CZ118693A3 - Combination for treating chronic viral liver diseases - Google Patents
Combination for treating chronic viral liver diseases Download PDFInfo
- Publication number
- CZ118693A3 CZ118693A3 CZ931186A CZ118693A CZ118693A3 CZ 118693 A3 CZ118693 A3 CZ 118693A3 CZ 931186 A CZ931186 A CZ 931186A CZ 118693 A CZ118693 A CZ 118693A CZ 118693 A3 CZ118693 A3 CZ 118693A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- combination
- dna
- polypeptide
- chain
- chains
- Prior art date
Links
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title description 7
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 title description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 78
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 123
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 12
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 80
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 40
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 28
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 10
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 5
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 101100188552 Arabidopsis thaliana OCT3 gene Proteins 0.000 description 4
- 108010055991 BglII endonuclease Proteins 0.000 description 4
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N Ala-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 3
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 3
- AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N Ser-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GORKKVHIBWAQHM-GCJQMDKQSA-N Ala-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GORKKVHIBWAQHM-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010092265 CCWGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102100025840 Coiled-coil domain-containing protein 86 Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- UESJMAMHDLEHGM-NHCYSSNCSA-N Gly-Ile-Leu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UESJMAMHDLEHGM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 2
- FDQYIRHBVVUTJF-ZETCQYMHSA-N His-Gly-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 FDQYIRHBVVUTJF-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 101000932708 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 86 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 108010045673 endodeoxyribonuclease XBAI Proteins 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 2
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 2
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 2
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- -1 prednisolone Chemical class 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-benzamido-3-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 1
- GOVUDFOGXOONFT-VEVYYDQMSA-N Asn-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GOVUDFOGXOONFT-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241000020089 Atacta Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000020847 Body for Life Nutrition 0.000 description 1
- 101710147327 Calcineurin B homologous protein 1 Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101000896148 Enterobacteria phage T4 Baseplate central spike complex protein gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101800001466 Envelope glycoprotein E1 Proteins 0.000 description 1
- 101000597227 Escherichia phage Mu Probable terminase, small subunit gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101000912555 Escherichia phage lambda Tail fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710170470 Glycoprotein 42 Proteins 0.000 description 1
- 101000764556 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 206010019759 Hepatitis chronic persistent Diseases 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 101000804764 Homo sapiens Lymphotactin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N Ile-Leu-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100035304 Lymphotactin Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 1
- FLMYSKVSDVHLEW-SVSWQMSJSA-N Ser-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLMYSKVSDVHLEW-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- ZCPCXVJOMUPIDD-IHPCNDPISA-N Trp-Asp-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 ZCPCXVJOMUPIDD-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 102100036955 Xin actin-binding repeat-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108050000064 Xin actin-binding repeat-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
(57) Řešení spočívá v kombinaci, tvořené alespoň jedním polypeptidovým řetězcem, zprostředkujícím antigenitu jednoho nebo většího počtu epitopů a nosiče, umožňujícího účinnost těchto polypeptidových řetězců. Uvedenou kombinaci je možno použít k výrobě farmaceutických prostředků pro léčení chronické virové hepatitidy.
' ' 7 /7 VJ
- 1 Kombinace . pro léčení chronických virových jaterních onemocnění
Oblast vynálezu
Vynález se týká kombinace pro léčení chronických virových jaterních onemocnění, který obsahuje polypeptidový řetězec, připravený způsobem s použitím rekombinantní DNA a nosič. Vynález se rovněž týká řetězců DNA# které jsou kódovými řetězci pro uvedený polypeptid a také buněk po transfekci, u nichž dochází k expresi polypeptidu.
Dosavadní stav techniky
Alespoň pět od sebe odlišných virů, zejména viry hepatitidy A, B, C, D a E vyvolávají klinický obraz akutního zánětu jater. Hepatitida A a E, která se přenáší zažívací soustavou se vždy vyhojí, kdežto hepatitida typu B, C (dříve nazývaná parenterální hepatitida, odlišná od typu A a B) a D může pokračovat do chronického zánětlivého stadia, v jehož důsledku může dojít k jaterní cirhose nebo může vzniknout primární karcinom z jaterních buněk.
Existuje poměrně málo údajů, týkající se hepatitidy typu C a D, způsobu jejich diagnosy, jejich léčení a také příslušného viru. Virus hepatitidy D je RNA-virus, o němž je známo , že je neúplný. Z tohoto důvodu je nutné, aby pro rozvoj onemocnění u nemocných byl přítomen ještě pomocný virus a k onemocnění proto dochází pouze u jednotlivců, infikovaných HBV. V poslední době byl objeven virus hapatitidy C a byl vyvinut test s použitím protilátky (anti-HCV), který usnadňuje diagnosu infekci virem chronické hepatitidy
C. Z uvedených důvodů vzniká zvyšující se potřeba léčení uvedených onemocnění.
Totéž platí pro chronickou hepatitidu B, která je daleko dokonaleji prostudovaným onemocněním, zejména pokud jde o diagnosu imunologickými metodami, o virus, který je příčinou tohoto onemocnění, jakož i o životní cyklus tohoto viru a jeho řetězec DNA. Nemocný se označuje jako chronický nosič viru hepatitidy B v případě, že je možno DNA viru prokázat v jeho organismu déle než 10 tudnú, antigen HBe (HBeAg) po dobu více než 12 týdnů nebo v případě, že v organismu je možno prokázat povrchový antigen viru hepatitidy V (HBsAg) po dobu delší než 6 měsíců.
Chronickou hepatitidou typu B trpí přibližně 3Ó0 milionů lidí, přičemž většina z těchto lidí žije na dálném východě.
V případě těchto lidí dochází k hlavnímu riziku infekce v průběhu porodu nebo bezprostředně po porodu vzhledem k tomu, že matka s chronickou infekcí přenáší virus na svého novorozence. 90 % dětí, infikovaných tímto způsobem bude trpět v pozdějším životě chronickou infekcí. V západních státech dochází k infekci obvykle později v průběhu života, během dětství nebo i v dospělosti, převážně dochází k přenosu parenterálně nebo při sexuálním styku. V těchto případech je infekce hepatitidou B po porodu vzácnější a pouze 5 až 10 % infikovaných se stává chronickými nosiči. Přenesený virus sám však není zodpovědný za určité reakce infikovaných lidí a není zcela zřejmé, proč u některých lidí dochází k eliminaci viru a u některých k udržení viru v organismu po celý život. Nejpravděpodobněji závisí na stavu imunologického aparátu budoucí tělesný stav infikovaných lidí.
Virion HB (částice Dane) je tvořena různými strukturními bílkovinami, a to bílkovinami jádra a povrchovými bílkovinami (S). Povrchové bílkoviny jsou produktem translace otevřeného čtecího rámce, který zahrnuje kódové řetězce tří oblastí typu S, z nichž každá začíná kodonem ATG, který je schopen zahájit translaci in vivo. Uvedené tři oblasti se označují preSl, preS2 a S v pořadí od 5'-zakončení ke 3'-zakončení molekuly. Existuje šest bílkovinných produktů, odvozených od tohoto ORF: glykosylovaná a neglykosylovaná forma hlavní bílkoviny, gp27 a p24, k jejíž translaci dochází pouze z oblasti S, obsahující 226 zbytků aminokyselin, střední bílkovina, obsahující 281 zbytků aminokyselin a obsahující jeden nebo dva postranní polysacharidové řetězce gp33 a gp36, pro niž je kódem oblast preS2 a S a konečně glykosylovaná (gp42) a nehlykosylovaná (p39) forma bílkoviny s dlouhým řetězcem, obsahující 39 až 400 zbytků aminokyselin v závislosti na serotypu viru, tato bílkovina vzniká translací preSl, praS2 a S. Bílkovinami jádra jsou HBeAg a HBeAg, přičemž druhá z těchto bílkovin vzniká zpracováním první uvedené bílkoviny.
Částice Dane, která je infekčním virionem, obsahuje jak bílkovinu jádra, tak povrchové bílkoviny, kdežto vlákna jsou tvořena směsí šesti povrchových antigenů. Peptidy S jsou samy o sobě kombinovány v částicích o velikosti 28 nm, které jsou zcela neinfekční.
Nemocní, kteří jsou infikováni virem HB a prošli několika stadii hepatitidy jsou tedy označováni jako nemocní, trpící chronickou infekcí HBV. Bezprostředně po infekci nastává infekční stadium, ktaré je charakterizováno přítomností antigenů HBeAg v krevním seru. Pokračující HBs-antigenemie přes inhibici replikace HBV znamená, že se řetězce DNA viru integrovaly do buněčného genomu nemocného. Tyto integrované řetězce viru však nezpůsobují syntézu úplného viru hostitelskou buňkou. Jaterní buňky, v nichž je integrován řetězec HBV, mohou produkovat pouze antigen HBsAg, který je možno prokázat v krevním seru nemocných a který je tedy indikátorem chronické hepatitidy typu B. Je pravděpodobné, že transformované jaterní buňky nejsou rozrušovány cytotoxickými T-buňkami, avšak proliferují a v důsledku toho se vyvíjí bu3 chronická přetrvávající hepatitidy CPH nebo chronická aktivní hepatitida CAH, z níž se může dále vyvinout jaterní cirhosa nebo také primární hepatocelulární karcinom, obě tato onemocnění mohou vést k předčasnému úmrtí nemocného.
V poslední době bylo prokázáno, že nemocní, kteří trpí chronickou infekcí HBV mají rovněž defekt v endogenní produkci interferonu, jak bylo popsáno v publikaci Abb a další, J. Med. Virol., 1985, 16, 171 - 176. Z tohoto důvodu byly činěny pokusy léčit nemocné, trpící chronickou hepatitidou B po průkazu přítomnosti HBeAg a HBV-DNA v krevním seru podáváním interferonu alfa (IPNalfa). Při pokusech na velkém množství nemocných bylo prokázáno, že při podávání interferonu alfa došlo ke statisticky významně zvýšené eliminaci viru hepatitidy B ve srovnání s kontrolními příklady. Avšak nemocní, infikovaní v průběhu porodu nebo těsně po narození na toto léčení odpovídali v daleko nižší míře. Tento fenomen naneštěstí znamená, že uvedeným způsobem není možno léčit přibližně 75 % nosičů tohoto onemocnění.
V současné době zůstává přesný mechanismus působení interferonu alfa na chronickou hepatitis B nejasný. Protivirový účinek této látky by mohl infikované buňkx chránit před infekcí, nebo by mohlo docházet ke snížení transkripce, translace a replikace viru v infikovaných buňkách. Mimoto má interferon také imunomodulační účinky, zejména dochází při jeho aplikaci k aktivaci T-buněk, makrofágů a NX-buněk a k indukci exprese bílkovin MHC skupiny I.
Další přístup k léčení chronické hepatitdy B je založen na myšlence, dosáhnout inhibice replikace viru a tím napomoci imunologickému systému hostitele dosáhnout eliminace viru, k jehož replikaci nemůže dojít. Za tímto účelem byly zkoumány protivirové látky, například adeninarabinosid a adeninarabinosidmonofosfát jako možné účinné látky pro léčení jednotlivců s chronickou infekcí HBV.
Avšak méně než polovina nemocných odpověděla na tuto léčbu bud tak, že přechodně došlo k přeměně HBeAg na anti-HBe v krevním seru. Dalším negativním hlediskem při použití těchto protivirových látek je skutečnost, že uvedené sloučeniny potlačují imunologický systém nemocného.
U chronických nosičů těchto virů byly zkoumány ještě další účinné látky, například interferon beta, acycloquanosin (acyclovir), intsrleukin 2, steroidy, například prednisolon a kombinace těchto látek. Při použití žádné z uvedených látek však nebylo možno dosáhnout příznivějších výsledků než při léčení interferonera alfa. Pouze kombinační léčbou, při níž se na počátku léčení podávají steroidy a pak se podává ještě interferon alfa, je u některých nemocných možno zvýšit počet zlepšených případů.
Z literatury je již známo, že šimpanzy, trpící chronickou infekcí HBV nebo možno vyléčit podáváním HBsAg, vázaným na tetanový toxoid, ani podáváním protilátek anti-HBS. Mimoto byly činěny pokusy imunizovat nemocné, trpící chronickou infekcí HBV podáváním peptidů S. Při tomto způsobu léčení však nedošlo u léčených osob ani ke tvorbě protilátek anti-HBS.
Mimoto podle definice uvedené na onemocnění je hlavní vlastností chronických nosičů viru hepatitidy B skutečnost, že v jejich krevním seru je možno prokázat antigen HBsAg. Nebylo tedy vůbec možno předpokládat, že by pomocí kombinace, obsahující epitop virového peptidů S, aktivujícího T-buňky podle vynálezu bylo možno dosáhnout imunizace a při dostatečně dlouhé době podávání i úplného vyléčení chronických nosičů viru hepatitidy B.
Vynález si klade za úkol navrhnout účinný prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy, při jehož použití by mohlo být dosaženo dobrého účinku, zejména dlouhodobé inhibice replikace viru HBV, ztráty DNA a DNA-polyerázy tohoto viru a současně by mělo být dosaženo také vymizení antigenů HBeAg a HBsAg v krevním seru nemocných, trpících tímto onemocněním.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří kombinaci pro léčení chronických virových jaterních onemocnění, která obsahuje směs
a) alespoň jednoho polypeptidového řetězce, schopného zprostředkovat antigenitu jednoho nebo většího počtu epitopů a
b) nosiče, schopného umožnit účinek řetězců epitopu a), přičemž polypeptidóvé řetězce a) mohou být na nosič b) vázány adsorpci, jakoukoliv chemickou vazbou nebo pomocí sekundárních valencí.
Podstatu vynálezu dále tvoří také použití svrchu uvedené kombinace polypeptidového řetězce a nosiče pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chronické virové hepatitidy.
Při použití svrchu uvedené kombinace nebo farmaceutic kého prostředku s jejím obsahem je možno léčit chronickou virovou hepatitidu tak, že se nemocným podává svrchu uvedená kombinace a) alespoň jednoho polypeptidového řetězce, schopného zprostředkovat antigenitu jenoho nebo většího počtu epitopů a b) nosiče, schopného umožnit účinek řetězce epitopů a), přičemž polypeptidový řetězec a) může být na nosič b) vázán adsorpci, jakoukoliv chemickou vazbou nebo pomocí sekundárních valencí.
Je důležité, aby polypeptidový řetězec a), který může být tvořen jedním polypeptidem nebo větším počtem různých polypeptidů, byl schopen zprostředkovat antigenitu epitopů, aktivujícího T-buňky, a to přímým nebo nepřímým způsobem.
Podle vynálezu může být polypeptidovým řetězcem a) polypeptid nebo kombinace dvou nebo většího počtu polypeptidů viru hepatitidy B, a to jakéhokoliv podtypu tohoto viru, zvláště adw, ayw, adr a ady. Tyto peptidy, odvozené od viru hepatitidy B mohou být například peptidy praSl, preS2 nebo S nebo také antigen jádra HBV.
Jako uvedené polypeptidové řetězce a) je možno mimoto použít jakýkoliv za svrchu uvedených polypeptidů, nebo kombinaci dvou nebo většího počtu polypeptidů, které byly modifikovány bud vypuštěním některého ze zbytků aminokyselin, přičemž alespoň jeden epitop, tvořený alespoň šesti po sobě následujícími zbytky aminokyselin musí být zachován, nebo přidáním dalších zbytků aminokyselin na N-tarminálním zakončení, na C-terminálním zakončení nebo uprostřed polypeptidového řetězce a). Je samozřejmé, že ve všech uvedených případech je nezbytně nutné zachování biologické účinnosti polypeptidového řetězce.
Ve výhodném provedení se k tomuto účelu užijí myristylované polypeptidové řetězce a).
Aby bylo možno dosáhnout příslušné farmakologické účinnosti, je zapotřebí, aby v kombinaci podle vynálezu byl polypeptidový řetězec nebo řetězce a) užity na nosiči
b). Tento nosič je tvořen zvláštním materiálem/ například může být tvořen částicemi hydrofobního polymeru/ částicemi anorganického nosiče nebo částicemi polysacharidu. S výhodou je však nosič b) tvořen dalším polypeptidovým řetězcem, který vytváří částice, přičemž průměr těchto částic je alespoň 10 nm.
Ve výhodném provedení obsahují částice, tvořené polypeptidem, který je užit jako nosič b) podstatnou část úplného řetězce aminokyselin polypeptidu, který může být zvolen z peptidů S viru HBV, antigenu jádra HBV, antigenu jádra HAV, povrchového antigenu HAV, povrchového antigenu HIV a antigenu jádra HIV a může jít také o povrchový antigen viru dětské obrny. Výhodným materiálem pro částice nosiče b) je zejména peptid S viru HBV a/nebo peptid jeho jádra.
