CN1913896A

CN1913896A - 用于治疗和控制血红蛋白病和贫血病的方法和组合物

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Publication number: CN1913896A
Application number: CNA2004800412523A
Authority: CN
Inventors: 劳瑞·穆塔-德帕塞维尔; 凯乐·W·H·陈; 海伦·布拉迪
Original assignee: Celgene Corp
Current assignee: Celgene Corp
Priority date: 2003-12-02
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2007-02-14
Anticipated expiration: 2024-12-02
Also published as: KR20060109979A; JP2011207906A; KR20110116225A; IL176020A0; JP2007513164A; CN101966183A; HK1100262A1; AU2004296765A1; AU2011202457B2; AU2004296765B2; CA2547570A1; JP5089170B2; EP1694328A4; ZA200604815B; MXPA06006061A; WO2005055929A3; US20050143420A1; CN1913896B; NZ548049A; BRPI0417186A

Abstract

本发明涉及免疫调节化合物，具体是一类称作IMiD^TM的化合物成员，更具体是化合物4－(氨基)－2－(2，6－二氧代(3－哌啶基))－异吲哚啉－1，3－二酮和3－(4－氨基－1－氧代－1，3－二氢异吲哚－2－基)－哌啶－2，6－二酮的用途，用于在CD34⁺细胞群中诱导胎儿血红蛋白的基因、红血球生成必需基因、和编码α血红蛋白稳定蛋白的基因的表达。这些化合物用于治疗血红蛋白病，如镰刀型细胞贫血病或β－地中海贫血症，或因为疾病、手术、意外事件、或者毒素、毒药或药物的引入或摄入所引起的贫血病。

Description

用于治疗和控制血红蛋白病和贫血病的方法和组合物

本申请要求2003年12月2日提交的美国临时申请60/526,910的优先权，在此引入其全部内容作为参考。

1.发明领域

本发明涉及治疗、预防和/或控制血红蛋白病(如镰刀型细胞贫血病)和其它贫血病(如疾病或药物诱导的贫血病)的方法，该方法包括给予称作IMiD^TM的沙利度胺类似物成员，具体地是IMiD^TM 4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮(也称作α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺；Celgene Corporation)和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮(也称作3-(4′氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮；Celgene Corporation)，和包括这种化合物的药物组合物。

2.发明背景

2.1.镰刀型细胞贫血病和其它血红蛋白病

镰刀型细胞贫血病(″SCA″)是一种与异常血红蛋白(称作血红蛋白S)有关的遗传性溶血性贫血病。据报道，这种疾病产生的原因是由于氨基酸的取代使血红蛋白S中的电荷降低，从而使取代的血红蛋白S的溶解度降低。The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第17版，MerckResearch Laboratories，Whitehouse Station，NJ，第878页(1999)。这种溶解度降低的血红蛋白S使棒状类晶团聚体形成半固体凝胶，使红血球成为月牙镰刀状。这些变形和变硬的红血球与血管内皮粘附，堵住小的细动脉和毛细血管，引起闭塞和梗塞形成。因为镰刀状红血球太碎，以致于不能承受血液循环的机械压力，因此当它们进入循环时会发生溶血。

SCA通常与特定的种族，即与非洲人-美洲人和其它热带非洲撒哈拉以南人群的后裔有关。患者遭受因镰刀状红血球闭塞而引起的急性疼痛。镰刀状红血球的存活期约为两周，而正常红血球的存活期约为四个月。因而，存活期缩短会导致慢性贫血病。

SCA的症状包括对生成和发展的损害；感染的可能性增大；塔形状的头骨；骨变化，如皮质变薄，不规则骨密度和髓管内的新骨形成；由于自动脾切除术使脾变小；风湿性或先天性心脏病机会增大；肺和肾功能逐渐降低；以及急性胸腔综合症。急性胸腔综合症是死亡的主要原因，其特征是突发性感冒、胸痛、白血球增多和在胸部x-射线中肺部肝细胞性渗透。

现有的治疗SCA的技术包括诱导胎儿血红蛋白，松弛血管，降低红血球粘合，和使用Gardos通道拮抗剂。Iyamu和Asakura，Expert Opin.Ther.Patents，13(6)：807-813(2003)。Gardos通道是一种由Gardos描述的钙活化的钾通道(Curr.Top.Membr.Transp.10：217-277(1978)和Nature London 279：248-250(1979))。

大部分经过研究和使用的SCA治疗是口服给予羟基脲(HU)。相信HU是通过诱导胎儿血红蛋白(HbF)的产生而发挥其作用。然而，HU并非对于所有患者都有效；一些患者对HU根本没有反应，而另一些患者会出现骨髓抑制。Iyamu和Asakura，同上。已使用被称作HEMOXIN^TM(以前称作NIPRISAN^TM)的天然草药提取物治疗SCA，这种提取物通过与HbS结合发挥其抗镰刀形成作用。参见美国专利5,800,819。Iyamu和Asakura，同上。HEMOXIN^TM仍未被FDA批准用于治疗SCA。一个研究小组当前正在研究使用克霉唑和其它Gardos通道阻断剂来降低镰刀状红血球的脱水特性。Iyamu和Asakura，同上。然而，这种化合物的功效还未得到证实。其它SCA治疗包括葡萄糖和电解质的静脉注射溶液，麻醉性止痛剂，和用于极度严重的贫血病病例的输液。考虑到多数SCA治疗的新生态，需要治疗和控制SCA的安全有效疗法。

提高胎儿血红蛋白产生的治疗很受人关注，原因是它们可以提高患有血红蛋白病或贫血病个体的血红蛋白总量。在成年人中，两种血红蛋白(血红蛋白α和血红蛋白β)占主要地位，几乎没有其它血红蛋白类型。相对而言，在胎儿中，存在另两种血红蛋白，血红蛋白ε和血红蛋白γ。血红蛋白ε是早期发展的主要形式，但发展到大约八周时在胎儿中消失。相反，血红蛋白γ在早期发展中存在，在妊娠约6-30周时达到峰值，占总血红蛋白的45％。然后，从出生前的大约6周到出生后的大约40期间，在总血红蛋白中消失。尽管其在40周后仍然在个体中存在，但是其后在血流中占总血红蛋白的2％以下。

2.2.IMID^TM

已经鉴定了一类化合物，称作IMiD^TM(Celgene Corporation)或免疫调节性药物，它们表现出对TNF-α的强烈抑制，和对LPS诱导的单核细胞IL1β和IL12产生的显著抑制作用。LPS诱导的IL-6也受免疫调节化合物的抑制，虽然是部分性的。这些化合物是LPS诱导的IL-10的强效刺激剂。已经证实了IMiD^TM可沿骨髓和红血球路径调节CD34⁺细胞的分化。参见2003年12月25日公开的美国专利申请2003/0235909，在此引入其全部内容作为参考。IMiD^TM的具体例子包括但不限于公开在G.W.Muller等人的美国专利6,281,230和6,316,471所述的取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)酞酰亚胺和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚。此前IMiD^TM没有被用作治疗血红蛋白病或贫血病的候选物，或作为红血球生成中所涉及基因的调节剂。

3.发明概述

本发明涉及治疗患有贫血病或血红蛋白病的个体的方法，所述方法包括给予有效量的本发明的化合物。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有贫血病或血红蛋白病的个体的方法，所述方法包括给予所述个体免疫调节化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前药。在一具体实施方案中，所述的贫血病是通过给予药物或化疗诱导的或与其有关的贫血病。在另一具体实施方案中，所述免疫调节化合物是氨基-取代的沙利度胺。在一更具体的实施方案中，所述免疫调节化合物是IMiD^TM。在一更具体的实施方案中，所述IMiD^TM是α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺(也称作4-(氨基)-2-(2，6-二氧代-(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮)；α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺的类似物或前药；3-(4′氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮；3-(4′氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮的类似物或前药，或下式的化合物：

在另一更具体的实施方案中，所述IMiD是1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉，1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉，1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基异吲哚啉，1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉，1，3二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉，或1，3二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉。

在另一具体实施方案中，所述治疗方法还包括用第二化合物治疗所述个体，其中所述第二化合物是诱导胎儿血红蛋白的化合物，松驰血管的化合物，当与血红蛋白S共价结合时降低血红蛋白S自凝集的化合物，作为Gardos通道拮抗剂的化合物，或降低红血球粘合的化合物。在一更具体的实施方案中，所述第二化合物是羟基脲，胍基衍生物，一氧化二氮，丁酸酯或丁酸酯衍生物，醛或醛衍生物，具有抗镰形细胞形成活性的植物提取物(例如，NIPRISAN^TM(HEMOXIN^TM))，克霉唑，三芳基甲烷的衍生物，单克隆抗体或聚乙二醇衍生物。

在另一具体实施方案中，所述治疗方法还包括用至少一种细胞因子治疗所述个体。在一更具体的实施方案中，所述至少一种细胞因子是促红血球生成素(Epo)、SCF、GM-CSF、Flt-3L、TNFα、IL-3、或其任何组合。在所述方法的另一具体实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一更具体的实施方案中，所述个体是人。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种调节CD34⁺干细胞或前体细胞分化成红血球的方法，该方法包括在合适条件下，在免疫调节化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前药存在的情况下分化所述细胞。在一更具体的实施方案中，所述免疫调节化合物是氨基-取代的沙利度胺。在另一更具体的实施方案中，所述免疫调节化合物是IMiD。在一更具体的实施方案中，所述IMiD是α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺(也称作4-(氨基)-2-(2，6-二氧代-(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮)；α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺的类似物或前药；3-(4′氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮；3-(4′氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮的类似物或前药，或下式的化合物：

在另一更具体的实施方案，所述IMiD是1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉，1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉，1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基异吲哚啉，1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉，1，3二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉，和1，3二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉。在另一具体实施方案中，所述CD34⁺干细胞或前体细胞是体外细胞。在另一具体实施方案中，所述CD34⁺干细胞或前体细胞是体内细胞。

在另一具体实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与至少一种细胞因子接触。在一更具体的实施方案中，所述至少一种细胞因子是促红血球生成素、SCF、GM-CSF、Flt-3L、TNFα、IL-3、或其任何组合。

本发明还提供了包括本发明的化合物和另一个化合物或细胞因子的药物组合物。因此，本发明提供一种药物组合物，含有处于药学上可接受的载体中的IMiD和第二化合物，其中所述第二化合物是诱导胎儿血红蛋白的化合物，松驰血管的化合物，当与血红蛋白S共价结合时降低血红蛋白S自凝集的化合物，作为Gardos通道拮抗剂的化合物，或降低红血球粘合的化合物。在一个更具体实施方案中，所述第二化合物是羟基脲，胍基衍生物，一氧化二氮，丁酸酯或丁酸酯衍生物，醛或醛衍生物，具有抗镰形细胞形成活性的植物提取物(例如，HEMOXIN^TM)，克霉唑，三芳基甲烷的衍生物，单克隆抗体或聚乙二醇衍生物。

本发明还提供了一种药物组合物，含有处于药学上可接受的载体中的IMiD和至少一种细胞因子。在具体实施方案中，所述细胞因子是促红血球生成素(Epo)、SCF、GM-CSF、Flt-3L、TNFα、IL-3、或其任何组合。

本发明还提供了一种治疗患有血红蛋白病或贫血病的个体的方法，所述方法包括以一定量的化合物给予所述个体一定的时间，使得α血红蛋白稳定蛋白(AHSP)的水平产生可检测的增加。在该方法的一个实施方案中，所述化合物是IMiD^TM。在一具体实施方案中，所述化合物是α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺(也称作4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮)或3-(4′氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮。

在本文中，所使用的术语″血红蛋白病″指个体的任何血红蛋白结构或功能方面的任何缺陷，包括由任何突变所引起的血红蛋白在一级、二级三级或四级结构中的缺陷，例如在任何血红蛋白基因的编码区中的删除或取代突变，或使产生的血红蛋白的量相对于正常或标准情况下降的基因的启动子或增强子中的突变或该启动子或增强子的删除。该术语还包括由外部因素(如疾病、化疗、毒素、毒药等)引起的血红蛋白的数量或效力的任何下降，不论是正常的下降还是异常的下降。

