CN1874780A

CN1874780A - 抑制多抗药性基因表达并抑制由该基因表达导致的蛋白质产生从而提高化学治疗剂治疗癌症有效性的方法

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Publication number: CN1874780A
Application number: CNA2004800316973A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂纳·萨克斯·巴拉布莱; 塔特杰纳·卢基克; 戴维·约翰·斯图尔特; 基肖尔·M·沃桑
Original assignee: Forbes Medi-Tech Inc
Current assignee: Forbes Medi-Tech Inc
Priority date: 2003-09-26
Filing date: 2004-09-27
Publication date: 2006-12-06
Also published as: KR20060135615A; JP2007524651A; BRPI0414812A; CA2540364A1; RU2006114049A; WO2005030225A3; WO2005030225A2; AU2004275444A1; EP1677803A2

Abstract

一方面，本发明提供一种抑制动物细胞内多抗药性基因表达的方法，包括给予动物有效量的至少一种胆固醇吸收抑制剂。另一方面，本发明提供一种抑制动物细胞中产生由多抗药性基因表达的蛋白质的方法，包括给予动物有效量的至少一种胆固醇吸收抑制剂。另一方面，本发明提供一种提高化学治疗剂对患有癌症动物有效性的方法，包括给予所述动物有效量的化学治疗剂和至少一种胆固醇吸收抑制剂。另一方面，本发明提供一种用于癌症治疗的组合物和药盒，其包括至少一种化学治疗剂和至少一种胆固醇吸收抑制剂。

Description

抑制多抗药性基因表达并抑制由该基因表达导致的蛋白质产生从而提高化学治疗剂治疗癌症有效性的方法

发明领域

本发明涉及癌症治疗领域。

背景技术

现已发现，由于内源性的或者获得性肿瘤细胞抗性，用某些化学治疗剂治疗人恶性肿瘤经常是无效的。由于多种肿瘤细胞抗性机制导致对大量具有不同作用机制且结构上无关的化学治疗药物产生并行的抗性，从而使问题更加严重。该情形被称为多抗药性。这是癌症治疗中的一个重要问题，看起来是用当前的化学治疗剂提高治愈率的主要障碍。

仅仅在七个主要的世界范围的药物市场(美国、日本、德国、意大利、法国、西班牙、英国)每年就报道大约二百零四万新的癌症病例¹。不幸的是，其中只有5-10％对化学疗法有成功响应。大约40-45％或者800,000以上患者每年会对一种或多种化学治疗方案产生多抗药性。毫不夸张地说，多抗药性的出现是世界范围内成功化学治疗癌症的主要障碍。是到目前为止没有成功解决的问题。

在分子和细胞水平上，几种机制可以解释多抗药性。对于肿瘤细胞表达对多种化学治疗剂抗药性所提出的细胞机制包括：药物摄入减少或者药物流出增多，氧化还原电势改变，DNA修复提高，增加的药物螯合机制或者药物-靶向蛋白质扩增。

如今，两种编码多抗药性输出蛋白的基因已经在人基因组中鉴别出来。其中第一种，MDR1编码P-糖蛋白，是一种170kDa多跨越的跨膜蛋白质，属于ATP结合盒(ABC)转运蛋白超家族²。提出一种机制，认为肿瘤细胞获得MDR是由于过度表达P-糖蛋白(Pgp)^{3，4，5，6}。

P-糖蛋白可能通过将疏水性化学治疗剂快速泵送出肿瘤细胞而起作用，从而使某些化学治疗剂的细胞内积聚降低到低于其抑制细胞生长的浓度。一种体外解决方案是增加化学药物浓度。不过，由于癌症化学治疗剂已经以它们的体内最大耐受剂量范围进行给药，增加剂量是难以接受的方案，常常引起极度毒性^7，8。

P-糖蛋白在结构上类似于囊性纤维化转运蛋白质，连接主要组织相容性复合体的肽转运体，和非P-糖蛋白相关的多抗药性蛋白质(MRP)^{9，10，11，12}。P-糖蛋白在不同位置被表达，包括正常人的肾上腺皮质、胆小管的腔面和结肠上皮、肾小管上皮以及血脑屏障和血睾屏障的内皮细胞。P-糖蛋白在这些位置的功能是不清楚的，但看起来起到宽特异性的能量依赖性泵的作用，可能与激素分泌和对抗毒素的保护有关。P-糖蛋白的表达可以主动流出大量疏水性和杂环的癌症化学治疗剂，包括阿霉素(多柔比星)、秋水仙素、秋水仙胺、鬼臼亚乙苷、紫杉醇、长春新碱、长春花碱等。

P-糖蛋白由高度保守的基因家族编码¹³。MDR-1基因编码使人具有多抗药性的I类P-糖蛋白¹⁴。仓鼠的pgp-1和pgp-2基因以及小鼠的mdr-3和MDR-1基因编码I和II类蛋白质，两者都使啮齿类动物有多抗药性¹⁵。

几条证据都支持P-糖蛋白增加和体外多抗药性之间的因果关系。蛋白质的结构特征是能量依赖性流出泵的特征¹⁶。蛋白质的过度表达与多抗药性有关¹⁷。现在还发现，P-糖蛋白的表达程度和抗药性表型之间有正相关性¹⁸。

结肠癌、肾癌、乳腺癌、肾上腺皮质癌和肝癌在诊断时经常表现出高水平的P-糖蛋白，即使对患者先前没有用抗癌药物治疗¹⁷。在多种肿瘤类型中，开始化学治疗方案后的复发或者疾病发展难以治疗，通常与MDR和高水平MDR-1表达有关¹⁸。细胞中的抗药性可表现为低基因拷贝数，并且可能是由于在转录、翻译或者翻译后水平上的调节。尽管体外研究经常表明，MDR-1扩增是抗药性的原因¹⁹，但升高的基因拷贝数在人肿瘤情况下明显是少见的²⁰。

MDR-1基因产物或其mRNA水平升高在很多人肿瘤研究中与较差的预后有关。乳腺癌的临床研究表明，显著百分数的患者表达了高水平的P-糖蛋白，低P-糖蛋白表达的患者对化学治疗的响应率和无疾病进展的存活率有明显好于高表达者^21，22。对结肠癌的回顾性分析研究中，68％的肿瘤表达了高水平的P-糖蛋白，并且通过血细胞侵入和转移测得，过度表达与攻击性有关²³。在有关急性骨髓性白血病的三次临床研究中，与MDR-1阳性组相比，MDR-1阴性组的完全缓解率较高并且无疾病存活的时间较长^24，25，26。

在成神经细胞瘤的三次研究中，研究者表明，MDR-1表达经常发生在非局限性的和治疗后的肿瘤中，并且与较差的预后有关^27，28，29。同样，在横纹肌肉瘤中，P-糖蛋白水平与增加的恶性肿瘤疾病分期有关，与P-糖蛋白阳性患者相比，P-糖蛋白阴性组的响应率明显更好并且无复发存活和总存活的时间更长³⁰。P-糖蛋白表达也与晚期难治性骨髓瘤高度有关³¹。该数据总起来表明，P-糖蛋白表达与多种人恶性肿瘤的临床预后有关。

认为可逆转MDR的药物表现出减少药物流出的机制(例如，钙通道阻断剂维拉帕米、地尔硫和尼卡地平³²，钙调蛋白抑制剂利血平、奎尼丁或者奎宁，环孢菌素A³⁴，环孢菌素衍生物³⁵，或者FK506和雷帕霉素³⁶。对于大多数这些药剂而言，抗性的临床逆转是受限制的，主要是由于获得抗性逆转所需的浓度水平具有临床毒性。

显然，多抗药性基因的表达、它们的蛋白质产物的产生以及MDR表型的获得明显束缚了医生选择可用的化学疗法，并明显恶化患者的预后。

因此，本领域需要寻找更有效的非毒性的MDR逆转和/或抑制药物。

本发明的一个目标是提供一种新化合物，其可以消除或者减少用于克服MDR的现有已知化合物的缺点。

本发明的一个目标是提供一种新组合物，其可以消除或者减少用于克服MDR的现有已知组合物的缺点。

发明概述

一方面，本发明提供一种抑制动物细胞内多抗药性基因表达的方法，包括给予动物有效量的至少一种胆固醇吸收抑制剂。

另一方面，本发明提供一种提高化学治疗剂对患有癌症动物有效性的方法，包括给予所述动物有效量的至少一种化学治疗剂和至少一种胆固醇吸收抑制剂。

另一方面，本发明提供一种逆转动物细胞显示的多抗药性表型的方法，包括使细胞暴露于有效量的至少一种胆固醇吸收抑制剂。

另一方面，本发明提供一种抑制动物细胞中产生由多抗药性基因表达的蛋白质的方法，包括给予动物有效量的至少一种胆固醇吸收抑制剂。

另一方面，本发明提供一种用于癌症治疗的组合物，其包含至少一种化学治疗剂和至少一种胆固醇吸收抑制剂。

另一方面，本发明提供一种药盒(kit)，其包括至少两种单独的成分：

a)包含至少一种胆固醇吸收抑制剂的组合物；和

b)包含至少一种化学治疗剂的组合物；

以及描述施用每种组合物的说明。

本发明的关键在于提供和共同施用(不过不必同时或者大致连续地)胆固醇吸收抑制剂和化学治疗剂。现已发现，胆固醇吸收抑制剂有效抑制多抗药性基因的表达。据认为，由这些基因表达的蛋白质的产生减少防止了癌症化学治疗剂从动物细胞中流出，使其有效性最大化。由于记述的问题涉及由多抗药性机制导致此前有希望的化学治疗剂实际上无效，因此这是重要的。

一些优选的本发明胆固醇吸收抑制剂(以下所述，包括式(i)到(iv)的那些)包括抗坏血酸基部分。这些特定化合物具有多种额外的优点。具体而言，在含水溶液例如水中的溶解性由于抗坏血酸基部分而得到改善，从而可以直接口服。同样，也便于其他给药方式。因此，本发明的这些所选化合物可以这样制得并使用，或者可以容易地将它们掺入药物制剂中，任选与所选的化学治疗剂一起使用，无论这样的制剂是否是水基的。溶解性提高通常意味着，为了获得理想的治疗效果，该化合物的给药剂量较低。

这些效果和其他明显的优点在下文中是明显的。

附图简述

通过以下非限定性附图说明本发明，其中：

图1是表示用文中所述的一种胆固醇吸收抑制剂：称为″FM-VP4″的抗坏血酸基甾烷醇基(stany1)磷酸酯处理一周后，CaCo2细胞中MDR-1表达水平(MDR-1/GAPDH的标准化比值；″GAPDH″或甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的直方图；

图2是表示对于GAPDH引物滴(primer drop)的滴定的图；

图3表示MDR-1、GAPDH的聚合酶链式反应(1.5％琼脂糖凝胶)的凝胶电泳结果；

图4是表示用文中所述的一种胆固醇吸收抑制剂：称为″FM-VP4″的抗坏血酸基甾烷醇基磷酸酯处理CaCo2细胞后细胞存活率的MTS-和LDH-试验的直方图；

图5是表示用文中所述的一种胆固醇吸收抑制剂：称为″FM-VP4″的抗坏血酸基甾烷醇基磷酸酯处理CaCo2细胞后蛋白质浓度的BCA-试验的直方图；

图6是表示用文中所述的一种胆固醇吸收抑制剂：称为″FM-VP4″的抗坏血酸基甾烷醇基磷酸酯处理一周后，CaCo2细胞中ABCC1(MRP-1)表达水平(MRP-1/GAPDH的标准化比值)的直方图；

图7表示MDR-1、GAPDH的聚合酶链式反应(1.5％琼脂糖凝胶)的凝胶电泳结果；用文中所述的一种胆固醇吸收抑制剂：称为″FM-VP4″的抗坏血酸基甾烷醇基磷酸酯的脂质体制剂处理CaCo2细胞后，用TRIAZOL分离RNA→RT-PCR→PCR；

图8是表示用文中所述的一种胆固醇吸收抑制剂：称为″FM-VP4″的抗坏血酸基甾烷醇基磷酸酯的脂质体制剂以2.5、5和10μm浓度处理一周后，与对照和空脂质体相比，CaCo2细胞中MDR-1表达水平(MDR-1/GAPDH的标准化比值)的直方图；

图9是与文中所述的一种胆固醇吸收抑制剂：称为″FM-VP4″的抗坏血酸基甾烷醇基磷酸酯孵育后，CaCo2细胞中P-糖蛋白的蛋白质印迹分析；

图10是样品PCR产物的电泳凝胶图(测定Caco-2细胞中mdr-1基因的表达谱，作为用10μM FM-VP4时间依赖性处理的效果)；

图11是表示在紫外光(UV-Epi Chem II)下成像，并用UVP-Labworks软件定量的图10所示PCR产物的荧光带的直方图；

图12是与FM-VP4预孵育1周对Caco-2单层中Rh 123积聚的作用的直方图。数据表示平均值±SD。^*P＜0.002；^**P＜0.0001；

图13是表示与FM-VP4预孵育1周对Rh123跨Caco-2单层(基底外侧到顶端)的P-gp转运的作用的直方图。数据表示3组的平均值±SD。^*P＜0.07；^**P＜0.009。

本发明优选的实施方式

以下进行详细说明，帮助本领域技术人员实施本发明。不过，该详细说明不应理解为对本发明范围进行限制。本领域普通技术人员可以对文中所述的实施方式进行修饰和变化，而不会偏离本发明的精神和范围。