Při použití jako nosiče b) mohou být svrchu uvedené polypeptidy modifikovány tak, že se některé zbytky aminokyselin vypustí nebo se jeden nebo větší počet zbytků aminokyselin nahradí nebo se přidá jeden nebo větší počet zbytků aminokyselin na N-terminální zakončení, C-terminální zakončení nebo uprostřed polypeptidového řetězce nosiče b) za předpokladu, že si materiál stále ještě uchovává schopnost tvořit částice. Ve výhodném provedení je polypeptidový řetězec nosiče b) myristylován.
V případě, že nosičem b) je polypeptidový řetězec, mohou být řetězce a) a b) vázány jedním nebo větším počtem následujících způsobů: může jít o vazbu přes hydrofobní skupinu (zprostředkovanou myristovou kyselinou), o tvorbu disufidových můstků nebo mohou být oba řetězce spojeny pomocí peptidové vazby za vzniku složeného peptidu. V tomto posledním případě je možno mezi polypeptidový řetězec a) a polypeptidový řetězec nosiče b) vložit ještě další řetězec, který je k oběma polypeptidům vázán peptidovými vazbami.
Podstatu vynálezu tvoří také rekombinantní molekula DNA, která je kódovým řetězcem pro kombinaci, vhodnou pro použití k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení chronické virové hepatitidy. Tato rekombinantní molekula DNA obsahuje alespoň jeden první řetězec DNA, popřípadě ještě druhý, třetí a/nebo čtvrtý řetětec DNA, přičemž
i) alespoň jeden první řetězec DNA představuje kódový řetězec pro alespoň jeden polypeptidový řetězec a) va svrchu uvedeném významu, ii) případný druhý řetězec DNA představuje kódový řetězec pro polypeptidový řetězec nosiče b) ve svrchu uvedeném významu, jde tedy o polypeptid nosiče b), schopný vytvářet částice, iii) případný třetí řetězec DNA představuje kódový řetězec pro řetězec, uložený mezi oběma polypeptidovými řetězci a) a b) a iv) případný čtvrtý řetězec DNA představuje kódový řetězec pro označení, usnadňující selekci produktu, přičemž uvedené řetězce DNA jsou řízeny prvky, které jsou nezbytná pro expresi uvedených řetězců DNA a popřípadě mají společný čtecí rámec.
Vzhledem ke skutečnosti, že kódem pro celou řadu zbytků aminokyselin může být více než jeden triplet, může existovat několik řetězců DNA podle vynálezu, které jsou přes svou různost vždy kódem pro svrchu uvedené polypeptidové řetězce a) a b).
Bez ohledu na tuto skutečnost tvoří podstatu vynálezu také rekombinantní molekuly DNA, které jsou odlišné od svrchu definovaných rekombinantních molekul DNA, přičemž může být substituována až 30 % nukleotidů těchto řetězců.
Podstatu vynálezu tvoří také hostitelská buňka po transfekci rekombinantní molekulou DNA, představující kódový řetězec pro svrchu uvedenou kombinaci, použitelnou pro léčení nemocných, s chronickou infekcí virem HBV. Může jít o hostitelskou buňku savce, o kvasinkovou buňku nebo o bakteriální buňku. Ve výhodném provedení se pro účely vynálezu používají buňky, které samy neprodukují žádnou bílkovinu lidského sera nebo žádou bílkovinu sera primátů s výjimkou polypeptidů, které odpovídají složkám svrchu uvedené kombinace.
Pod pojmem peptid S viru HBV” se rozumí peptid, pro nějž je kódovým řetězcem celá oblast genomu viru HBV.
Pod pojmem prs-S2 peptid HBV se rozumí v průběhu přihlášky peptid, pro nějž je kódovým řetězcem celá oblast pre-S2 a S genomu HBV. Pod pojmem pre-Sl peptid HBV se v průběhu přihlášky rozumí polypeptid, pro nějž je kódovým řetězcem calá oblast pre-Sl, pra-S2 a S genomu HBV. Pod pojmem epitop se v průběhu přihlášky rozumí řetězec alespoň šesti po sobě následujících zbytků aminokyselin, pro nějž je kódem uvedená oblast genomu, to znamená, že například pre-S2 epitop HBV znamená řetězec, obsahující alespoň šest zbytků aminokyselin, pro nějž je kódem určitá oblast pre-S2 genomu HBV. Pod pojmem epitop T-buňky se v průběhu přihlášky rozumí apitop, schopný interakce s receptory na povrchu T-buněk za současného podporování nebo jiného ovlivnění imunologické odpovědi.
Pod pojmem antigenita se v průběhu přihlášky rozumí schopnost, vyvolat imunologickou odpověó, to znamená například působit jako antigen, dále schopnost vyvolat tvorbu protilátek, to znamená opět působit jako antigen a/nebo schopnost interakce s receptorem na povrchu buňky ke zvýšení imunologické odpovědi nebo k vyvolání produkce protilátek.
Pod pojmem HBV se rozumí jakýkoliv podtyp viru, zejména adw, ayw, adr a ayr, tak jak byly popsány v litaratuče, například P. Valenzuela, Nátuře sv. 280, str. 815,
1979, Gerlich, EP-A-85 111 361, a Neurath, EP-A-85 102 250. Příklady peptidových řetězců, tvořících polypeptidové řetězce a), schopné zprostředkovat antigenitu jednoho nebo většího počtu epitopů budou dále uvedeny v seznamu řetězců, jde o řetězce ID č. 17 až 20 a 22.
Jako výhodná provedení vynálezu je možno označit následující kombinace:
částice S-antigenu HB sa specifickými epitopy (determinantami) z oblastí pre-Sl-. pre-S2 a/nebo může jít o peptidy jádra.
částice antigenu jádra HB s obsahem specifických epitopů (determinant) z oblasti peptidu pre-Sl, pre-S2, S a/nebo antigenu jádra, částice antigenu viru hepatitidy A sa specifickými epitopy (determinantami) viru hepatitidy B, a to oblasti S, pre-Sl, pre-S2 a/nebo peptidu jádra.
Rekombinantní molekuly DNA, které představují výhodné provedení vynálezu jsou charakterizovány přítomností řetězců, které jsou kódovými řetězci pro polypeptidové řetězce a), zprostředkující antigenitu pro jeden nebo větší počat epitopů T-buněk a také pro polypeptidové řetězce nosiče b), které po své sekreci vytvářejí částice s průměrem alespoň nm, v obou případech pod řízením vhodného promotoru. Příkladem pro řetězce, které jsou kódovými řetězci pro polypeptidy a), je možno uvést kterýkoliv z řetězců, které jsou dále uvedeny v seznamu řetězců pod čísly ID 1 až 24. Příklady řetězců DNA,které jsou kódovými řetězci pro polypeptidóvé řetězce nosiče b), mohou být kterékoliv z dále uvedených řetězců ID 25 až 27.
Kterýkoliv z řetězců ID-1 až 24 je možno kombinovat s kterýmkoliv řetězcem ID-25 až 27 v seznamu řetězců, a to v pořadí a-b i b-a.
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu jde o kombinaci epitopu řetězce ID-28, který odpovídá aminokyselinám 9 až 28 řetězce Sl HBV a řetězce ID 26 a/nebo 27 jako řetězce nosiče, tvořícího částice.
Řetězce viru hepatitidy, užité ke konstrukci rekombinantní DNA podle vynálezu je možno vytvořit nebo izolovat jakýmkoliv způsobem včetně izolace a navázání restrikčních fragmentů, chemické syntézy oligonukleotidů při použití syntetizačního přístroje (Cyclon, Bio-Search) a syntézy pomocí metody PCR podle publikace T. J. White, N. Arnleim,
Η. E. Erlich, 1989: The Polymerase Chain reaction, Technical Focus 5 (S).
Výhodné molekuly rekombinantní DNA byly vytvořeny vazbou syntetických oligonukleotidů na fragment 5'XBaI-BglII-3‘’, ID-27, z oblasti S genomu HBV, řetězec je odvozen od fragmentu HBV BglII-BglII včetně celé oblasti pre-Sl-pre-S2-Snebo celé oblasti S. Oligonukleotidy, užité při tvorbě těchto konstrukcí jsou souhrnně uvedeny v následující tabulce I.
Tabulka I funkce definice řetězec ID č.
| jádro (adw) | aax | 59-87 | 6 |
| jádro (adw) | aa | 2-28 | 7 |
| jádro (adw) | aa · | -10-28 | 8 |
| jádro (adw) | aa | 29-53 | 9 |
| jádro (adw) | aa | 1-87 | 10 |
| jádro (adw) | aa | -10-87 | 11 |
| jádro (adw) | aa | 70-110 | 12 |
| jádro (adw) | aa | 80-125 | 13 |
| jádro (adw) | aa | 88-120 | 15 |
| Sl (ayw) | aa | 9-28 | 17 |
| Sl (ayw) | aa | 83-103 | 13 |
| Sl (ayw) | aa | 20-40 | 19 |
| Sl (ayw) | aa | 59-94 | 20 |
| Sl (adw) | aa | 94-114 | 21 |
| Sl (adw) | aa | 70-105 | 22 |
| S 2 (ayw) | aa | 2-21 | 23 |
| S2 (ayw) | aa | 14-33 | 24 |
x aa = aminokyseliny
Další výhodné molekuly DNA byly vytvořeny vazbou ře těžce jádra, připraveného metodou PCR (kódové řetězce pro epitopy T-buněk) na řetězce jádra HBV, ID č. 25, užité ja ko polypeptidový řetězec nosiče b). Použité oligonukleoti dy pro tyto konstrukce jsou uvedeny v tabulce II-l.
14Tabulka II-l
| funkce | definice | ID |
| jádro | úplný řetězec, bp 1901-2500 | 1 |
| jádro | C-terminální vypuštění, bp 1901-2450 | 2 |
| jádro | C-terminální vypuštění a vložení stop kodonu, bp 1901-2405 | 3 |
| jádro/řetězec před jádrem | 10 aminokyselin řetězce před jádrem, C-terminální vypuštění, bp 1871-2405 | 4 |
| jádro/řetězec před jádrem | 10 aminokyselin řetězce před jádrem, C-terminální vypuštění, uložení stop-kodonu, bp 1371-2405 | 5 |
| jádro | aa (-10-120) | 16 |
| jádro/řetězec před jádrem | 10 aminokyselin řetězce před jádrem, úplné jádro a bp 1871-2500 | 35 |
V následující tabulce II-2 je uvedeno několik příkladů, v nichž byl izolován kódový řetězec DNA pro epitop T-buněk při použití restrikčních fragmentů z genomu viru HBV, tyto fragmenty pak byly navázány na řetězec DNA, který je kódovým řetězcem pro polypeptidový řetězec nosiče b) ve svrchu uvedeném významu.
Tabulka 11-2 funkce definice
ID č jádro/řetězec úplný řetězec, bp 1403-31 před jádrem S2 ay/ad xx
XX
S2 (X) ay/ad S2-S, 7 kodonů vypuštěno, kodon ATG pro počátek je nahrazen kodonem ATA
XX jc *
Řetězce byly zveřejněny v publikacích Galibert F. 1979, Nátuře, 231, 646-650 a Ono Y. a další, 1983, Acid. Res., 11(6), 1747-1757.
V následující tabulce II-3 jsou uvedeny některé cifické rekombinantní molekuly DNA. Konstrukce těchto bude podrobněji popsána v příkladové části přihlášky.
. další, Nucl.
spemolekul
Tabulka
II-3 nosič,tvo- selekční říci částice gen konečná konstrukce epitop
T-buněk
MT-jádro(-10-120) + SAg + neo jádro(aa-10-120)
S adw/ayw nebo S/Xball/BglII neo
MT-Sl(aa 9-28) -S + egpt
Sl(aa 9-28)ay S adw/ayw nebo S/Xball/BglII egpt x
MR-jádro-neo jádro/řetězec jádro adw před jádrem bp 1403-31 neo
MT-jádro(l-87) + HBsAg - neo jádro(aa 1-87) S adw/ayw nebo neo S/Xbal/BglII egpt = E. coli xanthinguaninfosforibosyltransferáza.
Výhodné rekombinantní molekuly DNA podle vynálezu obsahují kromě kódových oblastí pro polypeptidové řetězce a) a b) ještě další kódový řetězec pro označení, usnadňující pozdější selekci produktu. Mimoto to obsahují ještě všechny další obvyklé prvky, nezbytné pro expresi, jako jsou řetězec promotoru, kodon pro počátek a polyadenylační signál.
Příkladem vhodných promotorů mohou být methallothionein (MT), promotory U2 a H2K v případě, že se jako hostitelské buňky užijí buňky savců. V případě, že mají být použity kvasinkové buňky nebo bakteriální buňky, užijí se příslušné promotory pro tyto typy buněk, například promotor GCN4 a promotor GAL 1/10 nebo prokaryotickě promotory trp a tac.
Aby bylo možno produkovat kombinaci polypeptidových řetězců a) a b) podle vynálezu, uloží se rekombinantní molekula DMA do hostitelských buněk při využití transfekce (v případě buněk savců), transformace (v případě kvasinkových a bakteriálních buněk) nebo jinými způsoby. Jako hostitelská buňka může být použit jakýkoliv organismus, v němž může dojít k transkripci a translaci rekombinantnich molekul DNA, může jít například o buňky savců, bakteriální buňky nebo buňky kvasinek.
Vhodnými buňkami savců pro účely vynálezu jsou například buňky VĚRO (buněčná linie opičích ledvin), buňky 373-, C127 a L (buněčná linie myších fibroblastů) a buňky CHO (vaječníkové buňky čínského křečka), které reagují bud positivně nebo negativně na dehydrofolátreduktázu.
Podle specifického provedení vynálezu je také možno postupovat tak, svrchu uvedený řetězec DNA, který je kódem pro polypeptidové řetězce a) a svrchu definovaný druhý řetězec DNA, který je kódem pro polypeptidový řetězec b) jsou uloženy v různých rekombinantnich molekulách DNA, v tomto případě je nutno provést současnou transfekci hostitelských buněk s použitím obou typů rekombinantnich molekul DNA.
m
| H | Ή c >cu |
| +J | 4J |
| 0 | >cn |
| St | •rt |
| X | >0 |
Možné složení částic, obsahujících epitopy T-buněk pro zacílení nosiče v kombinaci chronické hepatitidě
Ή β
>0
Ať tt) rt C 0 tt) cn cn >
o o
•H >0 +J -H cn cn 'β o >0 β
Si >tt) β
-Q
I et β
Q)
O cí u
ct
X o
-P •H
X
0) z >C w
CN
St o
4J o
Sj <x 'β β
>0
CD β
O
Aí
Q)
Si
St
4J cn β
O
A!