在本文中，所使用的″贫血病″指与正常情况相比，血流中的血红蛋白的量的任何下降。这种下降可能是由于血细胞损失、缺铁、毒素、毒药、疾病、或任何其它生理原因所导致的。

在本文中，所使用的术语″血红蛋白病的症状″和″贫血病的症状″指与任何血红蛋白病或贫血病有关的任何生理学或生物学症状，包括但不限于头昏眼花、气短、意识损失、疲劳、虚弱、溶血、与异常血红蛋白有关的疼痛、红血球数量下降(即血球溶积下降)、与正常血量相比给定体积的水载氧能力下降、在显微镜下观察红血球变形等。该术语还包括负面心理症状，如压抑、低自尊、病感、身体能力受限等。

在本文中，所使用的术语″IMiD″指下文5.2节中所公开的化合物种类，包括化合物4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮(也称作α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺)和3-(4′氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮。

在本文中，所使用的术语″CC-5013″和″Revimid^TM″指化合物3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮(也称作3-(4′氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮)。

在本文中，所使用的术语″CC-4047″和″Actimid^TM″指化合物4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮(也称作α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺)。

在本文中，所使用的术语″CD34⁺细胞″指CD34⁺干细胞、祖细胞、或前体细胞。

在本文中，所使用的术语HEMOXIN^TM和NIPRISAN^TM指美国专利5,800,819中公开的植物提取物，其特征是约12至约17份重量的Piperguineense种子，约15至约19份重量的Pterocarpus osun茎，约12至约18份重量的Eugenia caryophyllata果实，和约25至约32份重量的Sorghum bicolor叶，和可选择的15至22份重量的碳酸钾的混合物，其中该混合物用冷水萃取。这种植物提取物具有抗镰形细胞形成活性。

4.附图说明

图1显示了在DMSO(对照)或者4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮存在时，在SCF、Flt3-L、GM-CSF和TNFα存在的情况下CD34⁺细胞分化的时间线。

图2显示了，胎儿血红蛋白基因血红蛋白ε₁、血红蛋白γ_A和血红蛋白γ_B的诱导表达对DMSO(对照)或4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮的响应。还显示了4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮(CC-4047)对与血红蛋白ε₁有关的EST的诱导的影响。

图3显示了培养6天后，在0、0.01、0.1、1.0、10或100μM 4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮存在的情况下，CD34⁺细胞中血型糖蛋白A标记的水平。

图4显示了培养6天后，在0、0.01、0.1、1.0、10或100μM 4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮存在的情况下，CD34⁺细胞中胎儿血红蛋白的水平。

图5显示了微阵列的一部分，显示了在含有SCF、Flt3-L、GM-CSF和TNFα的培养基中培养第0天、第3天和第6天时，红血球特异性基因的相对表达水平。通过将源于RNA的生物素标记cRNA与AffymetrixU133A微阵列杂交确定表达水平。

图6显示了在DMSO(对照)或者4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮存在时，在SCF、Flt3-L和IL-3存在的情况下CD34⁺细胞膨胀，然后在SCF和促红血球生成素存在的情况下分化的时间线。

图7是FACS分析结果，显示了在Epo和SCF存在的情况下、在4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或者DMSO(对照)存在时血型糖蛋白A在分化后的表达略微下降。每个象限中的数值表明表达血型糖蛋白A和/或CD71的细胞百分比。

图8显示了在4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮存在的情况下，与DMSO对照和SCF(50ng/ml)+Epo(4单位/ml)存在的情况相比，分化6天后CD34⁺细胞中的胎儿血红蛋白的表达升高。4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮的浓度从0.001μM变到10μM。数据点显示了用流式细胞法测得的表达胎儿血红蛋白的细胞的百分比。

图9是FACS分析，表明了胎儿血红蛋白的表达升高与成人血红蛋白的表达下降有关(Y-轴)。每个象限中的数值表明表达胎儿血红蛋白和/或成人血红蛋白的细胞的百分比。细胞在Epo、SCF、和4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或DMSO存在的情况下分化6天。

图10显示了与羟基脲或5-氮杂胞苷相比，4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮使胎儿血红蛋白的表达增加。细胞在存在SCF(50ng/ml)和Epo(2U/ml)，和DMSO(对照)、4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮(0.1、1、10μm)、5-氮杂胞苷(0.1、1μM；毒性10μM)或者羟基脲(0.1、1、10M)的情况下培养6天。各条柱显示出表达胎儿血红蛋白的细胞的百分比。

图11是流式细胞法分析，表明了在提高胎儿血红蛋白表达方面，4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮和羟基脲具有协同作用。CD34⁺细胞在SCF和Epo，和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮或者4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮(参见5.2节)存在的情况下分化6天。每一图表中的数值显示出表达胎儿血红蛋白的细胞的百分比。

图12显示了在存在或不存在Epo时，使用4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或者DMSO(对照)，从UT-7中得到的STAT5凝胶。下图：STAT5蛋白的绝对水平。上图：磷酸化的STAT5蛋白的水平。

5.发明详述

5.1.CD34⁺细胞向红血球系的分化

本发明提供了调节CD34⁺干细胞、前体细胞或祖细胞分化成主要的红血球系的方法。本发明人发现，当被称作的IMiD^TM的一类免疫调节化合物在适合条件下与这种细胞接触时，分化转向红血球系。这种分化转向可通过基因表达的特点变化来证实，包括但不限于编码血型糖蛋白A和胎儿血红蛋白(如血红蛋白γ和血红蛋白ε)的基因表达增加。因此，本发明的方法非常有用，其提供一种能够提高产血红蛋白细胞群产量的方法，该细胞群可替代个体中的天然产生的产血红蛋白细胞群。

IMiD^TM也可使分化的CD34⁺细胞中的α血红蛋白稳定蛋白的表达增加，α血红蛋白稳定蛋白是一种优选结合α血红蛋白而不是β血红蛋白或血红蛋白A(Hbα₂β₂)的蛋白。这是有利的，因为在α血红蛋白的量超过β血红蛋白时易于形成损害红血球的沉淀。因此，预测AHSP和IMiD-介导的AHSP表达的增加能够调节α血红蛋白过量的病理状态，包括β地中海贫血症。这种对AHSP表达的影响以及胎儿血红蛋白表达的增加相对于增加胎儿血红蛋白表达的其它药物，是IMiD治疗的优点。

因此，本发明首先提供一种调节CD34⁺细胞分化成红血球系的方法，该方法包括在适合条件下和在免疫调节化合物如IMiD，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前药存在下分化所述细胞。可用于本发明中的IMiD^TM的例子详细公开在下文的5.2节中。然而，特别优选的IMiD^TM是3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮和4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮。

CD34⁺细胞可以是能够分化成红血球的任何干细胞、祖细胞、或定型细胞。这些细胞可以是全能性的或多能性的，或可以定型成造血细胞系。CD34⁺细胞可以源于任何来源；特别优选的是源于胎盘的″胚胎样″干细胞。关于这种胚胎样干细胞及其获得方法的说明，参见2003年9月25日公开的美国申请公开US 2003/0180269 A1，在此引入其全部内容作为参考。用于本发明方法的其它CD34⁺细胞包括从任何组织得到的干细胞(例如，造血干细胞或胚胎干细胞)和从任何组织得到的无定型祖细胞。当这些根据本发明方法调节其分化的细胞用于治疗贫血病或血红蛋白病时，相对于目标受体，这些CD34⁺细胞可以是异种的或自体同源的。

CD34⁺细胞的分化通常在3-6天内发生。在IMiD存在的情况下培养CD34⁺细胞的体外分析(实施例所述)表明，沿红细胞途径分化的基因表达的变化在培养的第3天观察到。红血球特异性基因表达显著增加，红血球的表型特征出现在培养第6天的CD34⁺细胞中。

因此，根据本发明，可以在本发明的化合物(如免疫调节化合物，具体是IMiD)存在的情况下体外培养CD34⁺细胞一段时间，培养的天数足以出现红血球特异性基因表达，特别是胎儿血红蛋白基因表达，和/或细胞特征。在各实施方案中，CD34⁺细胞可以培养3、6、9或12天，或更久。本发明的化合物可以在培养开始时一次性加入，并持续培养，直到分化基本上完成，或培养3、6、9、12天或更久。可选择地，可以在培养过程中多次将本发明的化合物加到培养的CD34⁺细胞中。可以在一种本发明化合物或在多种不同的本发明化合物存在的情况下培养CD34⁺细胞。

本发明的化合物可以以0.01μM-10mM的任何浓度使用。优选地，4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮的浓度为0.01-10μM，3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的浓度优选是0.01-100μM。

除了体外分化CD34⁺细胞外，这些细胞也可以在个体内进行分化。这种个体优选是哺乳动物，更优选是人。如同体外分化CD34⁺细胞一样，可通过给予一种或多种本发明的免疫调节化合物来分化个体内的CD34⁺细胞。这种给予可以是单剂量形式。可选择地，可以多次给予个体一种或多种本发明的化合物。这种给予可以例如在3、6、9、12或更多天内进行，可以按照下文5.4节所述的剂量方案和形式进行。

如果在体内分化CD34⁺细胞，那么可以单独使用免疫调节化合物，或使用免疫调节化合物与一种或多种细胞因子的组合来完成分化。例如，对于患有血红蛋白病如镰刀型细胞贫血病或地中海贫血病的个体而言，如果其SCF和/或促红血球生成素的水平比正常的高，则可以通过给予一种或多种免疫调节化合物(例如，4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮)来完成体内分化。相反，如果个体患有因红血球生成细胞因子(例如，SCF或促红血球生成素)水平比正常低而引起的或以其为特征的贫血病，那么可以单独给予细胞因子，或在给予免疫调节化合物同时或之前给予细胞因子。例如，对于患有化疗诱导的贫血病的个体可以给予一种或多种细胞因子(例如，SCF、Flt-3L和IL-3的组合)，例如给予3-6天，随后给予例如3-6天的一种或多种本发明的免疫调节化合物，具体地与SCF和促红血球生成素同时给予，其量足以使所述个体的CD34⁺细胞中的胎儿血红蛋白表达产生可检测的增加。可选择地，这种个体可以被给予CD34⁺细胞，该细胞与一种或多种体外细胞因子(例如，SCF、Flt-3L和IL-3)接触例如3-6天，随后将该细胞与SCF和促红血球生成素一起给予该个体，其量足以使CD34⁺细胞中的胎儿血红蛋白表达产生可检测的增加。这种给予可以进行一次或多次，并且任何一次或多次这种给药可通过给予本发明的化合物(参见5.3节)，第二化合物(见下)，或所有三种的组合来实现。

本发明的任何化合物(例如，4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮)可以与CD34⁺干细胞、祖细胞或前体细胞接触，以诱导细胞中与红血球生成和/或造血作用有关或必需的一种或多种基因，尤其是一种或多种编码胎儿血红蛋白的基因。在一实施方案中，本发明提供了诱导与红血球生成或造血作用有关或必需的一种或多种基因的方法，该方法包括在促红血球生成素和干细胞因子的存在下，使造血干细胞、祖细胞或前体细胞与免疫调节剂接触，其中所述的免疫调节剂的存在量足以使所述造血干细胞、祖细胞或前体细胞表达一种或多种编码胎儿血红蛋白的基因。在一具体实施方案中，所述造血干细胞、祖细胞或前体细胞是CD34⁺细胞。在另一具体实施方案中，所述与红血球生成或造血作用有关的或必需的一种或多种基因是编码以下物质的基因：Kruppel样因子1红血球；恒河猴血型相关的糖蛋白；血型糖蛋白B；整合素α2b；红血球相关的因子；血型糖蛋白A；Kell血型前体；血红蛋白α2；溶质载体4，阴离子交换剂；碳酸酐酶1；血红蛋白γA；血红蛋白γG；血红蛋白ε1；或上述的任何组合。在另一具体实施方案中，所述免疫调节剂是IMiD^TM。在一更具体的实施方案中，所述IMiD^TM是α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺；α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺的类似物或前药；3-(4′氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮；3-(4′氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮的类似物或前药；或下式的化合物：

