebo homology a/nebo modifikovaný podíl obilného LTP této látky přidávají zejména v průběhu kroku ii) nebo před krokem ii).

19. Způsob výroby podle nároku 17, vyznačující se tím, že se obilný LTP a/nebo homology a/nebo modifikovaný podíl obilného LTP této látky získávají z ječmene, který se kultivuje tak, aby měl vysoký obsah LTP, zvláště pak L.TP1, za použití genetického přenosu, a slad se vyrábí ze suroviny, skládající se ze zrn tohoto kultivovaného ječmene.

20. Způsob výroby podle nároku 17, vyznačující se tím, že se obilný LTP a/nebo homology a/nebo modifikovaný podíl obilného LTP této látky získávají z kvasinek, obsahujících sekvenci DNA, kódující v genomu obilný LTP, zejména pak LTP1, a kvasinky se přidávají v kroku iii); -...™.. ...,, , ,

21. Použití sloučeniny, zahrnující obilný LTP a/nebo jeho homology, definované jako proteiny o 50-110 aminokyselinách, s výhodou pak 80-100 aminokyselinách, vykazující nejméně 60 % a lépe 80% či větší sekvenční homologii s obilným LTP, a/nebo modifikovaný podíl obilného LTP, získatelný z obilného LTP a/nebo homologů zahřátím, povařením a/nebo rmutováním obilného LTP a/nebo homologů ve vodě při pH mezi 3 a 7, jako pěnu tvořící přísady do nápoje.

22. Použití podle nároku 21, kdy sloučenina zahrnuje obilný LTP a/nebo homology a/nebo modifikovaný podíl obilného LTP této látky ve formě rozmělněných nebo rozdrcených zrn nebo zrnových produktů, nebo extraktu zrn či zrnového produktu.

23. Použití podle nároku 21, kdy se modifikovaný podíl obilného LTP získá z obilného LTP, který se vaří ve vodě společně s jednou nebo více z následujících složek: hordein, chmelové složky a tuky, zejména triglyceridy.