U
X a
φ x
o tt) c
Ό β
o
St
Ό '01 n
4J
Ol cn <u
X o
OJ c
4J
Ct cn
O
X
O
CD β
t) β
w* o
St
Ό 'β
Ό β
O
St
Ό 'β
| S CD | g 'H tt) fi | 1 tt) Xt Ό | 1 X I > u | X 0 t) cn | |||||
| N | It | O | N | St >0) | m | N tt) | tn | ||
| CD | Ό | O | tt) | Ό 4J | xo | tt) Xt | n s | + | Xo |
| ja | tt) 'β | Xin | Λ | tt) 'β >0) tt) | Λ | Λ X | M | a | |
| O -r-t | Λ CN | 0 -Π 3 0 | CN | ε c | 0) rt | CN | |||
| 0 | N | • 1 | 0 | Ν X β | t· 1 | 0 tt) | tt) >o | 0 'β | • 1 |
| St >tt) Ό | >St rt | St >tt) Ό X 0 | >St rt | St 0 | St +) | β β | Xt rt | ||
| Ό +J CD | xo | Ό tJ tt) > Si | XO | Ό N | Ό >0) | 0 | XO | ||
| 'β | tt) >lt | β cn | 'β | tt) >(t 1 | β cn | 'β >tt) 'β 3 | Si ·Η | β cn | |
| •r»ti X | β rt | •r»St X cn U | β rt | •o X | i tn | β rt |
CN a
X
CN
CN □ X CN rt —ť
CN a
x
CN σι
Ρ
Tabulka III - pokračování
C >0 >01
P >o
Ή
G >o o
G o o ω σ>
•P >,
Ρ '3 Φ O 44 44 3 Φ ε ε
CU
Cn
Φ a
φ o
Φ c
a ta φ
o φ
c
| Λ | 3 | *> >» | |
| 3 | 3 | 3 | |
| > | 3 | 3 | 3 |
| 0 | 3 | **» | |
| 0 | 0 | 0 | |
| •P >O | 0 | P | P |
| +1 -P | P | 3 | 3 |
| tn οι | 3 | '3 | '(0 |
| '3 0 | '3 | •ΓΊ | •o |
| >0 G | •ri |
c o
cn
Si ><D
C
I
Eh
| Φ | 3 | P |
| >P | Φ | n |
| >P | 1 | |
| 3 | a | n |
| ε | o | |
| 0 | O Φ | •«3* |
| P | Φ P | P |
| 3 | N 3 | |
| '(0 >φ '3 | a | |
| •o +) ·η | 43 |
Ή
O
Φ
P + o
Φ m
o m
o
| φ | 3 | Φ | 3 | rH | •P | P | φ | 3 | 3 | •P | '3 | P | ||
| >P | Φ | >P | Φ | Φ | 0 | CM | >P | Φ | 0 | G | CM | |||
| >P | >P | 3 | G | t | >P | tn | c | tri | 1 | |||||
| 3 | a | 3 | a | 0 | P | 3 | a | ε | 0 | •P | rp | |||
| ε | ε | tn | 44 | P* | 44 | tn | P* | |||||||
| 0 | O Φ | 0 | 0 | φ | 1 | co | 0 | 0 | φ | 1 | CO | |||
| os | P | φ p <c | P | φ | P | rf | u | rp | P | φ | P | u | a | rp |
| u | 3 | N 3 « | 3 | N | 3 | rf | 3 | M | 3 | O | ||||
| a | '<0 | >Φ '3 O | '3 | >Φ | '3 | o | 3 | a | '3 | >Φ | '3 | 3 | 44 | a |
| •n | -P TIP | •ri | -P | •ri | rp | C | 43 | •n | 44 | •n | r“ | tn | 43 |
O.
o •P
Ol
Φ s cfl a
σ>
φ x
o o
c
P
H
P cn «
\
W >tH (0 3 '>i\43 H 5 X Φ 3 \ o « w ρ» co
I
O σι P tn 3 3 '3 3 r-i·—
| CM | CM | CM | CM | |
| P | □ | a | □ | a |
| O | \ | |||
| 44 | CM | CM | CM | CM |
| O | rp | rp | rp | rp |
| ε o | fx | |||
| P | E-i | E^ | Ě-t | c-· |
| a | S | 2 | s |
<u o
'(O 3 3 P >O 44 Φ 01 c g o o 44 Si
O
P '3 •n o
I Φ G S I
M
C >CJ >01 •H >0
| M | 44 | 44 | 44 | 4J | 44 |
| c | a | a | a | a | a |
| >c | Ci | cn | (71 | σ> | σι |
| 44 | 0 | β | β | β | β |
| CU | X | \ | X | χ | χ |
| r-t fi | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CU (U | <u | β | β | β | β |
| 01 (Ji | β | β | β | β | c |
| H | Η | Η | Η | Η | |
| H | Η | Η | Η | Η | |
| r-4 | Η | ι—1 | r-4 | r-4 | |
| '>1 | tX> | (7> | εη | (Τ’ | (Τ’ |
| > | £3 | η | β) | Ο | Ο |
| 0 | 3 X | 3 χ | 3 X | 3 X | 3 X |
| O | CO XH | C0 >Η | C0 >Η | C0 ΧΗ | to >Η |
| •H >0 | β « | β β | β β | β β | β β |
| +J ·Η | 'XX Λ | ι>ι\Λ | 'Χ\η | 'XX Λ | |
| 01 0) | r-4 3: X | Η 3 X | Η 3 X | r-4 3 X | Η 3 4 |
| 'tú 0 | CU Ό X | β Ό X | β Ό X | β ΌΧ | 0Ό\ |
| >0 β | 0 β CO | ϋ β Μ | ο β co | ϋ β Μ | 0 β C0 |
I β o
o en
CN
I >0 β 3 Λ I
Eh OS u
Λ a o +4 •rl cu β >1 co
Tabulka III - pokračování
Ol
O
x)
O
CU β
X 'ca 3 c Ol >0 44 <u tn β β o o 44 44
| Ζ»»» | — | χ | ||
| C0 | « | 00 | ||
| 00 | CN | ΙΛ | χ | I |
| CN | 1 | 1 | CO | ο |
| 0 1 | 0 ο | 0 <71 | 0 1 | 0 Η |
| Ol CN | 04 (-4 | Ol CN | Οι ι-l | Οι 1 |
| Ό (β | Ό *3 | Ό C | ό <: | η <β |
| 'β < | 'β < | 'β < | 'β < | 'β < |
| •ΓΙ'— | •η*— | •ΓΙ’*-* | •η — | ·η—> |
CN □
X
CN £
Et
| CN | CN | CN | |
| 3 | 3 | 3 | CN |
| X | X | X | 3 |
| CN | <Ν | CN | X |
| (—4 | r-ί | ι-4 | CN |
| «Τ | r4- | i—l | |
| Εη | Εη | =4 | |
| 2 | S | 2 |
ΜΤλ12/υ2 jádro celý S neo/egpt (AA70-110) adw/ayw
S/Xbal/BglII
O
O + <U Οι β T3 —· I '(O r-' cn •nco < i i cn OS r-4 03 S ·— 33 i
i—1
CM
Tabulka III - pokračování
Ή c
><u
U >03 •P >U
Ή c
>o rP C 03 03 ω 3 'X >
o o
•P >C3 |4 ·Ρ 03 03 'tí O >O G >03 tí
XI
I řH tí cn
Pí u
fl fl o
P •H fl.
S X C/3
P
O
P o
P fl 'tí c
>C3
C3
P
P
03 tí C O O 44 44
| 'tí | n |
| Ή | 0 |
| P | P |
| 03 | 03 |
| P | ε |
| tí | |
| ε | tí |
| P | P | ||
| P | P | fl | fl |
| fl | fl | cn | tn |
| cn | cn | cu | 03 |
| 03 | 03 | X | X |
| X | X | 0 | O |
| 0 | 0 | 03 | CU |
| 03 | 03 | G | G |
| c | fí |
-D fl
X
O
G
-P fl cn
0)
X o
e
| H | H | H | |||||
| w | H | H | H | IP | |||
| H | rp | rp | rp | IP | |||
| rp | cn | tn | cn | rp | |||
| cn | H | ca | ca | Cn | |||
| ca | X | X | X | a | |||
| 1 S X | S H | 5 H | S H | 3\ | |||
| W XH | cn x | cn | X | cn | X | cn xh | cn |
| tí tí | tí tí | tí tí | tí tí | tí tí | |||
| 'XX 3 | 'XX á | 'XX Λ | 'XX Cfl | 'XXXI | 'X | ||
| rp £ X | >P 3 X | rH | 3 X | r—1 | 3 X | rp 3 X | rp |
| 0) tí) X | 03 tí) X | 03 | Ό X | 03 tí) 1 | 03 tí) X | 03 | |
| O tí Ul | o tí cn | O | tí cn | O | tí cn | υ tí cn | C3 |
O
CM rP
I o O rp
H
H rp ca
X IP (0 tí \a 5 X tí! X (0 M tí) < O 'tí <
ip ·η —
| • | H | Ό *** | |||
| < | λ | ||||
| —* | cn | X | |||
| Lítí | O | 9* | tí | ||
| CM | CM | + x | X | ||
| rP | rp | co | tí | ||
| 1 | 1 | O 1 | < Ctí | ||
| O o | 0 co | 0 rp CM | tíj —· | < O | |
| P co | P co | P 1 < | — CO | — rp | |
| tí) < | tí) c | tí) < < | 1 CM | 1 1 | |
| 'tí < | 'tí < | 'tí < | rp 1 | rp <P | |
| Ό — | m — | •IP— + | cn cn | cn co |
| CM | CM | CM | CM | CM | CM |
| □ | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| X | X | X | X | X | X |
| CM | CM | CM | CM | CM | CM |
| rp | rp | rp | rp | rp | rp |
| ··< | X | X | |||
| Ep | ep | Ep | Eh | Ep | Eh |
| 2 | 2 | 2 | 2 | «-Ρ | 2 |
| 0 o | 0 03 G | 1 | -U |
| P CM | + | co | fl |
| tí) -P | CM | 3 | |
| 'tí 1 | cn | rp 1 | 0 |
| •r-ι O | C | cn σ | |
| 1 rp | cn | I tf | + |
| Eh 1 | Eh < | ||
| 2 — | + | cn |
i
CN
CN
I
Tabulka III - pokračování
M
C >Φ
4-1 ><n •rl >0 XP β
>o
O
Ρ β β Φ tn σ >
o o
•rl >O
Ρ ·Η cn cn Ό o >0 fi
Si ><U β
Λ
I tó u
Q4Q4
O
P r| β
>4 cn
P
O
P
O ε
o ρ
o.
'β β
>o o
β o
Si β
o ií
P
P
M β
o
J4 >1
| P | >4 |
| 'β | Ό |
| 0 | |
| P | Ρ |
| 0 | 0 |
| P | c |
| β | |
| ε | β |
| Ρ | Ρ | Ρ |
| 04 | 04 | 04 |
| σι | σ> | σι |
| ο | β | β |
| X | X | X |
| 0 | 0 | 0 |
| β | β | β |
| β | β | β |
| Η | ||
| Η | Η | Η |
| Ρ | Η | Η |
| cn | Ρ | <—1 |
| ra | σ> | σι |
| 3 X | η | ra |
| cn >η | 3\ | 3 X |
| β β | cn > η | cn >4 η |
| '>\Λ | β β | β β |
| ι—ι 3 χ | '>ΧΧ3 | ΜΡΧΛ |
| Φ Ό X | Η 3 X | Η 3 X |
| ο β cn | β Τ3 X | β Ό X |
| ο β cn | ο β cn |
| 0 | Λ | Ό |
| >4 | β | |
| 1 | β | |
| 0 | · | |
| CN | r% | < ·Ν< |
| < | KČ 51· | < Η |
| < —> | < σι | *— ρ |
| >- >4 | ι | 1 1 |
| Ρ β | ρ σ» | Ρ |
| cn — | cn ιλ | cn σι |
| CN | CN | CN |
| 3 | D | □ |
| X | X | X |
| CN | CN | CN |
| Ρ | Ρ | γΗ |
| -=ί | Γ^ | |
| £ | &4 | |
| «1« | S | ρρ |
p σι <υ χ
o o
β
Cn ra
X W β <o >\ Λ rl β Ό X O (O W tn o
I I P O cn >·
CN □
X
CN ř4
P cn
Φ
X o
β
C
Ό β
O
P
Ό 'β •1-4 >4 β
3x
I CN Ρ I cn σι
CN □
X
CN
P
MT/12/U2 S2-(AA celý S neo/egpt
2-21)(ay > adw/ayw
S/Xbal/BglII
Ή >Φ
Χ>
>σι •Η >ϋ ι—( '(3 > •Η Τ3 12 Ο Φ χΐ Χ> Φ 3 £ ε
| Ή | χ> | 42 | a |
| 3 | a | a | σ> |
| >Ο | C3 | cn | φ |
| 24 | φ | φ | \ |
| φ | \ | \ | 0 |
| Η 3 | 0 | 0 | φ |
| φ φ οι σ> | ne III | φ 3 | 3 |
| '>1 | σι | 3 | 3 |
| > | CQ | Ό | Ό |
| 0 | 3 X. | 3 | 3 |
| ϋ | ω ϊηη | \ | \ |
| •Η >ϋ | 3 3 | 3 | 3 |
| 4J ·Η | '><\23 | >1 | >. |
| 01 Μ '3 0 | Γ-4 3 X Φ Ό \ | 3 | 3 |
| >Ο 3 | ϋ 3 ω | ϋΐ | Μ |
Φ
Cn ι
η
CN ι
>Φ
Λ
I £η a
ο χι
Η a
φ (X υ
a
Μ '(3 s
~
| >1 | |
| 3 | |
| CN | 1 <Ν |
| CQ |
~ 52 «3 —> Ο
| < ΓΟ | χι |
| *—* ΓΠ | a |
| 1 1 | 3 |
| CN Ν’ | τ) |
| Μ γΗ | 3 |
>ϋ u
Ο α
I
Η
Η η
ο
χ)
Ο ε
ο
Μ a
| CN | ||
| 3 | CN | CN |
| \ | □ | 3 |
| CN | \ | \ |
| r2 | CN | CN |
| •X | rH | Γ—1 |
| < | ||
| £ | Εη | |
| S |
rM
Εη '3 >ϋ
Φ
Ο λ:
φ ο
Η χ>
οι
Ο
X
| •Η | |||
| χι | |||
| χι | 3 | ||
| Ή | '3 | ||
| >Ν | >0 | ||
| 3 | |||
| 0 | 'Φ | ||
| a | > | ||
| 0 | |||
| 0 | TJ | ||
| 3 | 3 | ||
| >Ν | r-1 | ||
| 0 | 24 | ||
| ε | Ή | ||
| >i2 | |||
| η | φ | a | |
| •ΓΊ | |||
| 3 | > | ||
| Ό | »3 | ||
| 3 | 52 | 0 | |
| γ-4 | 0 | 3 | |
| 24 | Ρ | Φ | |
| Μ | 0 | Ό | |
| >12 | ε | Φ | |
| a | 0 | > | |
| Μ | 3 | ||
| > | a | •Η | |
| 0 | Χ3 | •ΓΊ | |
| α | 0 | >φ | |
| ·· | φ | '> | C |
| φ | TJ | 3 | 3 |
| υ | φ | Φ | 0 |
| r—1 | > | Τ3 | 52 |
| 3 | 3 | Φ | Ό |
| 22 | > | 0 | |
| 3 | Φ | 3 | a |
| 42 | ‘ΓΊ | Ν | φ |
| 24 | Ή | •ΓΊ | |
| 3 | > | ||
| Φ | •Η | Μ | |
| 24 | γ*Η | rH | 3 |
| > | XI | 0 | >Φ |
| •r( | >φ | 24 | X» |
| «—1 | > | '> | >03 |
| χι | 01 | •Η | |
| >φ | ’>ΐ | 3 | >φ |
| > | > | 'ΓΊ | |
| Μ | |||
| > | r-| | CN | η |
V tabulce III je uveden souhrnný přehled kombinací vhodných řetězců DNA k získání konstrukcí DNA podle vynálezu. Je nutno uvést, že jakékoliv složky, které jsou v tabulce uvedeny, je možno kombinovat za získání řetězce DNA který je možno užít k transfekci hostitelské buňky, která pak bude produkovat kombinaci polypeptidů a) a b), vhodnou pro léčení chronické virové hepatitidy.
Řetězce DNA, které jsou kódovými řetězci pro řetězce epitopů T-buněk byly připraveny synteticky (SYN) při použití automatického přístroje Biosearch Cyclon synthesiser, pomocí PCR (PCR) nebo fragmentací virového genomu pomocí restrikčních enzymů (GENE).
Pro léčení nemocných, trpících chronickou virovou hepatitidou je možno zpracovat kombinaci polypeptidových řetězců a) a b) do jekéhokoliv typu farmaceutického prostředku, který mimoto bude obsahovat vhodné ředidlo nebo farmaceutický nosič, například roztok pufru.
Takto připravený farmaceutický prostředek je možno podávat jakýmkoliv způsobem, například parenterálné, jako nitrožilně nebo nitrosvalově, nebo perorálně, například při použití tyfoidních bakteriálních buněk k zapouzdření účinného materiálu.
Farmaceutický prostředek má obsahovat svrchu uvedenou kombinaci řetězců a) a b) v dostatečné koncentraci k vyvolá ní požadovaného účinku po podání.
Praktické provedení vynálezu bude dále podrobněji popsáno v souvislosti s přiloženými výkresy.
Popis výkresů.
Na obr. I je znázorněna konstrukce DNA, která je Rodovým řetězcem pro promotor, řetězec nosiče, tvořící část i ce a selekční gen, tak jak je popsána v příkladu 3/4.
Na obr. II je znázorněna konstrukce DNA genu, obsahu jící promotor, epitop s úplným HB-S-Ag a gen pro selekci, tak jak je popsána v příkladu 3/18.
Na obr. III je znázorněna konstrukce DNA, která je tvořena promotorem, epitopem T-buněk se zbytkym, tvořícím částice a gen pro selekci, tato konstrukce je popsána v příkladu 3/21.
Na obr. IV jsou uvedeny hodnoty AST pro šimpanze 1 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care, léčení je popsáno v příkladu 10/1.
Na obr. V jsou uvedeny hodnoty antigenu u šimpanze 1 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care, tak jak je popsáno v příkladu 10/1.
Na obr. VI jsou uvedeny hodnoty jaterních enzymů ALT a GGT u šimpanze, jemuž byl v určitých intervalech třikrát podán prostředkem Hepa-Care podle příkladu 10/2.
Na obr. VII jsou uvedeny hodnoty jaterních enzymu ALT, AST a GGT a množství antigenu u šimpanze 2 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care způsobem, který je popsán v příkladu 10/3.
Na obr. VIII jsou uvedeny hodnoty jaterních enzymů, stanovená u neléčeného kontrolního šimpanze, tak jak je uvedeno v příkladu 10/3.
Na obr. IX a X jsou uvedeny hodnoty množství antigenu a titr protilátek u nemocného 1 v průběhu jeho léčení prostředkem Hepa-Care, tak jak je popsáno v příkladu 11.
Na obr. XI a XII je souhrnně uvedeno množství antigenu a titr protilátek u nemocného 2 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care způsobem podle příkladu 11.
Na obr. XIII a XIV jsou uvedeny hodnoty množství antigenu a titr protilátek u nemocného 3 v průběhu léčení prostředkem Hepa-Care, tak jak je popsáno v příkladu 11.