除了一种或多种本发明的化合物外，CD34⁺细胞还可以在一种或多种细胞因子的存在下进行额外的体内或体外分化。用于引导CD34⁺细胞沿红血球分化路径分化的细胞因子包括但不限于促红血球生成素(Epo)、TNFα、干细胞因子(SCF)、Flt-3L、和粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)。Epo和SCF是公知的红血球生成细胞因子。因此，在一实施方案中，在Epo或SCF的存在下分化CD34⁺细胞。在另一优选的实施方案中，在Epo和SCF的存在下分化CD34⁺细胞。在另一实施方案中，在TNFα、SCF、Flt-3L和GM-CSF组合的存在下分化CD34⁺细胞。在另一实施方案中，所述被分化的细胞是细胞培养基中的一种或多种细胞。在另一实施方案中，所述被分化的细胞是个体中的细胞。在一体外分化的实施方案中，Epo、TNFα、SCF、Flt-3L和GM-CSF中的一种或多种与一种或多种IMiD^TM接触。在体内分化的一实施方案中，在给予一种或多种IMiD^TM的同一个治疗方案中，将Epo、TNFα、SCF、Flt-3L和GM-CSF中的一种或多种给予个体。

本发明方法所用的细胞因子可以是天然发生的细胞因子，或是该细胞因子的人造衍生物或类似物。例如，可以与本发明的化合物一起使用的促红血球生成素的类似物或衍生物包括但不限于Aranesp^TM和Darbopoietin^TM。

所用的细胞因子可从天然来源纯化或经重组产生。本发明的方法所用的重组细胞因子的例子包括非格司亭；或重组粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)，其在美国以商品名Neupogen^(Amgen，Thousand Oaks，CA)出售；沙格司亭；或重组GM-CSF，其在美国以商品名Leukine^(Immunex，Seattle，WA)出售；重组Epo，其在美国以商品名Epogen^(Amgen，Thousand Oaks，CA)出售；和甲硫基干细胞因子(SCF)，其在美国以商品名Ancestim出售。GM-CSF的重组和突变形式可根据美国专利5,391,485、5,393,870和5,229,496的描述制备，这些专利引入本文作为参考。G-CSF的重组和突变形式可根据美国专利4,810,643、4,999,291、5,528,823和5,580,755的描述制备，这些专利引入本文作为参考。

可以使用在体外或体内条件下能够促进造血前体细胞和免疫活性造血细胞的存活和/或增殖，或在体外或体内条件下刺激细胞中的定型红血球祖细胞的分裂和分化的其它细胞因子。这种细胞因子包括但不限于：白细胞介素，如IL-2(包括重组IL-II(“rIL2”)和金丝雀痘(canarypox)IL-2)、IL-10、IL-12和IL-18；干扰素，如干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia和干扰素γ-Ib；和G-CSF。

当给予患有血红蛋白病的患者时，本发明的化合物，特别是在Epo存在的情况下，特别是在TNFα、SCF、Flt-3L和GM-CSF的组合存在的情况下，和更特别是在Epo和SCF存在的情况下，可诱导红血球的产生，胎儿血红蛋白的产生，以及AHSP的产生。如上所述，所用的细胞因子可以包括纯化或重组形式，或特定细胞因子的类似物或衍生物。

本发明的化合物也可以与对血红蛋白病已知具有或可能具有有益效果的一种或多种第二化合物组合使用。在本文中，″有益效果″指任何血红蛋白病或贫血病症状的任何减弱。

例如，针对具体的血红蛋白病镰刀型细胞贫血病而言，第二化合物可以是除了本发明化合物之外，已知或可能能诱导胎儿血红蛋白产生的化合物。这种化合物包括羟基脲，丁酸酯或丁酸酯衍生物。第二化合物也可以是松驰血管的化合物，如一氧化二氮，例如，外用或给予的一氧化二氮。第二化合物也可以是与血红蛋白S直接结合，防止诱导镰刀结构形成的化合物。例如，被称作HEMOXIN^TM(NIPRISAN^TM；参见美国专利5,800,819)的植物提取物，其是约12到约17份重量的Piperguineense种子，约15到约19份重量的Pterocarpus osun茎，约12到约18份重量的Eugenia caryophyllata果实，和约25到约32份重量的Sorghum bicolor叶，和可选择的15到22份重量的碳酸钾的混合物的提取物，其中该混合物用冷水萃取，具有抗镰形细胞形成活性。第二化合物也可以是Gardos通道拮抗剂。Gardos通道拮抗剂的例子包括克霉唑和三芳基甲烷衍生物。第二化合物也可以是降低红血球粘合，从而降低镰刀型细胞贫血病中血液凝块的量的化合物。

其它血红蛋白病可以用对具体病症已知或可能有效的第二化合物治疗。例如，地中海贫血症可以用第二化合物甲磺酸去铁胺(一种防止血液中铁积聚的铁螯合剂或叶酸(维生素B9)治疗。地中海贫血症或镰刀型细胞贫血病也可以用蛋白C作为第二化合物进行治疗(美国专利6,372,213)。有一些证据表明，草药疗法可以改善血红蛋白病的症状，例如，地中海贫血症。这种疗法和其中所含的任何特定的活性化合物都可以用作本发明方法中的第二化合物。参见，例如，Wu Zhikui等人，″TheEffect of Bushen Shengxue Fang on β-thalassemia at the Gene Level″，Journal of Traditional Chinese Medicine 18(4)：300-303(1998)；美国专利6,538,023，″Therapeutic Uses of Green Tea Polyphenols for Sickle CellDisease″。自体免疫性溶血性贫血病的治疗可以包括使用皮质类固醇作为第二化合物。

第二化合物可以是蛋白，并可以是其它蛋白的衍生物或类似物。这种衍生物可以包括但不限于缺少其天然形式中存在的碳水化合物部分的蛋白(例如，非糖基化形式)，聚乙二醇化衍生物和融合蛋白，如通过将IgG1或IgG3与蛋白或目的蛋白的活性部分融合而形成的融合蛋白。参见，例如，Penichet，M.L.和Morrison，S.L.，J.Immunol Methods 248：91-101(2001)。

用于治疗贫血病或血红蛋白病的有效的细胞因子和/或其它化合物可以与本发明的免疫调节化合物同时给予。就此而言，细胞因子或其它化合物可以以与免疫调节化合物不同的剂型给予，或如果可能，与免疫调节化合物混合而作为单一药物组合物给予。可选择地，细胞因子，其它化合物或二者，可以与本发明方法中所用的免疫调节化合物分开给予，并可以按照相同或不同的剂量方案给予。在优选的实施方案中，免疫调节化合物例如IMiD^TM、细胞因子、和用于治疗贫血病或血红蛋白病的任何其它化合物被同时给予，但是以分开的药物剂型给予，以保证给药的灵活性。

除了上述治疗组合之外，治疗的个体也可被输液。这种输液可以是输血，优选相匹配的血液，或血液替代品，如Hemospan^TM或Hemospan^TMPS(Sangart)。

在上述任何治疗组合中，治疗的个体是真核的。优选地，治疗的个体是哺乳动物，更优选是人。

本发明的方法可用于治疗任何贫血病，包括血红蛋白病引起的贫血病。可以用本发明方法治疗的血红蛋白病和贫血病的起源可以是遗传性的，如镰刀形细胞贫血病或地中海贫血症。血红蛋白病可以是因为疾病如癌症所引起的，包括但不限于造血或淋巴系统癌。可以用本发明方法治疗的其它疾病包括脾功能亢进症、脾切除适应症、肠切除、和骨髓渗透。本发明的方法也可用于治疗故意或意外引入毒药、毒素或药物而引起的贫血病。例如，因癌症化疗所引起的贫血病可以用本发明的方法和化合物治疗。同样，当贫血病或血红蛋白病是待治疗的原发性疾病，或是以前的疾病或治疗方案所引起的继发性疾病时，可以使用本发明的方法。

5.2.本发明的化合物

本发明的化合物可以商购得到，也可以根据本文所公开的专利或专利出版物中描述的方法制备获得。此外，可不对称合成或使用已知的拆分剂或手性柱以及其它标准的有机化学合成技术拆分光学纯的化合物。在本发明中使用的化合物包括免疫调节化合物，其是外消旋的、立体异构富集的或立体异构体纯的，以及其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体和前药。

在本发明中使用的优选化合物是分子量小于约1,000g/mol的小有机分子，并且不是蛋白质、肽、低聚核苷酸、低聚糖或其它大分子。

在本文中，除非另外指明，所使用的术语“免疫调节化合物”和“IMiD^TM”(Celgene Corporation)包括小的有机分子，其可显著抑制TNF-α，LPS诱导的单核细胞IL1β和IL12，和部分地抑制IL6的产生。具体的免疫调节化合物将在下文讨论。

TNF-α是由巨噬细胞和单核细胞在急性炎症期间产生的炎性细胞因子。TNF-α引发细胞内的不同种信号事件(signaling events)。不受理论的限制，由本发明的免疫调节化合物所产生的生物学效果之一是减少TNF-α的合成。本发明的免疫调节化合物提高了TNF-αmRNA的降解。

此外，不受理论限制，本发明所使用的免疫调节化合物还可以是有效的T细胞共刺激因子，并且能够以剂量依赖的方式显著增加细胞增殖。，本发明的免疫调节化合物对于CD8+T细胞亚群比对CD4+T细胞亚群具有更大的共刺激作用。另外，本发明化合物优选具有抗炎属性，并有效共刺激T细胞。此外，不受特定理论的限制，本发明所使用的免疫调节化合物可以通过细胞因子活化间接作用于自然杀伤(″NK″)细胞或直接作用于其上，并提高NK细胞的能力，从而产生有益的细胞因子，例如但不限于IFN-γ。

免疫调节化合物的具体实例包括但不限于：取代的苯乙烯的氰基和羧基衍生物，例如在美国专利5,929,117中公开的那些；1-氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟代哌啶-3-基)异吲哚啉和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟代哌啶-3-基)异吲哚啉，例如在美国专利5,874,448和5,955,476中描写的那些；四取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉，其描述于美国专利5,798,368中；1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉(例如沙利度胺的4-甲基衍生物)，包括但不限于，在美国专利5,635,517、6,476,052、6,555,554和6,403,613中公开的那些；在吲哚环4-或5-位取代的1-氧代和1，3-二氧代异吲哚啉(如4-(4-氨基-1，3-二氧代异吲哚啉-2-基)-4-氨基甲酰丁酸)，其描述于美国专利6,380,239中；在2-位由2，6-二氧-3-羟基哌啶-5-基取代的异吲哚啉-1-酮和异吲哚啉-1，3-二酮(例如2-(2，6-二氧代-3-羟基-5-氟代哌啶-5-基)-4-氨基异吲哚啉-1-酮)，其描述于美国专利6,458,810中；在美国专利5,698,579和5,877,200中公开的一类非多肽环状酰胺；氨基沙利度胺以及氨基沙利度胺的类似物、水解产物、代谢物、衍生物和前体、以及取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)酞酰亚胺和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉，例如美国专利6,281,230和6,316,471中描述的那些；和异吲哚-酰亚胺化合物，例如美国专利申请09/972,487(2001年10月5日提交)、美国专利申请10/032,286(2001年11月21日提交)和国际申请PCT/US01/50401(国际公开号WO 02/059106)中描述的那些。本文列出的每个专利和专利申请整体引入本文作为参考。免疫调节化合物不包括沙利度胺。