文中使用的″动物″是指动物界的任何成员，包括所有哺乳动物，最优选是人。也考虑兽医用途。

文中使用的术语″化合物″与术语″衍生物″、″结构″和″类似物″是可替换的。

文中使用的术语″有效的″或″治疗有效的″用于限定给予动物，特别是人的化合物或组合物的量，以引起施用化合物或者组合物者所研究的细胞、组织、系统、动物或者哺乳动物的生物学或者医学应答，其量达到以下的一个或者多个目标：

a)治疗或者减轻癌症；

b)防止、治疗或者减轻肿瘤生长；

c)抑制或者降低一种或者多种多抗药性基因的表达；

d)抑制或者降低由多抗药性基因表达的一种或者多种蛋白质的产生；

e)提高化学治疗剂在治疗癌症中的有效性；和

f)使细胞对一种或者多种化学治疗剂敏感。

文中使用的术语″回肠胆汁酸转运体″或″IBAT″与顶端钠共依存的胆汁酸转运体或者ASBT是同义词。

文中使用的″苯并硫氮杂(benzothiepine)IBAT抑制剂″是指回肠胆汁酸转运抑制剂，其包括一种治疗性化合物，含有2，3，4，5-四氢-1-苯并硫氮杂1，1-二氧化物结构。

文中使用的术语″多抗药性基因″或其任何缩写形式是指一种或者多种以下基因：ABCB1(MDR-1)；ABCA2(ABC2)；ABCB2(TAP)；ABCB3(TAP)；ABCC1(MRP-1)；ABCC3(MRP-3)。

文中使用的术语″前药″是指这样的化合物，其是药物前体，给予患者后，在体内通过某种化学或者生理学过程释放出该药物(例如，当达到生理学pH时或者通过酶作用，前药被转化为目标药物形式)。

文中使用的术语″溶剂合物″是指溶剂的分子或者离子与那些溶质(例如，式a)到f)的化合物，或者化合物a)到f)的前药)形成的分子或者离子配合物。可用溶剂的非限定性实例包括极性、质子溶剂，例如水和/或醇(例如甲醇)。

文中使用的术语″甾醇″没有限制地包括所有的甾醇，例如：(来自任何来源和以任何形式：a、β和γ)谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇(包括二氢菜子甾醇)、链甾醇、chalinosterol、多孔甾醇、γ-谷甾醇、麦角甾醇、粪甾醇、codisterol、异岩藻甾醇、岩藻甾醇、贞桐甾醇、nervisterol、烯胆甾醇、星鱼甾醇、菠菜甾醇、chondrillasterol、peposterol、燕麦甾醇、异燕麦甾醇、fecosterol、pollinastasterol、胆固醇以及其所有天然或合成形式和衍生物，包括异构体。

术语″甾烷醇″例如是指：(来自任何来源和以任何形式：a、β和γ)饱和或者氢化的甾醇，包括其所有天然或者合成形式和衍生物，和异构体，包括：谷甾烷醇、菜油甾烷醇、豆甾烷醇、菜子甾烷醇(包括二氢菜子甾烷醇)、链甾烷醇、chalinostanol、多孔甾烷醇、γ-谷甾烷醇、麦角甾烷醇、粪甾烷醇、codistanol、异岩藻甾烷醇、岩藻甾烷醇、贞桐甾烷醇、nervistanol、烯胆甾烷醇、星鱼甾烷醇、菠菜甾烷醇、chondrillastanol、pepostanol、燕麦甾烷醇、异燕麦甾烷醇、fecostanol和pollinastastanol。

应理解，对甾醇和甾烷醇的修饰，即包括侧链，也在本发明范围内。还应理解，在整个说明书中如有疑问，除非另外说明，否则术语″甾醇″包括甾醇和甾烷醇。也可使用术语″植物甾醇″和″植物甾烷醇″，分别是指所有来自植物的甾醇或者甾烷醇。

根据本发明，用于形成衍生物的甾醇和甾烷醇可以由多种天然来源制得或者它们可以被人工合成。例如，它们可以通过处理植物油(包括水生植物)获得，例如玉米油和其他植物油、麦芽油、大豆提取物、大米提取物、米糠、菜籽油、向日葵油、芝麻油和鱼(和其他海生来源)油。它们也可以来自酵母和真菌，例如麦角甾醇。因此，本发明并不限于甾醇的任何一种来源。美国专利4420427号教导了使用溶剂例如甲醇从植物油渣中制备甾醇。或者，植物甾醇和植物甾烷醇可以从妥尔油树脂或妥尔油皂中获得，妥尔油树脂或妥尔油皂是林业操作的副产物，如美国专利5770749所述，该专利并入本文作为参考。从妥尔油树脂提取甾醇和甾烷醇的其他方法描述在1998年2月20日提交的加拿大专利申请号2,230,373(相应于1999年2月19日提交的PCT/CA99/00150)和2002年1月28日提交的美国专利申请号10/060,022中，所有内容并入本文作为参考。

因此，文中使用的术语″甾醇″和″甾烷醇″应理解为最宽范围的定义，包括但不限于：游离甾醇和甾烷醇、脂肪酸或芳香酸酯化的甾醇和甾烷醇(从而分别形成脂肪酸酯或者芳香酸酯)、酚酸酯、肉桂酸酯、阿魏酸酯、植物甾醇和植物甾烷醇糖苷和酰化的糖苷或者酰基糖苷。因此，术语″甾醇″和″甾烷醇″包括所有类似物，如大多数天然甾醇一样其在环单元的5-位还可以有双键，或者在环的其他位(例如，6，7，8(9)，8(14)，145/7)上有一个或者多个双键，或者如烷醇那样，在环单元中没有双键。此外，还可以有甲基，例如象α₁-谷甾醇那样。

甾醇是可以行使多种关键性细胞功能的天然形成的化合物。甾醇，例如植物中的菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，真菌中的麦角甾醇以及动物中的胆固醇，分别是各自细胞类型中细胞和亚细胞膜的基本成分。特别是植物甾醇受到极大关注，因为当供给多种哺乳动物，包括人时，可以降低血清胆固醇水平。

任选地，本发明的化合物由天然产生的或者人工合成的β-谷甾醇、菜油甾烷醇、谷甾烷醇和菜油甾醇形成，这样形成的每种化合物然后混合到药物组合物中，然后以不同比例供给。最优选方式中，本发明的化合物在一个或者多个抗坏血酸基植物甾烷醇基磷酸二钠(文中称为″FM-VP4″)之间含有化学键，抗坏血酸基植物甾烷醇基磷酸二钠包括两个主要成分：抗坏血酸基菜油甾烷醇基磷酸二钠(″DACP″)和抗坏血酸基谷甾烷醇基磷酸二钠(″DASP″)。

在本发明范围内，″胆固醇吸收抑制剂″是指无论通过什么机制，对胆固醇转运、摄入或者吸收有负面影响的任何化合物，并包括抑制胆汁酸再吸收或者转运的任何化合物。

优选地，胆固醇吸收抑制剂包括如文中所述的一种或者多种甾醇、甾烷醇或其混合物或其衍生物。不是对上述概括的限制，所述抑制剂包括所有游离甾醇和甾烷醇，和所有甾醇和甾烷醇的脂族和芳族酯、甾醇和甾烷醇的酚酸酯、甾醇和甾烷醇的肉桂酸酯、甾醇和甾烷醇的阿魏酸酯、甾醇和甾烷醇的糖苷、甾醇和甾烷醇的酰化糖苷或者酰基糖苷。

最优选方式中，胆固醇吸收抑制剂包括具有一种或者多种下式的、包括甾醇或者甾烷醇的一种或者多种衍生物或者化合物，包括其生物学上可接受的盐：

iii)

R₄-R

其中R是甾醇或者甾烷醇部分，R₄来自抗坏血酸，并且n＝1-5，包括所有生物学上可接受的盐或者溶剂合物，或者至少一种这种化合物或其盐或溶剂合物的前药。

优选地，胆固醇吸收抑制剂是抗坏血酸基甾烷醇基磷酸二钠组合物，其包括抗坏血酸基菜油甾烷醇基磷酸二钠和抗坏血酸基谷甾烷醇基磷酸二钠的混合物。

可以通过已知方法制得式i)到iv)的化合物，例如在下文以及在2000年6月20日提交的、要求1999年6月23日提交的美国专利申请US 09/339,903的优先权的PCT/CA00/00730中描述的那些方法，其全部内容并入本文作为参考。

通常，可以如下制备式i)到iv)的化合物：所选的甾醇或者甾烷醇(或其卤代磷酸酯、卤代碳酸酯或卤代草酸酯衍生物)和抗坏血酸在反应条件下混合在一起，使得″酸″部分与″醇″(甾醇)进行缩合。这些条件与其他常见酯化反应(例如Fisher酯化方法)中所用的条件相同，其中，使酸成分和醇成分直接反应，或者在合适的酸催化剂，例如无机酸、硫酸、磷酸、对甲苯磺酸存在下进行反应。在这些酯化反应中通常使用的有机溶剂包括：醚，例如二乙醚、四氢呋喃，或者苯、甲苯或者类似的芳族溶剂，温度可以从室温到较高温度不等，取决于进行反应的反应物的反应性。

在优选的实施方式中，形成酯的方法包括：以酯(例如乙酸酯)或者醚(例如甲基醚)的形式″保护″抗坏血酸或其衍生物的羟基，然后在合适的反应条件下，使被保护的抗坏血酸与甾醇/甾烷醇卤代磷酸酯、卤代碳酸酯或者卤代草酸酯进行缩合。通常，这样的缩合反应在有机溶剂，例如二乙醚、四氢呋喃，或者苯、甲苯或者类似的芳族溶剂中进行。取决于反应物的性质和反应性，反应温度可以从低温(-15℃)到较高的温度不等。

更具体而言，以下是一种制备式i)到iv)，特别是式i)化合物的优选方式：最初，通过形成5，6-异亚丙基-抗坏血酸来保护抗坏血酸，防止其分解。这可以通过在合适的反应条件下，混合丙酮与抗坏血酸和酸催化剂例如硫酸或者盐酸而实现。植物甾烷醇氯代磷酸酯如下制得：形成植物甾烷醇在甲苯和吡啶(不过还可以使用其他氮碱，例如脂族胺和芳族胺)中的溶液，并且用磷衍生物例如磷酰氯处理该溶液。过滤并浓缩母液后所形成的残留物是植物甾烷醇氯磷酸酯。后者接下来与5，6-异亚丙基-抗坏血酸混合，加入合适的醇例如乙醇和HCl后，进行浓缩。或者，可以加入吡啶/THF，并浓缩产物。最后进行洗涤和干燥后，得到新产物甾烷醇-磷酸-抗坏血酸酯。

在制备式i)到iv)化合物的方法的另一优选方式中，在羟基位保护抗坏血酸，不是作为5，6-异亚丙基-抗坏血酸，而是作为酯(例如作为乙酸酯、磷酸酯等)。后者然后与甾醇或者甾烷醇进行缩合，如上所述衍化，使用已知的酯化方法，最终生成化合物。文献中充分描述了抗坏血酸单磷酸酯和二磷酸酯的形成。例如，Kato等人的美国专利系列号4,939,128,其内容并入本文作为参考，教导了抗坏血酸的磷酸酯的形成。类似地，Dobler等人的美国专利系列号4,999,437，其内容也完全并入本文作为参考，描述了抗坏血酸2-磷酸酯的制备。在Dobler等人的专利中，在叔胺存在下，用POCl₃磷酸化抗坏血酸或者抗坏血酸衍生物的核心反应(在德国公开申请DOS 2,719,303中有述)，通过向反应溶液中加入镁化合物，优选镁化合物水溶液而得到改进。可以使用任何已知的抗坏血酸衍生物。

更详细地，以下是制备式i)到iv)，特别是式ii)化合物的另一优选方式：制备″被保护的″抗坏血酸，进行如上详细所述相同的过程；不过，磷酰氯被草酰氯所代替，从而产生甾烷醇-草酸-抗坏血酸酯。

在优选方式中，本发明的胆固醇吸收抑制剂包括一种或者多种抗坏血酸基植物甾烷醇基磷酸二钠(称为″FM-VP4″)，其包括两种主要成分：抗坏血酸基菜油甾烷醇基磷酸二钠(″DAC″)和抗坏血酸基谷甾烷醇基磷酸二钠(″DASP″)。

或者，在本发明另一优选方式中，胆固醇吸收抑制剂包括来自羟基取代的氮杂环丁酮家族的化合物。最优选地，所述氮杂环丁酮是下式表示的羟基取代的氮杂环丁酮化合物或其生物学上可接受的盐：

其中：Ar₁和Ar₂独立地选自芳基和R₄取代的芳基；

Ar₃是芳基或者R₅取代的芳基；

X、Y和Z独立地选自--CH₂--、--CH(低级烷基)-和--C(二低级烷基)-；

R和R₂独立地选自--OR₆、--O(CO)R₆、--O(CO)OR₉和--O(CO)NR₆R₇；

R₁和R₃独立地选自氢、低级烷基和芳基；

q是0或1；r是0或1；m、n和p独立地是0、1、2、3或4；条件是q和r至少一个是1，并且m、n、p、q和r之和是2、3、4、5或6；条件是，当p是0并且r是1时，m、q和n之和是1、2、3、4或5；

R₄是1-5取代基，独立地选自低级烷基、--OR₆、--O(CO)R₆、--O(CO)OR₉、--O(CH₂)_1-5OR₆、--O(CO)NR₆R₇、--NR₆R₇、--NR₆(CO)R₇、-NR₆(CO)OR₉、--NR₆(CO)NR₇R₈、--NR₆SO₂R₉、--COOR₆、--CONR₆R₇、-COR₆、-SO₂NR₆R₇、S(O)_0-2R₉、--O(CH₂)_1-10--COOR₆、--O(CH₂)_1-10CONR₆R₇、-(低级链烯基)COOR₆、--CH＝CH--COOR₆、--CF₃、--CN、--NO₂和卤素；

R₅是1-5取代基，独立地选自--OR₆、--O(CO)R₆、--O(CO)OR₉、--O(CH₂)_1-5OR₆、--O(CO)NR₆R₇、--NR₆R₇、--NR₆(CO)R₇、-NR₆(CO)OR₉、--NR₆(CO)NR₇R₈、--NR₆SO₂R₉、--COOR₆、--CONR₆R₇、-COR₆、-SO₂NR₆R₇、S(O)_0-2R₉、--O(CH₂)_1-10--COOR₆、--O(CH₂)_1-10CONR₆R₇、-(低级链烯基)COOR₆和--CH＝CH--COOR₆；