Praktické provedení vynálezu bude podrobněji popsáno v následujících příkladech, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
1. Frakcionované srážení polyethylenglykolem (PEG)
Supernatant kultury, produkující bílkovinu HBV se odebere a rozdělí na podíly po 2400 ml. Ke každému podílu se přidá 144 g PEG 6000 (Serva) a po rozpuštění se směs míchá 20 minut při teplotě místnosti a pak ještě 6 hodin při teplotě 4 °C. Vzniklá sraženina se oddělí odstředěním v lahvích s objemem 500 ml při použití rotoru GS 3 při 9000/ot/min, tj. 15 000 g po dobu 30 minut při teplotě 10 °C. Pak se podíly supernatantu oddělí a přidá se znovu 144 g PEG 6000 stejným způsobem jako svrchu. Roztok se mícha 3 hodiny pri teplote 4 C. Vytvořená sraženina z tohoto roztoku se oddělí stejně jako svrchu až na to, že odstředění trvá 60 minut.
2. Chromatografie na gelu
Materiál, získaný po vysrážení pomocí PEG se znovu rozpustí ve 20 ml P3S a roztok se chromatografuje na A-5m (BioRad). Bylo užito sloupce s rozměry 25 x 1000 mm a 400 ml prostředku. Při typické frakcionaci došlo při použit PEG k vysrážení 1000 mikrogramů bílkoviny H3V v objemu 10 až 15 ml, eluce byla prováděna P3S rychlostí 6 kapek za minutu, tj. 18 ml za hodinu. Byly odebírány frakce s objemem 3 ml. K eluci bílkoviny HBV docházelo v prvním vrcholu. Odebrané frakce byly podrobeny gradientu CsCl.
3. Sedimentace v gradientu CsCl
Přibližně 30 frakcí, tvořících první vrchol při provádění ohromatografie na sloupci A-5m a obsahujících částečně čištěnou bílkovinu HBV byly odebrány a spojeny, objem spojených frakcí byl přibližně 100 ml. Tento roztok byl upravenna hustotu 1,30 g/ml přidáním CsCl a pak byl přenesen do polyallomerní zkumavky, kterou je možno použít v rotoru SW 27/28 (Beckman). Gradient byl vytvořen tak, že bylo nejprve uloženo 4 ml roztoku CsCl s hustotou 1,35 g/ml, na tuto vrstvu byla uložena vrstva 4 ml roztoku s hustotou 1,25 g/ml a ta byla ještě převrstvena vrstvou 4 ml roztoku s hustotou 1,20 g/ml. Pak bylo při použití tohoto gradientu prováděno odstřelování materiálu rychlostí 28000 ot/min celkem 50 hodin při teplotě 10 °C. Pak byl gradient podroben frakcionaci a byla oddělena čištěná bílkovina HBV, nacházející se ve vrstvě s hustotou 1,20 g/ml. Pak byl roztok zbaven soli dialýzou ve vacích proti vodě, dialýza byla třikrát opakována.
Příklad 2
Kvantitativní stanovení bílkoviny HBV
1. Radioimunologický způsob
Při radioimunologické zkoušce, prováděné v několika vrstvách, AUSRIA 11-125 (Abbot) se částice# opatřené povlakem morčecí protilátky proti povrchovému antigenů viru hepatitidy B (Anti-HBs) inkubují se šerem, plasmou nebo čištěnou bílkovinou při použití odpovídajících kontrolních vzorků. Jakýkoliv přítomný antigen HBsAg se váže na protilátku na pevné fázi. Po odsátí nenavázaného materiálu a promytí částic se s komplexem, vázaným na částice nechá reagovat lidský Ι-Anti-HBs. Pak se částice opět promyjí, aby došlo > 125 k odstraněni nenavázaného značeného I-Anti-HBs.
)-Anti-HBs HBsAg )-Anti-HBs . HBsAg I-Anti-HBs
125 )-Anti-HBs . H3sAg . I-Anti-HBs
Radioaktivita, která zůstává vázána na částice se stanoví pomocí scintilačního gamma-počítače.
2. Zkouška ELISA
Při použití plotny pro mikrostanovaní, Enzygnost (Behring) se při stanovení HBsAg vyhloubení povlékají anti-HBs. Pak se přidá sérum, plasma nebo čištěná bílkovina a také kontroly a plotna sa inkubuje. Po promytí se se zbývajícími antigenními determinantami nechá reagovat protilátka proti HBsAg, značená peroxidázou. Nenávázaná protilátka s enzymem se odstraní promytim a stanoví se účinnost enzymu, vázaného na pevnou fázi. Enzymaticky katalyzovaná reakce peroxidu vodíku a chromogenu se zastaví přidáním zředěné kyseliny sírové. Intenzita zbarvení je úměrná koncentraci HBsAg ve vzorku a je možno ji stanovit fotometrickým srovnáním intensity zabarvení neznámého vzor ku s intensitou zbarvení negativního a positivního kontrol ního vzorku sera.
Příklad 3
Příprava konstrukcí genů podle vynálezu, které obsahují promotor, požadované řetězce antigenu a gen, usnadňující selekci
1. Izolace MT-promotoru
Plasmid pBPV-342-12 (ATCC 37224) se rozštěpí působením restrikčních endonukleáz BglII a BamHI. Tímto způsobem vznikly tři molekuly DNA. Požadovaný fragment obsahuje methallothioneinový promotor a řetězec plasmidu pBR322 o velikosti 4,5 kb a je možno jej snadno odlišit od ostatních fragmentů s velikostí 2,0 kb a 7,6 kb.
Reakce se provádí v celkovém objemu 200 mikrolitrů reakčního pufru při konečné koncentraci DNA 0,5 /ug/^ul včetně 100 jednotek každého se svrchu uvedených restrikčních enzymů. Úplnost rozštělení byla kontrolována po inkubaci 3 hodiny při teplotě 37 °C elektroforézou na 0,8% agarosovém gelu. Pak byla reakce zastavena přidáním 4 mikrolitrů 0,5 M EDTA.
Fragment s velikostí 4,5 kb byl od ostatních fragmentů oddělen preparativní elektroforézou na 1,2% agarosovém gelu. Eluce DNA z agarosového gelu byla prováděna na Whatmanově filtračním papíru DE-31, DNA byla oddělena pomocí pufru s vysokým obsahem solí. Pak byla DNA čištěna extrakcí směsí fenolu a chloroformu s následným dvojím srážením při použití ethanolu.
2. Vazba fragmentu o 1,8 kb, který je kódem pro antigen jádra HBV
Fragment Bam-HI-3amHI o velikosti 1,3 kb, obsahující kódovou oblast jádra HBV byl izolován z DNA s obsahem HBV. Tento fragment byl pak navázán na fragment s velikostí 4,5 kb, obsahující MT-promotor a zbytek pBR, jak je popsáno v odstavci 1.
mikrolitry fragmentu o velikosti 1,8 kb se smísí se 3 mikrolitry fragmentu o velikosti 4,5 kb, vazba se provádí v celkovém objemu 10 mikrolitrů -příslušného pufru, který obsahuje dvě jednotky T4-DNA-ligázy, a 2 mM ATP přes noc při teplotě 14 °C.
K vazné směsi se přidá 150 mikrolitrů suspenze bakteriálních buněk pro příjem DNA. Po včlenění DNA do bakteriálních buněk se buňky nanesou na plotny LB-agaru s obsahem 50 mikrolitrů/ml ampicillinu, užije se 50 až 300 mikrolitrů buněčné suspenze na jednu plotnu. Pak sa agarové plotny inkubují přes noc při teplotě 37 °C a vzniklé jednotlivé izolované kolonie bakteriálních buněk se zkouší na přítomnost plasmidu, obsahujícího požadované fragmenty.
3. Sledování bakteriálních kolonií, obsahujících požadovaný plasmid
Jednotlivé kolonie se ostrým nástrojem oddělí od agaru a přenesou do zkumavky s objemem 5 ml, obsahující živné prostředí LB s ampicillinem. Zkumavky se inkubují přes noc při teplotě 30 °C za rychlého protřapavání. Pak se z každé suspenze bakteriálních buněk připraví plasmidy. Získané od sebe odlišné vzorky DNA se zkouší štěpením restrikční endonukleázou BglII. Očekává se vznik dvou molekul, a to fragman tu o velikosti 400 bp a fragmentu o velikosti 5,9 kb. Rozště pěný materiál se analyzuje elektroforézou na agarosovém gelu DNA plasmidu se izoluje z bakteriálních buněk.
4. Uložení selekčního označení-genu pro odolnost proti neomycinu
Plasmid, získaný v předchozím stupni se linearizuje rozštěpením restrikčním enzymem EcoRI. Reakce se provádí v celkovém objemu 50 mikrolitrů při konečné koncentraci DNA plasmidu l/ug/yul. Přidá se 50 jednotek enzymu EcoRI a štěpení se provádí inkubací 3 hodiny při teplotě 37 C, průběh štěpení se sleduje elektroforézou na agarosovém gelu.
Reakce se zastaví přidáním 1 mikrolitru ’0,5M EDTA a DNA se vysráží octanem sodným v konečné koncentraci 0,3 M a přidáním tří až čtyř objemů ethanolu při teplotě -80 °C v průběhu 30 minut. Vysrážená DNA se rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.
mikrolitry linearisovaného plasmidu se smísí se 3 mikrolitry fragmentu DNA, obsahujícího methallothioneinový promotor a selekční gen pro odolnost proti neomycinu, izolovaný z plasmidu pMT-neo-E (ATCC/Exogene) rozštěpením endonukleázou EcoRI jako fragment o velikosti 3,9 kb a vzniklá směs se naváže. Pak se jednotlivé bakteriální kolonie sledují na přítomnost požadovaného plasmidu.
5. Izolace fragmentu, obsahujícího řetězec promotoru U2
Plasmid pUC-8-42 (Exogene) se rozštěpí působením restrikčních endonukleáz EcoRI a Apal. Získají se 2 molekuly DNA. Požadovaný fragment obsahuje promotor UA o velikosti 340 bp a je možno jej snadno odlišit od zbývajícího fragmentu, který obsahuje 3160 bp. štěpení se provádí v celkovém objemu 200 mikrolitru reakčního pufru při konečné koncentraci DNA 0,5 /Ug//Ul včetně 100 jednotek každého restrikčního enzymu. Úplnost štěpení se po inkubaci 3 hodiny při teplotě 37 °C kontroluje elektroforézou na 0,7% agarosovém gelu. Reakce se pak zastaví přidáním 4 mikrolitrů 0,5 M EDTA. Fragment o velikosti 340 bp se od DNA plasmidu oddělí preparativní elektroforézou na 1,2% agarosovém gelu. DNA se z agarosového gelu vymývá na Whatmanově filtračním papíru DE-81, DNA se z tohoto materiálu vymyje pufrem s vysokým obsahem solí. Pak se DNA čistí extrakcí směsí fenolu a chloroformu a dvojím srážením ethanolem.
6. Uložení fragmentu s obsahem řetězce promotoru do piasmidu s obsahem spojovníku s větším počtem míst působení restrikčních enzymů
Plasmid pSP!55 (Promega Biotec), obsahující řetězec spojovníku s obsahem následujících míst působení restrikčních endonukleáz: EcoRI, Sací, Smál, Aval, BanHI, BglII,
Sáli, Pstl, HindlII se linearizuje působením restrikčního enzymu EcoRI. Reakce se provádí v celkovém objemu 50 mikrolitrů při použití konečné koncentrace DNA piasmidu l/Ug/^ul. Pak se přidá 50 jednotek enzymu EcoRI a směs se inkubuje 3 hodiny při teplotě 37 °C, štěpení se pak kontroluje elektroforázou na agarozovém gelu. Reakce se zastaví přidáním 1 mikrolitrů 0,5 M EDTA a DNA se vysráží při konečné koncentraci 0,3 M octanu sodného a 3 až 4 objemů ethanolu, srážení se provádí 30 minut při teplotě -80 °C. Vysrážená DNA se rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.
mikrolitry DNA piasmidu se smísí s 10 mikrolitry fragmentu DNA, obsahujícího řetězec promotoru U2 a oba fragmenty se naváží v celkovém objemu 25 mikrolitrů pufru k provedení vazby, obsahujícího dvě jednotky T4-DNA-ligázy a 2-mM ATP, vazba probíhá přes noc při teplotě 14 °C. Pak se DNA čistí extrakcí směsí fenolu a chloroformu, pak se dvakrát vysráží ethanolem a rozpustí v 10 mikrolitrech destilované vody. Výsledná vazná zakončení po štěpení EcoRI a Apal se převedou na zarovnané konce a provede se další vazba. Postup se provádí tak, že se vazná zakončení převedou na zarovnaná zakončení reakcí s nukleázou z bobů následujícím způsobem: k 25 mikrolitrům DNA o koncentraci l/Ug/^ul se v reakčnim pufru přidá 20 jednotek enzymu v konečné koncentraci glycerolu 1 % a v konečném reakčnim objemu 35 mikrolitrů. Směs se inkubuje 30 minut při teplotě 30 °c a pak se DNA čistí extrakcí směsí fenolu a chloroformu s následným dvojím vysrážením ethanolem. Pak se DMA znovu rozpustí v 5 mikrolitrech destilované vody. Výsledné zarovnané konce se naváží v 15 mikrolitrech reakčního objemu, užije se lOx vyšší množství P4-DNA-ligázy bež svrchu a 2 mM ATP, vazba probíhá přes noc při teplotě 14 °C.
Pak se směs, v níž probíhala vazba přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk pro příjem DNA. Po uložení DNA do bakteriálních buněk se buňky nanesou na plotny LB-agaru, obsahujícího 50 mikrogramň/ml ampicillinu, užije se objem 50 až 300 mikrolitrů buněčné suspenze na jednu plotnu. Pak se agarové plotny inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Jednotlivé izolované bakteriální kolonie se sledují na přítomnost plasmidu, obsahující požadovaný fragment promotoru U2. Výsledný plasmid se z bakteriálních buněk izoluje a provádí se jeho charakteristika analýzou s použitím restrikčnich enzymů.
7. Vazba syntetického oligo-DNA-nukleotidu 89 (řetězec
ID č. 30) na fragment MT-promotoru o velikosti 4,5 kb
Fragment o velikosti 4,5 kb popsaný ve stupni 1, obsahující MT-promotor a zbytek pBR se vzájemně váže na syntetic ký oligonukleotid 89 (řetězec ID č. 30). Vazná směs se pak přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk, aby došlo k příjmu DNA těmito buňkami. Pak se buněčná suspenze nanese na plotny a po inkubaci se jednotlivé izolované bakteriální kolonie sledují na přítomnost požadovaného plasmidu. Přítomnost tohoto plasmidu je možno prokázat rozštěpením působením restrikčnich endonukleáz EcoRI a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, jedné o velikosti 2,0 kb a druhé s velikostí 2,6 kb.
8. Vazba syntetického oligonukleotidu 101 (řetězec
ID ó. 32) na plasmid, popsaný ve stupni 7
Plasmid, popsaný v předchozím stupni se rozštěpí působením enzymů BglII a BamHI a oddělí se fragment, obsahující 13 nukleotidů a popsaný va stupni 1. Výsledný fragment, který obsahuje první oligonukleotid 89 (řetězec ID č. 30) se naváže na oligonukleotid 101 (řetězec ID č. 32), fragment BglII-BamHI. Po příjmu DNA bakteriálními buňkami a inkubací se jednotlivé buňky sledují na přítomnost požadovaného plasmidu. Přítomnost tohoto nového plsmidu je možno prokázat štěpením působením endonukleáz EcoRI a Xbal nebo EcoRI a BglII.
9. Vazba syntetického DNA-oligonukleotidu 99 (řetězec ID č. 31) na fragment o velikosti 4,4 kb, popsaný ve stupni 1
Fragment o velikosti 4,5 kb po štěpení enzymy
BglII-BamHI se naváže na DNA-oligonukleotid 99 (řetězec ID č. 31). Po uložení do bakteriálních buněk a inkubaci se analyzují jednotlivé bakteriální kolonie, které obsahují různé molekuly DNA. Požadovaný plasmid je možno prokázat rozštěpením působením restrikčního enzymu EcoRI, při němž vznikají dva fragmenty, s velikostí 1,9 kb a
2,7 kb a také positivní linearisací při použití restrikčního enzymu BglII nebo BamHI.
Nový plasmid se pak rozštěpí působením enzymu Pstl a
BamHI. Očekává se vznik dvou molekul, jedné s fragmentem o velikosti 2,6 kb s obsahem zbytku pBR, MT-promotoru a oligonukleotidu, druhou molekulou je zbytek pBR o velikosti 2,0 kb. Fragment s velikostí 2,6 kb se izoluje.