本发明其它具体的免疫调节化合物包括但不限于：在苯环用氨基取代的1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉，其描述于美国专利5,635,517中，其引入本文作为参考。这些化合物具有结构I：

其中X和Y之一是C＝O，X和Y的另一个是C＝O或CH₂，R²是氢或低级烷基，特别是甲基。具体的免疫调节化合物包括但不限于：

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-7-氨基异吲哚啉；

1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；和

1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉。

本发明其它具体的免疫调节化合物属于一类取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)酞酰亚胺和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚，例如美国专利6,281,230、6,316,471、6,335,349、以及6,476,052、和国际专利申请PCT/US97/13375(国际公开号WO 98/03502)描述的那些，其中的每个都引入本文作为参考。代表性的化合物具有式：

其中：

X和Y之一是C＝O，X和Y的另一个是C＝O或CH₂；

(i)R¹、R²、R³、R⁴各自独立地是卤素、1～4个碳原子的烷基或1～4个碳原子的烷氧基，或(ii)R¹、R²、R³、R⁴之一是-NHR⁵，R¹、R²、R³、R⁴中剩余的是氢；

R⁵是氢或1～8个碳原子的烷基；

R⁶是氢、1～8个碳原子的烷基、苄基或卤素；

如果X和Y是C＝O并且(i)R¹、R²、R³、R⁴中的每一个是氟或(ii)R¹、R²、R³、R⁴之一是氨基，则R⁶不是氢。

这类的代表性的化合物具有下式：

其中R¹是氢或甲基。在单独的实施方案中，本发明包括使用这些化合物对映异构纯的形式(例如光学纯的(R)或(S)对映异构体)。

本发明的其它具体免疫调节化合物属于异吲哚-酰亚胺类，其公开于美国专利申请公开2003/0096841和2003/0045552以及国际专利申请PCT/US01/50401(国际公开号WO 02/059106)中，其中的每个都引入本文作为参考。代表性的化合物是式II：

和其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其立体异构体的混合物，其中：

X和Y之一是C＝O，另一个是CH₂或C＝O；

R¹是H，(C₁-C₈)烷基，(C₃-C₇)环烷基，(C₂-C₈)烯基，(C₂-C₈)炔基，苄基，芳基，(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基，(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基，C(O)R³，C(S)R³，C(O)OR⁴，(C₁-C₈)烷基-N(R⁶)₂，(C₁-C₈)烷基-OR⁵，(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵，C(O)NHR³，C(S)NHR³，C(O)NR³R^3’，C(S)NR³R^3’或(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵；

R²是H，F，苄基，(C₁-C₈)烷基，(C₂-C₈)烯基，或(C₂-C₈)炔基；

R³和R^3’独立地是(C₁-C₈)烷基，(C₃-C₇)环烷基，(C₂-C₈)烯基，(C₂-C₈)炔基，苄基，芳基，(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基，(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基，(C₀-C₈)烷基-N(R⁶)₂，(C₁-C₈)烷基-OR⁵，(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵，(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵或C(O)OR⁵；

R⁴是(C₁-C₈)烷基，(C₂-C₈)烯基，(C₂-C₈)炔基，(C₁-C₄)烷基-OR⁵，苄基，芳基，(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基，或(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基；

R⁵是(C₁-C₈)烷基，(C₂-C₈)烯基，(C₂-C₈)炔基，苄基，芳基，或(C₂-C₅)杂芳基；

R⁶每次出现独立地是H，(C₁-C₈)烷基，(C₂-C₈)烯基，(C₂-C₈)炔基，苄基，芳基，(C₂-C₅)杂芳基，或(C₀-C₈)烷基-C(O)O-R⁵，或R⁶基团可连接形成杂环烷基；

n是0或1；和

^*代表手性碳中心。

在式II的具体化合物中，当n是0时，R¹是(C₃-C₇)环烷基，(C₂-C₈)烯基，(C₂-C₈)炔基，苄基，芳基，(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基，(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基，C(O)R³，C(O)OR⁴，(C₁-C₈)烷基-N(R⁶)₂，(C₁-C₈)烷基-OR⁵，(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵，C(S)NHR³，或(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵；

R²是H或(C₁-C₈)烷基；和

R³是(C₁-C₈)烷基，(C₃-C₇)环烷基，(C₂-C₈)烯基，(C₂-C₈)炔基，苄基，芳基，(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基，(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基，(C₅-C₈)烷基-N(R⁶)₂；(C₀-C₈)烷基-NH-C(O)O-R⁵；(C₁-C₈)烷基-OR⁵，(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵，(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵，或C(O)OR⁵；并且其它变量具有相同的定义。

在式II的其它具体化合物中，R²是H或(C₁-C₄)烷基。

在式II的其它具体化合物中，R¹是(C₁-C₈)烷基或苄基。

在式II的其它具体化合物中，R¹是H，(C₁-C₈)烷基，苄基，CH₂OCH₃，CH₂CH₂OCH₃，或

在式II化合物另一实施方案中，R¹是

其中Q是O或S，并且R⁷每次出现独立地是H，(C₁-C₈)烷基，(C₃-C₇)环烷基，(C₂-C₈)烯基，(C₂-C₈)炔基，苄基，芳基，卤素，(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基，(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基，(C₀-C₈)烷基-N(R⁶)₂，(C₁-C₈)烷基-OR⁵，(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵，(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵或C(O)OR⁵，或相邻出现的R⁷一起形成双环烷基或芳环。

在式II的其它具体化合物中，R¹是C(O)R³。

在式II的其它具体化合物中，R³是(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基，(C₁-C₈)烷基，芳基，或(C₀-C₄)烷基-OR⁵。

在式II的其它具体化合物中，杂芳基是吡啶基，呋喃基，或噻吩基。

在式II的其它具体化合物中，R¹是C(O)OR⁴。

在式II的其它具体化合物中，C(O)NHC(O)的H可用(C₁-C₄)烷基，芳基，或苄基代替。

此类化合物的其它例子包括但不限于：[2-(2，6-二氧代-哌啶-3-基)-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基)-酰胺；(2-(2，6-二氧代-哌啶-3-基)-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基)-氨基甲酸叔丁酯；4-(氨基甲基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基)-异吲哚啉-1，3-二酮；N-(2-(2，6-二氧代-哌啶-3-基)-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基)-乙酰胺，N-{2-(2，6-二氧代(3-哌啶基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}环丙基-羧酰胺；2-氯-N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}乙酰胺；N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)-3-吡啶基羧酰胺；3-{1-氧代-4-(苄基氨基)异吲哚啉-2-基}哌啶-2，6-二酮；2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-4-(苄基氨基)异吲哚啉-1，3-二酮；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}丙酰胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}-3-吡啶基羧酰胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}庚酰胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}-2-呋喃羧酰胺；{N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基甲酰基}甲基乙酸酯；N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)戊酰胺；N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)-2-噻吩基羧酰胺；N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基]甲基}(丁基氨基)羧酰胺；N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基]甲基}(辛基氨基)羧酰胺；以及N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基]甲基}(苄基基氨基)羧酰胺。

本发明的其它具体免疫调节化合物属于异吲哚-酰亚胺类，其公开于美国专利申请2002/0045643，国际公开号WO 98/54170，和美国专利6,395,754中，其中的每个引入本文作为参考。代表性的化合物具有式III：

X和Y之一是C＝O，另一个是C＝O或CH₂；

R是H或CH₂OCOR’；

(i)R¹、R²、R³、R⁴各自独立地是卤素、1～4个碳原子的烷基或1～4个碳原子的烷氧基，或(ii)R¹、R²、R³、R⁴之一是硝基或-NHR⁵，R¹、R²、R³、R⁴中剩余的是氢；

R⁵是氢或1～8个碳原子的烷基；

R⁶是氢、1～8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟；

R’是R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹)；

R⁷是间-亚苯基或对-亚苯基或-(C_nH_2n)-，其中n值是0～4；

R⁸和R⁹各自独立地是氢或1～8个碳原子的烷基，或R⁸和R⁹连接在一起是四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、或-CH₂CH₂X¹CH₂CH₂-，其中X¹是-O-、-S-、或-NH-；

R¹⁰是氢，1～8个碳原子的烷基，或苯基；和

^*代表手性碳中心。

其它代表性的化合物具有式：

其中：

X和Y之一是C＝O，X和Y中的另一个是C＝O或CH₂；

(i)R¹、R²、R³、R⁴各自独立地是卤素，1～4个碳原子的烷基，或1～4个碳原子的烷氧基，或(ii)R¹、R²、R³、R⁴之一是-NHR⁵，R¹、R²、R³、R⁴中剩余的是氢；

R⁵是氢或1～8个碳原子的烷基；

R⁶是氢、1～8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟；

R⁷是间-亚苯基或对-亚苯基或-(C_nH_2n)-，其中n值是0～4；

R⁸和R⁹各自独立地是氢或1～8个碳原子的烷基，或R⁸和R⁹连接在一起是四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、或-CH₂CH₂X¹CH₂CH₂-，其中X¹是-O-、-S-、或-NH-；和

R¹⁰是氢，1～8个碳原子的烷基，或苯基。

其它代表性的化合物具有式：

其中：

X和Y之一是C＝O，X和Y中的另一个是C＝O或CH₂；

R¹、R²、R³、R⁴各自独立地是卤素，1～4个碳原子的烷基，或1～4个碳原子的烷氧基，或(ii)R¹、R²、R³、R⁴之一是硝基或被保护的氨基，R¹、R²、R³、R⁴中剩余的是氢；和

R⁶是氢、1～8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟。

其它代表性的化合物具有式：

其中：

X和Y之一是C＝O，X和Y中另一个是C＝O或CH₂；

(i)R¹、R²、R³、R⁴各自独立地是卤素、1～4个碳原子的烷基、1～4个碳原子的烷氧基，或(ii)R¹、R²、R³、R⁴之一是-NHR⁵，R¹、R²、R³、R⁴中剩余的是氢；

R⁵是氢、1～8个碳原子的烷基，或CO-R⁷-CH(R¹⁰)NR⁸R⁹，其中R⁷、R⁸、R⁹、以及R¹⁰各自如上文所定义；和

R⁶是1～8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟。

化合物具体实例具有下式：

其中：

X和Y之一是C＝O，X和Y中的另一个是C＝O或CH₂；

R⁶是氢、1～8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟；

R⁷是间-亚苯基或对-亚苯基或-(C_nH_2n)-，其中n值是0～4；

R¹⁰是氢、1～8个碳原子的烷基、或苯基。

本发明优选的免疫调节化合物是4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮。该化合物可通过标准的合成方法获得(例如参见美国专利5,635,517，该专利引入本文作为参考)。化合物可从Celgene Corporation，Warren，NJ.得到。4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮具有如下的化学结构：