R₆、R₇和R₈独立地选自氢、低级烷基、芳基和芳基取代的低级烷基；和

R₉是低级烷基、芳基或者芳基取代的低级烷基。

更优选地，在式V的化合物中，Ar₁是苯基或者R₄取代的苯基，Ar₂是苯基或者R₄取代的苯基，并且Ar₃是R₅取代的苯基。

在式V的替代实施方式中，Ar₁是R₄取代的苯基，其中R₄是卤素；Ar₂是R₄取代的苯基，其中R₄是卤素或者--OR₆，其中R₆是低级烷基或者氢；并且Ar₃是R₅取代的苯基，其中R₅是--OR₆，其中R₆是低级烷基或者氢。

在式V的替代实施方式中，在该化合物中，X、Y和Z分别是--CH₂--；R₁和R₃分别是氢；R和R₂分别是--OR₆，其中R₆是氢；并且m、n、p、q和r之和是2、3或者4。

在式V的替代实施方式中，在该化合物中，m、n和r分别是0，q是1并且p是2。

在式V的替代实施方式中，在该化合物中，p、q和n分别是0，r是1，并且m是2或者3。

在式V优选的实施方式中，该化合物选自：

3(R)-(2(R)-羟基-2-苯基乙基)-4(R)-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2-氮杂环丁酮；

3(R)-(2(R)-羟基-2-苯基乙基-4(S)-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2-氮杂环丁酮；

3(S)-(1(S)-羟基-3-苯基丙基)-4(S)-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2-氮杂环丁酮；

3(S)-(1(R)-羟基-3-苯基丙基)-4(S)-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2-氮杂环丁酮；

3(R)-(1(R)-羟基-3-苯基丙基)-4(S)-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2-氮杂环丁酮；

rel-3(R)→(S)-羟基-(2-萘基)甲基！-4(3S)-(4-甲氧基苯基)-1-苯基)-1-苯基-2-氮杂环丁酮；

rel-3(R)→(R)-羟基-(2-萘基)甲基！-4(S)-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2-氮杂环丁酮；

3(R)-(3(R)-羟基-3-苯基丙基)-1，4(S)-二-(4-甲氧基苯基)-2-氮杂环丁酮；

3(R)-(3(S)-羟基-3-苯基丙基)-1，4(S)-二-(4-甲氧基苯基)-2-氮杂环丁酮；

4(S)-(4-羟基苯基)-3(R)-(3(R)-羟基-3-苯基丙基-1-(4-甲氧基苯基)-2-氮杂环丁酮；

4(S)-(4-羟基苯基)-3(R)-(3(S)-羟基-3-苯基丙基-1-(4-甲氧基苯基)-2-氮杂环丁酮；

rel 3(R)→3(RS)-羟基-3→4-(甲氧基甲氧基)-苯基！-1，4(S)-二-(4-甲氧基苯基)-2-氮杂环丁酮；

1-(4-氟苯基)-3(R)→3(S)-(4-氟苯基)-3-羟基丙基)！-4(S)-(.sup.4-羟基苯基)-2-氮杂环丁酮；

1-(4-氟苯基)-3(R)→3(R)-(4-氟苯基)-3-羟基丙基)！-4(S)-(4-羟基苯基)-2-氮杂环丁酮；

4(S)→4-(乙酰氧基)苯基！-3(R)-(3(R)-羟基-3-苯基丙基)-1-(4-甲氧基苯基)-2-氮杂环丁酮；

4(S)→4-(乙酰氧基)苯基！-3(R)-(3(S)-羟基-3-苯基丙基)-1-(4-甲氧基苯基)-2-氮杂环丁酮；

1-(.sup.4-氟苯基)-3(R)→3(S)-(4-氟苯基)-3-羟基丙基)！-4(S)→4-(苯基甲氧基)苯基！-2氮杂环丁酮；

3(R)→3(R)-乙酰氧基)-3-苯基丙基！-1，4(S)-二-(4-甲氧基苯基)-2-氮杂环丁酮；

3(R)→3(S)-乙酰氧基)-3-苯基丙基！-1，4(S)-二-(4-甲氧基苯基)-2-氮杂环丁酮；

3(R)→3(R)-(乙酰氧基)-3-(4-氟苯基)丙基！-4(S)→4-(乙酰氧基)苯基！-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮；

3(R)→3(S)-(乙酰氧基)-3-(4-氟苯基)丙基！-4(S)→4-(乙酰氧基)苯基！-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮；

3(R)→3(R)-(乙酰氧基)-3-(4-氯苯基)丙基！-4(S)→4-(乙酰氧基)苯基！-1-(4-氯苯基)-2-氮杂环丁酮；

3(R)→3(S)-(乙酰氧基)-3-(4-氯苯基)丙基！-4(S)→4-(乙酰氧基)苯基！-1-(4-氯苯基)-2-氮杂环丁酮；和

rel 1-(4-氟苯基)-4(S)-(4-羟基苯基)-3(1R)-(1(R)-羟基-3-苯基丙基)-2-氮杂环丁酮。

这样的羟基取代的氮杂环丁酮在Schering公司的美国专利系列号5,846,966和5,767,115中记载并要求保护，两者的全部内容并入本文作为参考。具体而言，本文优选使用被称为″Ezetimibe″并由Schering以商标Zetia^TM出售的2-氮杂环丁酮衍生的抑制剂。

在一个替代实施方式中，本发明范围内的胆固醇吸收抑制剂可以是胆汁酸转运或者再吸收的抑制剂，包括但不限于回肠、顶端和肝脏转运的抑制剂。

发现来自肠道内腔的胆汁酸的再循环和血清胆固醇减少之间存在因果关系，现正积极研究回肠胆汁酸转运抑制剂″IBATs″对于降低胆固醇和治疗动脉粥样硬化的作用。Stedronsky³⁷讨论了胆汁酸和胆固醇的生物化学、生理学和已知的活性剂。

在本发明中使用的一些IBAT抑制剂在PCT/US95/10863中有述，其内容并入本文作为参考。更多的IBAT抑制剂在PCT/US97/04076中有述，其并入本文作为参考。本发明使用的另外一些IBAT抑制剂在美国申请系列号08/816,065中有述，其并入本文作为参考。本发明使用的更多IBAT抑制剂化合物在WO 98/40375中有述，其并入本文作为参考。本发明使用的一系列其他IBAT抑制剂化合物在美国专利5,994,391中有述，也并入本文作为参考。

其他IBAT由多篇Hoechst Aktiengesellschaft专利申请所公开，其公开了胆汁酸转运抑制性化合物，分别列举如下：

H1.加拿大专利申请号2,025,294。

H2.加拿大专利申请号2,078,588。

H3.加拿大专利申请号2,085,782。

H4.加拿大专利申请号2,085,830。

H5.欧洲申请号0 379 161。

H6.欧洲申请号0 549 967。

H7.欧洲申请号0 559 064。

H8.欧洲申请号0 563 731。

在本发明范围内，其他胆汁酸转运抑制剂包括所选的苯并硫氮杂，例如在WO 93/321146、PCT/US97/04076、PCT/US95/10863、EP508425、FR 2661676、WO 99/35135、WO 92/18462和US 5,994,391(Lee等人)中公开的那些。

The Wellcome Foundation Limited的WO 92/16055中描述了多种合适的苯并硫氮杂化合物。另外一些降血脂的苯并硫氮杂化合物(特别是2，3，4，5-四氢苯并-1-硫-4-氮杂化合物)公开在专利申请号WO 96/05188、WO 96/05188和WO 96/16051中。

其他的IBAT抑制剂化合物包括萘类化合物，由T.Ichihashi等人在J.Pharmacol.Exp.Ther.，284(1)，43-50(1998)中描述。该类中，S-8921(1-(3，4-二甲氧基苯基)-3-(3-乙基戊酰基)-4-羟基-6，7，8-三甲氧基-2-萘甲酸甲酯)是特别有用的。S-8921的结构表示在该出版物的式B-20中。其他萘化合物或者木质素衍生物在PCT专利申请号WO 94/24087中有述。

其他IBAT例如包括由Pharmacia Corporation，IL和Monsanto，MO开发的SC-635；由GlaxoSmithKline开发的264W94；由Shiongi开发的S-8921，和(3R，5R)-3-丁基-3-乙基-2，3，4，5-四氢-7，8-二甲氧基-5-苯基-1-4-苯并硫氮杂1，1-二氧化物。

在一个替代实施方式中，本发明范围内的胆固醇吸收抑制剂可以是雄甾烷和/或雄甾烯衍生物，其中雄甾烷和/或雄甾烯与抗坏血酸偶合，并由一个或多个以下通式表示：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆可以独立地选自氢、OH、羰基和抗坏血酸基部分；并且R₇可以是氢或者任何卤素。

最优选地，偶合到雄甾烷或者雄甾烯家族化合物的抗坏血酸基部分独立地选自一种或者多种以下结构：

其中，M⁺表示任何金属、碱土金属或者碱金属。

带有一个或者多个式ix)到xx)的抗坏血酸基部分的式vi)到viii)的雄甾烷/雄甾烯化合物，可以由已知方法制得，例如在PCT/CA03/00824中描述的那些，其内容并入本文作为参考，或者可以通过以上描述的用于制备式i)到iv)化合物的方法，相应调整，进行制备。

盐

文中使用的术语″生物学上可接受的盐″是指保持文中所述化合物想要的生物学和/或生理学活性并且表现出最小的不希望的毒物学作用的任何盐。因此，这里所指的所有化合物包括其与无机和/或有机酸和碱形成的各自酸和/或碱盐。

酸加成盐的例子包括乙酸盐(例如与乙酸或者三卤乙酸例如三氟乙酸形成的那些)、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-氢乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过磺酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。

含有酸部分的那些化合物可以与多种有机碱和无机碱形成盐。

因此，本发明不仅包括例如含有所选甾醇和/或甾烷醇的母体化合物，而且，如果可能(即，如果母体含有自由羟基)，则本发明包括所述化合物的生物学可接受的金属、碱土金属或者碱金属盐。

文中所述的盐比相应的母体化合物具有更好的水溶性，因此它们在体外和体内的效果和评价可能得到提高。

本发明化合物的成盐易于进行，例如，通过用一系列碱(例如，甲醇钠或者其他金属醇盐)处理含有自由OH基的任何母体化合物，以形成相应的碱金属盐。钙、镁、锰、铜、锌等其他金属盐可以通过母体与合适的金属醇盐反应而产生。

关于这些衍生物的形成，可以理解，尽管描述了所选的合成方法，但是有大量其他方法可以用来制备公开并要求保护的衍生物种类。一旦选择了特定的衍生物，技术人员就可以使用本领域常用技术进行合成，这在该化学领域技术人员的能力范围之内。因此，没有描述每种和每个要求保护的衍生物的完全合成。

由于文中所述的化合物及其盐可以以互变异构形式存在，考虑所有这样的互变异构形式作为本发明的一部分。

本发明化合物所有的立体异构体，例如由于多个组成部分上的不对称碳而存在的那些，包括对映体形式(即使在没有不对称碳情况下也可以存在)和非对映体形式，也包括在本发明范围内。本发明化合物的各立体异构体例如可以一起混合或者与其他立体异构体混合为消旋物。化合物的手性中心可以有如IUPAC 1974Recommendations所定义的S或R构型。这样的立体异构体可以使用常规技术进行制备，或者通过反应对映体的起始材料，或者通过分离本发明化合物的异构体。当制备非对映体或者对映体产物时，可以通过常规方法进行分离，例如色谱法或者分步结晶。

异构体可以包括几何异构体，例如相对双键的顺式异构体或者反式异构体。在本发明使用的化合物中考虑所有这些异构体。

本发明使用的化合物也包括互变异构体。

本发明完全覆盖对以下多抗药性基因表达的抑制：ABCB1(MDR-1)；ABCA2(ABC2)；ABCB2(TAP)；ABCB3(TAP)；ABCC1(MRP-1)；ABCC3(MRP-3)，但是发现文中所述的胆固醇吸收抑制剂特别用于抑制MDR-1(ABCB1)的表达，MDR-1以P-糖蛋白作为其基因产物。此外，还发现文中所述的胆固醇吸收抑制剂特别用于抑制由MDR-1基因表达的P-糖蛋白的产生。

使用方法

根据本发明一个方面，提供一种抑制动物细胞中多抗药性基因表达的方法，包括给予动物有效量的文中所述的至少一种胆固醇吸收抑制剂。

根据本发明另一个方面，提供一种用于癌症治疗的组合物，其包括文中所述的至少一种化学治疗剂和至少一种胆固醇吸收抑制剂。

根据本发明又一个方面，提供一种提高化学治疗剂对患有癌症动物的有效性的方法，包括给予所述动物有效量的文中所述的至少一种化学治疗剂和至少一种胆固醇吸收抑制剂。

根据本发明又一个方面，提供一种逆转动物细胞显示的多抗药性表型的方法，包括使细胞暴露于有效量的文中所述的至少一种胆固醇吸收抑制剂。

根据本发明又一个方面，提供一种抑制动物细胞中产生由多抗药性基因表达的蛋白质的方法，包括给予动物有效量的至少一种胆固醇吸收抑制剂。

根据本发明另一方面，提供一种药盒，其包括至少两种单独成分：

a)包含文中所述的至少一种胆固醇吸收抑制剂的组合物；和

b)包含至少一种化学治疗剂的组合物；

以及描述施用每种组合物的说明。

本发明的方法、组合物和药盒适合用于治疗癌症，通常包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肠癌、结肠癌、肺癌、脑癌、肾上腺皮质癌、骨髓癌、胚胎干细胞癌、实质癌、上皮癌、各种淋巴癌(包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、骨癌、睾丸癌、子宫颈癌、子宫癌、食道癌、口癌和皮肤癌。

可以认为，它们将会明显成功地用于治疗那些诊断时经常表现出高水平P-糖蛋白的癌症，即使患者先前没有用化学治疗剂进行治疗(一种或者多种抗癌药物的联合)。这样的癌症包括但不限于：结肠癌、肾癌、乳腺癌、肾上腺皮质癌和肝癌。

本发明的方法、组合物和药盒并不限于任何一种特定的癌症化学治疗剂或者这些药物的组合。不过，优选的化学治疗剂包括但不限于：所有疏水性和杂环的癌症化学治疗剂，例如阿霉素(多柔比星)、磷酸酯(盐)、秋水仙胺、鬼臼亚乙苷、紫杉醇、比生群(bisantrene)、长春新碱和长春花碱。

本发明的组合物可供″联合治疗″使用，其中，胆固醇吸收抑制剂和所选的化学治疗剂或者以基本上同时的方式共同给药，例如，以具有固定比例的活性成分的单一片剂或者胶囊的形式，或者对于每部分以多次、单独性给药。该单独性给药包括连续性剂量形式。

为更清楚起见，该″联合给药″包括以基本上同时方式共同给予治疗药剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一剂量形式，或者对于每种药剂以多次、单独性剂量形式给药。此外，这样的给药也包括以连续方式使用每类药剂。或者，该治疗方案提供药物联合的有益效果，达到文中所述的一个或者多个治疗目标。

因此，本发明提供多种达到一个或者多个以下治疗目标的方式：

a)治疗或者减轻癌症；

b)防止、治疗或者减轻肿瘤生长；

c)抑制或者降低多抗药性基因的表达；

e)提高化学治疗剂在治疗癌症中的有效性；和

f)使细胞对一种或者多种化学治疗剂敏感；

包括给动物或者来自所述动物的或者所述动物内的细胞施用如文中所述的非毒性和治疗有效量的至少一种胆固醇吸收抑制剂和至少一种癌症化学治疗剂。本发明还包括任何所公开的化合物和组合物用于文中所述的任何适应症的用途，具体而言，用于达到以上所述的一个或者多个治疗目标。

特别地，为更确实起见，现已发现，共同施用(不过不必同时或者差不多连续地)胆固醇吸收抑制剂和化学治疗剂有效地抑制多抗药性基因的表达，从而减少有关蛋白质例如P-糖蛋白的产生。这种减少防止了癌症化学治疗剂从动物细胞中流出，使其有效性最大化。

此前，没有认识到胆固醇吸收抑制剂对多抗药性的显著作用。尽管在克服这种抗药性的领域进行了研究，但是其焦点在于其他化合物对P-糖蛋白抑制或者MDR表达的调节作用，例如，通过设计选择性结合MDR-1基因的化合物。以下绝非无遗漏地对这样的研究进行综述。

WO 0213815公开了一种包括选定的化合物(该文中所述的式I)的药物组合物，该化合物本身没有药学活性，但依其所述，通过抑制存在于肠壁的p-糖蛋白，可以提高其他活性成分的生物利用率。使得能够吸收活性成分(例如抗癌症药物)，否则这些成分的吸收很差。

WO 02034291公开了结合到MDR-1基因上并选择性抑制基因表达的分子。这些药物的传送系统包括含有脂类的非聚合物系统。还包括一种抑制MDR基因表达的方法，该方法包括使编码MDR多肽的核酸与HIF-1SUMO-1复合阻断剂接触。

WO 0160349公开了一种包括吡啶甲酸、镰孢菌酸及其衍生物的药物。发现镰孢菌酸成分对于控制含高水平p-糖蛋白的细胞生长是有效的。提示镰孢菌酸可在治疗耐受与MDR有关的药物的肿瘤方面具有一定作用。相同发明人的WO 0220486也公开了类似的信息。

WO 0048571公开了包含n-苯甲酰基-星形孢菌素的药物组合物，及其作为抗肿瘤、抗增殖药物的用途。WO 0226208公开了基于母育酚的颗粒乳剂，用于传送化学治疗剂。该乳剂包括一种或者多种母育酚、表面活性剂、任选的助溶剂和化学治疗剂。

US 5,639,887描述了多种二环胺，其有效使得多抗药性细胞对化学治疗剂例如阿霉素、长春新碱和比生群敏感。US 5,670,507教导了一种逆转由于mdr-1过度表达而对疏水性化学治疗药物不敏感的肿瘤中MDR表型的方法，包括给予有效量的选自两种公开通式的长链氨基醇化合物。

US 5,866,699公开了具有互补于MDR-1基因至少一部分的核苷酸序列的合成寡核苷酸或其转录物，该部分编码核苷结合位点。还公开了一种含有这种寡核苷酸的药物制剂，和治疗MDR癌细胞、防止细胞中P170的表达以及防止诱导癌细胞中MDR的方法。

US 5,874,567教导了一种长度介于15和30个核苷酸(含)之间的修饰寡核苷酸，其具有在人细胞中与人MDR-1基因及其等位变体的互补序列特异性杂交的序列，以抑制由细胞显示的多抗药性表型的表达。该互补序列选自SEQ ID No：103、104和105(如该文中所述)，修饰包括选自二硫酯(dithioate)、甲基膦酸酯、吗啉代、聚酰胺或其任何组合的骨架修饰。

US 6,162,616公开了一种组合物，用于减弱异常的MRP-β基因表达、蛋白质产生和/或蛋白质功能，包括MRP-β核酸，包括探针和反义寡核苷酸，MRP-β多肽和抗体，MRP-β表达宿主细胞，和MRP-β转基因的或者失效合子的(nullizygous)非人哺乳动物。

胆固醇吸收抑制剂在克服MDR应用中还有其他优点。文中所述的一些胆固醇吸收抑制剂(上述式i)到iv)所示的化合物)含有抗坏血酸基部分。这些特定的化合物具有很多额外的优点。首先且最重要的，所述化合物在水溶液和非水性介质例如油和脂肪中的溶解性得到大大提高。由于较高的溶解性，可以减少有效的治疗剂量和相关成本。第二，这些衍生物是热稳定的(对氧化和水解稳定)，这对于一些处理机制是重要的。

可以以多种不同方式获得文中所述的理想效果。胆固醇吸收抑制剂和化学治疗剂，分开地或者一起地，可以以与药物一起使用的任何常规方式进行给药，即，与药物可接受的载体一起使用。该药物组合物可以含有约1％到99％的″活性″成分，优选约5％到95％的活性成分。

可以使用常规的、药物可用的赋形剂和添加剂以及通过常规技术制备所述制剂和药物组合物。这些药物可接受的赋形剂和添加剂包括非毒性的相容的填料、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、香料、增稠剂、着色剂、乳化剂等。

为了获得理想效果所需要的胆固醇吸收抑制剂的确切量或者剂量当然取决于多种因素，例如所选的特定化合物或者组合物、所施用的化合物或者组合物的效力、给药制剂、给药方式以及患者的年龄、体重、病情和响应。所有这些因素，尤其是将由主治医生根据个体或者患者情况进行考虑。

一般而言，含有式i)到viii)之一并且包括甾醇和/或甾烷醇的胆固醇吸收抑制剂的每日总给药剂量是每日10mg到约20g，更优选10mg到1.5g，最优选最多800mg，以单一剂量或者分多次的剂量给药。

如果所选的胆固醇吸收抑制剂是甾醇或者甾烷醇，无论是游离的还是作为化合物或衍生物的一部分，可以以每天包括最多6克甾醇和/或甾烷醇的形式给药。应该承认，提供更高日剂量的甾醇、甾烷醇及其衍生物对动物宿主是无害的，因为过量部分只需通过正常的排泄通道排出。

如果所述的胆固醇吸收抑制剂是取代的氮杂环丁酮，则可以以约0.1到约30mg/kg体重的日剂量进行给药，优选约0.1到约15mg/kg，最优选地每天最多10mg/kg。对平均体重70kg而言，剂量水平为每天约5mg到约1000mg药物，优选以单一剂量或者分成2-4次的剂量给药。

如果该胆固醇吸收抑制剂是抑制胆汁酸再吸收的任何化合物，则以约0.003mg到20mg/kg动物体重的剂量进行给药。一般而言，IBAT抑制剂总的日剂量为约0.01到约1000mg/天，优选为约0.1mg到约50mg/天，更优选为约1到约10mg/天。

当分开施用该胆固醇吸收抑制剂和化学治疗剂时，则每天所给的每种成分的剂量和该剂型的量不必是相同的。例如，与该化学治疗剂相比，该胆固醇吸收抑制剂可能需要每天更多的给药，和/或可能要求更大的剂量。

如果需要，这些胆固醇吸收抑制剂的日剂量可以以单一剂量或者多次剂量给予个体。可以使用缓释剂型。

使用药物可接受的载体，将文中所公开的用于实施本发明的化合物和组合物配制成适合系统性给药的剂型，也在本发明范围内。经适当选择载体和合适的制备方法，本发明的化合物和组合物，特别是配制为溶液的那些，可以肠道外给药，例如由静脉注射。使用本领域众所周知的药物可接受的载体，易于将化合物和组合物配制成适合口服的剂型。这样的载体使得本发明的化合物和组合物可以被配制成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等，用于进行治疗的患者口服摄入。

包含一种或者多种本发明化合物的药物组合物包括其中含有有效量活性成分以达到预期目标的组合物。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是按照文中所提供的详细内容。

除了活性成分外，这些药物组合物可以含有合适的药物可接受的载体，包括赋形剂和助剂，其便于将活性化合物处理为可药用的制剂。为口服而配制的制剂可以是片剂、糖衣丸、胶囊或者溶液形式。

在优选方式中，以脂质体形式施用胆固醇吸收抑制剂。脂质体是由一层或多层脂双层构成的空心微球。它们在30多年前第一次用作多种药物物质的载体，从那时起，对于它们体外特性的了解使得可以针对某些疾病的特定治疗而进行更合理的设计。

当薄的脂质膜水合时形成脂质体。水合的脂质片在搅动过程中分开，并自闭合形成多层囊泡。

本领域中有多种制备脂质体的已知且广泛应用的方法。经常使用已有方法将化学治疗剂例如阿霉素封装在脂质体中。

通常如下制备直径100nm的脂质体：将多种脂质混合物的氯仿溶液暴露于高真空中，接下来用pH4的缓冲液水合所得的脂质膜(DSPC/CHOL，EPC/CHOL，DSPC/PEG-PE/CHOL)，并在冷冻和融化步骤后，通过聚碳酸酯滤器将其挤出。通过加入碱化剂，将囊泡外介质的pH调节为7.5，从而产生跨膜pH梯度。该技术利用弱碱跨显示pH梯度的膜重新分布的能力，其中[药物]入/[药物]出＝[H+]入/[H+]出。

在升高的温度下，通过将少量药物溶液加入囊泡溶液中而包封所选的药物，使药物积聚在脂质体内。通过在凝胶过滤柱上从脂质体自由分离被包裹的药物，并通过液体闪烁计数、荧光光谱或者UV-VIS光谱法定量两级分的脂质和药物含量，从而测定包封效率。然后评价这些脂质体的大小分布(准弹性光散射、扫描电镜)、药物摄入和释放研究、稳定性和体内肿瘤靶向效率。

以下实施例中描述一种制备脂质体的优选但非限定性的方法。

更具体而言，可以用本身已知的任何方式制备本发明的药物组合物，例如，通过常规的混合、溶解、粒化、制锭剂、研粉、乳化、封装、包封或者冻干方法。

用于肠道外给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的悬浮液可以制备为合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或者载体包括：脂肪油，例如芝麻油，或者合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或者葡聚糖。任选地，该悬浮液还可以含有合适的稳定剂或者增加化合物溶解性的试剂，使得可以制备高浓度的溶液。

口服使用的药物制剂可以如下制得：混合活性化合物与固体赋形剂，任选研磨所得的混合物，如果需要，加入合适的助剂后，处理颗粒的混合物，以获得片剂或者锭剂核。合适的赋形剂包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼胶或藻酸，或其盐，例如藻酸钠。

为锭剂核提供合适的包衣。为此，可以使用浓的糖溶液，其中任选可含有阿拉伯胶、、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛，漆(lacquer)溶液，和合适的有机溶剂或者溶剂混合物。染料或者颜料可以加入片剂或锭剂包衣中，以识别或者表征活性化合物剂量的不同组合。

可以口服的药物制剂包括由明胶制得的推合式(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨糖醇制得的密封的软胶囊。推合式胶囊可以含有活性成分，混合有填料，例如乳糖，粘合剂，例如淀粉，和/或润滑剂，例如滑石或者硬脂酸镁，和任选的稳定剂。软胶囊中，活性化合物可以溶解于或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或者液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。

口服液体制剂例如可以是乳剂、糖浆或者酏剂形式，或者可以是干制品，在使用前用水或者其他合适的载体重建。这样的液体制剂可以含有常规的添加剂，例如悬浮剂，例如山梨糖醇，糖浆，甲基纤维素，明胶，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，硬脂酸铝凝胶，氢化的食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂，脱水山梨醇单油酸酯，或者阿拉伯胶；非水性载体(其可以含有食用油)，例如扁桃油，精馏的椰子油，油性酯，例如甘油、丙二醇或乙醇的酯；防腐剂，例如对羟基苯甲酸或山梨酸的甲酯或丙酯；如果需要，还可含有有常规的调味剂或着色剂。

由于本发明涉及具有可同时或分开施用的活性成分组合的组合物，所以这里还提供用于此目的的药盒。涉及这样的药盒，其中组合有两种单独的单元：含有至少一种文中所述的胆固醇吸收抑制剂的药物组合物，和含有至少一种癌症化学治疗剂的单独的药物组合物。该药盒优选包括各单独成分的给药说明。当各单独成分必须以不同剂型(例如，口服与肠道外与静脉内)给药或者以不同给药间隔给药或者以不同剂量给药时，这种类型的药盒设计是特别有用的。

不需进一步详述，以上充分说明了本发明，通过使用目前或者将来的知识，其他人可以对本发明进行改进，以在本文中所述和要求保护的不同条件下使用。

实施例

实施例1——文中所述的一种胆固醇吸收抑制剂：文中称为″FM-VP4″的抗坏血酸基甾烷醇基磷酸酯的制备；

步骤1：保护抗坏血酸

将发烟硫酸(24％，8.3g)滴加到丙酮(50ml)中。在0℃下，将抗坏血酸(12g)引入混合物中，并在0℃下搅拌反应混合物达6小时。所得的晶体被抽吸过滤，将滤饼压干，然后用丙酮(30ml)洗涤。获得产物，5，6-异亚丙基抗坏血酸(14g)。

步骤2：连接到植物甾烷醇

在0℃下，将植物甾烷醇混合物(24g)(菜油甾烷醇：36.4％；谷甾烷醇：62.3％)在甲苯(500ml)和吡啶(25ml)中的溶液滴加到磷酰氯(9ml)在甲苯(200mol)中的混合物中。在室温下搅拌混合物达3小时。过滤出盐酸吡啶，浓缩母液，以回收甲苯。残留物溶于无水THF(100mol)中，在0℃下，滴加以上制得的受保护的抗坏血酸(14g)在无水THF(400ml)中的溶液。在室温下持续搅拌达1小时。浓缩溶液，以除去溶剂。加入乙醇(400ml)和3N HCl(200ml)，将混合物加热到50℃达30分钟，并浓缩。加入乙酸乙酯(600mol)，所得溶液用水洗涤(3×300ml)，在磷酸钠上干燥，浓缩，得到产物(植物甾烷醇-磷酸-抗坏血酸酯)，为白色粉末22g。

步骤3：转化为钠盐

将以上制得的酸(17g)溶于乙醇(100mol)中，在搅拌和室温下加入甲醇钠(2.7g)在乙醇(50ml)中的溶液。加入后，持续搅拌达30分钟。将所得的白色饼状物过滤，干燥并称重，得到白色粉末20g(植物甾烷醇-磷酸-抗坏血酸钠)。

实施例2：——文中所述的一种胆固醇吸收抑制剂：脱氢异雄甾酮的抗坏血酸基磷酸酯二钠的制备

在0℃下，向干燥圆底烧瓶中加入丙酮(150ml)和L-抗坏血酸(50g)。在10分钟内，通过加液漏斗滴加乙酰氯(7.5ml)。在0℃下搅拌反应混合物达24小时。将沉淀过滤出，并用丙酮洗涤(3×20ml)。白色产物，5，6-异亚丙基抗坏血酸，真空干燥1.5小时，得到干燥粉末(52g)，产率85％。

干燥三颈圆底烧瓶装有搅拌棒、氩气入口和加液漏斗。在0℃下，在10分钟内，将脱氢异雄甾酮(1.73g，6mmol)在无水THF(15ml)和吡啶(2.4ml)中的溶液滴加到无水THF(12ml)和POCl₃(0.7ml，7.5mmol)的混合物中。立即形成白色沉淀。在0℃下，搅拌悬浮液达40分钟，并在室温下搅拌1小时40分钟。

在0℃下，在20分钟时间内，向以上悬浮液中滴加5，6-异亚丙基抗坏血酸(3.6g，16.67mmol)在无水吡啶(3ml)和THF(30ml)中的溶液。该悬浮液在0℃下搅拌30分钟，并在室温下搅拌1.5小时。过滤出所形成的氯化吡啶，并用THF洗涤两次。在40℃下减压蒸发溶剂，得到残留物。

将该残留物溶于THF(40ml)，并一次性加入2N HCl(30ml)。混合物在室温下搅拌8小时。减压蒸发THF。水层用乙酸乙酯萃取(4×50ml)。合并的乙酸乙酯溶液用盐水(100ml)洗涤，并在Na₂SO₄上干燥。蒸发溶剂，得到残留物。将残留物溶于CHCl₃，然后加入己烷，以沉淀产物。过滤出沉淀的固体，用己烷洗涤，并真空干燥(2.43g，粗产物，产率：77％)。通过反相C-18色谱(Waters，水/甲醇＝90/10到60/40)纯化磷酸酯。从50mg粗产物中分离纯化合物4(图1，39mg)。总产率(基于脱氢异雄甾酮)为60％。

室温下，脱氢异雄甾酮的抗坏血酸基磷酸酯(0.5g，0.95mmol)溶于甲醇(3ml)中，然后加入甲醇钠的甲醇溶液(1ml，20％)。悬浮液在室温下搅拌30分钟。过滤出沉淀的固体，用甲醇、丙酮和己烷进行洗涤。将母液浓缩到2ml，加入丙酮，以沉淀产物。得到额外的白色固体。在室温下，真空干燥合并的固体。得到脱氢异雄甾酮的抗坏血酸基磷酸酯二钠(0.49g，产率91％)。

实施例3--文中所述的另一种胆固醇吸收抑制剂：5α-雄甾烷-3β-醇-17-酮的抗坏血酸基磷酸酯二钠的合成

向干燥圆底烧瓶中加入5α-雄甾烷-3β-醇-17-酮(1.0g，3.4mmol)、THF(8.6ml)和吡啶(1.38ml)。在室温下搅拌混合物，直到得到澄清溶液。向另一干燥圆底烧瓶中加入THF(6.9ml)和POCl₃(0.4ml，4.25mmol)，在0℃下搅拌5分钟。在氩气气氛下，在10分钟内，向该混合物中滴加以上制得的5α-雄甾烷-3β-醇-17-酮溶液。加入完毕后，白色悬浮液在0℃下搅拌35分钟，并在室温下搅拌2小时。停止反应，白色悬浮液无需过滤即可用于偶合反应。

5，6-异亚丙基抗坏血酸(2.0g，9.52mmol)溶于吡啶(1.71ml)和THF(17ml)中。将含有先前制得的白色悬浮液的圆底烧瓶浸在冰-水浴中。在0℃搅拌下，在15分钟内，向该混合物中滴加以上制得的5，6-异亚丙基抗坏血酸的THF溶液。加入完毕后，混合物在0℃下搅拌25分钟，并在室温下搅拌2小时。过滤出氯化吡啶的白色固体，并用THF(8ml)洗涤。浓缩滤液，以除去THF和过剩吡啶，得到残留物(2.38g)。

将残留物溶于THF(30ml)，并一次性加入1N HCl(30ml)。混合物在室温下搅拌16小时45分钟。室温下将12N HCl(4ml)加入该反应混合物中。该反应混合物在室温下再搅拌4小时45分钟。在减压下将THF蒸发。水层用乙酸乙酯萃取(3×60ml)。合并的乙酸乙酯溶液用盐水(60ml)洗涤，并在Na₂SO₄上干燥。将萃取液浓缩为约3ml。加入己烷(15ml)，以沉淀产物。过滤出沉淀的固体，用己烷洗涤，并在减压下干燥(1.48g)。

在室温下，5α-雄甾烷-3β-醇-17-酮的抗坏血酸基磷酸酯(0.5g，0.95mmol)溶于甲醇(3ml)中，然后加入甲醇钠的甲醇溶液(1.5ml，20％)。悬浮液在室温下搅拌25分钟。过滤出沉淀的固体，用甲醇、丙酮和己烷洗涤。将母液浓缩为2ml，然后加入丙酮，以沉淀产物。得到额外的产物。在室温下，减压干燥合并的固体，得到5α-雄甾烷-3β-醇-17-酮的抗坏血酸基磷酸酯二钠(0.38g)。总产率为57％(基于5α-雄甾烷-3β-醇-17-酮)。

实施例4——文中所述的另一种胆固醇吸收抑制剂：雄甾-5-烯-3β，17β-二醇的抗坏血酸基磷酸酯二钠的合成

向干燥圆底烧瓶中加入3β-乙酰氧基雄甾-5-烯-17β-醇(1.0g，3.0mmol)、无水THF(6.3ml)和吡啶(0.73ml)。混合物在室温下搅拌，直到得到澄清溶液。向另一干燥圆底烧瓶中加入THF(2ml)和POCl₃(0.35ml，3.22mmol)，在-5℃～-10℃下搅拌5分钟。在氩气气氛下，在20分钟内，向该混合物中滴加以上制得的3β-乙酰氧基雄甾-5-烯-17β-醇溶液。加入完毕后，白色悬浮液在室温下搅拌1小时。将混合物浓缩，以除去THF和过剩POCl₃，得到残留物。

5，6-异亚丙基抗坏血酸(0.98g，4.55mmol)溶于无水吡啶(0.70ml)和THF(6.2ml)中。残留物溶于无水THF(4ml)中。在0℃搅拌下，在20分钟内，向该混合物中滴加以上制得的5，6-异亚丙基抗坏血酸的THF溶液。加入完毕后，混合物在室温下搅拌1小时25分钟。过滤出氯化吡啶的白色固体，并用THF(6ml)洗涤。浓缩滤液，以除去THF和过剩吡啶，得到残留物。

残留物溶于乙醇(12.5ml)和1N HCl(12.5ml)的混合物中。混合物在50℃-55℃下再搅拌3小时45分钟(TLC监测)。用乙酸乙酯(60ml)萃取混合物，用10％NaCl水溶液(30ml，20ml)洗涤两次，并在Na₂SO₄(10g)上干燥1.5小时。过滤后，将滤液浓缩为5ml。加入己烷(10ml)，以沉淀产物。收集沉淀物，用己烷(10ml)洗涤，并在减压下干燥，得到淡黄色的粉末(0.95g，粗产物，产率60％)。通过制备型HPLC得到纯产物。

仪器是Waters Delta Preparative 4000HPLC系统。柱是WatersSymmetry C18，5μm，30×100mm。流动相是0.1％H₃PO₄的水和乙腈溶液。水和乙腈是HPLC级或者相当级别的。

通过制备型HPLC纯化粗产物。收集产物，并在旋转蒸发仪上蒸发，以除去乙腈。水溶液用乙酸乙酯萃取两次。乙酸乙酯层在Na₂SO₄上干燥，浓缩，并在减压下干燥，得到白色粉末产物。对该产物进行NMR和质谱分析。两种谱都表明产物是雄甾-5-烯-3β，17β-二醇的抗坏血酸基磷酸酯。

雄甾-5-烯-3β，17β-二醇的抗坏血酸基磷酸酯二钠(5，图3)的制备类似于实施例3中描述的过程。

实施例5——文中所述的另一种胆固醇吸收抑制剂：雄甾-5-烯-17β-醇的抗坏血酸基磷酸酯二钠的合成

在0℃下，在10分钟内，向吡啶(0.41ml)和1，2-亚苯基氯亚磷酸酯(1，2-phenylenephosphorochloridite)(0.6ml，5mmol)在无水THF(10ml)中的溶液中滴加在无水THF(10ml)中的脱氢异雄甾酮(1.44g，5mmol)。反应混合物在0℃下搅拌30分钟，并在室温搅拌4小时。用TLC(己烷/EtOAc＝2/1)监测反应。过滤出所形成的氯化吡啶，并用THF洗涤。在40℃下蒸发溶剂，得到白色粉末。

粗制磷酸酯溶于二氯甲烷(25ml)，并用碘(1.27g)在室温下处理4小时。反应混合物用二氯甲烷(75ml)稀释，用1N NaOH(2×50ml)和水(2×50ml)洗涤，并在Na₂SO₄上干燥。将溶剂除去，并从二氯甲烷和甲醇中结晶出产物(1.4g，产率71％)。

在50-55℃下，3β-碘雄甾-5-烯-17-酮(1.27g，3.19mmol)溶于冰醋酸(40ml)中，一次性加入活化的锌粉(2.7g)。混合物在50℃-55℃下搅拌2小时，过滤出锌粉，并用二氯甲烷洗涤。溶液用二氯甲烷(120ml)稀释，用水(2×100ml)、1N NaOH(2×100ml)和水(100ml)洗涤，并在Na₂SO₄上干燥。除去溶剂，得到白色粉末。真空干燥白色粉末，得到雄甾-5-烯-17-酮(0.83g，产率：95％)。

室温下，雄甾-5-烯-17-酮(0.65g，2.34mmol)溶于甲醇(25ml)中。将溶液冷却到0℃，并一次性加入NaBH₄(50mg)。混合物在0℃下搅拌3小时，并用TLC(己烷/EtOAc＝3/1)监测。3小时后，加入另一部分NaBH₄(20mg)，反应混合物在0℃下再搅拌半小时。在0℃下，缓慢加入NH₄Cl(5％，25ml)和HCl(6N，5ml)水溶液，并搅拌1小时。加入水(100ml)，以完全沉淀产物。过滤出沉淀的固体，并用水洗涤，真空干燥。通过柱色谱得到纯产物(0.62g，产率：95％)。

在0℃下，在5分钟内，将雄甾-5-烯-17β-醇(0.63g，2.3mmol)在无水THF(8ml)和吡啶(1ml)中的溶液滴加到无水THF(6ml)和POCl₃(0.28ml，3mmol)的混合物中。悬浮液在0℃下搅拌50分钟，然后在室温下搅拌一小时。

在0℃下，在15分钟内，向以上悬浮液中滴加5，6-异亚丙基抗坏血酸(1.38g)在无水吡啶(1.2ml)和THF(12ml)中的溶液。悬浮液在0℃下搅拌1.5小时，然后在室温下过夜。过滤出所形成的盐酸吡啶，并用THF洗涤两次。减压下，在40℃蒸发溶剂，得到残留物。

然后将残留物溶于THF(35ml)，并一次性加入2N HCl(30ml)。混合物在室温下搅拌过夜。减压下蒸发THF。水层用乙酸乙酯萃取(3×100ml)。合并的乙酸乙酯溶液用盐水(100ml)洗涤，并在Na₂SO₄上干燥。蒸发溶剂，得到残留物。残留物溶于丙酮，并加入己烷，以沉淀产物。过滤出沉淀的白色固体，用己烷洗涤，并真空干燥(0.82g，粗产物，产率：70％)。

雄甾-5-烯-17β-醇的抗坏血酸基磷酸酯二钠的制备类似于实施例2。

实施例6——文中所述另一种胆固醇吸收抑制剂：3β-乙酰氧基雄甾-5-烯-7β，17β-二醇的单抗坏血酸基二磷酸酯四钠的合成

向干燥圆底烧瓶中加入3β-乙酰氧基雄甾-5-烯-7β，17β-二醇(0.5g，1.43mmol)、吡啶(0.83ml)和THF(4ml)。混合物在室温下搅拌，直到获得澄清溶液。向另一干燥圆底烧瓶中加入THF(5ml)和POCl₃(0.33ml)，在-5℃-0℃下搅拌5分钟。在氩气气氛下，在15分钟内，向该混合物中滴加以上制得的3β-乙酰氧基雄甾-5-烯-7β，17β-二醇溶液。加入完毕后，白色悬浮液在室温下搅拌2小时45分钟。停止反应，该白色悬浮液无需过滤即可用于偶合反应。

5，6-异亚丙基抗坏血酸(1.30g，6.02mmol)溶于吡啶(1.16ml)和THF(5.8ml)中。含有先前制得的白色悬浮液的圆底烧瓶浸在冰-水浴中。在0℃搅拌下，在15分钟内，向该混合物中滴加以上制得的5，6-异亚丙基抗坏血酸的THF溶液。加入完毕后，混合物在0℃下搅拌40分钟，并在室温下搅拌17小时。过滤出氯化吡啶的白色固体，并用THF(5ml)洗涤。浓缩滤液，以除去THF和过剩吡啶，得到残留物(2.76g)。

该化合物粗品溶于THF(30ml)和1N HCl(30ml)的混合物中。该混合物在室温下持续搅拌3.5小时(TLC监测)。加入第二部分1N HCl(10ml)。混合物再搅拌18.5小时。在减压下除去反应混合物中的THF。用乙酸乙酯和正丁醇(1∶1，110ml)萃取该水悬浮液。有机层用蒸馏水(11ml)洗涤。在旋转蒸发仪上浓缩该有机层，得到残留物。该残留物用己烷洗涤(2×10ml)并在减压下干燥，得到粗产物(1.15g)。

该化合物钠盐的制备类似于实施例3。

实施例7——文中所述的另一种胆固醇吸收抑制剂：雄甾-5-烯-3β，17β-二醇的二抗坏血酸基二磷酸酯四钠的合成

在干燥圆底烧瓶中，雄甾-5-烯-3β，17β-二醇(1.5g，5.17mmol)溶于吡啶(3.0ml)和THF(15ml)中。在另一干燥圆底烧瓶中加入THF(20ml)和POCl₃(1.17ml，12.56mmol)。后者在-5℃下搅拌5分钟，然后在20分钟内加入雄甾-5-烯-3β，17β-二醇。白色沉淀在加入后马上可以观察到，并且在-5℃下反应最初20分钟后，使反应在室温下继续2.5小时。

然后使烧瓶冷却到0℃，在剧烈搅拌下，在20分钟分钟内，滴加5，6-异亚丙基抗坏血酸(3.19g，14.78mmol)在吡啶(3ml)和THF(15ml)中的溶液。使反应再继续两小时。然后，过滤反应混合物，并将滤液浓缩为浓浆液。加入庚烷，并在减压下蒸馏混合物。得到固体粗产物。

将粗产物溶于THF/1N HCl(1∶1，150ml)中，在室温下，在剧烈搅拌下进行水解。反应12小时后，TLC测试表明水解完全。在减压下，在室温下除去反应混合物中的THF，正丁醇和乙酸乙酯(1∶1，100ml)用于萃取。有机层用水洗涤(2×20ml)，然后浓缩，得到粗产物雄甾-5-烯-3β，17β-二醇的二抗坏血酸基二磷酸酯(3.0g)。

粗产物雄甾-5-烯-3β，17β-二醇的二抗坏血酸基二磷酸酯(400mg)溶于甲醇(5ml)中。在磁力搅拌下，向该溶液中加入2ml甲醇钠(20％，w/v)的甲醇溶液。加入甲醇钠甲醇溶液后观察到白色沉淀。搅拌悬浮液半小时，然后过滤并用甲醇和丙酮洗涤。固体产物在高真空下干燥，得到雄甾-5-烯-3β，17β-二醇的二抗坏血酸基二磷酸酯四钠(330mg)。

实施例8——用FM-VP4处理一周后测定CaCo2细胞中的MDR-1表达

用不同量的FM-VP4(0.5μm、1.0μm、5.0μm和10.0μM)处理T-75摇瓶中汇合的CaCo2细胞(P33-39)一周。每隔一天更换一次培养基和处理。七天后，收集细胞，并用TRIZOL^TM分离总RNA。用聚合酶链式反应，通过反转录→cDNA进行分析。

对于GAPDH引物滴的滴定程序：

50ng cDNA(CaCo2细胞)

0.5μM MDDR 1正向，0.5μM MDR-1反向

PCR程序：94℃，5分钟，94℃，1分钟，55℃，1分钟，72℃，1分钟30秒，从步骤2开始再重复29次，72℃，10分钟，4℃。

引物滴在以下循环时加入：0、6、9、12、16、20、23、26、28和30。

图1是表示这些结果的图，由该图清楚看到，随着胆固醇吸收抑制剂浓度增加，MDR-1基因表达明显减少。对这些结果的其他支持表示在图2中，图2表示对于GAPDH引物滴的滴定，图3表示MDR-1和GAPDH的聚合酶链式反应(1.5％琼脂糖凝胶)电泳板的结果。

与10mM FM-VP4孵育清楚导致MDR-1显著下调。

实施例9——用FM-VP4处理一周后测定CaCo2细胞中的MRP-1表达

实施例8中提供的关于MDR-1基因的全部方案被用于证实胆固醇吸收抑制剂对另一种多抗药性基因：MRP-1的表达的作用。

图6是表示用FM-VP4处理一周后CaCo2细胞中ABCC1(MRP-1)表达水平(MRP-1/GAPDH的标准化比值)的直方图，其结果清楚说明对基因表达具有抑制作用。

实施例10——细胞毒性研究：通过MTS、LDH和BCA试验证实所测试的胆固醇吸收抑制剂的非毒性

将Caco2-细胞接种于48或96孔板中。生长培养基每2-3天吸出，并用新鲜培养基替换。细胞保持在37℃，5％CO₂的潮湿气氛中。然后用培养基、0.1％Triton X-100(作为毒性的阳性对照)、FM-VP4、所选的胆固醇吸收抑制剂处理细胞。

24小时后，将每孔50ml转入新96-孔板中，进行LDH-试验。在最初的板上进行MTS-试验(CellTiter 96 AQueous One Solution试剂盒(Promega^TM)。

可以通过线粒体的完整性来反映细胞的生存力。MTS-试验是一种比色方法，用来确定治疗后的活细胞数(细胞毒性)。当将MTS试剂(四唑盐)施加给活细胞时，其被转化为有色的化合物(甲)，在492nm处有光发射。可以通过线粒体的完整性来反映细胞的生存力。

进行该试验后，吸出培养基和溶液，用PBS洗涤细胞三次，并溶解，以进行BCA蛋白质试验(PIERCE)。该特殊的比色试验通过鉴定特定的肽键来测量总蛋白质水平。从用蛋白质标准(牛血清白蛋白或″BSA″)建立的校正曲线来计算蛋白质浓度。

LDH-试验检查细胞膜的完整性，可以用于由化学或其他试剂介导的细胞毒性。细胞破坏与细胞内、胞质内容物和乳酸脱氢酶或″LDH″(一种稳定的胞质酶)的流失有关，可以用作该事件的报道分子。使用Promega^TM的试剂盒(Cytotox96非放射性细胞毒性试验)测量从细胞释放入培养基中的LDH。该方法基于一系列相连的酶反应，最终反应是四唑盐还原为有色的、不可溶的甲产物，该产物可在492nm处测量到。从读数中减去仅有培养基和包括该处理的培养基的背景吸光度，以校正数值。

图4是用″FM-VP4″处理CaCo2后细胞生存力的MTS-和LDH-试验的直方图。图5是表示用″FM-VP4″处理CaCo2后蛋白质浓度的BCA-试验的直方图。

测试的胆固醇吸收抑制剂，FM-VP4，在最高100mM浓度范围内都没有表现出任何毒性(线粒体活性)，无论该处理是24小时(细胞存活率为90.9+/-9.8％)还是96小时(94.6+/-4.4％)。以250mM浓度处理24小时，下降到59.2+/-8.1％，处理96小时则为19.3+/-7.6％。FM-VP475mM的最高测试浓度表明，24小时后，细胞存活率为8.5+/-5.8％，和22.1+/-1.6％。

这些发现与处理后的蛋白质浓度一致。表现出与MTS-试验所见相同的趋势。

实施例11——与FM-VP4孵育后，Caco2-细胞中P-糖蛋白的蛋白质印迹分析(→蛋白质表达)

实验：

10瓶Caco2-细胞(T75)

将接种约28天后的细胞分成2组(I和II)

两组都受到相同处理达1周，然后分别进行分析

处理组I：RNA分离，用TRIZOL分离RNA→RT-PCR→PCR＝＞mdr-1表达

处理组II：蛋白质分离→SDS-Page凝胶→蛋白质印迹＝＞P-糖蛋白表达

收集组I的细胞，按照实验方案，用TRiZOLI^提取细胞的总RNA。RNA被逆转录为cDNA，使用特异性引物评价MDR-1的表达水平。使用GAPDH(引物滴)进行内部对照。来自每种PCR产物的样品在1.5％琼脂糖凝胶(含有溴化乙锭)上进行电泳。使用100bp标准物确定产物大小。该荧光带在紫外灯(UVP-Epi Chemi II Darkroom)下成像，并用UVP-Labworks软件进行定量。

对组II的细胞进行蛋白质提取过程。用PIERCE BCA蛋白质试验试剂盒测定浓度。每种样品的15μg总蛋白质在11％SDS Page凝胶上进行电泳，并转移到PVDF膜上(湿法转移)。使用免疫印迹技术进行P-gp鉴定。用于P-gp的单克隆抗体是JSB-1，第二抗体是辣根过氧化物酶标兔抗小鼠抗体(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.)。优化试验后，证明抗体溶液的最佳稀释度为：第一抗体为1∶200，第二抗体为1∶1000。用PerkinElmer的化学荧光试剂盒显示蛋白带，并将X光胶片放在该膜上。使胶片曝光约1分钟，然后显影。

图9是与所选的胆固醇吸收抑制剂：″FM-VP4″孵育后，CaCo2细胞中P-糖蛋白的蛋白质印迹分析。

与FM-VP4孵育明显导致MDR-1下调。换句话说，可检测到由mdr-1编码的较低水平的P-糖蛋白。与FM-VP4 10μM孵育七天导致mdr-1下调(证实了先前的实验)。蛋白质水平也与该发现一致。可检测到由MDR-1编码的较低水平的P-糖蛋白。

这些数据提示，mdr-1基因表达的改变导致由mdr-1编码的蛋白质水平P-gp的相应改变。

实施例12——用FM-VP4脂质体处理后，Caco2-细胞中的MDR-1基因表达

目标是确认胆固醇吸收抑制剂(″FM-VP4″)的无胆固醇脂质体制剂对多抗药性基因的基因表达的影响。

FM-VP4在水中的稀释液被施加于Caco2-细胞。所关心的是无胆固醇的脂质体制剂(DMPC 100∶0，比值10∶1 DMPC∶FM-VP4)中脂质体FM-VP4的影响。FM-VP4脂质体以三个不同浓度(2.5、5和10μMFM-VP4)使用。

程序：将Caco2-细胞以10,000细胞/cm²接种于T-75摇瓶(Corning)中。每隔一天更换一次生长培养基。细胞保持在37℃，5％CO₂的潮湿气氛中。处理组含有2.5、5和10μM无胆固醇的脂质体FM-VP4，以及不含FM-VP4的无胆固醇空脂质体。处理一周后收集细胞，按照实验方案，用TRIZOL^分离总RNA。该步骤后进行RT-PCR，并使用特异性引物评价MDR-1的表达水平。通过在1.5％琼脂糖凝胶(含有溴化乙锭)上电泳分析PCR产物，并使荧光带在紫外光下成像，使用UVP-Labworks软件进行定量。

图7表示MDR-1、GAPDH的聚合酶链式反应(1.5％琼脂糖凝胶)的电泳结果；用文中所述的一种胆固醇吸收抑制剂：称为”FM-VP4”的抗坏血酸基甾烷醇基磷酸酯的脂质体制剂处理CaCo2细胞后，用TRIAZOL分离RNA→RT-PCR→PCR；

图8的直方图表示，与对照和空脂质体相比，用2.5、5和10μm的脂质体FM-VP4处理一周后，CaCo2细胞中MDR-1的表达水平(MDR-1/GAPDH的标准化比值)。

所有3个测试浓度都导致MDR-1基因下调。与空脂质体孵育没有表现出任何假定的作用，可以作为对照使用。与胆固醇吸收抑制剂溶于水中时相比，下调明显更有效。

因此，用较低浓度的脂质体FM-VP4处理后，Caco2-细胞中的MDR-1基因表达比非脂质体制剂明显减少。

实施例13——含有胆固醇吸收抑制剂的脂质体的制备

一般性方案

制备干燥脂质膜

1.制备脂类在氯仿中的储备溶液(DMPC/胆固醇55∶45摩尔比)。

2.将适量储备溶液转入试管中。

3.干燥的溶剂在氮气流中干燥

4.用氮气干燥

5.当脂类差不多干燥好后，将其放入真空装置中，以除去残留的氯仿至少2小时。

6.干燥的脂质被封盖并放在冰箱中进行存放。

使脂质水合

1.设定水浴为55℃。

2.在水浴中，加热一些HBS，或者溶于HBS中的所选的胆固醇吸收抑制剂(例如：FM-VP4)。

3.向试管中加入适量的HBS或者HBS中的FM-VP4。

4.涡旋。

5.在水浴中加热。

冻融循环

1.用液氮装填杜瓦瓶

2.将脂质混合物转入塑料冻存管中。

3.冻存管连接升降装置(crane)。

4.在液氮中冷冻样品，然后在水浴中融化。重复5次。

5。将样品存放在冰箱中。

挤压/调节囊泡的大小

1.设定水浴为55℃。

2.安装挤压机。

3.用氮气然后用HBS测试挤压机。

4.将压力升高为300-600psi。

5.样品在挤出前等分为500μL，将其转入微量离心管(eppendorf)，并标为BE。

6.使脂质悬浮液通过2个聚碳酸酯滤器

7.用0.1μm滤器将样品大小挤压为100nm

8.挤压样品10次。

9.等分为500μL，并标为AE。

10.透析后，等分为500μL，并标为AD。

实施例14——用胆固醇吸收抑制剂处理后，Caco-2细胞中的MDR-1基因表达

目标：研究用胆固醇吸收抑制剂处理后，Caco-2细胞中时间依赖性的mdr-1基因表达

实验程序：将Caco2-细胞以10,000细胞/cm²接种于T-75摇瓶(Corning)中。每隔一天更换一次生长培养基(Dulbecco极限必需培养基-DMEM)，其含有10％热活化的胎牛血清、292μg/ml谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100mg/ml谷氨酰胺。细胞保持在37℃，5％CO₂的潮湿气氛中。如上所述，用10μM“FM-VP4”处理细胞，当达到约95％汇合时，溶解于水中。对照组只有培养基。

60、90分钟，6、24和48小时后收集细胞。用TRIazol试剂分离总RNA，然后逆转录为单链cDNA。用对于mdr-1的特异性引物进行PCR反应，并且用管家基因GAPDH作为内部对照。每种PCR产物的样品在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳。在紫外光(UV-Epi Chemi II)下显示荧光带，并用UVP-labworks软件进行定量。

图10和11：作为用10μM FM-VP4处理的时间依赖性作用，检查了Caco-2细胞中mdr-1基因的表达谱。每种PCR产物的样品在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳(10)。荧光带在紫外光(UV-Epi Chem II)下成像，并用UVP-Labworks软件(11)进行定量。

实施例15——胆固醇吸收抑制剂对Caco-2细胞的罗丹明123细胞积聚的影响

目标：研究罗丹明积聚，其是多药流出转运体P-糖蛋白(P-gp)活性的指标。较低P-gp活性导致细胞中罗丹明123的积聚。

罗丹明123是P-gp底物(荧光染料)，用作测定P-gp功能活性的探针底物。激发波长是485nm，发射波长是520nm。如文中所述，细胞与″FM-VP4″孵育，并将罗丹明123加到基底外侧。细胞溶解后，测定罗丹明123含量。

Caco-2细胞以40,000细胞/cm²的密度接种在12mm直径的聚碳酸酯滤器插件(Transwell，Costar)上。每隔一天更换一次含有10％热活化的胎牛血清、292μg/ml谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100mg/ml谷氨酰胺的生长培养基(Dulbecco极限必需培养基-DMEM)。细胞保持在37℃，5％CO₂的潮湿气氛中。对于处理实验，将不同浓度的FM-VP4加入培养基中，并施加到Transwell板的顶端和基底外侧。测定单层的跨上皮电阻(TEER)，以确认单层的完整性。Teer值大于400Ω/cm²的Caco-2细胞被用于P-gp研究。

处理一周后，用含10mM Hepes、pH 7.4的HBSS(没有酚红)洗涤细胞几次，并与HBSS和10mM Hepes中的FM-VP4预孵育1小时。测量Teer值，以检查单层的完整性。将Teer值低于400Ω/cm²的Transwells从实验中排除。对照孔只含有培养基，用于抑制P-gp的阳性对照是维拉帕米。将5μM罗丹明123加到基底外侧，在37℃下3小时后，除去培养基，并用冰冷的PBS洗涤细胞3次。然后切下膜，转入1.5ml微量离心管中，加入250μl的1％Triton X-100并涡旋。室温下10分钟并且离心5分钟除去细胞碎片后，将25μl(一式三份)转入96孔板中，并测量荧光(激发：485nm；发射：530nm)。最后，用BCA蛋白质试验(PIERCE)测定蛋白质含量，并对罗丹明123积聚进行标准化。

图12：与FM-VP4预孵育1周对于Caco-2单层中Rh123积聚的影响。数据表示平均值±SD。^*P＜0.002；^**P＜0.0001

用100μM维拉帕米作为P-gp抑制的阳性对照，结果每mg蛋白质有1604pmol罗丹明123积聚。使用5μM以上浓度的FM-VP47天，可以观察到P-gp底物罗丹明123的细胞积聚升高，因此P-gp活性降低。

实施例16——胆固醇吸收抑制剂对于多药物流出转运体P-糖蛋白(P-gp)功能活性的影响

用FM-VP4处理后，进行实验，以测定Caco-2细胞中P-gp的活性。先前实验证实，施用FM-VP4(10μM)一周后，FM-VP4减少mdr-1(其编码P-gp)的基因表达。mdr-1下调导致较低的P-gp蛋白质表达水平，如蛋白质印迹分析所示。

人肠上皮单层Caco-2细胞在其顶膜上表达P-gp。用于测量跨单层的顶端和基底外侧转运以及用于确定某种物质的通透性的一个良好系统是Transwell板。细胞在置于两个区室之间的半透膜上生长。Caco-2细胞分化为高度功能化的上皮屏障。形态学和生物化学上，其类似于小肠柱状上皮。

为了测量类似于肠环境的药物吸收，将物质加到顶侧，并测量基底外侧的浓度。这代表了肠吸收。如果物质被加到基底外侧上，并测定其向顶端区室中的转运，则可以测定分泌性转运。P-gp的一种良好底物是罗丹明123，已经用其作为探针测定P-gp的功能活性。其是一种荧光染料。罗丹明123在511nm处的摩尔消光系数为85,200M^-1cm^-1。

将Caco-2细胞接种于12mm直径的聚碳酸酯滤器插件(Transwell，Costar)上。每隔一天更换一次含有10％热活化的胎牛血清、292μg/ml谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100mg/ml谷氨酰胺的生长培养基(Dulbecco极限必需培养基-DMEM)。细胞保持在37℃，5％CO₂的潮湿气氛中。对于处理实验，将不同浓度的FM-VP4加入培养基中，并施加到Transwell板的顶端和基底外侧上，达一周。对照孔只含有培养基。用于抑制P-gp的阳性对照是维拉帕米(钙通道阻断剂)。

测量单层的跨上皮电阻(TEER)，以确认单层的完整性。然后使用TEER值大于400Ω/cm²的Caco-2细胞用于转运研究。为了测量分泌性转运(基底外侧到顶端)，将5μM罗丹明加入基底外侧的区室中。以时间依赖性方式从顶侧取样，并测定荧光。立即用新鲜的接受培养基(培养基、培养基加FM-VP4或者培养基加P-gp抑制剂)代替样品。

总之，并且如图13所示，可以观察到胆固醇吸收抑制剂对于Caco-2细胞Transwell系统中罗丹明123顶端摄入的作用。当在两侧(顶端以及基底外侧)进行孵育时，在25μM FM-VP4浓度下发生明显的P-gp抑制。

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Claims

1.一种抑制动物细胞中多抗药性基因表达的方法，包括给予动物有效量的至少一种胆固醇吸收抑制剂。

2.权利要求1的方法，其中，该动物细胞是由于多抗药性基因过度表达而对化学治疗剂不敏感的肿瘤细胞。

3.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是天然或者人工合成形式的甾醇或甾烷醇或其混合物。

5.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是以任何一种异构体形式的甾醇或者甾烷醇。

6.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾醇：谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇(包括二氢菜子甾醇)、链甾醇、chalinosterol、多孔甾醇、γ-谷甾醇、麦角甾醇、粪甾醇、codisterol、异岩藻甾醇、岩藻甾醇、贞桐甾醇、nervisterol、烯胆甾醇、星鱼甾醇、菠菜甾醇、chondrillasterol、peposterol、燕麦甾醇、异燕麦甾醇、fecosterol和pollinastasterol。

7.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾烷醇：谷甾烷醇、菜油甾烷醇、豆甾烷醇、菜子甾烷醇(包括二氢菜子甾烷醇)、链甾烷醇、chalinostanol、多孔甾烷醇、γ-谷甾烷醇、麦角甾烷醇、粪甾烷醇、codistanol、异岩藻甾烷醇、岩藻甾烷醇、贞桐甾烷醇、nervistanol、烯胆甾烷醇、星鱼甾烷醇、菠菜甾烷醇、chondrillastanol、pepostanol、燕麦甾烷醇、异燕麦甾烷醇、fecostanol和pollinastastanol。

8.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾醇衍生物或者甾烷醇衍生物：脂族酯、芳族酯、酚酸酯、肉桂酸酯、阿魏酸酯、糖苷、酰化的糖苷和酰基糖苷。

9.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是具有一种或者多种下式的、包括甾醇或者甾烷醇的一种或者多种化合物，包括其生物学上可接受的盐：

10.权利要求9的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是抗坏血酸基甾烷醇基磷酸二钠组合物，其包括抗坏血酸基菜油甾烷醇基磷酸二钠和抗坏血酸基谷甾烷醇基磷酸二钠。

11.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是羟基取代的氮杂环丁酮。

12.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是下式表示的羟基取代的氮杂环丁酮化合物，或其生物学上可接受的盐：

其中：Ar₁和Ar₂独立地选自芳基和R₄取代的芳基；

Ar₃是芳基或者R₅取代的芳基；

R₁和R₃独立地选自氢、低级烷基和芳基；

R₄是1-5取代基，独立地选自低级烷基、--OR₆、--O(CO)R₆、--O(CO)OR₉、--O(CH₂)_1-5OR₆、--O(CO)NR₆R₇、--NR₆R₇、--NR₆(CO)R₇、-NR₆(CO)OR₉、--NR₆(CO)NR₇R₈、--NR₆SO₂R₉、--COOR₆、--CONR₆R₇、--COR₆、-SO₂NR₆R₇、S(O)_0-2R₉、--O(CH₂)_1-10--COOR₆、--O(CH₂)_1-10CONR₆R₇、-(低级链烯基)COOR₆、--CH＝CH--COOR₆、--CF₃、--CN、--NO₂和卤素；

R₉是低级烷基、芳基或者芳基取代的低级烷基。

13.权利要求12的方法，其中，在该化合物中，Ar₁是苯基或者R₄取代的苯基，Ar₂是苯基或者R₄取代的苯基，并且Ar₃是R₅取代的苯基。

14.权利要求12的方法，其中，在该化合物中，Ar₁是R₄取代的苯基，其中R₄是卤素；Ar₂是R₄取代的苯基，其中R₄是卤素或者--OR₆，其中R₆是低级烷基或者氢；并且Ar₃是R₅取代的苯基，其中R₅是--OR₆，其中R₆是低级烷基或者氢。

15.权利要求12的方法，其中，在该化合物中，X、Y和Z分别是--CH₂--；R₁和R₃分别是氢；R和R₂分别是--OR₆，其中R₆是氢；并且m、n、p、q和r之和是2、3或者4。

16.权利要求12的方法，其中，在该化合物中，m、n和r分别是0，q是1并且p是2。

17.权利要求12的方法，其中，在该化合物中，p、q和n分别是0，r是1，并且m是2或者3。

18.权利要求12的方法，其中，该化合物选自：

4(S)→4-(乙酰氧基)苯基！-3(R)-(3(S)-羟基-3-苯基丙基)-1(4-甲氧基苯基)-2-氮杂环丁酮；

1-(.sup.4-氟苯基)-3(R)→3(S)-(4-氟苯基)-3-羟基丙基)！-4(S)→4-(苯基甲氧基)苯基！-2-氮杂环丁酮；

19.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是雄甾烷和/或雄甾烯衍生物，其中雄甾烷和/或雄甾烯与抗坏血酸偶合，并由一个或多个以下通式表示：

20.权利要求19的方法，其中，偶合到雄甾烷或者雄甾烯家族化合物的抗坏血酸基部分分别选自一种或者多种以下结构：

其中，M⁺表示任何金属、碱土金属或者碱金属。

21.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是胆汁酸转运或者再吸收的抑制剂，并选自所有回肠、顶端和肝脏转运的抑制剂。

22.一种提高化学治疗剂对患有癌症动物有效性的方法，包括给予所述动物有效量的

a)化学治疗剂，和

b)至少一种胆固醇吸收抑制剂。

23.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是天然或者人工合成形式的甾醇或甾烷醇或其混合物。

24.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是以任何一种异构体形式的甾醇或者甾烷醇。

25.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾醇：谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇(包括二氢菜子甾醇)、链甾醇、chalinosterol、多孔甾醇、γ-谷甾醇、麦角甾醇、粪甾醇、codisterol、异岩藻甾醇、岩藻甾醇、贞桐甾醇、nervisterol、烯胆甾醇、星鱼甾醇、菠菜甾醇、chondrillasterol、peposterol、燕麦甾醇、异燕麦甾醇、fecosterol和pollinastasterol。

26.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾烷醇：谷甾烷醇、菜油甾烷醇、豆甾烷醇、菜子甾烷醇(包括二氢菜子甾烷醇)、链甾烷醇、chalinostanol、多孔甾烷醇、γ-谷甾烷醇、麦角甾烷醇、粪甾烷醇、codistanol、异岩藻甾烷醇、岩藻甾烷醇、贞桐甾烷醇、nervistanol、烯胆甾烷醇、星鱼甾烷醇、菠菜甾烷醇、chondrillastanol、pepostanol、燕麦甾烷醇、异燕麦甾烷醇、fecostanol和pollinastastanol。

27.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾醇衍生物或者甾烷醇衍生物：脂族酯、芳族酯、酚酸酯、肉桂酸酯、阿魏酸酯、糖苷、酰化的糖苷和酰基糖苷。

28.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是具有一种或者多种下式的、包括甾醇或者甾烷醇的一种或者多种化合物，包括其生物学上可接受的盐：

29.权利要求28的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是抗坏血酸基甾烷醇基磷酸二钠组合物，其包括抗坏血酸基菜油甾烷醇基磷酸二钠和抗坏血酸基谷甾烷醇基磷酸二钠。

30.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是羟基取代的氮杂环丁酮。

31.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是下式表示的羟基取代的氮杂环丁酮化合物，或其生物学上可接受的盐：

其中：Ar₁和Ar₂独立地选自芳基和R₄取代的芳基；

Ar₃是芳基或者R₅取代的芳基；

R₁和R₃独立地选自氢、低级烷基和芳基；

R₅是1-5取代基，独立地选自--OR₆、--O(CO)R₆、--O(CO)OR₉、--O(CH₂)_1-5OR₆、--O(CO)NR₆R₇、--NR₆R₇、--NR₆(CO)R₇、-NR₆(CO)OR₉、--NR₆(CO)NR₇R₈、--NR₆SO₂R₉、--COOR₆、--CONR₆R₇、-COR₆、-SO₂NR₆R₇、S(O)0-2R₉、--O(CH₂)_1-10--COOR₆、--O(CH₂)_1-10CONR₆R₇、-(低级链烯基)COOR₆和--CH＝CH--COOR₆；

R₉是低级烷基、芳基或者芳基取代的低级烷基。

32.权利要求31的方法，其中，在该化合物中，Ar₁是苯基或者R₄取代的苯基，Ar₂是苯基或者R₄取代的苯基，并且Ar₃是R₅取代的苯基。

33.权利要求31的方法，其中，在该化合物中，Ar₁是R₄取代的苯基，其中R₄是卤素；Ar₂是R₄取代的苯基，其中R₄是卤素或者--OR₆，其中R₆是低级烷基或者氢；并且Ar₃是R₅取代的苯基，其中R₅是--OR₆，其中R₆是低级烷基或者氢。

34.权利要求31的方法，其中，在该化合物中，X、Y和Z分别是--CH₂--；R₁和R₃分别是氢；R和R₂分别是--OR₆，其中R₆是氢；并且m、n、p、q和r之和是2、3或者4。

35.权利要求31的方法，其中，在该化合物中，m、n和r分别是0，q是1并且p是2。

36.权利要求31的方法，其中，在该化合物中，p、q和n分别是0，r是1，并且m是2或者3。

37.权利要求31的方法，其中，该化合物选自：

rel 3(R)-(2(R)-羟基-2-苯基乙基)-4(R)-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2-氮杂环丁酮；

rel 3(R)-(2(R)-羟基-2-苯基乙基)-4(S)-(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2-氮杂环丁酮；

38.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是雄甾烷和/或雄甾烯衍生物，其中雄甾烷和/或雄甾烯与抗坏血酸偶合，并由一个或多个以下通式表示：

39.权利要求38的方法，其中，偶合到雄甾烷或者雄甾烯家族化合物的抗坏血酸基部分分别选自一种或者多种以下结构：

其中，M⁺表示任何金属、碱土金属或者碱金属。

40.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是胆汁酸转运或者再吸收的抑制剂，并选自所有回肠、顶端和肝脏转运的抑制剂。

41.一种逆转动物细胞显示的多抗药性表型的方法，包括使细胞暴露于有效量的至少一种胆固醇吸收抑制剂。

42.权利要求41的方法，其中，该动物细胞是由于多抗药性基因过度表达而对化学治疗剂不敏感的肿瘤细胞。

43.权利要求41的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是天然或者人工合成形式的甾醇或甾烷醇或其混合物。

44.权利要求41的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是以任何一种异构体形式的甾醇或者甾烷醇或其混合物。

45.权利要求41的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾醇：谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇(包括二氢菜子甾醇)、链甾醇、chalinosterol、多孔甾醇、γ-谷甾醇、麦角甾醇、粪甾醇、codisterol、异岩藻甾醇、岩藻甾醇、贞桐甾醇、nervisterol、烯胆甾醇、星鱼甾醇、菠菜甾醇、chondrillasterol、peposterol、燕麦甾醇、异燕麦甾醇、fecosterol和pollinastasterol。

46.权利要求41的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾烷醇：谷甾烷醇、菜油甾烷醇、豆甾烷醇、菜子甾烷醇(包括二氢菜子甾烷醇)、链甾烷醇、chalinostanol、多孔甾烷醇、γ-谷甾烷醇、麦角甾烷醇、粪甾烷醇、codistanol、异岩藻甾烷醇、岩藻甾烷醇、贞桐甾烷醇、nervistanol、烯胆甾烷醇、星鱼甾烷醇、菠菜甾烷醇、chondrillastanol、pepostanol、燕麦甾烷醇、异燕麦甾烷醇、fecostanol和pollinastastanol。

47.权利要求41的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾醇衍生物或者甾烷醇衍生物：脂族酯、芳族酯、酚酸酯、肉桂酸酯、阿魏酸酯、糖苷、酰化的糖苷和酰基糖苷。

48.权利要求41的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是具有一种或者多种下式的、包括甾醇或者甾烷醇的一种或者多种化合物，包括其生物学上可接受的盐：

49.权利要求48的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是抗坏血酸基甾烷醇基磷酸二钠组合物，其包括抗坏血酸基菜油甾烷醇基磷酸二钠和抗坏血酸基谷甾烷醇基磷酸二钠。

50.权利要求41的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是羟基取代的氮杂环丁酮。

51.权利要求41的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是下式表示的羟基取代的氮杂环丁酮化合物，或其生物学上可接受的盐：

其中：Ar₁和Ar₂独立地选自芳基和R₄取代的芳基；

Ar₃是芳基或者R₅取代的芳基；

R₁和R₃独立地选自氢、低级烷基和芳基；

R₉是低级烷基、芳基或者芳基取代的低级烷基。

52.用于癌症治疗的组合物，其含有至少一种化学治疗剂和至少一种胆固醇吸收抑制剂。

53.权利要求52的组合物，其中，该胆固醇吸收抑制剂是天然或者人工合成形式的甾醇或甾烷醇或其混合物。

54.权利要求52的组合物，其中，该胆固醇吸收抑制剂是以任何一种异构体形式的甾醇或者甾烷醇或其混合物。

55.权利要求52的组合物，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾醇：谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇(包括二氢菜子甾醇)、链甾醇、chalinosterol、多孔甾醇、γ-谷甾醇、麦角甾醇、粪甾醇、codisterol、异岩藻甾醇、岩藻甾醇、贞桐甾醇、nervisterol、烯胆甾醇、星鱼甾醇、菠菜甾醇、chondrillasterol、peposterol、燕麦甾醇、异燕麦甾醇、麦角甾醇和pollinastasterol。

56.权利要求52的组合物，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾烷醇：谷甾烷醇、菜油甾烷醇、豆甾烷醇、菜子甾烷醇(包括二氢菜子甾烷醇)、链甾烷醇、chalinostanol、多孔甾烷醇、γ-谷甾烷醇、麦角甾烷醇、粪甾烷醇、codistanol、异岩藻甾烷醇、岩藻甾烷醇、贞桐甾烷醇、nervistanol、烯胆甾烷醇、星鱼甾烷醇、菠菜甾烷醇、chondrillastanol、pepostanol、燕麦甾烷醇、异燕麦甾烷醇、fecostanol和pollinastastanol。

57.权利要求52的组合物，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾醇衍生物或者甾烷醇衍生物：脂族酯、芳族酯、酚酸酯、肉桂酸酯、阿魏酸酯、糖苷、酰化的糖苷和酰基糖苷。

58.权利要求52的组合物，其中，该胆固醇吸收抑制剂是具有一种或者多种下式的、包括甾醇或者甾烷醇的一种或者多种化合物，包括其生物学上可接受的盐：

59.权利要求52的组合物，其中，该胆固醇吸收抑制剂是抗坏血酸基甾烷醇基磷酸二钠组合物，其包括抗坏血酸基菜油甾烷醇基磷酸二钠和抗坏血酸基谷甾烷醇基磷酸二钠。

60.权利要求52的组合物，其中，该胆固醇吸收抑制剂是羟基取代的氮杂环丁酮。

61.一种药盒，其包括至少两种单独成分：

a)含有至少一种胆固醇吸收抑制剂的组合物；和

b)含有至少一种化学治疗剂的组合物；

以及描述施用每种组合物的说明书。

62.一种抑制在动物细胞中产生多抗药性基因表达的蛋白质的方法，包括给予动物有效量的至少一种胆固醇吸收抑制剂。

63.权利要求62的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是天然或者人工合成形式的甾醇或甾烷醇或其混合物。

64.权利要求62的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是以任何一种异构体形式的甾醇或者甾烷醇。

65.权利要求62的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自以下的甾醇：谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇(包括二氢菜子甾醇)、链甾醇、chalinosterol、多孔甾醇、γ-谷甾醇、麦角甾醇、粪甾醇、codisterol、异岩藻甾醇、岩藻甾醇、贞桐甾醇、nervisterol、烯胆甾醇、星鱼甾醇、菠菜甾醇、chondrillasterol、peposterol、燕麦甾醇、异燕麦甾醇、麦角甾醇和pollinastasterol。

66.权利要求62的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自以下的甾烷醇：谷甾烷醇、菜油甾烷醇、豆甾烷醇、菜子甾烷醇(包括二氢菜子甾烷醇)、链甾烷醇、chalinostanol、多孔甾烷醇、γ-谷甾烷醇、麦角甾烷醇、粪甾烷醇、codistanol、异岩藻甾烷醇、岩藻甾烷醇、贞桐甾烷醇、nervistanol、烯胆甾烷醇、星鱼甾烷醇、菠菜甾烷醇、chondrillastanol、pepostanol、燕麦甾烷醇、异燕麦甾烷醇、fecostanol和pollinastastanol。

67.权利要求62的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是选自下组的甾醇衍生物或者甾烷醇衍生物：脂族酯、芳族酯、酚酸酯、肉桂酸酯、阿魏酸酯、糖苷、酰化的糖苷和酰基糖苷。

68.权利要求62的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是具有一种或者多种下式的、包括甾醇或者甾烷醇的一种或者多种化合物，包括其生物学上可接受的盐：

69.权利要求68的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是抗坏血酸基甾烷醇基磷酸二钠组合物，其包括抗坏血酸基菜油甾烷醇基磷酸二钠和抗坏血酸基谷甾烷醇基磷酸二钠。

70.权利要求62的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是羟基取代的氮杂环丁酮。

71.权利要求62的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是下式表示的羟基取代的氮杂环丁酮化合物，或其生物学上可接受的盐：

其中：Ar₁和Ar₂独立地选自芳基和R₄取代的芳基；

Ar₃是芳基或者R₅取代的芳基；

R₁和R₃独立地选自氢、低级烷基和芳基；

R₉是低级烷基、芳基或者芳基取代的低级烷基。

72.权利要求71的方法，其中，在该化合物中，Ar₁是苯基或者R₄取代的苯基，Ar₂是苯基或者R₄取代的苯基，并且Ar₃是R₅取代的苯基。

73.权利要求71的方法，其中，在该化合物中，Ar₁是R₄取代的苯基，其中R₄是卤素；Ar₂是R₄取代的苯基，其中R₄是卤素或者--OR₆，其中R₆是低级烷基或者氢；并且Ar₃是R₅取代的苯基，其中R₅是--OR₆，其中R₆是低级烷基或者氢。

74.权利要求71的方法，其中，在该化合物中，X、Y和Z分别是--CH₂--；R₁和R₃分X别是氢；R和R₂分别是--OR₆，其中R₆是氢；并且m、n、p、q和r之和是2、3或者4。

75.权利要求71的方法，其中，在该化合物中，m、n和r分别是0，q是1并且p是2。

76.权利要求71的方法，其中，在该化合物中，p、q和n分别是0，r是1，并且m是2或者3。

77.权利要求71的方法，其中，该化合物选自：

78.权利要求62的方法，其中，该胆固醇是雄甾烷和/或雄甾烯衍生物，其中雄甾烷和/或雄甾烯与抗坏血酸偶合，并由一个或多个以下通式表示：

79.权利要求78的方法，其中，偶合到雄甾烷或者雄甾烯家族化合物的抗坏血酸基部分分别选自一种或者多种以下结构：

其中，M⁺表示任何金属、碱土金属或者碱金属。

80.权利要求62的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂是胆汁酸转运或者再吸收的抑制剂，并选自所有回肠、顶端和肝脏转运的抑制剂。

81.权利要求1的方法，其中，该多抗药性基因选自以下的一种或者多种：ABCB1(MDR-1)；ABCA2(ABC2)；ABCB2(TAP)；ABCB3(TAP)；ABCC1(MRP-1)；和ABCC3(MRP-3)。

82.权利要求22的方法，其中，该多抗药性基因选自以下的一种或者多种：ABCB1(MDR-1)；ABCA2(ABC2)；ABCB2(TAP)；ABCB3(TAP)；ABCC1(MRP-1)；和ABCC3(MRP-3)。

83.权利要求41的方法，其中，该多抗药性基因选自以下的一种或者多种：ABCB1(MDR-1)；ABCA2(ABC2)；ABCB2(TAP)；ABCB3(TAP)；ABCC1(MRP-1)；和ABCC3(MRP-3)。

84.权利要求52的组合物，其中，该多抗药性基因选自以下的一种或者多种：ABCB1(MDR-1)；ABCA2(ABC2)；ABCB2(TAP)；ABCB3(TAP)；ABCC1(MRP-1)；和ABCC3(MRP-3)。

85.权利要求62的方法，其中，该多抗药性基因选自以下的一种或者多种：ABCB1(MDR-1)；ABCA2(ABC2)；ABCB2(TAP)；ABCB3(TAP)；ABCC1(MRP-1)；和ABCC3(MRP-3)。

86.权利要求1的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂以脂质体形式提供。

87.权利要求22的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂以脂质体形式提供。

88.权利要求41的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂以脂质体形式提供。

89.权利要求52的组合物，其中，该胆固醇吸收抑制剂以脂质体形式提供。

90.权利要求61的药盒，其中，该胆固醇吸收抑制剂以脂质体形式提供。

91.权利要求62的方法，其中，该胆固醇吸收抑制剂以脂质体形式提供。