10. Vazba fragmentu plasmidu, popsaného ve stupni 9 o velikosti 2,6 kb na fragment, izolovaný z plasmidu ze stupně S
Plasmid, popsaný ve stupni 8 a obsahující DNA-oligonukleotidy 39 a 101 (řetězce ID č. 30 a 32) se rozštěpí působením restrikčních enzymů Pstl a BglII. Očekává se vznik dvou fragmentů. První fragment s velikostí 2,5 kb obsahuje zbytek pBR a MT-promotor a fragment s velikostí 2,2 kb obsahuje zbytek pBR a oba svrchu uvedené oligonukleotidy.
Fragment s velikostí 2,2 kb se oddělí a naváže na fragment s velikostí 2,6 kb, obsahující zbytek pBR, MT-promotor a oligonukleotid 99 (řetězec ID č. 31), popsaný ve stupni 8.
Po analýze jednotlivých bakteriálních kolonií na přítomnost požadovaného plasmidu je možno plasmid charakterizovat štěpením pomocí restrikčních endonukleáz BglII-Xbal. Očekává se vznik dvou fragmentů, jednoho o velikosti 270 bp s obsahem oligo-DNA-nukleotidů a druhého s velikostí 4,5 kb, který obsahuje MT-promotor a pBR.
11. Vazba fragmentu HBV o velikosti 2,3 kb po štěpení enzymem BglII-BglII
Z DNA, obsahující HBV se izoluje fragment o velikosti
2,3 kb po štěpení enzymem BglII-BglII, obsahující oblasti HBV pre-Sl, pre-S2 a S jako kódové oblasti. Fragment s velikostí 2,3 kb se pak naváže na fragment s velikostí 4,5 kb, získaný podle stupně 1 a obsahující methallothioneinový promotor.
mikrolitry fragmentu o velikosti 2,3 kb se smísí se 3 mikrolitry fragmentu s velikostí 4,5 kb a vazba probíhá v celkovém objemu 10 mikrolitrů pufru k provedení vazby s obsahem 2 jednotek T4-DNA-ligázy a 2 mM ATP přes noc při teplotě 14 °C.
Pak se směs po ukončené vazbě přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk pro příjem DNA. Bakteriální buňkx se pak nanesou na plotny L3-agaru s obsahem 50 mikrogramů/ml ampicillinu, ušije se 50 až 300 mikrolitrů buněčné suspenze na jednu plotnu. Pak se agarové plotny inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Jednotlivé izolované bakteriální kolonie se pak sledují na přítomnost plasmidu, obsahujícího požadovaný fragment.
12. Přeměna části řetězce genu HBV epitopy jádra HBV
Plasmid, získaný ve stupni 11 se rozštěpí působením endonukleáz BglII a Xbal. očekává se vznik dvou molekul, a to fragmentu o 550 bp a fragmentu o velikosti 6,25 kb, který se izoluje elektroforézou na abarozovém gelu.
Pak se fragment s velikostí 6,25 kb naváže na fragment s velikostí 270 bp z plasmidu, popsaného ve stupni 10 po rozštěpení enzymy BglII a Xbal a po izolaci fragmentu svrchu uvedeným způsobem. Fragment o velikosti 270 bp je kódovým řetězcem pro epitop jádra genu HBV.
Směs po provedené vazbě sa přidá ka 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk pro příjem DNA.
Po inkubaci se jednotlivé izolované bakteriální kolonie sladují na přítomnost požadovaného plasmidu. Přítomnost nového plasmidu je možno prokázat jeho rozštěpení pomocí enzymu BamHI. Očekává se vznik 3 molekul s velikostí 950 bp, 450 bp a 5150 bp.
13. Příprava nosného plasmidu
Plasmid ze stupně 11 se rozštěpí působením enzymů EcoRI a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, s velikostí 2450 bp a 4350 bp, tyto fragmenty se izolují elektroforézou na gelu.
Fragment s velikostí 4350 bp se naváže na oligo-DNA-nukleotid 39 (řetězec ID č. 29) jde o kódový řetězec, který je úplným řetězcem pro gen HBV-S od kodonu ATG až do místa působení enzymu Xbal, v řetězci byl kodon ATG nahrazen kodonem ATA.
14. Epitop jádra proti směru exprese úplného genu HBV-S
Nosný plasmid, získaný v předchozím stupni se rozštěpí působením enzymů Pstl a Xbal. Očekává se vznik dvou molekul, zbytku plasmidu s velikostí 600 bp a fragmentu s velikostí 3850 bp, který se izoluje a naváže na fragment 2800 bp (2700 bp), izolovaný po rozštěpení plasmidu ze stupně 10 působením enzymů Pstl-Xbal.
Po zavedení plasmidu do bakteriálních buněk, inkubaci a pěstování na agaru je možno požadovaný plasmid charakterizovat štěpením restrikčními endonukleázami EcoRI a Xbal nebo EcoRI a BglII a BamHI.
15. Uložení označení, usnadňujícího selekci
Plasmid ze stupně 14 se linearizuje působením enzymu EcoRI. Reakce se provádí v celkovém objemu 50 mikrolitrů při konečné koncentraci DNA plasmidu l^ug/yul. Přidá se 50 jednotek enzymu EcoRI a po provedení štěpná reakce inkubací 3 hodiny při teplotě 37 °C se materiál analyzuje elektroforézou na agarozovém gelu.
Reakce se zastaví přidáním 1 mikrolitrů 0,5 M EDTA a pak se DNA vysráží octanem sodným do konečné koncentrace 0,3 M a 3 až 4 objemy ethanolu 30 minut při teplotě -80 °C. Vysrážená DNA se rozpustí v 50 mikrolitrach destilované vodě.
mikrolitry linearizovaného plasmidu se smísí se 3 mikrolitry fragmentu DNA, obsahujícího methallothioneinový promotor a selekční gen pro odolnost proti neomycinu, popsaný ve stupni 4 a nechá se proběhnout vazba. Jednotlivé bakteriální kolonie s obsahem získaného materiálu se analyzují na přítomnost požadovaného plasmidu, který se pak izoluje, čistí a charakterizuje.
Každá svrchu uvedená konstrukce genu může být vytvořena také při použití U2-promotoru tak, že se fragment DNA, obsahující MT-promotor po rozštěpení enzymy EcoRI a BglII nahradí fragmentem DNA, obsahujícím U2-promotoru po rozštěpení týmiž enzymy.
16. Izolace selekčního genu pro xanthinguaninfosforibosyltransferázu (egpt) z E. coli
Fragment, obsahující selekční gen egpt se izoluje po rozštěpení plasmidu pMSG působením BamHI a BglII a získaný fragment o velikosti 1,8 kb se naváže na fragment o 4,5 kb, popsaný ve stupni 1 (BglII-BamHI), který obsahuje MT-promotor.
Materiál se užije k uložení do buněk, vzniklé kolonie se analyzují na přítomnost plasmidu, který se izoluje, čistí a nakonec se místo působení enzymu BamHI převede na místo působení enzymu EcoRI.
17. Izolace požadovaných řetězců DNA pomocí PCR
Fragment DNA o velikosti 400 bp sa izoluje elektroforézou na gelu. Vzniká při použití PCR podle příkladu 5 a specifických oligonukleotidú 131 a 132 (řetězce ID č.
a 34) jako primerů.
Fragment DNA se rozštěpí působením endonukleáz BamHI a Xbal a pak se čistí elektroforézou na gelu. Izolovaný PCR-fragment se naváže na fragment s velikostí 6,25 kb, izolovaný z plasmidů, popsaného ve stupni 13 po rozštěpení enzymy BglII a Xbal. Po příjmu DNA a transformaci bakteriálních buněk se analyzují jednotlivé bakteriální kolonie na přítomnost požadovaného plasmidů.
18. Uložení označení pro selekci
Plasmid, popsaný ve stupni 17 .se ještě upraví přidáním selekčního genu, popsaného ve stupni 15.
19. Izolace promotoru H2K
Promotor H2K se izoluje tak, že se plasmid pSP65H2 (Exogene) rozštěpí působením endonukláz EcoRI a BglII a fragment o velikosti 2 kb se izoluje.
Ve všech svrchu uvedených konstrukcích je možno všechny promotory vzájemně zaměnit ve formě fragmentů po působení enzymů EcoRI/BglII.
20. Přeměna části řetězce genu HBV
Plasmid ze stupně 11 se rozštěpí působením endonukleáz BglI a Xbal. Očekává se získání 2 molekul, z nichž jednou je fragment o velikosti 6250 kb, který se izoluje po elektroforéze na agarozovém gelu.
Fragment o velikosti 6250 kb se naváže na oligo-DNA-nukleotid 23 (řetězec ID č. 23). Vazná směs se přidá ke 150 mikrolitrům suspenze příslušných bakteriálních buněk, aby došlo k příjmu DNA. Pak se jednotlivé izolované bakteriální kolonie analyzují na přítomnost požadovaného plasmidu. Přítomnost nového plasmidu je možno prokázat rozštěpením endonukleázami EcoRI a BglII, při němž mají vzniknout dvě molekuly, jedna s velikostí 1,9 kb a druhá s velikostí 4450 kb.
21. Uložení selekčního označení egpt
Plasmid, popsaný ve stupni 20 se linearizuje působením enzymu EcoRI. Reakce se provádí v konečném objemu 100 mikrolitrů při konečné koncentraci DNA plasmidu 0,6 /ug/^ul.
Přidá se 60 jednotek enzymu EcoRI a směs se inkubuje tři hodiny při teplotě 37 °C, ukončené štěpení se prokáže elektroforézou na agarozovém gelu. Reakce se zastaví přidáním 2 mikrolitrů 0,5 M EDTA a DNA se vysráží octanem sodným v konečné koncentraci 0,3 M a 4 objemy ethanolu při teplotě -30 °C, reakce trvá 1 hodinu. Pak se vysrážená DNA rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.
mikrolitry linearizovaného plasmidu se smísí sa 3 mikrolitry fragmentu DNA o velikosti 3,7 kb, který obsahuje methallothioneinový promotor a selekční gan egpt, popsaného ve stupni 15 po rozštěpení enzymem EcoRI a směs se naváže. Po uložení vzniklého materiálu do bakteriálních buněk sa jednotlivé kolonie analyzují na přítomnost požadovaného plasmidu. Každý z genů, uvedených v tabulce III je možno připravit obdobným způsobem jako v popsaných stupních 1 až 21 příkladu 3.
Příklad 4
Transfekce buněk savců při použití konstrukcí podle vynálezu
Aby bylo možno dosáhnout sekrece většího množství peptidů HBV, pro něž jsou kódem konstrukce podle vynálezu, je nutno dosáhnout transfekce buněk savců konstrukcemi DNA podle vynálezu. Transfekce byla provedena ve dvou stupních, to znamená, že byla pro každou konstrukci užita samostatná transfekce, nebo v jednom stupni, v němž byla provedena transfekce oběma konstrukcemi současně. Současnou transfekci bylo možno provést bučí s použitím selekčního značení na obou konstrukcích nebo průkazen sekrece produktů exprese obou konstrukcí imunologickými zkouškami.
Je také možno postupovat tak, že se spojí do jediné konstrukce řetězec, který je kódem pro řetězec peptidu HBV podle vynálezu a další řetězec, který je kódem pro úplnou bílkovinu oblasti S nebo jádra nebo HAV.
Příklad 5
Řetězová reakce s použitím polymerázy (PCR)
Při PCR-reakci je možno dosáhnout amplifikace specifických nukleotidových řetězců DNA nebo zvolené oblasti řetězce známého genomu in vitro více než miliónkrát, jak bylo popsáno v publikacích Thomas J. White, Norman Arnleim, Henry A. Erlich, 1989, The polymerase chain reaction. Technical Focus, sv. 5, č. 6, S. Kwok a R. Higuchi 1989, Avoiding falše positives with PCR. Nátuře, sv. 339, str. 237-238.
DNA, izolovaná z buněk nebo DNA plasmidu se zpracovává tak, aby bylo možno oddělit její komplementární řetězce. Ty43 to řetězce se pak spojí s přebytkem dvou DNA-oligonukleotidů s délkou vždy 20 až 25 párů baží, které byly chemicky syntetizovány tak, aby odpovídaly řetězcům X nukleotidů, kde X je obvykle 50 až 2000 párů baží.
Oba nukleotidy jsou použity jako specifické primery pro syntézu DNA in vitro, katalyzovanou DNA-polymerázou, při níž dochází ke vzniku kopií DNA mezi oběma řetězci, odpovídajícími použitým dvěma oligonukleotidům. V případě, že oba oligonukleotidy, použité jako primery obsahují příslušné řetězce, je možno vytvořit nová místa štěpení na obou zákonce nich 5'a 3'.
Po mnohonásobném opakování reakčních cyklů je možno získat velké množství fragmentu DNA s požadovanou délkou, tento fragment je pak možno čistit elektroforézou na gelu a prokázat jeho vlastnosti štěpením působením restrikčních enzymů a elektroforézou na agarosovém gelu. Amplifikovaný, čištěný fragment DNA je pak možno použít k vazbě na další fragmenty nebo plasmidy.
PCR-fragmenty DNA se amplifikují se zarovnaným zakončením. Aby bylo mošno získat zakončení, vhodná pro následující vazbu, je nutno fragment rozštěpit požadovanou endonukleázou a pak znovu čistit.
PCR-reakci je možno uskutečnit ve 20 až 30 cyklech. Každý z těchto cyklů sa dělí na tři stupně, které se provádějí po různou dobu při odlišných reakčních teplotách, které jsou řízeny automatickým zařízením, PCR-thermo-cycler. Prvním stupněm je denaturace matrice DNA (1 minuta při 95 °C), druhým stupněm hybridisace této DNA a primerů (1 minuta při 55 °C), třetím stupněm je polymerace (2 minuty při 72 °C).
Konečný objem pro jednu zkoušku je 30 mikrolitrů v následujících konečných koncentracích: PCR-pufr lx, směs nukleotidů s obsahem 200 mikroM každého ze čtyř nukleotidů, 200 ng každého ze dvou primerů ve 30 mikrolitrech a 0,5 jed notky Taq-polymerázy ve 30 mikrolitrech bidestilované vody.
Příklad 6
Pěstování buněk po transfekci a sekrece bílkoviny
Buňky po transfekci (C127 nebo CHO, ATCC) se naočkují na běžné růstové prostředí DMEM s 10 % fetálního telecího sera, glukosou a glutaminem v Petriho miskách v množství 1 až 2 x 10® buněk na misku s průměrem 10 cm ve dni 1. Následujícího dne se prostředí odstraní 4 hodiny před přidáním sraženiny DNA k buňkám a buňky se dvakrát promyjí lx PBS Pak se přidá 8 ml prostředí DMEM bez fetálního telecího sera (PCS) a po 4 hodinách se k buňkám přidá vysrážená DNA, připravená dále uvedeným způsobem. Po dalších 4 hodinách se prostředí znovu odstraní a přidají se 3 ml prostředku Glycerol-Mix (50 ml 2 x TBS pufru, 30 ml glycerolu a 120 ml destilované vody). Směs se inkubuje 3 minuty při teplotě 37 °C, pak se prostředí okamžitě odstraní a buňky se promyjí 1 x PBS. Pak se buňky pěstují přes noc v 8 ml prostředí DMEM s 10 % FCS.
Po 48 hodinách se buňky od plotny oddělí působením roztoku trypsinu a EDTA (0,025 % trypsinu + 1 mM EDTA).
Pak se buňky promyjí 1 x PBS k odstranění trypsinu a EDTA, uvedou se do suspenze v prostředí DMEM s 10 % FCS a rozdělí na plotny s 24 vyhloubeními tak, že se buňky z jedná misky rozdělí do 4 těchto ploten.
V případě, že buňky dobře rostou, přidá se selekční prostředí (0,5 až 1 mg/ml neomycinu nebo 250/Ug/ml xanthinu, /ug/ml hypoxanthinu nebo 25/Ug/ml adeninu, 10/Ug/ml thymidinu, 2^ug/ml aminopterinu, 25/Ug/ml kyseliny mykofenolové v případě eco-gpt. Prostředí sa mění každý týden. Po dvou týdnech je možno pozorovat růst prvních kolonií buněk.
K 10 mikrogramům DNA plasmidu a 20 mikrogramům DNA jako nosiče (DNA ze spermatu lososa nebo z telecího brzlíku) se přidá pufr TE (10 mM tris-HCl a 1 mM EDTA, pH 7,05) do konečného objemu 440 mikrolitrů a přidá se 60 mikrolitrů 2M chloridu vápenatého. Pak se přidá ještě stejné množství 2 x TBS (Hepes 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM, pH 7,05) a směs se dobře promíchá. Tento roztok se inkubuje 30 minut při teplotě 37 °C a pak se přímo přidá k buňkám, určeným pro transfekci.