化合物3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮具有如下的化学结构：

在另一实施方案中，本发明具体的免疫调节化合物包括3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的多晶形式，例如在2003年9月4日提交的美国临时申请60/499,723和2004年9月3日提交的相应的美国非临时申请中公开的形式A、B、C、D、E、F、G和H，在此引入该专利申请作为参考。例如，3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的形式A是非溶剂化的结晶物，其可以从非水性溶剂体系中得到。形式A的X-射线粉末衍射图在约8、14.5、16、17.5、20.5、24和26度2θ处包含明显峰，其差示扫描量热法最大熔融温度约270℃。形式A弱吸湿或不吸湿，是至今3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的热力学最稳定的无水多晶形。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的形式B是半水合结晶物，其可以从各种溶剂体系中得到，包括但不限于己烷、甲苯和水。形式B的X-射线粉末衍射图在约16、18、22和27度2θ处包含明显峰，DSC曲线在约146和268℃出现吸热，通过热台显微实验证实是脱水和熔融。互变研究表明，形式B在水性溶剂体系中转化成形式E，在丙酮和其它无水体系中转化成其它形式。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的形式C是半溶剂化结晶物，其可以从溶剂例如但不限于丙酮中得到。形式C的X-射线粉末衍射图在约15.5和25度2θ处包含明显峰，其差示扫描量热法最大熔融温度约269℃。形式C在低于约85％RH下不吸湿，但是在较高的相对湿度下可以转化成形式B。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的形式D是结晶的溶剂化多晶型物，其从乙腈和水的混合物中制备。形式D的X-射线粉末衍射图在约27和28度2θ处包含明显峰，其差示扫描量热法最大熔融温度约270℃。形式D弱吸湿或不吸湿，但是当在较高的相对湿度下压力下，一般会转化成形式B。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的形式E是二水合的结晶物，其可通过使3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮在水中形成浆料，并在约9：1的丙酮：水的溶剂体系中缓慢蒸发3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮来获得。形式E其X-射线粉末衍射图在约20、24.5和29度2θ处包含明显峰，其差示扫描量热法最大熔融温度约269℃。形式E在丙酮溶剂体系中可以转化成形式C，在THF溶剂体系中可以转化成形式G。在水性溶剂体系中，形式E是最稳定的形式。形式E的反溶解实验表明，当在约125℃加热约5分钟时，形式E转化成形式B。在175℃加热约5分钟时，形式B转化成形式F。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的形式F是非溶剂化的结晶物，其可通过使形式E脱水得到。形式F的X-射线粉末衍射图在约19、19.5和25度2θ处包含明显峰，其差示扫描量热法最大熔融温度约269℃。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的形式G是非溶剂化的结晶物，其可以从形式B和E在溶剂例如但不限于四氢呋喃(THF)中的浆料中得到。形式G的X-射线粉末衍射图在约21、23和24.5度2θ处包含明显峰，其差示扫描量热法最大熔融温度约267℃。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的形式H是部分水合的结晶物(约0.25摩尔)，其可通过使形式E暴露在0％相对湿度中得到。形式H的X-射线粉末衍射图在约15、26和31度2θ处包含明显峰，其差示扫描量热法最大熔融温度约269℃。

本发明的其它具体免疫调节化合物包括但不限于：1-氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟代哌啶-3-基)异吲哚啉和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧-3-氟代哌啶-3-基)异吲哚啉，如在美国专利5,874,448和5,955,476中描述的那些，其中的每个引入本文作为参考。代表性的化合物具有下式：

其中Y是氧或H₂，和

R¹、R²、R³、R⁴各自独立地是氢、卤素、1～4个碳原子的烷基，1～4个碳原子的烷氧基，或氨基。

本发明的其它具体免疫调节化合物包括但不限于：四取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉，其描述于美国专利5,798,368中，该专利引入本文作为参考。代表性的化合物具有下式：

其中R¹、R²、R³、R⁴各自独立地是卤素、1～4个碳原子的烷基或1～4个碳原子的烷氧基。

本发明的其它具体免疫调节化合物包括但不限于1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉，其公开于美国专利6,403,613，该专利引入本文作为参考。代表性的化合物具有下式：

其中：

Y是氧或H₂，

R¹和R²中的第一个是卤素、烷基、烷氧基、烷氨基、二烷氨基、氰基或氨基甲酰基，R¹和R²中的第二个独立于第一个，是氢、卤素、烷基、烷氧基、烷氨基、二烷氨基、氰基或氨基甲酰基，和

R³是氢、烷基或苄基。

本发明化合物的具体实例具有下式：

其中R¹和R²中的第一个是卤素、1～4个碳原子的烷基、1至4个碳原子的烷氧基、二烷氨基(其中每个烷基具有1～4个碳原子)、氰基或氨基甲酰基，

R¹和R²的第二个独立于第一个，是氢、卤素、1～4个碳原子的烷基、1～4个碳原子的烷氧基、烷氨基(其中烷基具有1～4个碳原子)、二烷氨基、(其中每个烷基具有1～4个碳原子)、氰基或氨基甲酰基，和

R³是氢、1～4个碳原子的烷基或苄基。具体实例包括但不限于1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-甲基异吲哚啉。

其它代表性的化合物具有下式：

其中，R¹和R²中的第一个是卤素、1～4个碳原子的烷基，1～4个碳原子的烷氧基，二烷氨基(其中每个烷基具有1～4个碳原子)，氰基，或氨基甲酰基，

R¹和R²的第二个独立于第一个，是氢，卤素，1～4个碳原子的烷基，1～4个碳原子的烷氧基，烷氨基(其中烷基具有1～4个碳原子)，二烷氨基(其中每个烷基具有1～4个碳原子)，氰基，或氨基甲酰基，和

R³是氢，1～4个碳原子烷基，或苄基。

具体实例包括但不限于1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-甲基异吲哚啉。

本发明的其它具体免疫调节化合物包括但不限于在吲哚啉环4-位或5-位取代的1-氧代和1，3-二氧代异吲哚啉，其描述美国专利6,380,329和2004年7月28日提交的共同未决美国申请10/900,270中，其引入本文作为参考。代表性的化合物具有下式：

其中表示为C^*的碳原子构成手性中心(当n不是0且R¹和R²不相同时)；X¹和X²之一是氨基、硝基、1～6个碳原子的烷基或NH-Z，X¹或X²的另一个是氢；R¹和R²各自独立地是羟基或NH-Z；R³是氢、1～6个碳原子的烷基、卤素或卤代烷基；Z是氢、芳基、1～6个碳原子的烷基、甲酰基或1～6个碳原子的酰基；并且n的值为0、1或2；条件是如果X¹是氨基，并且n为1或2，那么R¹和R²都不是羟基；以及其盐。

其它代表性的化合物具有式：

其中当n不是0且R¹不同于R²时，表示为C^*的碳原子构成手性中心；X¹和X²之一是氨基、硝基、1～6个碳原子的烷基或NH-Z，X¹或X²的另一个是氢；R¹和R²各自独立地是羟基或NH-Z；R³是1～6个碳原子的烷基、卤素或氢；Z是氢、芳基、或1～6个碳原子的烷基或酰基；并且n的值为0、1或2。

具体例子包括但不限于2-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-4-氨基甲酰基-丁酸和4-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-4-氨基甲酰基-丁酸，它们分别具有下面的结构，和其药学上可接受的盐，溶剂化物，前药，和立体异构体：

其它代表性化合物具有式：

其中当n不是0并且R¹和R²不相同时，表示为C^*的碳原子构成手性中心；X¹和X²之一是氨基、硝基、1～6个碳原子的烷基或NH-Z，X¹或X²的另一个是氢；R¹和R²各自独立地是羟基或NH-Z；R³是1～6个碳原子的烷基、卤素或氢；Z是氢、芳基或1～6个碳原子的烷基或酰基；并且n的值为0、1或2；以及其盐。

具体例子包括但不限于4-氨基甲酰基-4-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-丁酸，4-氨基甲酰基-2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-丁酸，2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-4-苯基氨基甲酰基-丁酸，和2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-戊二酸，它们分别具有下面的结构，和其药学上可接受的盐，溶剂化物，前药，和立体异构体：

化合物的其它具体例子具有式：

其中X¹和X²之一是硝基或NH-Z，X¹或X²的另一个是氢；

R¹和R²各自独立地是羟基或NH-Z；

R³是1～6个碳原子的烷基、卤素或氢；

Z是氢、苯基、1～6个碳原子的酰基或1～6个碳原子的烷基；并且

n的值为0、1或2；

前提条件是如果X¹和X²是硝基，并且n为1或2，那么R¹和R²都不是羟基；和

如果-COR¹和-(CH₂)_nCOR²是不同的，那么表示为C^*的碳原子构成手性中心。其它代表性的化合物具有式：

其中X¹和X²之一是1～6个碳原子的烷基；

R¹和R²各自独立地是羟基或NH-Z；

R³是1～6个碳原子的烷基、卤素或氢；

Z是氢、苯基、1～6个碳原子的酰基、或1～6个碳原子的烷基；和

n的值为0、1或2；和

如果-COR²和-(CH₂)_nCOR¹是不同的，那么表示为C^*的碳原子构成手性中心。

本发明的其它具体的免疫调节化合物包括但不限于：在2-位用2，6-二氧代-3-羟基哌啶-5-基取代的异吲哚啉-1-酮和异吲哚啉-1，3-二酮，其描述于美国专利6,458,810中，该专利引入本文作为参考。代表性的化合物具有式：

其中：

表示为C^*的碳原子构成手性中心；

X是-C(O)-或-CH₂-；

R¹是1～8个碳原子的烷基或-NHR³；

R²是氢，1～8个碳原子的烷基，或卤素；

和

R³是氢，

1～8个碳原子的烷基，未取代或被1～8个碳原子的烷氧基，卤素，氨基，或1～4个碳原子的烷氨基取代，

3～18个碳原子的环烷基，

苯基，未取代或被1～8个碳原子的烷基、1～8个碳原子的烷氧基、卤素、氨基、或1～4个碳原子的烷氨基取代，

苄基，未取代或被1～8个碳原子的烷基、1～8个碳原子的烷氧基、卤素、氨基、或1～4个碳原子的烷氨基取代，或-COR⁴，其中

R⁴是氢，

1～8个碳原子的烷基、未取代或被1～8个碳原子的烷氧基、卤素、氨基、或1～4个碳原子的烷氨基取代，

3～18个碳原子的环烷基，

苄基，未取代或被1～8个碳原子的烷基、1～8个碳原子的烷氧基、卤素、氨基、或1～4个碳原子的烷氨基或取代。

本发明的化合物可以商购得到，也可以根据本文公开的专利或专利出版物中描述的方法制备得到。此外，可不对称合成或使用已知的拆分剂或手性柱以及其它标准的有机化学合成技术拆分光学纯的化合物。

除非另有说明，本文所使用的术语″药学上可接受的盐″包括该术语所涉及的化合物的无毒酸和碱加成盐。可接受的无毒酸加成盐包括衍生自本领域已知的有机和无机酸或碱的那些盐，包括如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲磺酸、乙酸，酒石酸，乳酸，琥珀酸，柠檬酸，苹果酸，马来酸，山梨酸，乌头酸，水杨酸，邻苯二甲酸，embolic acid，庚酸等。

天然呈酸性的化合物能够和各种的药学上可接受的碱形成盐。可用于制备药学上可接受的这种酸性化合物的碱加成盐的碱是形成无毒碱加成盐的那些碱，也就是形成含有药理学上可接受的阳离子的盐的碱，这些盐例如但不限于碱金属或碱土金属盐，尤其是钙、镁、钠、钾盐。适宜的有机碱包括但不限于N，N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、赖氨酸和普鲁卡因。

除非另有说明，本文所使用的术语″溶剂化物″指本发明的化合物或其盐，还包括化学计算量或非化学计算量的通过非共价分子间力结合的溶剂。如果溶剂是水，那么该溶剂化物是水合物。

除非另有说明，本文所使用的术语“前药”指的是化合物的衍生物，其可以在生物学条件(体外或体内)下水解、氧化或发生其它反应而提供该化合物。前药的实例包括但不限于含有可生物水解部分如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸酯类似物的本发明的免疫调节化合物的衍生物。前药的其它实例包括含有-NO、-NO₂、-ONO或-ONO₂部分的本发明的免疫调节化合物的衍生物。前药一般可以用公知的方法来进行制备，例如在Burger’s Medicinal Chemistry and DrugDiscovery，172-178，949-982(Manfred E.Wolff编，第5版.1995)和Design of Prodrugs(H.Bundgaafd编，Elselvier，New York 1985)中描述的方法。

除非另有说明，本文所使用的术语″可生物水解的酰胺″、″可生物水解的酯″、″可生物水解的氨基甲酸酯″、″可生物水解的碳酸酯″、″可生物水解的酰脲″、″可生物水解的磷酸酯″分别表示具有以下性质的化合物的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲或磷酸酯：1)不干扰该化合物的生物活性，但是在体内可赋予该化合物有利属性，例如吸收、作用持续时间或作用起始；或2)没有生物活性，但是在体内转化成生物活性化合物。可生物水解的酯的实例包括但不限于低级烷基酯、低级酰氧基烷基酯(例如乙酰氧基甲基、乙酰氧基乙基、氨基羰氧基甲基、新戊酰氧基甲基和新戊酰氧基乙基酯)、内酯基酯(例如酞基和硫代酞基酯)、低级烷氧基酰氧基烷基酯(例如甲氧基羰氧基甲基、乙氧基羰氧基乙基和异丙氧基羰氧基乙基酯)、烷氧基烷基酯、胆碱酯和酰基氨基烷基酯(例如乙酰氨基甲基酯)。可生物水解的酰胺的实例包括但不限于低级烷基酰胺、α-氨基酸酰胺、烷氧基酰基酰胺和烷氨基烷基羰基酰胺。可生物水解的氨基甲酸酯的实例包括但不限于低级烷基胺、取代的乙二胺、氨基酸、羟烷基胺、杂环和杂芳族胺以及聚醚胺。

除非另有说明，本文所使用的术语″立体异构体″包括所有对映体/立体异构纯的和对映体/立体异构富集的本发明化合物。

除非另有说明，本文所使用的术语“立体异构体纯的”或“对映体纯的”是指化合物包括一种立体异构体且基本上不含有该化合物的相反立体异构体或对映体。例如，当化合物含有80％、90％、或95％或更多的一种立体异构体和20％、10％、或5％或更少的相反立体异构体时，该化合物是立体异构体或对映体纯的。在某些情况下，当本发明的化合物相对于特定的手性中心是约80％ee(对映体过量)或更大，优选等于或大于90％ee，更优选相对于特定的手性中心为95％ee时，则该化合物被认为相对于手性中心是光学活性的或立体异构体/对映体纯的(即，基本上R-型或基本上S-型)。

除非另有说明，本文所使用的术语“立体异构体富集的”或“对映体富集的”包括本发明化合物的立体异构体的外消旋混合物以及其它混合物(例如，R/S＝30/70、35/65、40/60、45/55、55/45、60/40、65/35和70/30)。本发明的各种免疫调节化合物含有一个或多个手性中心，可以以对映异构体的外消旋混合物或非对映体混合物存在。本发明包括使用这种化合物的立体异构体纯的形式以及使用那些形式的混合物。例如，可以在本发明的方法和组合物中使用含有等量或不等量的本发明特定免疫调节化合物的对映异构体的混合物。可以不对称合成或使用标准技术例如手性柱或手性拆分剂拆分这些异构体。例如参见：Jacques，J.等人，Enantimoers，Racemates and Resolutions(Wiley-Interscience，New York，1981)；Wilen，S.H.等人，Tetrahedron 33：2725(1977)；Eliel，E.L.，Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill，NY，1962)；和Wilen，S.H.，Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions，268页(E.L.Eliel编，Univ.of Notre Dame Press，Notre Dame，IN，1972)。

需要注意的是，如果所示结构和该结构的名称之间有差异，应以所示结构为准。此外，如果没有用例如粗线或虚线指出结构或结构部分的立体化学，则应当理解为该结构或结构部分包括其所有立体异构体。

5.3.药物组合物和剂型

药物组合物可用于制备单独的单一单位剂型。本发明药物组合物和剂型包含本发明的免疫调节化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前药。本发明药物组合物和剂型还可以包含一种或多种赋形剂。

本发明药物组合物和剂型还可以包含一种或多种其它的活性试剂。因此，本发明药物组合物和剂型包含本发明所公开的活性试剂(例如免疫调节化合物和第二活性试剂)。本发明公开了任选的第二或其它活性成分(参见例如5.1节)。

本发明的单一单位剂型适于通过口服、粘膜(例如鼻、舌下、阴道、颊或直肠)、或肠胃外(例如皮下、静脉内、弹丸注射、肌内内或动脉内)、局部(滴眼剂或其它眼科制剂)、透皮或经皮向患者给药。剂型的实例包括但不限于：片剂；囊片；胶囊，如弹性软明胶胶囊；扁囊剂；含片；锭剂；分散剂；栓剂；粉末剂；气雾剂(例如鼻喷雾剂或吸入剂)；凝胶剂；适于对患者口服或经粘膜给药的液体剂型，包括悬浮液(例如水性或非水性液体悬浮液、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；适于对患者肠胃外给药的液体剂型；适于局部给药的滴眼剂或其它眼科制剂；和可以重新配制以提供适于肠胃外给药给患者的液体剂型的无菌固体(例如结晶形或无定形固体)。

本发明的剂型的组成、形状和类型一般根据其应用而变化。例如，与用于相同疾病的慢性治疗的剂型相比，用于疾病急性治疗的剂型可含有更多量的一种或多种活性试剂。类似地，与用于治疗相同疾病的口服剂型相比，肠胃外剂型可含有更少量的一种或多种活性试剂。本发明的特定剂型从一种改变为另一种的这些和其它方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing，Easton PA(1990)。

典型的药物组合物和剂型含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是药学领域的普通技术人员所熟知的，合适的赋形剂的非限制性例子在本说明书中有提供。具体赋形剂是否适于掺入药物组合物或剂型，这取决于本领域众所周知的多种因素，包括但不限于将该剂型给予患者的方式。例如，口服剂型(如片剂)可含有不适合用于肠胃外剂型的赋形剂。具体赋形剂的适用性可取决于剂型中的特定活性成分。例如，一些赋形剂(如乳糖)，或当暴露于水时可加速一些活性成分的分解。含有伯胺或仲胺的活性成分对这种加速分解特别敏感。因此，本发明包括含有极少(若有的话)乳糖其它单糖或二糖的药物组合物和剂型。在本发明中，所使用的术语″无乳糖″表示乳糖的含量(若有的话)不足以在实质上加快活性成分的降解速度。

本发明的无乳糖组合物可含有本领域熟知的赋形剂，这些赋形剂列在，例如，《美国药典》(USP)25-NF20(2002)中。通常，无乳糖组合物含有药学上可相容的且药学上可接受量的活性试剂、粘合剂/填料和润滑剂。优选无乳糖剂型含有活性试剂、微晶纤维素、预胶凝淀粉和硬脂酸镁。

本发明还包括含有活性成分的无水药物组合物和剂型，因为水可能会促进某些化合物的降解。因为水会促进某些化合物的降解。例如，为了测定制剂随时间变化的性质，如保存期或稳定性，加入水(例如5％)作为一种模拟长期储存的方式在制药领域是被广泛接受的。参见例如，JensT.Carstensen，《药物稳定性：原则和实践》(Drug Stability：Principles &Practicce)，第二版，Marcel Dekker，NY，NY，1995，第379-80页。实际上，水和热将加速一些化合物的分解。因此，水对于制剂的作用非常显著，因为水分和/或湿气在制剂的制造、处理、包装、储存、装运和使用过程中经常遇到。

本发明的无水的药物组合物和剂型可用无水或水分含量低的成分并在低湿度条件下制造。如果预计在生产、包装和/或储存期间会与水分和/或湿气发生实质性接触，那么包含乳糖和至少一种含有伯胺或仲胺的活性试剂的药物组合物和剂型优选是无水的。

无水药物组合物应以保持其无水特性的方式制备和储存。因此，无水组合物优选用已知可防止暴露于水的材料来包装，因此可将它们装在合适的制剂盒中。合适的包装的例子包括但不限于密封的薄膜、塑料、单位剂量容器(如药瓶)、水泡包装和窄条包装。

本发明还包括含有一种或多种可降低活性成分分解速度的化合物的药物组合物和剂型。这种化合物在本文称为“稳定剂”，其包括但不限于抗氧化剂(如抗坏血酸)、pH缓冲剂或盐缓冲剂。

如同赋形剂的量和类型一样，剂型中特定活性成分的类型和量可根据各种因素而改变，这些因素包括但不限于给药途径。然而，本发明的典型剂型含有约0.10-约150mg的本发明的免疫调节化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前药。典型的剂型含有约0.1、1、2、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、50、100、150或200mg本发明的免疫调节化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前药。在一具体实施方案中，优选的剂型含有约1、2、5、10、25或50mg 4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮(即，α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺)。在一具体实施方案中，优选的剂型含有约5、10、25或50mg 3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮。典型的剂型含有约1-约1000mg、约5mg-约500mg、约10mg-约350mg、约50mg-约200mg第二种活性成分。当然，抗癌药物的具体量将取决于所用的具体活性成分、所治疗或控制的癌症类型以及对患者联合施用的免疫调节化合物和任何任选的另外的活性成分的量。

如果将一种或多种本发明的化合物和细胞因子一起给予个体，那么该细胞因子可以是本文其它部分所述的任何药学上可接受的剂型，或可接受的浓度。通常地，例如，Neupogen以注射丸药给予，剂量约4～约8微克/kg/天，直到嗜中性粒细胞计数达到10,000/mm³。Ancestim(重组甲硫基人干细胞因子)通常通过皮下注射(不是静脉注射)给予，1-20微克/kg/天，给予9-12天；重组人干细胞因子可以以相似剂量给予。沙格司亭通常以最多约250微克/m²/天的剂量静脉或皮下给予，直到白血球计数超过约50,000/mm³。在需要时，聚乙二醇化非格司亭(Neulasta^TM)通常以约6毫克的剂量皮下给予。可以根据每一患者，通过测量特定白血球的数量，或总白血球数量，来确定影响血液中白血球数量的细胞因子的适合剂量。重组IL-3例如可以从R&D Systems，Inc.(Minneapolis，MN)得到。重组IL-3其体外ED₅₀为约0.1～约0.4ng/ml，可以使用相同的体内浓度。重组人干细胞因子(SCF)例如可以从BioSource International(Camarillo，CA)得到。重组SCF其体外ED₅₀为约2～约5ng/ml，可以使用相同的体内浓度。重组人Fms样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)可以从例如ProSpec-Tany TechnoGene LTD(Rehovot，Israel)或U.S.Biological(Swampscott，MA)得到。重组人Flt-3L其体外ED₅₀为约1～约10ng/ml，可以使用相同的体内浓度。可以根据个体，通过本领域中已知的实践，测量在培养基中或从个体中取得的血样中的白血球或红血球随时间的变化，从而确定上述任何的实际工作浓度。可以使用公知技术分析CD34⁺细胞沿红细胞途径的分化和胎儿血红蛋白基因的表达(例如，胎儿血红蛋白转录或胎儿血红蛋白的PCR-介导或抗体-介导的检测)。

促红血球生成素(例如，Epogene^)通常以约12.5U/kg～525U/kg，通常约100U/kg或更少的剂量静脉或皮下给予。促红血球生成素的变体，Aranesp^TM，通常以相似剂量给予。对于促红血球生成素和促红血球生成素类似物而言，适合的剂量是使血球密度为约10g/dL～约12g/dL，并在任意2周的时间内避免增加超过1.0g/dL的剂量。

5.3.1.口服剂型

适合口服给药的本发明的药物组合物可制成分散剂型，例如但不限于片剂(例如咀嚼片)、囊片、胶囊和液体(例如风味糖浆)。这种剂型含有预定量的活性成分，并可用本领域的普通技术人员所熟知的制药方法来制备。通常可参见《雷明顿药物科学》，第18版，Mack Publishing，Easton PA(1990)。

典型的口服剂型是按照常规药物化合技术通过将活性试剂与至少一种赋形剂充分混合而制得的。根据给药所需的制剂形式，赋形剂可呈多种不同的形式。例如，适用于口服液体或气雾剂剂型的赋形剂包括但不限于水、二醇、油、醇、风味剂、防腐剂和着色剂。适用于固体口服剂型(例如粉剂、片剂、胶囊和胶囊形片剂)的赋形剂的实例包括但不限于淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。

由于其易于给药，使用固体赋形剂的片剂和胶囊代表最有利的口服单位剂型。如果需要，可通过标准的水或非水化技术将片剂包衣。这种剂型可通过任何制药方法制得。药物组合物和剂型一般这样制得：将活性试剂与液体载体、良好分散的固体载体或二者均匀充分混合，然后如果需要的话将产物制成所需的形状。