Příklad 7
Příprava pomocného prostředku z čištěných částic
K požadované koncentraci antigenu v suspenzi ve sterilním fyziologickém roztoku se přidá Thimerosol v objemovém poměru 1:10 000, dále 1/10 objemu filtrací sterilizovaného 0,2 M roztoku KA1(SO4)2 x 12H2O. Pak se upraví pH na 5,0 přidáním IN sterilního roztoku hydroxidu sodného a suspenze se míchá 3 hodiny při teplotě místnosti. Antigen, vysrážený hlinitou sloučeninou se oddělí odstředěním 10 minut při 2000 ot/min, uvede se znovu do suspenze v IN roztoku chloridu sodného s obsahem 1 : 10 000 Thimerosolu a pak se za sterilních podmínek dělí na jednotlivé podíly.
Příklad 8
Čistění antigenu jádra viru hepatitidy B
Supernatant buněk, vylučujících antigan jádra HB se oddělí a koncentruje ultrafiltraci. Koncentrát se vyčaří odstředěním 15 minut při 20 000 ot/min a teplotě 4 °C při použití rotoru SW28 (Beckman).
Tvorka částic se zkouší odstředěním při použití gradientu 0 až 45 % sacharosy a téhož rotoru 24 hodin při 28 000 ot/min a teplotě 4 °C. Gradient se podrobí frakcionaci a frakce se analyzují zkouškou ELISA.
Příklad 9
V následujících tabulkách jsou uvedeny výsledky zkoušky ELISA s imunogenními částicemi podle vynálezu následujícím způsobem.
V následující tabulce IV jsou uvedeny údaje pro čištěné částice antigenu HBs, získané při použití jakékoliv konstrukce řetězce HBV podle vynálezu včetně epitopů pre-Sl a oblasti S s použitím anti-pre-Sl-monoklonální pro tilátky MA 18/7 a anti-HBs-monoklonální protilátky G022.
V následující tabulce IV jsou uvedeny frakce, které byly získány při použití gradientu CsCl.
Tabulka IV-1
| gradient CsCl frakce č. | zkouška ELISA (E=492) monoklonální protilátka 18/7 |
| 13 | 0,092 |
| 14 | 0,210 |
| 15 | 0,388 |
| 16 | 1,662 |
| 17 | 2,604 |
| 18 | 0,648 |
| 19 | 0,031 |
| Tabulka IV-2 | |
| gradient CsCl | zkouška ELISA (E=492) |
| frakce č. | monoklonální protilátka G022 |
| 13 | 0,136 |
| 14 | 0,426 |
| 15 | 0,822 |
| 16 | 1,970 |
| 17 | 2,954 |
| 18 | 0,967 |
| 19 | 0,076 |
V tabulce V jsou uvedeny výsledky zkoušky ELISA s čištěnými částicemi antigenu jádra HB z jakékoliv konstruk ce řetězce jádra HB podle vynálezu s polyklonálními protilátkami proti jádru HB a monoklonální protilátkou G022.
Tabulka V-l
| sacharosový gradient frakce č. | zkouška ELISA (E=492) polyklonální protilátky |
| 6 | 0,25 |
| 7 | 0,922 |
| 8 | 1,423 |
| 9 | 1,5 |
| 10 | 1,5 |
| 11 | 1,28 |
| 12 | 0,466 |
| Tabulka V-2 | |
| sacharosový gradient frakce č. | zkouška ELISA (E=492) monoklonální protilátka G022 proti HB-S-Ag |
| 6 | 0,020 |
| 7 | 0,024 |
| 8 | 0,018 |
| 9 | 0,011 |
| 10 | 0,015 |
| 11 | 0,020 |
| 12 | 0,022 |
Příklad 10
Zkoušky s podáváním prostředku Hepa-Care u šimpanzů
Hepa-Care jsou částice s povrchovým antigenem viru hepatitidy B (SI a S2) ve specifickém zpracování v poměru 50 : 50, tento prostředek je možno použít k léčení chronických nosičů viru hepatitdy.
Pokus 1
Šimpanzu 1, který byl nosičem viru hepatitidy B, byl nitrosvalově podán prostředek Hepa-Care v časovém období 0, 4 a 8 týdnů, vždy v dávce 18 mikrogramů v jedné injekci.
Pak byly sledovány jaterní enzymy, výsledek je znázorněn na obr. IV a množství antigenu hepatitidy B v seru, jak je znázorněno na obr. V.
Pokus 2
Šimpanz 1 byl po ošetření, provedeném podle pokusu 1 ještě léčen dalšími injekcemi, které byly podávány v týdnu 30, 34 a 38. Výsledky tohoto léčení jsou uvedeny na obr. VI
Pokus 3
Šimpanzu 2 byl podáván prostředek Hepa-Care, avšak prostředek byl podán nitrožilně vždy v dávce 2 mg. Výsledky jsou znázorněny na obr. VII.
U kontrolního šimpanze 3 byly rovněž sledovány jaterní enzymy, výsledek je znázorněn na obr. VIII.
Příklad 11
Léčení prostředkem Hepa-Care (složení prostředku je popsáno v příkladu 10)
Pacient 1 (muž, 65 let, nemocí trpí 2 roky):
parametry hepatitidy B: HBsAg pos.
anti-HBs neg.
HBeAg neg. anti-HBe pos. anti-HBc neg.
Nemocnému byl nitrosvalově podáván prostředek Hepa-Care v měsíci 0, 1, 6 a 7. Výsledky měření množství antigenu a protilátky jsou uvedeny na obr. IX a X.
Pacient 2 (žena, 48 let, onemocnění trvá 12 let):
parametry hepatitidy B: HBsAg pos.
HBeAg neg. anti-HBs neg. anti-HBe pos. anti-HBc pos.
Nemocné byl nitrosvalově podáván prostředek Hepa-Care v měsíci 0, 1 a 6. Výsledky měření množství antigenu a protilátky jsou uvedeny na obr. XI a XII.
Pacient 3 (žena, 41 let, onemocnění trvá 5 let):
parametry hepatitidy 3: HBsAg pos.
HBeAg neg. anti-HBs neg. anti-BBe pos.
Nitrosvalově byl podáván Hepa-Care v měsíci 0, 1, 2a
5. Hodnoty antigenu a protilátky jsou uvedeny na obr. XIII a XIV.
Seznam řetězců řetězec ID č: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
558 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro H3V
PCR-amplifikace
| ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT | GIG | GAG | TTA. | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC | 1 4 1 | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
| GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
| GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
| CTA | 1 i L7 ' | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | QTT* | ACT | φΓ* Γφ |
| GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
| TTC | GGA | GTG | Tk3k3 | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | C-CC | Τλ. |
| AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
| CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
| GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
| CGC | AGA | CGT | AGA | TCT | CAA | TCG | CCG | CGT | CGC | AGA |
| AGA | TCT | CAA | TCT | CGG | GAA | TCT | CAA | iG; | TAG |
řetězec ID c.: ty? řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
504 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro H3V
PCR-amplifikace
| ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT ' | ' AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
| GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | '.GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT - | :cac | CAT · | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC ” | -TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG . | '.GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT ' | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
| GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
| CTA | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | ||
| GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | m λ m iC · |
| TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | *·*ι |
| AGA | CCA- | CCA | £ 2 v | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT | |
| CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | C-AC | CGA | |
| GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | ccc | TCG | CCT |
| CGC | AGA | CGT |
řetězec č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
504 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro K3V
PCR-amplifikace
| ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | GGA. | m m m i | |
| ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTČ | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
| GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GCC | CTC | TGC | TGG | Z-»Z*<· | GAA | TTG | ATG | |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | m ΧΛΧ |
| <-H ύι í | AAT | ACT | AAC | ATG | OkJ X | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
| CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | XU*w | CTT | ACT | TTT |
| GGA | AGA | VAU | ACT | GTA | GAA | T - | mm/-» X X 'J | mm z·» L3 X | X « | |
| X -'w | GGA | /»*·* z* | m »* *» | ATT | CGC | ACT | ΓΓΤ W w * | CGA | GCC | m m ΧΛ. |
| AGA | CCA | CCA | AAT | z·» <» z* | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | CTT |
| /-* <* z·· | GAA | ACT | ACT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA | |
| Z-· Z*/-» | AGG | ICC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CGC | TCG | CCT |
CGC AGA CGT řetězec č.: 4 typ řetězce: nukleotid délka řetězce: 534 bp řetězec: jednoduchý topologie: lineární typ molekuly: DNA genomu původní zdroj: jádro HBV pokusný zdroj: PCR-amplifikace
| TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
| ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT - | TCT | GAC |
| TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | .CTA | GAC | ACC |
| GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | ÍÁÁkJ | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | . TGC | TGG | GGG | .GAA | TTG | ATG |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
| GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
| CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | |
| GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | T^G | GTC | TCT |
| GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | ww « | CCA | GCC | ||
| AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | |
| CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
| GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | H*/*»*·* X | CCT |
CGC AGA CGT řetězec IDe.: typ řetězce: dálka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
534 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HSV
PCR-amplifikace
| TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | rrr OkJO | TGG | CTT | TGG | /»<·<* | |
| ATG | GAC | GAC | CCT | TA.T | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT | |
| ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | - GA? | CTC. | CTA | GAC | ACC |
| GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA. | GAG | TCT |
| CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | «»/»«“· | GGG | GAA | TTG | ATG |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | ονα x | AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
| AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA | |
| CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | |
| GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
| T i 'w | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | W '•W | |
| AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA | ACA | Qrnrn |
| CCG | GAA | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
| /***-*<* | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
| CGC | AGA | c* *** i·** CO i |
řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
ATC CTC TGC TGG
GGC AAT AAT TTG řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
GAC ATT GAC CCT nukleotid 87 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
GGG GAA TGG ATG ACT CTA GCT ACC TGG GTG
GAA GAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT nukleotid 81 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG
TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC TTC TTT CCT TCC GTC AGG řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
TCC AAC TTG
GAC ATT GAC
GTG GAG TTA
TTT CCT TCC řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
GAT CTC CTA
GAA GCC TTA nukleotid
114 np jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
| TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | ATG |
| CCT | TAT | AAA | DAA | TTT | GGA | GCT | ACT |
| CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC | TTC |
GTC AGG nukleotid 90 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
| GAC | ACC | GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA |
| GAG | TCT | CCT | GAG | CTA | TGC | TCA | CCT |
CAC CAT ACT GCA CTC AGG CAA GGT řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
261 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro H3V chemická syntéza
| ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC | TTT | CCT | TCC | GTC | AGG | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
| GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | GAG | CTA | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GGT | ATC | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TGG | ATG |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGC | AAT | AAT | TTG | GAA |
| GAT | CCA | GCA | TCT | AGG | GAC | CTT | GTA | GTA | AAT |
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
291 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
| TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
| ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC | TTT | CCT | TCC | GTC | AGG | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
| GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | GAG | CTA | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GGT | ATC | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TGG | ATG |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG ' | GGC | AAT | AAT | TTG | GAA |
| GAT | CCA | GCA | TCT | AGG | GAC | CTT | GTA | GTA | AAT |
| řetězec ID č.: | 12 |
| typ řetězce: | nukleotid |
| délka řetězce: | 123 bp |
| řetězec: | jednoduchý |
| topologie: | lineární |
| typ molekuly: | DMA genomu |
| původní zdroj: | jádro HBV |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza |
| ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA | GAT | CCA | GCA |
| TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT | GTT | AAT | ACT |
| AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA | CTA | TTG | TGG |
| TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
| řetězec č.: | 13 |
| typ řetězce: | nukleotid |
| délka řetězce: | 138 bp |
| řetězec: | jednoduchý |
| topologie: | lineární |
| typ molekuly: | DNA genomu |
| původní zdroj: | jádro HBV |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza |
| GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT | GTT | AAT |
| ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA' | CTA | TTG |
| TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT | GGA | AGA |
| GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT | TTC | GGA |
GTG TGG řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid 294 bp jednoduchý lineární DNA genomu H3V S2 ayw/adw DNA HSV
| ATG | CAG | TGG | AAT |
| CAA | GAT | CCC | AGA |
| GGT | GGC | TCC | AGT |
| ACT | ACT | GCC | TCT |
| ATA' | GAG | AAC | ATC |
| CTC | GTG | TTA | CAG |
| ATC | CTC | ACA | ATA |
| ACT | TCT | CTC | AAT |
| CTT | GGC | CAA | AAT |
| TCA | CCA | ACC | TCT |
| CGC | TGG | ATG | TGT |
| TTC | ATC | CTG | í-w |
| CTT | CTG | GAC | TAT |
| CTA | ATT | CCA | GGA |
| rnr»^ | CGG | ACC | TGC |
| ATG | CCC | TCC | |
| GGA | AAT | TGC | ACC |
| GCT | TTC | GGA | AAA |
| CGT | TTC | TCC | TGG |
| CAG | TGG | TTC | GTA |
| TCA | GTT | ATA | φφ'- |
| CTG | TAC | AGC | ATC |
| CCA | ATT | TTC | TTT |
| TCC | AGA | ACC | TTC |
| GTG | AGA | GGC | CTG |
| TCA | GGA | ACA | GTA |
| CCC | TTA | TCG | TCA |
| ACA | TCA | GGA | TTC |
| GCG | GGG | TTT | TTC |
| CCG | CAG | AGT | CTA |
| TTT | CTA | GGG | GGA |
| TCG | CAG | TCC | TCA |
| TGT | CCT | CCA | ACT |
| CTG | CGG | CGT | TTT |
| CTA | TGC | CTC | ATC |
| CAA | (jvjx | ATG | TTG |
| TCC | TCA | ACA | ACC |
| ATG | ACT | ACT | GCT |
| TGT | TGC | TGT | ACC |
| TGT | ATT | CCC | ATC |
| TTC | CTA | TGG | GAG |
| CTC | AGT | TTA | CTA |
| Ijovj | CTT | TCC | CCC |
| ATG | ATG | TGG | TAT |
| φί**Λ· i | AGT | CCC | TT*7 |
| TGT | CTT | TGG | GTA |
| CAC | CAA | ACT | CTG |
| TAT | TTC | CCT | φ/-·φ si'** X |
| AAC | CCT | GTT | CTG |
| ATC | TTC | TCG | AGG |
| CTA | GGA | CCC | CTT |
| TTG | TTG | ACA | AGA |
| GAC | TCG | TGG | TGG |
| ACT | ACC | GTG | TGT |
| ACC | TCC | AAT | CAC |
| TGT | CCT | GGT | TAT |
| ATC | ATC | TTC | CTC |
| TTC | TTG | TTG | GTT |
| CCC | GTT | TGT | CCT |
| AGC | ACG | GGA | CCA |
| CAA | GGA | ACC | TCT |
| AAA | CCT | m | φ> Φ |
| CCA | TCA | X | TGG |
| TGG | GCC | TCA | GCC |
| GTG | CCA | TTT | GTT |
| ACT | GTT | TGG | |
| TGG | GGG | CCA | AGT |
| TTA | CCG | CTG | TTA |
| TAC | ATT |
| řetězec ID č.: | 15 |
| typ řetězce: | nukleotid |
| délka řetězce: | 99 bp |
| řetězec: | jednoduchý |
| topologie: | lineární |
| typ molekuly: | DNA genomu |
| původní zdroj: | jádro H3V |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza |
| TAT | GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG |
| CAA | CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT |
| TTT | GGA | AGA | GAG | ACT^ | GTA | CTT | GAA . Λ | TAT_ | TTG | GTC |
řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid 390 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro H3V PCR-amplifikace
| TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | GGC | ||
| ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
| GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | GAG | CAT | TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
| GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
| CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | |
| GGA | AGA' | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | w Á w |
řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid a odpovídající bílkovina 60 bp jednoduchý lineární
DNA genomu
HBV Sl ay chamická syntéza
| AAT | CCT | CGT | GGA | TTC | TTT | CCC | GAT CAC CAG TTG GAT |
| CCA | GCC | TTC | AGA | GCA | AAC | ACC | GCA |
| Asn | Pro | Leu | Gly | Phe | Phe | Pro | Asp His Gin Leu Asp |
| Pro | Ala | Phe | Arg | Ala | Asn | Thr | Ala |
řetězec ID č. typ řetězce: délka řetězce řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj pokusný zdroj nukleotid a odpovídající bílkovina 63 bp jednoduchý lineární
DNA genomu
HBV Sl ay chemická syntéza
| CCT | GCC | TCC | ACC | AAT | CGC |
| ACC | CCG | CTG | TCT | CCA | CCT |
| Pro | Ala | Ser | Thr | Asn | Arg |
| Thr | Pro | Ila | Ser | Pro | Pro |
| CAG | TCA | GGA | AGG | CAG | CCT |
| TTG | AGA | AAC | |||
| Gin | Ser | Gly | Arg | Gin | Pro |
| Leu | Arg | Asn |
řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid a odpovídají 63 bp jednoduchý lineární
DNA genomu
HBV SI ay chemická syntéza í bílkovina
| GAT | CCA | GCC | TTC | AGA | GCA | AAC | ACC | GCA | AAT |
| TGG | GAC | TTC | AAT | CCC | AAC | AAG | GAC | ACC | |
| Asp | Pro | Ala | Phe | Arg | Ala | Asn | Thr | Ala | Asn |
CCA GAT
Pro Asp
Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr řetězec ID δ.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid a odpovídající bílkovina
108 bp jednoduchý lineární
DNA genomu
HBV SI ay chemická syntéza
| CCG | CAC | GGA | GGC | CTT | TTG | GGG | TGG | AGC | CCT | CAG | GCT |
| CAG | GGC | ATA | CTA | CAA | ACT | TTG | CCA | GCA | AAT | CCG | CCT |
| CCT | GCC | TCC | ACC | AAT | CGC | CAG | TCA | GGA | AGG | CAG | CCT |
| Pro | His | Gly | Gly | Leu | Leu | Gly | Trp | Ser | Pro | Gin | Ala |
| Gin | Gly | Ile | Leu | Glu | Thr | Leu | Pro | Ala | Asn | Pro | Pro |
| Pro | Ala | Ser | Thr | Asn | Arg | Gin | Ser | Gly | Arg | Gin | Pro |
řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
CCT GCC TCC nukleotid 63 bp jednoduchý lineární DMA genomu HBV SI ad chemická syntéza
ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT
ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA AGA GAC - X řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid a odpovídající bílkovina
108 bp jednoduchý lineární
DNA genomu
HBV SI ad chemická syntéza
| CCA | CAC | GGC | GGT | ATT | TTG | GGG | TGG | AGC | CCT | CAG | GCT |
| CAG | GGC | ATA | TTG | ACC | ACA | GTG | TCA | ACA | ATT | CCT | CCT |
| CCT | GCC | TCC | ACC | AAT | CGG | CAG | TCA | GGA | AGG | CAG | CCT |
| Pro | His | Gly | Gly | Ile | Leu | Gly | Trp | Ser | Pro | Gin | Ala |
| Gin | Gly | Ile | Leu | Thr | Thr | Val | Ser | Thr | Ile | Pro | Pro |
| Pro | Ala | Ser | Thr | Asn | Arg | Gin | Ser | Gly | Arg | Gin | Pro |
řetězec ID č.:
typ řetězce:
délka řetězce:
řetězec:
topologie:
typ molekuly:
původní zdroj:
pokusný zdroj:
CAG TGG AAT TCC AGA
CAA GAT CCC AGA GTG řetězec ID δ.:
typ řetězce:
délka řetězce:
řetězec:
topologie:
typ molekuly:
původní zdroj:
pokusný zdroj:
GAT CCC AGA GTG AGA nukleotid 60 bp jednoduchý lineární DNA genomu H3V S2 ay chemická syntéza
ACC TTC CAC CAA ACT CTG
AGA GGC CTG TAT - X nukleotid 60 bp jednoduchý lineární DNA genomu HBV S2 ay chemická syntéza
GGC CTG TAT TTC CCT GCT
GGT GGC TCC AGT TCA GGA ACA GTA AAC - X
| řetězec ID č.: | 25 |
| ty? řetězce: | nukleotid |
| délka řetězce: | 558 bp |
| řetězec: | jednoduchý |
| topologie: | lineární |
| ty? molekuly: | DNA genomu |
| původní zdroj: | jádro HBV adw |
| pokusný zdroj: | PCR-amplifikac |
| ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC | TTT | -CCT. | .TCC | .GTA | CGA. | ..GAT. | CTC | CTA | GAC | .ACC |
| GCC | TCA | GCT | -CTG. | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | GAG | CAT | -TGC | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GCA | CTC |
| AGG | CAA | GCC | .ATT | CTC | TGC. | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
| GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
| CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | TTT |
| GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | CTT | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
| TTC | GGA | GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | TAT |
| AGA | CCA | CCA | AAT | GCC | CCT | ATG | TTA | TCA . | ACA | Qřprn |
| CCG | GAA' | ACT | ACT | GTT | GTT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA |
| GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AGA | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
| CGC | AGA | CGT | AGA | TCT | CAA. | TCG | CCG | CGT | CGC | AGA |
AGA TCT CAA TCT CGG GAA TCT CAA TGT TAG
| řetězec ID č.: | 27 |
| typ řetězce: | nukleotid |
| délka řetězce: | 585 bp |
| řetězec: | jednoduchý |
| topologie: | lineární |
| typ molekuly: | DNA genomu |
| původní zdroj: | HBV S adw/ayw |
| pokusný zdroj: | DNA HBV |
| CTA | GAC | TCG | TGG | TGG | ACT | TCT | CTC | AAT | TTT | CTA | |
| GGA | TCT | CCC | GTG | TGT | CTT | CAA | AAT | TCG | CAG | TCC | |
| CCA | ACC | TCC | AAT | CAC | 'TCA | •CCA | ACC | TCC | TGT | CCT | CCA |
| ATT | TGT | CCT | /*·/*· *T* L5L3X | TAT | CGC | TGG | ATG | TGT- | -CTG | CGG | CGT |
| TTT | ATC | ATA | TTC | CTC | TTC | ATC | CTG | CTG | CTA | TGC | CTC |
| ATC | TTC | TTA | TTG | GTT | CTT | CTG | GAT | TAT | CAA | GGT | ATG |
| TTG | CCC | GTT | TGT | CCT | CTA | ATT | CCA | GGA | TCA | ACA | ACA |
| ACC | AGT | ACG | GGA | CCA | TGC | AAA | ACC | TGC | ACG | ACT | CCT |
| GCT | CAA | GGC | AAC | TCT | ATG | TTT | CCC | TCA | TGT | TGC | TGT |
| ACA | AAA | CCT | ACG | GAT | GGA | AAT | TGC | ACC | TGT | ATT | CCC |
| ATC | CCA | TCG | TCC | TGG | G<-x | TTC | GCA | AAA | TAC | CTA | TGG |
| GAG | TGG . | GCC | TCA | GTC | CGT | TTC | TCT | TGG | CTC | AGT | TTA |
| CTA | GTG | CCA | TTT | Cj x x | CAG | TGG | TTC | GTA | GGG | C j. - | TCC |
| CCC | ACT | GTT | TGG | CTT | TCA | GCT | ATA | TGG | ATG | ATG | |
| TAT | TGG | CCA | AGT | CTG | TAC | AGC | ATC | GTG | AGT | CCC | |
| TTT | ATA | CCG | CTG | TTA | CCA | ATT | TTC | TTT | TGT | CTC | TGG |
GTA TAC ATT
| řetězec ID č.: | 28 |
| typ řetězce: | nukleotid |
| délka řetězce: | 106 bp |
| řetězec: | jednoduchý |
| topologie: | lineární |
| typ molekuly: | DNA genomu |
| původní zdroj: | HBV SI |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza |
5'-GAT-CTT-TAA-CAT-GGA-GAA-CAA-TCC-TCT-G
GG-ATT-CTT-TCC-CGA-TCA-CAA-GTT-GGA-TCC-A
GC-CTT-CAG-AGC-AAA-CAC-CGC-AAA-TCC-AGA-T TG-GGA-CTT-CAA-TCC-CAG-(T)-3'
| řetězec ID č.i | 29 |
| typ řetězce: | nukleotid |
| délka řetězce: | 115 bp |
| řetězec: | jednoduchý |
| topologie: | lineární |
| typ molekuly: | DNA genomu |
| původní zdroj: | HBV S |
| pokusný zdroj: | chemická syntéza |
5'-AAT-TCT-AGA-CTC-GAG-TCT-GAA-CAT-AGA-G
AA-CAT-CAC-ATC-AGG-ATT-CCT-AGG-ACC-CCT-T
CT-CGT-GTT-ACA-GGC-GGG-GTT-TTT-CTT-GTT-G
AC-AAG-AAT-CCT-CAC-AAT-ACC-GCA-GAG-(C)-3 řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
108 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
5'-GAT-CTT-TTA-AAG-GGA-TCC-TCT-GCT-GGG-G
GG-AAT-GGA-TGA-CTC-TAG-CTA-CCT-GGG-TGG-G
CA-ATA-ATT-TGG-AAG-ATC-CAG-CAT-CTA-GGG-A CC-TTG-TAG-TAA-ATC-TAG-AC-(A)-3 * řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid
106 bp jednoduchý lineární
DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
-GAT-CTC-CGG-GAA-TTC-CTG-GGG-C.AT-GGA-C
AT-TGA-CCC-TTA-TAA-AGA-ATT-TGG-AGC-TAC-T
GT-GGA-GTT-ACT-CTC-GTT-TTT-GCC-TTC-TGA-C
TT-CTT-TCC-TTC-CGT-CAG-(G)-3' retezec č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid 89 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
-GAT-CTC-CTA-GAC-ACC-GCC-TCA-GCT-CTG-T
AT-CGA-GAA-GCC-TTA-GAG-TCT-CCT-GAG-CAT-T
GC-TCA-CCT-CAC-CAT-ACT-GCA-CTC-AGG-CAA-G
-(G)-3' řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid 25 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza '-TTG-GAT-CCT-CCA-ACC-TGT-GCC-TTGU G) - 3 ' «
řetězec ID č.: typ řetězce: délka řetězce: řetězec: topologie: typ molekuly: původní zdroj: pokusný zdroj:
nukleotid 25 bp jednoduchý lineární DNA genomu jádro HBV chemická syntéza
-CCT-CTA-GAA-CCA-AAT-ATT-CAA-GTA-(C)-3'
| řetězec ID č.: | 35 |
| typ řetězce: | nukleotid |
| délka řetězce: | 588 b? |
| řetězec: | jednoduchý |
| topologie: | lineární |
| typ molekuly: | DNA genomu |
| původní zdroj: | jádro HBV |
| pokusný zdroj: | PCR-amplifikace |
| TCC | AAC | CTG | TGC | CTT | GGG | TGG | CTT | TGG | GGC | |
| ATG | GAC | ATT | GAC | CCT | TAT | AAA | GAA | TTT | GGA | GCT |
| ACT | GTG | GAG | TTA | CTC | TCG | TTT | TTG | CCT | TCT | GAC |
| TTC | TTT | CCT | TCC | GTA | CGA | GAT | CTC | CTA | GAC | ACC |
| GCC | TCA | GCT | CTG | TAT | CGA | GAA | GCC | TTA | GAG | TCT |
| CCT | GAG | CAT | i <3^. | TCA | CCT | CAC | CAT | ACT | GcA | CTC |
| AGG | CAA | GCC | ATT | CTC | TGC | TGG | GGG | GAA | TTG | ATG |
| ACT | CTA | GCT | ACC | TGG | GTG | GGT | AAT | AAT | TTG | CAA |
| GAT | CCA | GCA | TCC | AGA | GAT | CTA | GTA | GTC | AAT | TAT |
| GTT | AAT | ACT | AAC | ATG | GGT | TTA | AAG | ATC | AGG | CAA |
| CTA | TTG | TGG | TTT | CAT | ATA | TCT | TGC | CTT | ACT | mm m i X X |
| GGA | AGA | GAG | ACT | GTA | Ui. | GAA | TAT | TTG | GTC | TCT |
| TTC | GGA· | ’ GTG | TGG | ATT | CGC | ACT | CCT | CCA | GCC | m |
| AGA | CCA | CCA | AAT | CCT | ATG | TCA | ACA | CTT | ||
| CCG | GAA | ACT | ACT | AGA | CGA | CGG | GAC | CGA | ||
| GGC | AGG | TCC | CCT | AGA | AC-A | AGA | ACT | CCC | TCG | CCT |
| CGC | AGA | CGT | AGA | TCT | CAA | TCG | CCG | CGT | CGC | AGA |
| AGA | TCT | CAA | TCT | CGG | GAA· | m mm | CAA | TGT | TAG |
Claims (18)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Kombinacea) alespoň jednoho polypeptidováho řetězce, schopného zprostředkovat antigenitu jednoho nebo většího počtu epitopů ab) nosiče, schopného umožnit účinek řetězců epitopu a), přičemž polypeptidové řetězce a) mohou být na nosič b) vázány adsorpcí, jakoukoliv chemickou vazbou nebo pomocí sekundárních valencí.
- 2. Kombinace podle nároku 1, v níž polypeptidové řetězce a) zprostředkují antigenitu epitopu, aktivujícího T-buňky, přímým nebo nepřímým způsobem.
- 3. Kombinace podle nároků 1 nebo 2, v níž polypeptidovým řetězcem a) nebo polypeptidovými řetězci a) jsou polypeptidy viru hepatitidy B.
- 4. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v níž jsou polypeptidovým řetězcem nebo polypeptidovými řetězci a) řetězce aminokyselin jednoho nebo většího počtu členů ze skupiny, zahrnující peptidy pre Sl, pra S2, S a antigeny jádra viru HB.
- 5. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v níž mohou být polypeptidové řetězce a) modifikovány některým z následujících způsobů:i) je možno vypustit některé části řetězce, přičemž musí být zachován epitop, který obsahuje alespoň šest po sobě následujících zbytků aminokyselin, ii) jednu nebo větší počet aminokyselin je v řetězci možno nahradit, nebo iii) je možno přidat další aminokyseliny nebo řetězce aminokyselin na N-terminálním nebo na C-terminálním zakončení nebo také uprostřed polypeptidového řetězce nebo řetězců a).
- 6. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, v níž je polypeptidový řetězec a) myristylován.
- 7. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, v níž řetězcem nosiče b) je polysacnarid, hydrofobní polymer nebo anorganická molekula v částicové formě.
- 8. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, v níž je řetězcem nosiče b) další polypeptidový řetězec.
- 9. Kombinace podle nároku 8, v níž polypeptidový řetězec b) po své sekreci vytváří částice, které mají průměr alespoň 10 nm.
- 10. Kombinace podle nároku 8 nebo 9, v níž polypeptidovým řetězcem nosiče b) je podstatná část nebo úplný řetězec aminokyselin polypeptidu ze skupiny S-peptidu HBV, peptidu jádra HBV, antigenu jádra HAV nebo antigenu jádra HIV nebo také povrchového antigenu viru dětské obrny, nebo některého z virů HAV nebo HIV.
- 11. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10, v níž může být polypeptidový řetězec nosičem b) modifikován některým z následujících způsobů:i) vypuštění některých částí, přičemž schopnost vytvářet částice musí být zachovány, ii) náhradou jedné nebo několika aminokyselinami jinými aminokyselinami, nebo iii) přidáním dalších řetězců aminokyselin na N-tarminální zakočení, C-terminálním zakončení nebo uprostřed polypeptidového řetězce b).
- 12. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 8 až 11, v níž je polypeptidový řetězec nosiče b) myristylován.
- 13. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo 8 až 12, v níž jsou polypeptidové řetězce a) a b) spolu spojeny disulfidovými můstky.
- 14. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, nebo 8 až 13, v níž jsou polypeptidové řetězce a) a b) spolu spojeny hydrofobním spojením, zprostředkovaným myristovoukyselinou.
- 15. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a 8 až 14, v níž jsou polypeptidové řetězce a) a b) spolu spojeny peptidovou vazbou, přičemž je popřípadě mezi polypeptidový řetězec a) a polypeptidový řetězec nosiče b) uložen další řetězec, který je k polypeptidovým řetězcům a) a b) vázán peptidovými vazbami.
- 16. Použití kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chronické virové hepatitidy.
- 17. Rekombinantní molekula DNA, která je kódem pro kombinaci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16, obsahující alespoň jeden první řetězec DNA, popřípadě druhý řetězec, třetí řetězec a/nebo čtvrtý řetězec DNA, přičemž kombinace, která byla popsána ve kterémkoliv z nároků 1 až 15.
- 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se t i m , že se uvedená kombinace podává nitrožilní nebo nitrosvalovou injekcí.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90124775A EP0491077A1 (en) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| PCT/EP1991/002460 WO1992011368A1 (en) | 1990-12-19 | 1991-12-19 | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ118693A3 true CZ118693A3 (en) | 1994-02-16 |
| CZ290233B6 CZ290233B6 (cs) | 2002-06-12 |
Family
ID=8204863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19931186A CZ290233B6 (cs) | 1990-12-19 | 1991-12-19 | Farmaceutický prostředek pro léčení chronické virové hepatitidy |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6020167A (cs) |
| EP (2) | EP0491077A1 (cs) |
| JP (2) | JP3857305B2 (cs) |
| KR (1) | KR0156587B1 (cs) |
| AT (1) | ATE170220T1 (cs) |
| AU (1) | AU657935B2 (cs) |
| CA (1) | CA2098021C (cs) |
| CZ (1) | CZ290233B6 (cs) |
| DE (1) | DE69130071T3 (cs) |
| DK (1) | DK0563093T4 (cs) |
| ES (1) | ES2121000T5 (cs) |
| HK (1) | HK1002901A1 (cs) |
| HU (1) | HU216301B (cs) |
| SK (1) | SK280551B6 (cs) |
| WO (1) | WO1992011368A1 (cs) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341074C (en) | 1987-06-22 | 2000-08-08 | Hans A. Thoma | Hbv surface antigen particles, prepared by recombinant dna processes, composed of different epitopes, selected from the pre-s and s-peptides as a new vaccine |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| DE4107612A1 (de) | 1991-03-09 | 1992-09-10 | Behringwerke Ag | Rekombinante proteine mit der immunreaktivitaet des hepatitis b virus e antigens (hbeag), verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in immunoassays und impfstoffen |
| US6689363B1 (en) | 1992-01-29 | 2004-02-10 | Epimmune Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions |
| US7611713B2 (en) | 1993-03-05 | 2009-11-03 | Pharmexa Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions |
| US6509149B2 (en) | 1995-06-06 | 2003-01-21 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
| WO1997049425A1 (en) * | 1996-06-25 | 1997-12-31 | Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid | Vaccine comprising antigens bound to carriers through labile bonds |
| US7091324B2 (en) | 1998-11-05 | 2006-08-15 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational epitopes |
| AU2001249564A1 (en) | 2000-03-29 | 2001-10-08 | Cornell Research Foundation Inc. | Method of treating hepatitis delta viral infection |
| IL142802A (en) * | 2000-04-27 | 2015-01-29 | Enzo Therapeutics Inc | Use of one or more HBV antigens for the preparation of oral pharmaceutical preparations for the treatment of a person with active HBV infection or hepatocellular carcinoma |
| US6787526B1 (en) | 2000-05-26 | 2004-09-07 | Idenix Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating hepatitis delta virus infection with β-L-2′-deoxy-nucleosides |
| US7022830B2 (en) * | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
| WO2002062959A2 (en) * | 2001-02-05 | 2002-08-15 | Stressgen Biotechnologies Corp. | Hepatitis b virus treatment |
| US7351413B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-04-01 | Lorantis, Limited | Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis |
| KR100708398B1 (ko) * | 2002-03-22 | 2007-04-18 | (주) 에이프로젠 | 인간화 항체 및 이의 제조방법 |
| DE10339927A1 (de) * | 2003-08-29 | 2005-03-24 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen |
| GB0326416D0 (en) | 2003-11-12 | 2003-12-17 | Karolinska Innovations Ab | Methods and means relating to hepatitis B infection |
| CA2549865A1 (en) * | 2003-11-12 | 2005-06-02 | Hbv Theranostica Ab | Methods and means relating to hepatitis b infection |
| EP1802746B1 (en) * | 2004-10-27 | 2011-05-04 | Crucell Switzerland AG | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus |
| EP2185195A2 (en) * | 2007-08-16 | 2010-05-19 | Tripep Ab | Immunogen platform |
| WO2009092396A1 (en) | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Universitätsklinikum Heidelberg | Hydrophobic modified pres-derived peptides of hepatitis b virus (hbv) and their use as hbv and hdv entry inhibitors |
| CN101485672B (zh) * | 2008-12-05 | 2010-08-25 | 广东粤龙药业有限公司 | 异丙景糖酐在制备治疗人HBeAg阳性慢性乙型肝炎药物中的应用 |
| US9393299B2 (en) | 2009-08-07 | 2016-07-19 | Transgene S.A. | Composition for treating HBV infection |
| US10076570B2 (en) | 2009-08-07 | 2018-09-18 | Transgene S.A. | Composition for treating HBV infection |
Family Cites Families (85)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US34705A (en) * | 1862-03-18 | Improvement in tompions for fire-arms | ||
| US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
| FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
| EP0182442B2 (en) * | 1978-12-22 | 1996-04-03 | Biogen, Inc. | Recombinant DNA molecules and their method of production |
| DD147855A5 (de) * | 1978-12-22 | 1981-04-22 | Biogen Nv | Verfahren zur erzeugung mindestens eines hbv-antigenwirkung aufweisenden polypeptids |
| IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
| US4935235A (en) * | 1979-05-24 | 1990-06-19 | The Regents Of The University Of California | Non-passageable viruses |
| US5196194A (en) * | 1979-05-24 | 1993-03-23 | The Regents Of The University Of California | Vaccines containing Hepatitis B S-protein |
| USRE34705E (en) | 1979-08-30 | 1994-08-23 | Institut Pasteur | Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby |
| US4415491A (en) * | 1980-01-14 | 1983-11-15 | The Regents Of The University Of California | Synthetic vaccine peptide epitomes of hepatitis B surface antigen |
| EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
| FI83662C (fi) * | 1980-07-17 | 1991-08-12 | Scripps Clinic Res | Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning. |
| GR76274B (cs) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
| AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
| US4741901A (en) * | 1981-12-03 | 1988-05-03 | Genentech, Inc. | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
| JPS58194897A (ja) * | 1982-05-07 | 1983-11-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ，その製造方法およびそれで形質転換させた宿主 |
| JPS5936698A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 |
| US4977092A (en) * | 1985-06-26 | 1990-12-11 | Amgen | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
| US5198348A (en) * | 1982-08-30 | 1993-03-30 | Amgen Inc. | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
| JPS5974985A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-04-27 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
| CA1341116C (en) * | 1983-02-22 | 2000-10-17 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein |
| US4696898A (en) * | 1984-01-16 | 1987-09-29 | Integrated Genetics, Inc. | Vector encoding hepatitis B surface antigen |
| FR2559159B1 (fr) * | 1984-02-02 | 1986-09-12 | Inst Nat Sante Rech Med | Vecteurs viraux de clonage et d'expression d'une proteine dans une cellule eucaryote, comportant au moins une partie du genome d'un retro-virus; cellules eucaryotes transfectees; procede utilisant de telles cellules et proteines obtenues |
| FR2560890B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-16 | Grp Genie Genetique | Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention |
| US5324513A (en) * | 1984-03-07 | 1994-06-28 | Institut Pasteur | Composition useful for the fabrication of vaccines |
| US5204096A (en) * | 1984-03-07 | 1993-04-20 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
| US4861588A (en) * | 1985-02-05 | 1989-08-29 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
| US4847080A (en) * | 1984-03-07 | 1989-07-11 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers |
| US5158769A (en) * | 1984-03-07 | 1992-10-27 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
| US4777240A (en) * | 1984-03-08 | 1988-10-11 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
| US4942125A (en) * | 1984-09-07 | 1990-07-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
| AU579148B2 (en) * | 1984-03-09 | 1988-11-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants |
| US4599231A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
| US4599230A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
| US5098704A (en) * | 1984-06-18 | 1992-03-24 | Chiron Corporation | Hepatitis surface antigen particle vaccine |
| EP0401941A3 (en) * | 1984-07-11 | 1991-04-17 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Hepatitis b virus surface antigen and production thereof |
| GB8421282D0 (en) * | 1984-08-22 | 1984-09-26 | Connaught Lab | Multispecific antigenic proteins |
| US4722940A (en) * | 1984-08-23 | 1988-02-02 | Georgia Tech Research Corporation | Aminoalkyl phenyl selenides for the treatment of hypertension and nervous system dysfunctions |
| US4722840A (en) * | 1984-09-12 | 1988-02-02 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
| ATE70308T1 (de) * | 1984-09-12 | 1991-12-15 | Chiron Corp | Hybridpartikel-immunogene. |
| US4639371A (en) * | 1984-10-02 | 1987-01-27 | New York Blood Center, Inc. | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom |
| EP0180012A1 (de) * | 1984-10-27 | 1986-05-07 | Wolfram H. Prof. Dr. Gerlich | Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus |
| US4683136A (en) * | 1985-03-06 | 1987-07-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Proteinaceous antigens with conformation-independent and conformation-dependent determinants |
| CA1324094C (en) * | 1985-04-03 | 1993-11-09 | Dino Dina | Hepatitis a virus vaccines |
| FI861417A0 (fi) * | 1985-04-15 | 1986-04-01 | Endotronics Inc | Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav. |
| US5837249A (en) * | 1985-04-19 | 1998-11-17 | The Wistar Institute | Method for generating an immunogenic T cell response protective against a virus |
| US4639271A (en) * | 1985-04-24 | 1987-01-27 | Moore Business Forms, Inc. | Chromogenic mixtures |
| FR2581394B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1988-08-05 | Grp Genie Genetique | Particules ayant les proprietes immunogenes de l'antigene hbs et portant un site antigenique etranger aux epitopes portes par l'antigene hbs, vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et compositions contenant de telles particules pour la production de vaccins mixtes |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| JPH084507B2 (ja) * | 1985-10-03 | 1996-01-24 | 武田薬品工業株式会社 | 新規ｄｎａおよびポリペプチド |
| US4959323A (en) * | 1985-11-04 | 1990-09-25 | Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Production and use of pre S polypeptides of hepatitis B virus |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| US4742158A (en) * | 1986-04-25 | 1988-05-03 | Merck & Co., Inc. | Purification of hepatitis pre-S antigens by polymerized serum albumin affinity binding |
| IE59389B1 (en) * | 1986-05-23 | 1994-12-23 | Merck & Co Inc | Method for producing hepatitis b virus core antigen (HBcAg) in yeast |
| CA1310602C (en) * | 1986-06-03 | 1992-11-24 | Hajime Horii | Yeast promoter and process for preparing heterologous protein |
| AU617292B2 (en) * | 1986-06-20 | 1991-11-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | T and b cell epitopes of the pre-s region of hepatitis b virus surface antigen |
| US5068185A (en) * | 1986-07-10 | 1991-11-26 | Merck & Co., Inc. | Trains of yeast for the expression of heterologous genes |
| IL79740A0 (en) * | 1986-08-17 | 1986-11-30 | Yeda Res & Dev | Hepatitis vaccine |
| US5143726A (en) * | 1986-12-09 | 1992-09-01 | The Scripps Research Institute | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
| US4818527A (en) * | 1986-12-09 | 1989-04-04 | Scripps Clinic And Research Foundation | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
| US4882145A (en) * | 1986-12-09 | 1989-11-21 | Scripps Clinic And Research Foundation | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
| AP56A (en) * | 1987-01-30 | 1989-09-26 | Smithkline Biologicals S A | Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them. |
| CA1341074C (en) * | 1987-06-22 | 2000-08-08 | Hans A. Thoma | Hbv surface antigen particles, prepared by recombinant dna processes, composed of different epitopes, selected from the pre-s and s-peptides as a new vaccine |
| EP1088830A3 (en) * | 1987-06-22 | 2004-04-07 | Medeva Holdings B.V. | Hepatitis b surface antigen particles |
| US4883865A (en) * | 1987-09-30 | 1989-11-28 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+s antigen |
| US4963483A (en) * | 1987-10-13 | 1990-10-16 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| US5011915A (en) * | 1987-10-26 | 1991-04-30 | Merck & Co., Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| US5039522A (en) * | 1988-01-29 | 1991-08-13 | New York Blood Center, Inc. | Immunogens containing peptides with an attached hydrophobic tail for adsorption to hepatitis B virus surface antigen |
| NZ229260A (en) * | 1988-06-03 | 1994-02-25 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and |
| US5242812A (en) * | 1989-02-07 | 1993-09-07 | Bio-Technology General Corp. | Method for production and purification of hepatitis B vaccine |
| US5462863A (en) * | 1989-02-09 | 1995-10-31 | Development Center For Biotechnology | Isolation of Hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells |
| GB8903313D0 (en) * | 1989-02-14 | 1989-04-05 | Wellcome Found | Conjugates |
| ES2109921T3 (es) * | 1989-07-25 | 1998-02-01 | Smithkline Beecham Biolog | Nuevos antigenos y procedimientos para su preparacion. |
| EP0421626A1 (en) * | 1989-09-19 | 1991-04-10 | Merck & Co. Inc. | Vaccine for aids and hepatitis B |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| US5102989A (en) * | 1991-03-15 | 1992-04-07 | Merck & Co., Inc. | Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells |
| IL101653A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles |
| CA2067003A1 (en) * | 1991-04-29 | 1992-10-30 | Peter J. Kniskern | Hbsag escape mutant vaccine |
| US5840303A (en) * | 1991-08-26 | 1998-11-24 | The Scripps Research Foundation | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus |
| JP2501186Y2 (ja) * | 1992-03-31 | 1996-06-12 | 株式会社栗本鐵工所 | ハンマ―ミル |
| CN1063343C (zh) * | 1993-04-27 | 2001-03-21 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
| CN1094311A (zh) * | 1993-04-27 | 1994-11-02 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
| CN1059927C (zh) * | 1994-03-10 | 2000-12-27 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 羧端带有前表面抗原1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合基因及其编码蛋白 |
| US5792163A (en) * | 1996-01-03 | 1998-08-11 | Hitzig; Gary | Linear punch |
-
1990
- 1990-12-19 EP EP90124775A patent/EP0491077A1/en not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-12-19 JP JP50100592A patent/JP3857305B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 EP EP92900527A patent/EP0563093B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 US US08/075,520 patent/US6020167A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 HU HU9301794A patent/HU216301B/hu unknown
- 1991-12-19 DK DK92900527T patent/DK0563093T4/da active
- 1991-12-19 ES ES92900527T patent/ES2121000T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 DE DE69130071T patent/DE69130071T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 SK SK636-93A patent/SK280551B6/sk unknown
- 1991-12-19 WO PCT/EP1991/002460 patent/WO1992011368A1/en active IP Right Grant
- 1991-12-19 AT AT92900527T patent/ATE170220T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 CZ CZ19931186A patent/CZ290233B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 CA CA002098021A patent/CA2098021C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 AU AU90817/91A patent/AU657935B2/en not_active Ceased
-
1993
- 1993-06-18 KR KR1019930701862A patent/KR0156587B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-10 HK HK98101997A patent/HK1002901A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-06-07 JP JP2000175584A patent/JP2001019643A/ja active Pending
-
2003
- 2003-03-21 US US10/394,896 patent/US20030235591A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU657935B2 (en) | 1995-03-30 |
| AU9081791A (en) | 1992-07-22 |
| JPH06507303A (ja) | 1994-08-25 |
| JP3857305B2 (ja) | 2006-12-13 |
| ATE170220T1 (de) | 1998-09-15 |
| ES2121000T5 (es) | 2008-04-16 |
| EP0491077A1 (en) | 1992-06-24 |
| WO1992011368A1 (en) | 1992-07-09 |
| HUT66437A (en) | 1994-11-28 |
| KR0156587B1 (en) | 1998-10-15 |
| EP0563093B1 (en) | 1998-08-26 |
| JP2001019643A (ja) | 2001-01-23 |
| EP0563093A1 (en) | 1993-10-06 |
| DE69130071T3 (de) | 2008-02-21 |
| DE69130071T2 (de) | 1999-01-07 |
| DE69130071D1 (de) | 1998-10-01 |
| EP0563093B2 (en) | 2007-10-03 |
| US6020167A (en) | 2000-02-01 |
| DK0563093T4 (da) | 2008-01-21 |
| CA2098021C (en) | 2000-04-25 |
| CZ290233B6 (cs) | 2002-06-12 |
| US20030235591A1 (en) | 2003-12-25 |
| HK1002901A1 (en) | 1998-09-25 |
| SK63693A3 (en) | 1993-10-06 |
| DK0563093T3 (da) | 1999-02-08 |
| CA2098021A1 (en) | 1992-06-20 |
| HU9301794D0 (en) | 1993-10-28 |
| HU216301B (hu) | 1999-06-28 |
| SK280551B6 (sk) | 2000-03-13 |
| ES2121000T3 (es) | 1998-11-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ118693A3 (en) | Combination for treating chronic viral liver diseases | |
| JP2758184B2 (ja) | 肝炎ｂ表面抗原ワクチン | |
| Kuroki et al. | A cell surface protein that binds avian hepatitis B virus particles | |
| KR101639216B1 (ko) | Ｂ형 간염 바이러스(ＨＢＶ)의 소수성 변형된 ｐｒｅＳ-유래 펩티드 및 이의 ＨＢＶ 및 ＨＤＶ 침입 억제제로서의 용도 | |
| KR100208129B1 (ko) | B형 간염 백신 | |
| US20090239265A1 (en) | Virus like particles | |
| IE69265B1 (en) | Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins | |
| CA2084180A1 (en) | Expression of specific immunogens using viral antigens | |
| Pride et al. | Evaluation of B and T-cell responses in chimpanzees immunized with Hepagene®, a hepatitis B vaccine containing pre-S1, pre-S2 and S gene products | |
| WO2014205491A1 (en) | Biological molecules and methods of use | |
| WO1998028004A1 (en) | Hepatitis delta particle containing a fusion protein immunogen | |
| JP5102209B2 (ja) | 切り詰め型ｈｂｃコアタンパク質と、サポニンが主成分の免疫増進剤とを含有するワクチン | |
| Wu et al. | A novel hepatitis B virus variant S 129 (Gln→ Leu): Lack of correlation between antigenicity and immunogenicity | |
| US10369218B2 (en) | Immunostimulator and method for producing the same | |
| KR970007153B1 (ko) | B형 간염 표면 항원 백신 | |
| NO885658L (no) | Retrovirusekspresjonsvektorer og fremgangsmaater for fremstilling av hbv-antigener. | |
| EP3173476A1 (en) | Immunity inducer | |
| TW209245B (cs) | ||
| KR960004264B1 (ko) | B형 간염 표면항원, 이의 생성 진핵 세포 및 백신의 제조방법, 검정방법 및 진단용 키트 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20081219 |