例如，片剂可通过压缩或压模来制得。压缩片可通过在合适的机器中压缩自由流动形式，例如粉末或颗粒形式的活性试剂来制得，任选地与赋形剂混合。压模片可通过在合适的机器中压模粉末状化合物的混合物来制备，该粉末状化合物用惰性液体稀释剂润湿。

可用于本发明的口服剂型的赋形剂的实例包括但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。适用于药物组合物和剂型的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其它淀粉，明胶，天然与合成树胶例如阿拉伯胶、藻酸钠、藻酸、其它藻酸盐，黄蓍胶粉末、瓜尔胶，纤维素及其衍生物(例如乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预凝胶化淀粉、羟基丙基甲基纤维素(例如2208、2906、2910号)、微晶纤维素及其混合物。

微晶纤维素的适当形式包括但不限于以AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105销售的材料(得自FMC Corporation，American Viscose Division，Avicel Sales，Marcus Hook，PA)及其混合物。一种具体的粘合剂是以AVICELRC-581销售的微晶纤维素与羧甲基纤维素钠的混合物。合适的无水或低水分含量的赋形剂或添加剂包括AVICEL-PH-103^TM和Starch 1500LM。

适用于本发明药物组合物和剂型的填充剂的实例包括但不限于滑石粉、碳酸钙(例如颗粒或粉末)、微晶纤维素、纤维素粉末、葡萄糖结合剂(dextrates)、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预凝胶化淀粉及其混合物。本发明药物组合物中粘合剂或填充剂以占药物组合物或剂型重量的约50％到约99％的量存在。

在本发明组合物中使用崩解剂以提供在暴露于水环境时发生崩解的片剂。含有太多崩解剂的片剂在储存时可能会崩解，而含有太少崩解剂的片剂可能不会以所需速度崩解或者在所需条件下不崩解。因此，应当使用既不太多也不太少的决定性地改变活性试剂的释放的足量崩解剂以形成本发明的固体口服剂型。所用崩解剂的量随着制剂的类型而改变，并且易于由本领域技术人员来决定。典型的药物组合物包含约0.5％到约15％重量的崩解剂，优选约1％到约5％重量的崩解剂。

可用于本发明药的物组合物和剂型的崩解剂包括但不限于琼脂、海藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、聚克立林钾、羟乙酸淀粉钠、马铃薯或甘薯淀粉、其它淀粉、预凝胶化淀粉、其它淀粉、粘土、其它藻酸盐、其它纤维素、树胶及其混合物。

可用于本发明的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其它二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石粉、氢化植物油(例如花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。其它的润滑剂包括例如syloid硅胶(AEROSIL200，由W.R.Grace Co.of Baltimore，MD生产)、合成二氧化硅的凝固气雾胶(由Degussa Co.of Plano，TX销售)、CAB-O-SIL(Cabot Co.of Boston，MA销售的烧结二氧化硅产品)及其混合物。如果完全使用，润滑剂通常以小于其所掺入的药物组合物或剂型重量的约1％的量使用。

优选的固体口服剂型包含本发明的免疫调节化合物、无水乳糖、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸、胶态无水二氧化硅和明胶。

5.3.2.缓释剂型

本发明活性试剂可以通过控释装置或本领域技术人员公知的递送装置给药。实例包括但不限于在以下专利中描述的那些：美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556和5,733,566，其分别引入本文作为参考。通过使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可渗透性膜、等渗系统、多层包衣、微颗粒、脂质体、微球体或其组合来产生不同比例的理想释放效果，这种剂型可用来缓释或控释一种或多种活性成分。合适的控释制剂包括本文所述的那些，其是本领域技术人员公知的，且易于选择以与本发明的活性试剂一起使用。因此，本发明包括适于控释并适于口服给药的单一单位剂型，包括但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊和胶囊形片剂。

所有控释药物产品都具有以下共同目标：提高药物疗果以超过其非受释产品所达到的疗效。理想地，在医疗中使用最优设计的控释制剂的特征在于：采用最少药物，在最短的时间内治愈或控制病症。控释制剂的优点包括延长药物活性、降低给药频率和提高患者依从性。此外，控释制剂可用于影响作用开始的时间或其它特征，例如药物的血液水平，以及由此影响副作用(例如不利副作用)的发生率。

大部分控释制剂被设计成在开始时释放出能够立即产生所需治疗效果的药物(活性成分)量，并且逐渐和连续释放其它药物量以在延长的时间内维持该水平的治疗或预防效果。为了在体内保持恒定的药物水平，该药物必须以一定的速率从剂型中释放，该速率将弥补代谢掉的和从体内排泄出的药物量。活性试剂的控释可通过各种条件来刺激，包括但不限于pH、温度、酶、水或其它生理条件或化合物。

5.3.3胃肠外剂型

肠胃外剂型可通过各种途径，包括但不限于皮下、静脉内(包括弹丸注射)、肌肉内和动脉内途径来对患者给药。由于其给药一般绕过了患者对污染物的天然防御，所以肠胃外剂型优选是无菌的，或者能够在对患者给药之前灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于注射溶液、可溶解或悬浮在药学上可接受的载体中以用于注射的干燥产品、注射悬浮液和乳剂。

可用于提供本发明的肠胃外剂型的合适的载体是本领域技术人员公知的。实例包括但不限于：USP注射用水；水性载体，例如但不限于氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液和乳酸化林格注射液；可与水混溶的载体，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及非水性载体，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。

还可以将能够提高本文所公开的一种或多种活性成分的溶解度的化合物掺入到本发明的肠胃外剂型中。例如，可使用环状糊精及其衍生物来提高免疫调节化合物及其衍生物的溶解度。参见例如美国专利号5,134,127，其引入本文作为参考。

5.3.4局部和经粘膜给药剂型

本发明的局部和经粘膜给药剂型包括但不限于喷雾剂、气雾剂、溶液、乳剂、悬浮液或本领域技术人员已知的其它剂型。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16和18版，Mack Publishing，Easton PA(1980 & 1990)；和Introduction to Pharmaceutical DosageForms，第4版，Lea & Febiger，Philadelphia(1985)。适于治疗口腔内粘膜组织的剂型可以配制成漱口剂或口腔用凝胶剂。

可用于制备本发明的局部和经粘膜给药剂型的合适的赋形剂(例如载体和稀释剂)以及其它材料是制药领域技术人员公知的，且取决于给定药物组合物或剂型所施用到的具体组织。事实上，典型的赋形剂包括但不限于水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁烷-1，3-二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕桐酸异丙酯、矿物油及其混合物，以形成无毒且药学上可接受的溶液、乳剂或凝胶剂。如果需要的话，还可以将增湿剂或湿润剂加到药物组合物和剂型中。这种其它成分的实例是本领域公知的。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16和18版，Mack Publishing，Easton PA(1980 & 1990)。

还可以调节药物组合物或剂型的pH来提高一种或多种活性试剂的递送。类似地，可以调节溶剂载体的极性、其离子强度或张力来提高递送。还可以将化合物例如硬脂酸酯加到药物组合物或剂型中以有利地改变一种或多种活性试剂的亲水性或亲脂性来提高递送。在这方面，硬脂酸酯可以用作制剂的脂质载体、乳化剂或表面活性试剂以及递送促进剂或渗透促进剂。还可以使用活性试剂的不同盐、水合物或溶剂化物来调节所得组合物的性质。

5.3.5.试剂盒

本发明的活性成分一般优选不在同一时间或通过相同的给药途径给药。因此，本发明包括试剂盒，在由医务人员使用时，该试剂盒可简化向患者给予适量的活性试剂的给药过程。

典型的本发明试剂盒包含本发明的免疫调节化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前药的剂型。优选地，试剂盒中的免疫调节化合物是4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮或下式的化合物：

本发明的试剂盒还可以包含细胞因子或细胞因子衍生物，如G-CSF、GM-CSF、Epo、Flt-3L、SCF、IFN、IL2、IL8、IL18等，和/或其它化合物，包括但不限于对贫血病或血红蛋白病已知具有或可能具有有益效果的任何其它化合物，oblimersen(Genasense^)，美法仑，拓普替康，达卡巴嗪，依立替康，多西他赛，COX-2抑制剂，己酮可可碱，环丙沙星，地塞米松，Ara-C，长春瑞滨，异维甲酸，13顺式维生素A酸，或其药理学活性突变体或其衍生物，或其组合。试剂盒中所含的其它化合物包括下面中的一种或多种：诱导胎儿血红蛋白的化合物；松驰血管的化合物；当与血红蛋白S共价结合时降低血红蛋白S自凝集的化合物；作为Gardos通道拮抗剂的化合物；和降低红血球粘合的化合物。在一更具体的实施方案中，所述第二化合物是羟基脲，胍基衍生物，一氧化二氮，丁酸酯或丁酸酯衍生物，醛或醛衍生物，具有抗镰形细胞形成活性的植物提取物(例如，NIPRISAN^TM(HEMOXIN^TM))，克霉唑，三芳基甲烷的衍生物，单克隆抗体或聚乙二醇衍生物。另外的活性成分的例子包括但不限于本文所述的那些(参见例如5.1节)。

如果在治疗血红蛋白病的过程中口服给予一些成分(例如，免疫调节化合物，例如，IMiD^TM，例如，4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮；提取物)，并通过另一种常用途径给予其它的成分，例如，通过静脉内或皮下给予，那么除了本发明的免疫调节化合物之外，本发明的试剂盒还可以包括待给予的成分或化合物，用作免疫调节化合物的佐剂。

本发明的试剂盒还可以包含用于施用所述活性成分的装置。这种装置的实例包括但不限于注射器、滴液袋、贴片和吸入剂。

本发明的试剂盒还可以包含移植用细胞或血液以及可用于施用一种或多种活性成分的药学上可接受的载体。例如，如果活性成分是固体形式，且必须配制成以进行肠胃外给药，那么该试剂盒可以包含含有适当载体的密封容器，该活性成分可溶解在该载体中而形成适于肠胃外给药的不含颗粒的无菌溶液。药学上可接受的载体的实例包括但不限于：USP注射用水；含水载体，例如但不限于氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液和乳酸化林格注射液；可与水混溶的载体，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及非水化载体，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。

6.实施例

6.1.实施例1：源于骨髓的CD34+造血祖细胞向树突状细胞的分化表明红血球特异性基因上调

BM-CD34⁺细胞从Cambrex(East Rutherford，NJ)得到，并在干细胞因子(SCF)、Flt3-L、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和TNFα存在的情况下，在含有BIT 95000(StemCell Teclmologies，UK)的Iscove′sMDM中培养6天。为了研究4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮对树突状细胞产生的影响，在存在或不存在4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮的情况下培养CD34+原始细胞6天。培养6天后，通过流式细胞法测定红血球标记(CD36、CD71、血型糖蛋白A和胎儿血红蛋白)的细胞的表型特征。通过微阵列分析在CD34+分化的第1天、第3天和第6天监测基因表达(图1)。

RNA纯化和微阵列分析.使用RNAeasy(Qiagen)从CD34⁺细胞中分离出全部RNA。使用Affymetrix U133A基因芯片进行基因表达分析。简而言之，共使用5μg RNA合成双链cDNA。使用MessageAmp aRNA试剂盒(Ambion)合成生物素标记cRNA，将15μg cRNA片段化并与各阵列杂交。对于每一RNA样品，上述过程进行两次，以得到双份的生物素标记探针。平均两份芯片的结果，计算倍差。

结果.在SCF、Flt3-L、GM-CSF和TNFα的存在下，4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮治疗上调了CD34+分化过程中的红血球特异性基因的基因表达。重要的是，一旦CD34⁺细胞分化，4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮提高胎儿血红蛋白基因的表达，胚胎血红蛋白ε在第6天具体提高18倍，血红蛋白γ在第6天提高7倍(图2)。

在存在或不存在4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的情况下，通过流式细胞法测得的分化CD34⁺细胞的表型特征表现出对红血球和血红蛋白标记的调节。血型糖蛋白A(图3)和胎儿血红蛋白(图4)的表达以剂量依赖性方式提高。4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮还诱导其它红血球特异性基因(图5)。还发现，在4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮存在的情况下，编码正常红血球生成所必需的血型糖蛋白B、恒河猴血型相关的糖蛋白、Kell血型前体、EDRF/AHSP(α血红蛋白稳定蛋白)、和红血球Kruppel样转录因子的基因的表达在分化的CD34⁺细胞中也上调。

由4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮提高的多种红血球特异性基因在改善贫血病中有明显的作用。血红蛋白水平和α-血红蛋白稳定蛋白(AHSP)的增加可以提高载氧能力，同时防止细胞的α-血红蛋白水平过量，过量会损害血球。IMiD通常对提高的红血球生成有影响，尤其是对上述基因有影响，这可用于克服化疗的贫血作用以及治疗低红血球数是其症状或治疗效果的疾病。

可以预期到，IMiD^TM与促红血球生成素具有协同作用。IMiD^TM可以诱导早期红血球前体的合成，而促红血球生成素对于分化的晚期阶段红血球的增殖、存活和分化至关紧要。

6.2.实施例2：CD34⁺细胞分化成红血球

骨髓(BM)CD34+造血祖细胞的分化：BM-CD34+祖细胞从Cambrex得到，并在生长因子存在的情况下，在含有BIT 95000(血清替代品；StemCell Teclmologies)的Iscove′s MDM中培养。在开始的6天，CD34⁺细胞用SCF(100ng/ml)、Flt3-L(100ng/ml)和IL-3(20ng/ml)膨胀，然后通过在SCF(50ng/ml)、和Epo(2U或4U/ml)存在的情况下培养6天而向红血球方向分化。为了研究IMiD^TM的作用，在存在或不存在4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的情况下，分化CD34+祖细胞6天(图6)。

流式细胞法：培养6天后通过流式细胞法(FACScan，Coulter)分析表面抗原表达。在第6天使用FITC和PE耦合的单克隆抗体(mAb)对细胞进行双染色(30min，4℃)。所用的抗体是：CD34-PE、CD36-FITC、CD71-FITC和血型糖蛋白A-PE，全部从BD Pharmingen(San Diego，CA)得到。培养6天后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，用2％多聚甲醛固定，用cytopermeafix(BD Pharmingen)渗透，并用HbF-PE(BDPharmingen，San Diego，CA)、Hbε-FITC(Cortex Biochem，San Leandro，CA)mAb和HbA-FITC(Perkin Elmer)染色，用流式细胞法(FACScan，Coulter或FCASAria，BD Pharmingen)分析。

结果：IMiD^TM 4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮是红血球前体中的血红蛋白F的有效诱导剂。CD34+祖细胞首先用生长因子的组合(SCF、Flt3-L和IL-3)膨胀6天。膨胀后，在存在或不存在IMiD^TM的情况下，用SCF和Epo使CD34细胞向红血球方向分化6天(图6)。通过特征红血球表面标记：血型糖蛋白A(CD235)和铁传递蛋白受体(CD71)，的表达来监测在SCF和Epo存在下的CD34+祖细胞的分化(图7)。在使用或不使用IMiD^TM分化CD34⁺细胞时，都存在红血球表型。有趣地是，血型糖蛋白A的表达在IMiD^TM-处理细胞中更低，而CD71的表达在两种条件下都保持在较高水平。

用SCF和Epo培养6天后，通过流式细胞法监测表达胎儿血红蛋白的细胞的百分比。IMiD^TM以剂量依赖性方式提高胎儿血红蛋白的表达(图8)。重要的是，胎儿血红蛋白(HbF)的增加与成人血红蛋白(HbA)的减少相关。在IMiD^TM存在的情况下，HbF/HbA的比值增大。(图9)

除了成熟表型、定量血红蛋白之外，还测量了细胞的增殖状态。用SCF和Epo培养6天后进行细胞计数。在IMiD^TM存在的情况下总细胞计数增加，并与群落的发展阶段(即较少成熟)相关。

6.3.实施例3：IMID与现有的胎儿血红蛋白核准疗法协同作用

如前所述，CD34+祖细胞首先用生长因子的组合(SCF、Flt3-L和IL-3)膨胀6天，然后用SCF和Epo诱导红血球分化6天。在红血球分化期间，在IMiD^TM存在或不存在，单独存在或与羟基脲和5-氮杂胞苷之一共同存在的情况下，培养CD34⁺细胞，以比较IMiD^TM与这两种已知的胎儿血红蛋白合成诱导剂的效果。在分化的第6天，用流式细胞法测量细胞的血红蛋白容量。据报道，羟基脲和5-氮杂胞苷增加胎儿血红蛋白的表达(图10)。然而，与羟基脲或5-氮杂胞苷相比，IMiD对胎儿血红蛋白生成的诱导更明显，在10μM 4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮存在的情况下产生10倍的诱导。有趣地是，4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮在与羟基脲组合时表现出惊人的协同作用，使得胎儿血红蛋白显著再活化(图11)。

6.4.实施例4：EPO+IMID使STAT5磷酸化增加

为了进一步研究Epo和IMiD^TM对红血球的协同作用，在UT-7细胞系中进行信号实验，具体地，以确定IMiD^TM是否对STAT5表达有影响，已知一旦Epo与促红血球生成素受体(EpoR)结合，STAT5就会被活化。UT-7是一种人白血病细胞系，绝对地依赖于增殖用的促红血球生成素，从患有急性骨髓白血病(AML M7)的患者中分离出。这些细胞中EpoR表达水平为约60％。

为了研究IMiD^TM在Epo信号中的作用，在存在或不存在4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮的情况下，如下所述用Epo刺激UT-7细胞。在含有10％FBS和GM-CSF(5ng/ml)的RPMI培养基中膨胀UT-7细胞。使细胞缺少血清和生长因子过夜，然后用10μM4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮或DMSO对照预孵育45分钟，用Epo(10U/ml)刺激10分钟。4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮使Epo-诱导的STAT5(Tyr694)磷酸化增加2倍(图12)。这种作用在用Epo刺激的10分钟内检测到。

6.5.实施例5：毒理学研究

在麻醉的狗中研究了3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮对心血管和呼吸机能的影响。使用两组Beagle狗(2/性别/组)。一组只接受三个剂量的载体，而另一组接受三个升序剂量的3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮(2、10、20mg/kg)。在所有情况下，3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮或载体依次通过颈静脉输液给药，间隔至少30分钟。

与载体对照组相比，由3-4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮诱导的心血管和呼吸的改变在所有剂量中都极小。在给予低剂量的3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮后，在载体和试验组之间唯一统计上显著的差别是动脉血压的少量增加(由94mmHg增至101mmHg)。该作用持续大约15分钟，且在较高剂量下未观察到。在股骨血流、呼吸参数和Qtc间隔方面的偏差为对照组和治疗组二者所共有，且不认为是与治疗有关的。

本发明的上述实施方案仅是举例，本领域所属技术人员使用常规实验、具体化合物、材料、和程序的多种等价物可以理解或明白这些实施方案。所有这些等价物都被认为是在本发明的范围内，并被所附权利要求所涵盖。

7.参考文献

在本文所引用的所有参考文献均全文引为参考，如同各个出版物、专利或专利申请特定地、单独地全文引为参考一样。引用的申请日之前的任何出版物只是用于公开的目的，不能解释为是承认本发明不是这些公开的在先发明。

Claims

1.治疗患有血红蛋白病或贫血病的个体的方法，所述方法包括以足以使所述血红蛋白病的一种或多种症状减轻的量和时间向所述个体给予免疫调节化合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述血红蛋白病是镰刀型细胞贫血病或地中海贫血症。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述贫血病是由化疗或服用药物诱导的或与其有关的贫血病。

4.如权利要求1所述的方法，其中向所述个体给予免疫调节化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前药。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述免疫调节化合物是氨基-取代的沙利度胺。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述免疫调节化合物是α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺；α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺的类似物或前药；3-(4′-氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮；3-(4′-氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮的类似物或前药，或下式的化合物：

7.如权利要求4所述的方法，其中所述免疫调节化合物是1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉；1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基异吲哚啉；1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉，1，3二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；或1，3二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉。

8.如权利要求1所述的方法，该方法还包括用第二化合物治疗所述个体，其中所述第二化合物是诱导胎儿血红蛋白的化合物、松驰血管的化合物、当与血红蛋白S共价结合时降低血红蛋白S自凝集的化合物、作为Gardos通道拮抗剂的化合物、或降低红血球粘合的化合物。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述第二化合物是羟基脲、胍基衍生物、一氧化二氮、丁酸酯或丁酸酯衍生物、醛或醛衍生物、具有抗镰形细胞形成活性的植物提取物、克霉唑、三芳基甲烷的衍生物、单克隆抗体或聚乙二醇衍生物。

10.如权利要求1所述的方法，该方法还包括用至少一种细胞因子治疗所述个体。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述至少一种细胞因子是促红血球生成素(Epo)、SCF、GM-CSF、Flt-3L、TNFα、IL-3、或其任何组合。

12.如权利要求10所述的方法，其中用Epo和SCF治疗所述个体。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述个体是人。

15.如权利要求10所述的方法，其中所述治疗包括用干细胞因子(SCF)、Flt-3L和IL-3的组合治疗所述个体，随后用SCF和促红血球生成素的组合治疗所述个体，其中所述治疗足以使至少一种胎儿血红蛋白基因的表达发生可检测的增加。

16.调节CD34⁺干细胞或前体细胞向红血球系分化的方法，该方法包括在适合条件下和在免疫调节化合物存在的情况下分化所述细胞。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述分化在存在免疫调节化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前药的情况下进行。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述免疫调节化合物是氨基-取代的沙利度胺。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述免疫调节化合物是α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺；α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺的类似物或前药；3-(4′-氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮；3-(4′-氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮的类似物或前药，或下式的化合物：

20.如权利要求17所述的方法，其中所述免疫调节化合物是1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉；1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基异吲哚啉；1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉，1，3二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；或1，3二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉。

21.如权利要求16所述的方法，其中所述CD34⁺干细胞或前体细胞是体外细胞。

22.如权利要求16所述的方法，其中所述CD34⁺干细胞或前体细胞是体内细胞。

23.如权利要求16所述的方法，该方法还包括使所述细胞与至少一种细胞因子接触。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述至少一种细胞因子是促红血球生成素(Epo)、SCF、GM-CSF、Flt-3L、TNFα、IL-3、或其任何组合。

25.药物组合物，该组合物包括在药学上可接受的载体中的第一免疫调节化合物和第二化合物，其中所述第二化合物是诱导胎儿血红蛋白的化合物、松驰血管的化合物、当与血红蛋白S共价结合时降低血红蛋白S自凝集的化合物、作为Gardos通道拮抗剂的化合物、或降低红血球粘合的化合物。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述第二化合物是羟基脲、胍基衍生物、一氧化二氮、丁酸酯或丁酸酯衍生物、醛或醛衍生物、具有抗镰形细胞形成活性的植物提取物、克霉唑、三芳基甲烷的衍生物、单克隆抗体或聚乙二醇衍生物。

27.药物组合物，该组合物包括在药学上可接受的载体中的免疫调节化合物和至少一种细胞因子，其中所述至少一种细胞因子是促红血球生成素(Epo)、SCF、GM-CSF、Flt-3L、TNF-α、IL-3、或其任何组合。

28.治疗患有血红蛋白病或贫血病的个体的方法，所述方法包括以足以使α血红蛋白稳定蛋白(AHSP)的水平发生可检测的提高的量和时间向所述个体给予化合物。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述化合物是免疫调节化合物。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述免疫调节化合物是α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺或3-(4′-氨基异吲哚啉-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮。