CN1390126A - 治疗和/或抑制体重增加的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在易感温血动物(包括人类)中肥胖、腹部脂肪和胰岛素耐药性的医学治疗和/或预防的新方法,该方法包括施用选择性雌激素受体调节剂(SERM类物质)。还公开了一种SERM与一定量雌激素或性甾类化合物前体(其选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾－5－烯－3b,17b－二醇和体内转化为一种前述前体或雌激素)的联合。

Description

治疗和/或抑制体重增加的方法
本申请要求1999年7月6日提交的U.S.临时申请第60/142,407号的优先权。
发明领域
本发明涉及一种治疗和/或预防肥胖(尤其是腹部肥胖)的方法，并且涉及治疗或抑制包括人体在内的易感温血动物中获得异常胰岛素耐药性的方法。所述的方法包括施用下述通式I的化合物或其药物组合物。在其他实施方式中，所述的方法包括施用与性类固醇前体联合的选择性雌激素受体调节剂(“SERM”)。
相关技术背景
肥胖，一种以身体脂肪过多为特征的病症，被公认为是多种疾病的危险因素，这些疾病诸如是心血管疾病、高血压、糖尿病和乳腺癌。此外，个人外表在大多数人的整体健康形象中起着重要作用。
肥胖的普通疗法，如多种饮食(包括节食性饮食)、体重减轻计划和运动对于许多人来说产生不同程度的成功效果。然而，对于那些采用现有技术没有显著效果的人来说仍然需要其他技术，或者用来作为现有技术的补充。
近来，公开了一些用于治疗或预防肥胖的雌激素激动剂/拮抗剂：欧洲专利申请号EP 0 659 423 A1中的雷洛昔芬(raloxifene)及其有关化合物；欧洲专利申请号EP 0 716 855 A2中具有苯并噻吩母核的的雌激素激动剂；国际申请号PCT/DK96/00011中的3，4-二苯基色满类化合物；国际申请号PCT/IB95/00286中的萘基(naphtyl)雌激素激动剂/拮抗剂。
另据报导另一种雌激素激动剂/拮抗剂他莫昔芬在雌性大鼠中可以预防舒必利引起的体重增加(Baptista等，Pharmacol.，Biochem.Behav.(1997)，57(1/2)，215-222)。也有报导称，他莫昔芬在大鼠中可以模拟雌二醇对食物摄取量、体重和机体组成的作用(Wade等，American Journal of Physiology 1993，33(6)，R1219-1223)。
DHEA在肥胖的治疗和/或预防中也具有有益效果。在老龄Sprague-Dawley大鼠中，Schwartz(在Kent，Geriatrics 37：157-160，1982中)已经观察到在DHEA的作用下体重由600减轻到550g，同时不影响食物摄取量。Schwartz(Cancer 39：1129-1132，1979)观察到给予了DHEA(450mg/kg，每周3次)的C3H小鼠体重明显降低且变得比对照动物衰老，具有较少脂肪，而且更加活跃。体重得以减轻，而不需丧失食欲或节食。此外，DHEA能够预防饲养动物导致其在成年期变肥胖的体重增加(在Kent，Geriatrics 37：157-160，1982中)。
尽管增加了食物摄取量，DHEA对瘦型Zucher大鼠的给药可以降低体重增量。因此，经处理动物具有较小的脂肪垫，总之，这表明DHEA可以加强食物代谢，由此降低体重和脂肪蓄积(Svec等，Proc.2nd Int.Conf.Cortisol and Anti-Cortisols，Las Vegas，Nevada，USA，p.56 abst.，1997)。
在AVY突变型小鼠(Yen等，Lipids 12：409-413，1977)和Zucker大鼠(Cleary和Zisk，Fed.Proc.42：536，1983)中发现肥胖得到改善。DHEA处理的C3H小鼠具有比对照物更加年轻的外表(Schwartz，Cancer Res.39：1129-1132，1979)。
腹部脂肪与冠状乳腺病的代谢危险因子有关联(Imbault等Metabolism 1999，48(3)，355-62；Ledoux等(CMAJ 1997，157.Suppl.1；46-53)。
发明概述
所以，本发明的一个目的在于减少脂肪组织，尤其是腹部脂肪。
本发明的另一目的是降低冠心病和其他以肥胖或过度脂肪组织为危险因素的疾病或病症的危险性。
在一实施方式中，本发明提供一种新的治疗或抑制包括人类在内的易感温血动物中体重增加的方法，该方法包括给需要这种治疗或抑制的对象施用治疗有效量的含或不含有药学稀释赋形剂或载体的至少一种通式I的化合物：
Figure A0081247400201
其中R1和R2独立地选自氢、羟基、-OM(M选自直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C3-C4链烯基、直链或支链C3-C4炔基)和体内可转化为羟基的部分；
其中G是-H或-CH3；和
其中R3是选自吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代和NRaRb(Ra和Rb独立地是氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C3-C6链烯基和直链或支链C3-C6炔基)的基团。
在另一实施方式中，施用选择性雌激素受体调节剂或其可药用盐以减少腹部脂肪或降低腹部脂肪的蓄积。
在另一实施方式中，除了选择性雌激素受体调节剂(SERM)以外施用性类固醇前体(如脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇)可用于治疗肥胖或用于抑制体重增加。相信年龄等于或大于50岁的人群应对该联合疗法反应良好，这可能是由于前体的水平会随着年龄趋于不期望的降低。
所以，在该方面，本发明提供一种治疗肥胖或抑制体重增加的方法，该方法包括给需要上述抑制或治疗的对象施用治疗有效量的含或不含药学稀释剂或载体的至少一种SERM和有效量的至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇的性类固醇前体和体内可转化为任何上述前体的化合物。
另一方面，本发明提供一种治疗或减小产生胰岛素耐药性的危险的方法，该方法包括给需要这种治疗或减小的对象施用治疗有效量的至少一种SERM。在一些实施方式中，有效量的至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇和体内转化为它们的化合物的性类固醇前体也成为该联合疗法的组成部分。
另一方面，本发明提供一种治疗肥胖的试剂盒，其包含第一容器和第二容器，该第一容器包含至少一种SERM，并且该第二容器包含至少一种性类固醇前体，所述的性类固醇前体选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇和体内可转化为它们的化合物。
也可以在一个或多个容器中提供药学赋形剂载体或稀释剂，并且可以包括本领域中已知的防腐剂和其他添加剂。上述物质也可以与本发明多种实施方式中所用的任何活性成分包含在一起。
在此所用的选择性雌激素受体调节剂(SERM)是指在乳房组织中直接或者通过其活性代谢物起雌激素受体拮抗剂作用(“抗雌激素”)，而且对机体脂肪、骨组织和血清胆固醇水平产生雌激素样作用(即降低血清胆固醇)的化合物。在体外或人体中或大鼠乳腺组织中作为雌激素受体拮抗剂发挥作用的非甾类化合物可能会具有SERM的作用(尤其是如果该化合物作为抗雌激素对人体乳腺癌细胞起作用)。我们试验并发现的可作为SERM发挥作用的非甾类抗雌激素包括EM-800、EM-652、EM-652.HCl(EM-01538)、雷洛昔芬、他莫昔芬、艾多昔芬、托立美芬(Torimefene)、LY353381、LY335563、GW5638和屈洛昔芬(下文将作更加详细的描述)。按照本发明的任意实施方式，当作为抗雌激素使用时，SERM类物质适宜采取现有技术中已知的相同剂量给药。
不受任何理论地约束，SERM类物质，其中许多优选带有两个经1或2个碳原子连接的芳环，被认为可借助于该分子的上述部分与雌激素受体相互作用，这些部分可以被受体很好识别。所述的SERM类物质也带有侧链，其可以选择性地在乳腺和子宫内膜组织中引起拮抗特性但对其他组织、尤其是骨骼没有明显的拮抗特性。所以，SERM类物质可以在乳腺和子宫内膜中作为抗雌激素发挥预期作用，同时对机体脂肪具有令人惊奇的且为人们所期望的雌激素样活性。
本发明还包括按期望抑制附加体重的增加或如愿地减轻体重，即使无法达到正常体重。
在此所用的术语“肥胖”是指导致体重增加的脂肪组织的过量。本发明的预防和治疗方法包括抑制体重增加并诱导体重减轻。本发明包括通过使肥胖者体重降低至(并维持在)正常来治疗肥胖的方法。本发明也包括对于容易获得该疾病的人发生肥胖的预防方法。需要本发明的患者包括那些超重(与医学上公认的标准比较)或处于超重危险下的对象。
按照本发明，SERM也可以用来降低血液甘油三酯水平。譬如，人们相信EM800(本文所述)对这个目的十分有效。
在另一实施方式中，本发明提供新的化合物和药物组合物。
需要这种治疗或减小上述疾病或病症的发病的危险的患者是指被诊断为患有上述疾病或容易患有上述疾病的对象。本发明尤其适合那些由于遗传、环境因素或其他公认危险因素获得本发明所涉及疾病的危险性比普通人群更高的个体。
除非另外指出，本发明活性化合物的优选剂量对于治疗和预防目来说是相同的。不论被治疗(或预防)的疾病如何，本发明所述各活性成分的剂量都相同。
虽然讨论了两种或多种不同的活性剂作为本发明联合疗法的组成部分(例如酶抑制剂和抗雄激素)，但可以施用多种不同的化合物而不是单一的具有多重活性的化合物。
除非另外指出，术语“化合物”和任何有关的分子结构可以包括其任何可能的为外消旋混合物形式或光学活性的立体异构体。
除非另外指出或从本文中明显看出，在此所述的剂量是指不受药学赋形剂、稀释剂、载体或其他成分影响的活性化合物的重量，尽管这些附加成分是按照期望包含在其中的，如本发明实施例所述。任何制药工业中常用的剂型(胶囊、片剂、注射等)皆适用于本发明，并且术语“赋形剂”、“稀释剂”或“载体”包括在工业中常与活性成分一起包含在所述剂型内的非活性成分。譬如，包括典型的胶囊、丸剂、肠溶包衣、固体或液体稀释剂或赋形剂、矫味剂、防腐剂等。
在一些实施方式中，采用了本发明活性成分的前药(即可体内转化为活性成分的化合物)。许多官能团在制药工业中已知可以在体内转化为本发明所述活性化合物的官能团。参见，例如《Textbook of DrugDesign & Development》，第五章“Design and Application ofProdrugs”，Bundgaard & Larsen，Ed.，Harwood Academic PublishersGmbH(Chur，Switzerland，1991)。前药常常能够为相应活性化合物提供更加良好的生物利用度、自身稳定性和/或制造的灵活性。
任何本发明所述的疗法中所用的活性成分均可以配制为药物制剂，所述的制剂中还含有一种或多种其他活性成分。另外，它们可以分别单独给药但足以及时同时奏效，最终使患者同时具有提高的血药水平或享受到各活性成分(或策略)的益处。譬如，在本发明的一些优选实施方式中，一种或多种活性成分被配制为一种药物组合物。在本发明的顺序实施方式中，提供一种包括至少两个独立容器的试剂盒，其中在至少两个独立容器的内含物中，至少一个容器的内含物在其所含有的活性成分上完全或部分不同于至少另一容器的内含物。本发明的联合疗法中采用了两个或多个不同的容器。本文所述的联合疗法还包括所述联合疗法中的一种活性成分在制造用于治疗(或预防)所述疾病的药物中的应用，其中的治疗或预防进一步包含该联合的另一种活性成分或策略。
腹部脂肪被认为不同于全身性肥胖，并且可以在不存在全身性肥胖的情况下出现。还可以肯定它很大程度上是心脏疾病的一种危险因子。腹部脂肪对本发明反应良好。
本发明的优选SERM类物质，如上面式I的那些化合物，在子宫内膜中没有不利的雌激素效应，这对于一些现有方法中所用的SERM疗法是一个非常重大的改进。
本发明所用的SERM类物质有益于降低血液甘油三酯以及胰岛素耐药性。
在本发明的优选实施方式中，SERM的作用通过DHEA或相似的性类固醇前体来增强。
不受任何理论的约束，对于通过联合SEMR类物质和前体来获得协同作用的一种解释是它们的作用机理至少部分不同。譬如，DHEA可以增强食物新陈代谢但不抑制食欲，EM-652.HCl(一种SERM)可以抑制食物摄取量。
附图简述
图1.表示用增加剂量(0.01、0.03、0.1、0.3、1mg/kg，口服，每天1次)的SERM类物质EM-800、雷洛昔芬、他莫昔芬和一种无活性对映异构体EM-776(EM-800的对映异构体)对卵巢切除大鼠35周治疗的全身脂肪的影响。数据表示为平均值±SEM.**：P＜0.01试验相对于各自的对照。
图2.表示20天的治疗对完整大鼠、卵巢切除大鼠和卵巢切除且用SERM EM-652.HCl或雌二醇处理的大鼠中体重增量(A)、蛋白质增量(B)和脂肪增量(C)的影响。数据以克(g)表示为平均值±SEM。*p＜0.05相对于完整组；p＜0.05相对于OVX+E2组(只相对于EM-652.HCl组)。
图3.表示20天的处理对完整大鼠、卵巢切除大鼠和卵巢切除且用EM-652.HCl或雌二醇处理的大鼠中的累积食物摄取量的影响。数据以克(g)表示。
图4.表示20天的处理在完整大鼠、卵巢切除大鼠和卵巢切除且用EM-652.HCl或雌二醇处理的大鼠中对于作为蛋白质的机体能量(A)和作为脂肪的机体能量(B)的影响。数据以千焦耳(Kj)计，表示为平均值±SEM；*p＜0.05相对于完整组；p＜0.05相对于OVX+E2组(只相对于EM-652.HCl组)。
图5.表示20天的处理在完整大鼠、卵巢切除大鼠和卵巢切除且用EM-652.HCl或雌二醇治疗的大鼠中对于血清胰岛素水平和血清葡萄糖水平的影响。数据以nmol/L计表示为平均值±SEM；*p＜0.05相对于完整组。
图6.表示为20天的处理在完整大鼠、卵巢切除大鼠和卵巢切除且用EM-652.HCl或雌二醇治疗的大鼠中对于白脂肪组织参数：腹股沟(A)和腹膜后(C)脂肪组织重量(数据以克(g)计表示为平均值±SEM)、腹股沟(B)和腹膜后(D)脂肪组织脂蛋白脂酶活性(数据以？U/g蛋白计表示为平均值±SEM；*p＜0.05相对于完整组；p＜0.05对OVX+E2组(只对EM-652.HCl组))的影响。
图7.表示20天的处理对肩胛间褐色脂肪组织参数：(A)褐色脂肪组织重量(数据以克(g)计表示为平均值±SEM；*p＜0.05相对于完整组；p＜0.05对OVX+E2组(只对EM-652.HCl组))；(B)蛋白质含量(数据以组织重量的百分率计表示为平均值±SEM；*p＜0.05相对于完整组；p＜0.05对OVX+E2组(只对EM-652.HCl组))；(C)脂蛋白脂酶活性(数据以？U/g蛋白计)的影响。
图8.表示20天的处理在完整大鼠、卵巢切除大鼠和卵巢切除且用雌二醇和EM-652.HCl治疗的大鼠中对比目鱼肌重量(数据以克(g)计表示为平均值±SEM)和脂蛋白脂酶(数据以？U/g蛋白计表示为平均值±SEM；*p＜0.05对完整组)的影响。
发明详述
优选施用一种药物组合物，其中含有可药用赋形剂、稀释剂或载体以及治疗有效量的具有下面通式I的选择性雌激素受体调节剂：
其中R1和R2独立地选自氢、羟基、-OM(M选自直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C3-C4链烯基、直链或支链C3-C4炔基)和体内可转化为羟基的部分；
其中G是-H或-CH3；
其中R3选自吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代和NRaRb(Ra和Rb独立地是氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C3-C6链烯基和直链或支链C3-C6炔基)，和性类固醇前体选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇和体内转化为两者的化合物。
上式I的SERM产生不同于现有技中已知SERM类物质的意外优越性，其对子宫内膜具有很小或没有雌激素效应。
优选本发明的SERM具有旋光性，并且含有50％以上的在碳2上具有绝对构型S的立体异构体化合物。
鉴于稳定性和水溶性(生物利用度)的原因，还优选本发明的SERM是式I的化合物与酸形成的盐，所述的酸选自乙酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、富马酸、氢碘酸、氢溴酸、氢氯酸、氢氯噻嗪酸(hydrochlorothiazide acid)、羟萘甲酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、棕榈酸、新戊酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对苯二甲酸、对甲苯磺酸和戊酸。
本发明的一种优选化合物是PCT/CA96/00097(WO96/26201)中报导的EM-800。EM-800的分子结构是：
本发明的另一更优选的化合物是EM-652.HCl(也称作EM-01538)：
Figure A0081247400262
EM-652.HCl提供了其他SERM类物质(如EM-800)所没有的另外的优越性，这是由于它不含有可以增强使血清肉毒碱水平降低的危险性的新戊酰基。
本发明的其他优选SERM类物质包括他莫昔芬((Z)-2-[4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)]-N，N-二甲基乙胺)(购自Zeneca，UK)、托瑞米芬(购自Orion-Farmos Pharmaceuticla，Finland或Schering-Plough)、屈洛昔芬和CP-336,156(顺-1R-[4’-吡咯烷基-乙氧基苯基]-2S-苯基-6-羟基-1，2，3，4，-四氢萘D-(-)-酒石酸盐)(Pfizer Inc.，USA公开在US5,889,042中)(也称作拉索昔芬(Lasofoxifene))、雷洛昔芬(EliLilly和Co.，USA)、LY335563和LY353381(Eli Lilly&Co.，USA公开在WO98/45287、WO98/45288和WO98/45286中)、艾多昔芬(SmithKline Beecham，USA)、来伏昔芬(Levormel oxifene)(3，4-反式-2，2-二甲基-3-苯基-4-[4-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基]-7-甲氧基色满)(Novo Nordisk，A/S，Denmark)，其由Shalmi等公开在WO97/25034、WO97/25035、WO97/25037、WO97/25038；和Korsgaard等WO97/25036)中，GW5638(由Willson等公开在Endocrinology，138(9)，3901-3911，1997中)、吲哚衍生物(由Miller等公开在EP0802183A1中)和TSE424，和由Wyeth Ayerst(USA)开发并公开在JP10036347(American home products corporation)中的ERA923，和WO97/32837中公开的非甾类雌激素衍生物。本发明的其他SERM物质公开在：WO99/07377；WO98/48806；EP0823437A2；EP0838464A1；EP0835867A1，EP0835868A1；EP0792641A1；EP0873992A1和EP0895989A1。
可以采用任何符合功效需要的SERM(如由制造商推荐用于骨质疏松症或乳腺癌的治疗和/或预防)。所属领域了解适用的剂量。可以按照本发明使用任何其他可商购的非甾类抗雌激素。也可以使用任何活性与SERM类物质(如雷洛昔芬)相似的化合物。
按照本发明，所施用的SERM适宜在经口服给药时以0.01-10mg/kg体重/天(优选0.05-1.0mg/kg)的剂量范围给药，并且60mg/天，尤其是20mg/天对于平均体重的个人来说是优选的；或者适宜在经非肠道给药(即肌肉内、皮下或经皮给药)时以0.003-3.0mg/kg体重/天(优选0.015-0.3mg/kg体重)的剂量范围给药，并且20mg/天，尤其是10mg/天对于平均体重的个人而言是优选的。优选SERM类物质与下述可药用稀释剂或载体一起给药。
优选的性类固醇前体是脱氢表雄酮(DHEA)(购自Diosynth Inc.，Chicago，Illinois，USA)、其前药(购自Steraloids，Wilton，NewHampshire，USA)、5-雄甾烯-3b，17b-二醇和其前药雄甾-5-烯-3b，17b-二醇3-乙酸酯和雄甾-5-烯-3b，17b-二醇二半琥珀酸酯(购自Steraloids，Wilton，New Hampshire USA)。
Figure A0081247400281
性类固醇前体可以配制为醇凝胶，其中含有2.0-10％的辛酸-癸酸甘油三酯(Neobee M-5)；10-20％己二醇；2.0-10％二甘醇一甲醚(Transutol)；2.0-10％的环甲基硅酮(Cyclomethicone)(Dow Corning345)；1.0-2％苄醇和1.0-5.0％的羟丙基纤维素(Klucel HF)。
载体(用于SERM或前体)也可以包括多种制药工业中常用的添加剂。譬如，芳香剂、抗氧剂、香料、胶凝剂、增稠剂(如羧甲基纤维素)、表面活性剂、稳定剂、润肤剂、着色剂和其他类似试剂可以存在。当活性成分经皮给药时，应改变在皮肤上涂敷的位点，从而避免过高的活性成分的局部浓度和性类固醇前体的雄激素代谢物可能对皮肤和皮脂腺的过度刺激。
在口服给药的药物组合物中，DHEA或其他前体优选以占购自组合物总重量5-98％(重量)的浓度存在，更优选50-98％(重量)，尤其是80-98％。单一前体如DHEA可以是唯一的活性成分，或者另外地，可以利用多种前体和/或其类似物(例如DHEA、DHEA-S、5-二醇的联合，或两种或多种可体内转化为DHEA、DHEA-S或5-二醇的化合物联合，或DHEA或5-二醇和一种或多种其可体内转化为DHEA或5-二醇的类似物的联合，等等)。DHEA的血液水平是剂量充分的最终标准，其考虑到吸收和代谢的个体差异。
更加可取地，主治临床医生尤其在治疗开始时应该监测个体患者的全身反应和DHEA的血清水平(与上述优选血清浓度比较)，同时监测患者对治疗的全身反应，当给药患者的代谢或对治疗的反应不适合时应根据需要调整剂量。
本发明的治疗适合无限延续。DHEA和/或5-二醇或其他前体的治疗将直接使DHEA水平保持在类似于绝经前妇女中自然存在的(血清浓度为4-10微克/升)或成年男子中自然存在(血清浓度为4-10微克/升)的范围内。
SERM化合物和/或性类固醇前体也可以经口服途径给药，并可以与常规赋形剂，如喷雾干燥的乳糖、微晶纤维素和硬脂酸镁一起配制在口服给药的片剂或胶囊中。
活性物质可以加工在片剂或糖衣剂片芯中，这可以通过与固体、粉状载体物质(如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸二钙)和粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、明胶或纤维素衍生物)混合来实现，也可以采取加入乳化剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、“Carbowax”或聚乙二醇。显然，在口服给药形式的情况中可以加入矫味物质。
另外，可以采用插式胶囊，如硬明胶的对插式胶囊，以及含有软化剂和增塑剂如甘油的密封软明胶胶囊。对插式胶囊含有优选为颗粒形式的活性物质，譬如与填充剂混合，所述的填充剂例如是乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉类(如土豆淀粉或支链淀粉)、纤维素衍生物或高分散硅酸类化合物。在软明胶胶囊中，活性成分适宜溶解或悬浮于适当液体中，如植物油或液态聚乙二醇类。
洗剂、软膏、凝胶或霜剂形式也可行，并且应该彻底擦涂到皮肤内，使皮肤上看不到过多的药物，同时不应该洗涤皮肤的该区域，直至大多数的透皮制剂已经适当存在至少4小时，更优选至少6小时。
按照已知技术透皮贴剂可以传递前体或SEEM。通常其敷用时间较长，例如1至4天，但活性成分通常与较小的表面面积相接触，使活性成分缓慢和恒定的传递。
迄今已经开发并使用的多种透皮给药体系适合于本发明活性成分的传递。释放的速率一般通过基质扩散来控制，或者利用活性成分穿过控制膜的通道来控制。
透皮装置的机械方面是所属技术领域熟知的并解释在如美国专利5,162,037、5,154,922、5,135,480、4,666,441、4,624,665、3,742,951、3,797,444、4,568,343、5,064,654、5,071,644、5,071,657中。其公开内容在此引入作为参考。其他背景技术由欧洲专利0279982和英国专利申请2185187公开。
所述的装置可以是任何该领域中已知的常规类型，包括胶粘基质和储库型透皮给药装置。所述的装置可以包含掺混纤维的含药物基质，其吸收活性成分和/或载体。在储库型装置中，储库可以由不渗透载体和活性成分的聚合物膜构成。
在透皮装置中，该装置本身使活性成分保持与指定的局部皮肤表面相接触。在这种装置中，对活性成分所用载体的粘度的考虑要比对霜剂或凝胶所用载体的粘度少。透皮装置的溶剂体系包括例如油酸、链醇乳酸酯和一缩二丙二醇(dipropylene glycol)，或所属领域已知的其他溶剂体系。活性成分可以溶解或悬浮在载体中。
为了与皮肤粘着，将透皮贴剂安放在外科用胶带上，在该胶带的中央带有一个穿孔。粘合剂适宜被一个释放衬垫覆盖以在使用之前起到保护作用。适合释放的典型材料包括聚乙烯和聚乙烯包衣纸，并且优选采用容易揭去的聚硅氧烷包衣。在应用于该装置时，直接揭下释放衬垫并使粘合剂附着在患者的皮肤上。在美国专利5,135,480中，其公开内容在此引入作为参考。Bannon等描述了另一种具有将装置固定在皮肤上的非胶粘器具的装置。
本发明的经皮或经粘膜给药体系也可以作为新的和改进了的给药体系用于肥胖的预防和/或治疗。
           本发明方法的有效性的实施例
                 实施例1使用本发明化合物的35周处理对于卵巢切除大鼠的总体脂肪和体重的
                 影响材料和方法动物和处理
在处理开始时选用10-12周龄的、体重约225-250g的雌性Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。试验开始之前令动物适应1周环境条件(温度：22±3℃；湿度：50±20％；12小时光照-12小时黑暗循环，在07：15h开始光照)。每笼笼养3只动物并允许其自由接近自来水和成丸的合格啮齿动物饲料(Lab Diet 5002，Ralston Purina，St-Louis，MO)。试验在加拿大动物保护委员会(Canadian Council on Animal Care)批准的设备中、按照有关“试验动物的保护和使用”的CCAC指南进行。
将276只大鼠随机分配为23组，各组有12只动物，这些组分别为：1)完整对照；2)OVX对照；3至7)OVX+EM-800(0.01、0.03、0.1、0.3或1mg/kg)；8至12)OVX+雷洛昔芬(0.01、0.03、0.1、0.3或1mg/kg)；13至17)OVX+他莫昔芬(0.01、0.03、0.1、0.3或1mg/kg)；18至22)OVX+EM-776(0.01、0.03、0.1、0.3或1mg/kg)；23)OVX+雌二醇(E2，植入物)。在研究的第一天，在异氟烷麻醉条件下对有关组的动物进行两侧卵巢切除(OVX)。将一个雌二醇(E2)的硅橡胶植入物皮下埋植在第13组的各动物的背侧区域。植入物具有下述的E2浓度和大小：E2(E2：胆甾醇(1∶100，w∶w))，0.5cm(长度)，0.125英寸(外径)和0.062英寸(内径)。在试验过程中，每月更换E2植入物。研究第2天开始用EM-800、雷洛昔芬、他莫昔芬和EM-776或载体(4％乙醇、4％聚乙二醇-600、1％明胶和0.9％NaCl)处理。通过口饲管法每天以0.5ml/只大鼠给予1次单独的适当化合物或载体，共37周。末次给药后约24小时，在异氟烷麻醉下将禁食过夜的动物于腹主动脉处通过放血处死。脂肪体组成
处理35周后，用双能X射线吸光分析法(dual energy X-ranabsorptiometry)(DEXA；QDR 4500A，Hologic，Waltham，MA)和局部高分辨扫描软件对异氟烷麻醉下的各个大鼠的全身骨骼及其右股骨进行扫描。用于全身的扫描场大小为30.492×17.912cm，分辨率为0.1512×0.0640cm且扫描速率为2.499mm/秒。测定全身的脂肪体组成。统计学分析
数据表示为平均值±SEM。按照Duncan-Kramer(1956)的多范围检验(multiple-range test)测定统计学显著性。结果
图1举例说明通过DEXA体内测量增加EM-800、雷洛昔芬、他莫昔芬和EM-776的日口服剂量对身体脂肪的作用。可以看到，EM-800在0.01mg/kg的最低剂量下使OVX诱导刺激的身体脂肪减少78％，雷洛昔芬的活性低于EM-800，而EM800的对映异构体EM-776不具有明显作用。在表1中，报告了EM-800或雷洛昔芬在卵巢切除大鼠中对体重的作用。将完整大鼠和卵巢切除对照大鼠进行比较。还可以发现，小剂量的EM-800对体重的控制与其非常高剂量的雷洛昔芬相似(例如0.03mg/kgEM-800获得与0.3mg/kg雷洛昔芬相似的结果)。两种物质在非常高的剂量下基本上逆转卵巢切除诱发的体重增加。
              表1
          组      尸体剖检时的体重
完整对照OVX对照OVX+EM-800(0.01mg/kg)″(0.03mg/kg)″(0.1mg/kg)″(0.3mg/kg)″(1mg/kg)OVX+雷洛昔芬(0.01mg/kg)″(0.03mg/kg)″(0.1mg/kg)″(0.3mg/kg)″(1mg/kg)          g356±16**491±16385±17**364±10**369±17**359±7**368±6**439±13*451±14*389±14**367±9**342±12**
                           实施例2
利用本发明化合物的11个月的联合治疗1. 试验材料1.1 试验化合物：
DHEA：购自Steraloids Inc.Wilton，NH.Lot：H137；
EM-800是在Mol.Endo.，CHUL.的实验室的UCPO部门合成的。1.2 载体
a) 明胶：Lab-Grade，ACP Chemicals Inc.，Montreal，Qc.Lot#F0195
b) 乙醇：Commercial Alcohols Inc.，Brampton，Ontario.Lot No.11296
c) 聚乙二醇-600(PEG-600)：Omega Chemical Company Inc.，Lévis，Quebec.Lot# ：00-0117-EZ
d) 普通盐水：0.9％氯化钠冲洗液USP.
Abbott Laboratories Limited，St-Laurent，Qc..
e) 丙二醇(1，2-丙二醇，PPG)：Sigma Chemical Co.，St-Louis，MO.
g) 载体1：4％ETOH-4％PEG-600-1％明胶-0.9％NaCl-H2O，用于皮下注射。
h) 载体2：50％ETOH-50％PPG用于局部涂敷。2.试验动物的说明：2.1 种类：褐家鼠(Rattus norvegicus)2.2 品种：Sprague-Dawley Rat(Crl：CD(SD)BR VAF/PlusTM)2.3 性别：雌性2.4 来源：Charles River Canada Inc.188 Lasalle RoadSt.Constant，Quebec1-800-561-49752.5 给药开始时的年龄：G18至29的大鼠为16周龄2.6 笼养和保持a) 笼养：将2-3只/笼的大鼠笼养在鞋盒笼中。全部笼子用笼标签清楚地标明方案号、组号和动物数量。b)研究期间，室内的环境条件应受到控制(目标条件：温度20至25℃；湿度：50±20％.)。光周期是12小时光照：12小时黑暗。c) 饮食和水：啮齿动物饲料(丸)，和自来水随意提供。2.7 适应期：至少2周。2.8 随机化：大鼠应在抵达时随机分配至各组。2.9 安死术的方法：异氟烷引起的全身麻醉。3. 方法和试验设计1 完整                              11大鼠/组2 OVX CONT                          共44只大鼠3 OVX+DHEA 12.5mg4 OVX+DHEA 12.5mg+EM-800(100μg)3.1 载体和试验品的制备a) EM-800的制备：将EM-800或其两者溶于ETOH∶PEG-600(1∶1)同时在Fisher ScientificStirring Hot Plate上搅拌，随后加入1％GNS至预定体积。
b) DHEA的制备：
通过搅拌将DHEA溶于50％ETOH、50％PPG中。3.2 动物的准备和处理：
动物每天一次按照6.1条所述进行处理。每天将体积为0.5ml的在50％ETOH和50％PPG中制备的DHEA给相应的动物透皮涂敷(P.C.)1次(I.D.)。EM-800在4％ETOH、4％PEG-600、1％明胶、0.9％NaCl中配制，并且每天以0.5ml的体积经皮下给相应组的动物施用1次(S.C.，I.D.)。如果没有用任何试验化合物皮下处理，则给该大鼠皮下注射0.5ml的载体1；并且如果没有用5-二醇或DHEA处理，则该大鼠局部涂敷0.5ml的载体2。3.3 观察和测量a) 临床观察：  每天至少观察1次各大鼠的全身表现。b) 体重：在给药方案开始和结束时以及在治疗期间每3个月称重大鼠一次。4. 结果：
如表2所示，使用日剂量为12.5mg DHEA的治疗的效果是使OVX刺激的体重降低87％。给药日剂量为100μg的EM-800产生协同作用并对OVX刺激的体重具有140％的抑制作用。
                    表2
              处理     总重量(g)
完整OVXOVX+DHEA(12.5mg/天/只大鼠)OVX+DHEA(12.5mg/天/只大鼠)+EM-800(100μg/天/只大鼠)   479.5+20.4567.4+25.7490.8±24.1444.5±20.5
                     实施例3
       采用EM-652.HCl的20天处理对卵巢切除大鼠中
              机体脂肪和体重参数的作用材料和方法动物和处理
在处理开始时选用10-12周龄的、体重约225-250g的雌性Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。试验开始之前令动物适应1周环境条件(温度：22±3℃；10小时光照-14小时黑暗循环，于06：00h进行光照)。将动物各自笼养在普通设计的不锈钢笼中且允许其自由获取自来水和高碳水化合物混合饲料(g/100g)：玉米淀粉，31.2；葡萄糖，31.2；酪蛋白，20.0；玉米油，6.4；dl-蛋氨酸，0.3；复合维生素，1.0；AIN-76复合矿物质，4.9和纤维，5.0。试验在加拿大动物保护委员会(CanadianCouncil on Animal Care)批准的设备中、按照有关“试验动物的保护和使用”的CCAC指南进行。
将40只大鼠随机分配为4组，每组10只动物，各组为：1)完整对照；2)OVX对照；3)OVX+EM-652.HCl(0.5mg/大鼠，～2.5mg/kg)；4)OVX+雌二醇(E2，植入物)。在研究的第一天，在异氟烷麻醉下将有关组的动物进行两侧卵巢切除。将一个雌二醇(E2)的硅橡胶植入物皮下埋植在第4组各动物的背侧区域。在预备试验中挑选的产生生理水平E2的植入物具有下述类固醇浓度和尺寸：E2∶胆固醇(1∶50，w∶w)，0.5cm(硅橡胶管内稀释类固醇的长度)，0.125英寸(硅橡胶管的外径)和0.062英寸(硅橡胶管的内径)。在皮下埋植于动物体内之前，将该雌二醇植入物在0.9％NaCl中37℃下浸渍过夜。自研究的第2天开始用单独的EM-652.HCl或载体(0.4％存在于水中的甲基纤维素)处理。通过口饲管每天给予1次0.5ml/只大鼠的化合物或载体，共20天。每2天记录1次体重和食物消耗量。
末次给药后约24小时，将过夜禁食的动物用氯胺酮-赛拉嗪麻醉并通过心脏穿刺取血。收集血液以及白色和褐色脂肪组织。能量、脂肪和蛋白质测量中的体重、食物摄取量和体重增量
按照Deshaies等Am.J.Physiol.，1997；273，E355-E362(1997)的方法测定能量、脂肪和蛋白质测量中的体重、食物摄取量和体重增量。组织的测量
按照Deshaies等Am.J.Physiol.，1997；273，E355-E362(1997)的方法测定脂蛋白脂酶活性。结果
从图2A和C中可以发现，使用EM-652.HCl的20天处理分别彻底逆转卵巢切除后所观察到的4倍体重增量和3倍脂肪增量，而这种作用对于蛋白质增加的影响较弱(图2B)。雌二醇具有更小的作用。图3表示累积食物摄取量。处理效果反映在对体重增加的影响。雌二醇部分防止由Ovx引起的食物摄取量的增高，而EM-652.HCl比雌二醇更加有效，以致能够使食物摄取量的值降低到低于完整动物的食物摄取量值。
表3中概括了能量平衡的主要变量。Ovx使可消化能量摄取量提高44％。雌二醇使Ovx动物中的能量摄取量减少，但总的能量摄取量仍然比完整动物的高17％，而EM-652.HCl彻底预防Ovx诱导的能量摄取量的增高。能量增加与食物摄取量成比例。另外，雌二醇可以减少能量的增加(达到与完整大鼠没有明显差别的水平)，但EM-652.HCl更加有效(明显不同于雌二醇)。
食物效率在Ovx作用下增高，在Ovx动物中被E2降低，并且被EM-652.HCl进一步降低。
卵巢切除后由蛋白质产生的机体能量的30％增量以及源自脂肪的机体能量的80％增量也通过EM-652.HCl的处理完全逆转，可以参见图4A和B。如5A所示，在Ovx动物中通过禁食性高胰岛素血症(其常常与胰岛素耐药性的程度成比例)和禁食性高血糖(胰岛素丧失维持正常血糖水平的有效性的一种反映)的存在可以证实胰岛素耐药性的产生。雌二醇和EM-652.HCl两者均可以预防这种Ovx诱导的胰岛素耐药性。
图6A和6C表示OVX增加了腹股沟和腹膜后脂肪组织的质量(量)，这是在全身脂肪中观察到变化的表现。EM-652.HCl的处理可以彻底消除这种增加。对于雌二醇，该效果较不显著。在反映脂蛋白脂酶活性的图6B和6D中也显示出了相同的模式。所述的酶可以调节血管内甘油三酯的水解，并由此调节脂肪酸向脂肪储备的转入。
褐色脂肪组织在啮齿动物中是主要的产热效应器。卵巢切除术在肩胛间褐色脂肪组织中表现出不同于白色脂肪组织的模式。褐色脂肪组织重量比在白色脂肪组织中观察到的增高2倍(图7A)。然而，蛋白质含量(图7B)和脂蛋白活性(图7C)在OVX后分别降低了33和30％。对于这三个参数，EM-652.HCl的处理可以完全逆转卵巢切除术的作用。
比目鱼肌的重量通常是机体的蛋白质量状况的一个良好指标。正如所期望的，图8显示出比目鱼肌的重量通过Ovx有所增高(食物摄取量的增加导致能量沉降成为脂肪和蛋白质的增多)。雌二醇和EM-652.HCl的处理都可以预防肌肉重量的增高。肌肉内的脂蛋白脂酶常常明确地与胰岛素敏感性相关(敏感性越好，肌肉内的脂蛋白脂酶越多)。Ovx使比目鱼肌中的脂蛋白脂酶活性降低，这是肌肉内胰岛素耐药性产生的一个间接证据。雌二醇和EM-652.HCl的处理皆可以预防肌肉内脂蛋白脂酶的减少。
                       表3能量平衡
  卵巢状态       完整处理           OVX
 无     E2    EM-652
可消化能量摄取量 4708(kJ)能量增量(kJ)   532表观能量消耗量  4176(kJ)食物效率     10.2(％) 6758a 5511a 4479b1677a 903    278b5081a 4609a 4201b24.1a 15.9   5.9b
a不同于完整，p＜0.05. b不同于卵巢切除+E2，p＜0.05.
可消化能量摄取量是指在20天的处理中摄取能量的总量(考虑不可消化的物质，如纤维)。
能量增量是在20天处理期间沉积为脂肪+蛋白质的千焦耳的量。
表观能量消耗量是指代谢需求和运动所耗费的能量的量(由能量摄取量和能量增量计算)。可以推测，当瘦肉质量越大时，该表观能量消耗量越高(如Ovx动物)。
食物效率是指被摄取能量沉积为脂肪和蛋白的效率(以沉积的kJ/摄取100kJ计)。
                     实施例4
         本发明的优选化合物的合成实施例(S)-(+)-7-羟基-3-(4’-羟苯基)-4-甲基-2-(4”-(2-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃盐酸盐EM-01538(EM-652.HCl)合成路线1
Figure A0081247400391
步骤A：BF3·Et2O，甲苯；100℃；1小时。步骤C：3，4-二氢吡喃，对甲苯磺酸一水合物，乙酸乙酯；25℃，氮
气下，16小时和随后在异丙醇中结晶。步骤D、E和F：(1)哌啶，甲苯，迪安斯塔克设备(Dean & Starkapparatus)，氮气下回流；(2)1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一碳-7-烯，DMF，回流3小时；(3)CH3MgCl，THF，-20至0℃且随后室温下24小时；步骤G、h：(1S)-(+)-10-樟脑磺酸，丙酮，水，甲苯，室温，48小时。步骤HH：95％乙醇，70℃，随后室温下3天。步骤HHR：母液的再循环和步骤HH的洗涤(S)-10-樟脑磺酸，回流；36小时，随后室温16小时。步骤I：(1)含水DMF，Na2CO3，乙酸乙酯；(2)乙醇，稀HCl；(3)水。2-四氢吡喃氧基-4-羟基-2’-(4”-四氢吡喃氧基苯基)苯乙酮(4)的合成
在约25℃下，将2，4-二羟基-2’-(4”-羟基苯基)苯乙酮3(97.6g，0.4mole)(购自Chemsyn Science Laboratories，Lenexa，Kansas)在3，4-二氢吡喃(218ml，3.39mole)和乙酸乙酯(520ml)中的溶液用对甲苯磺酸一水合物(0.03g，0.158mmole)处理。在氮气、无外部加热下将反应混合物搅拌约16小时。该混合物用碳酸氢钠(1g)和氯化钠(5g)在水(100ml)中的溶液洗涤。分离各相并且用盐水(20ml)洗涤有机相。各洗涤液再用50ml乙酸乙酯返提取。合并全部有机相且经硫酸钠过滤。
通过在大气压下蒸馏除去溶剂(约600ml)且加入异丙醇(250ml)。在大气压下再蒸馏溶剂(约300ml)且加入异丙醇(250ml)。在大气压下再蒸馏溶剂(约275ml)且加入异丙醇(250ml)。将该溶液冷却至约25℃同时搅拌，约12小时后，过滤结晶固体，用异丙醇洗涤并干燥(116.5g，70％)。4-羟基-4-甲基-2-(4’-[2”-哌啶子基]-乙氧基)苯基-3-(4-四氢吡喃基氧基)苯基-7-四氢吡喃氧基-色满(10)的合成  在氮气下用迪安斯塔克设备回流存在于甲苯(8L)中的2-四氢吡喃基氧基-4-羟基-2’-(4”-四氢吡喃氧基苯基)苯乙酮4(1kg，2.42mole)、4-[2-(1-哌啶子基)乙氧基]苯甲醛5(594g，2.55mole)(购自Chemsyn ScienceLaboratories，Lenexa，Kansas)和哌啶(82.4g，0.97mole)(购自Aldrich Chemical Company Inc.，Milwaukee，Wis.)，直至收集1当量的水(44mL)。
在大气压下通过蒸馏除去溶液中的甲苯(6.5L)。加入二甲基甲酰胺(6.5L)和1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一碳-7-烯(110.5g，0.726mole)。室温下将该溶液搅拌约8小时使查耳酮8异构为苯并二氢吡喃-4-酮9，随后加入水和冰(8L)和甲苯(4L)的混合物。分离各相且用水(5L)洗涤甲苯层。合并的洗涤水用甲苯提取(3×4L)。最后合并的甲苯提取液用盐水(3×4L)洗涤，在大气压下浓缩为5.5L，随后冷却至-10℃。
在氮气下、在持续的外部冷却和搅拌的同时，加入氯化甲基镁在THF(2.5L，7.5mole)(购自Aldrich Chemical Company Inc.，Milwaukee，Wis.)中的3M溶液，保持温度低于0℃。在加入全部格氏试剂后，撤去外部冷却，将该混合物温至室温。在此温度下搅拌该混合物约24小时。
将该混合物重新冷却至约-20℃，并且在持续的外部冷却和搅拌下缓慢加入饱和氯化铵溶液(200ml)，保持温度低于20℃。将该混合物搅拌2小时，随后加入饱和氯化铵溶液(2L)和甲苯(4L)且搅拌5分钟。分离各相，水层用甲苯(2×4L)提取。合并的甲苯提取液用稀盐酸洗涤直至该溶液变均匀，随后用盐水(3×4L)洗涤。最后在大气压下浓缩该甲苯溶液至2L。该溶液直接用于下一步。(2R，S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑酸盐(±12)的合成
向4-羟基-4-甲基-2-(4’-[-2”-哌啶子基]-乙氧基)-苯基-3-(4-四氢吡喃氧基)苯基-7-四氢吡喃氧基色满(10)的甲苯溶液中中加入丙酮(6L)、水(0.3L)和(S)-10-樟脑磺酸(561g，2.42mole)(购自Aldrich Chemical Company Inc.，Milwaukee，Wis.)。在氮气下将该混合物搅拌48小时，随后过滤固体的(2R，S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐(12)，用丙酮洗涤且干燥(883g)。该物质无需进一步纯化就可以用于下一步(HH)。(2S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐(13，(+)-EM-652(1S)-CSA盐)的合成
搅拌下将(2R，S)-7-羟基-3-(4’-羟苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐±12(759g)在95％乙醇中的混悬液加热至约70℃直至该固体溶解。将该溶液冷却至室温同时搅拌，随后接种少许(2S)-7-羟基-3-(4’-羟苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐13的结晶。室温下将该溶液共搅拌约三天。过滤结晶，用95％乙醇洗涤且干燥(291g，76％)。产物的非对映体过量(de)为94.2％且纯度为98.8％。(S)-(+)-7-羟基-3-(4’-羟苯基)-4-甲基-2-(4”-(2-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃盐酸盐EM-01538(EM-652，HCl)的合成
将化合物13(EM-652-(+)-CSA盐，500mg，0.726mmol)在二甲基甲酰胺(11μL，0.15mmol)中的混悬液用0.5M碳酸钠水溶液(7.0mL，3.6mmol)处理，并且搅拌15分钟。该混悬液用乙酸乙酯(7.0mL)处理且搅拌4小时。有机相用饱和碳酸钠水溶液(2×5mL)和盐水(1×5mL)洗涤，用硫酸镁干燥和浓缩。将所得粉色泡沫(EM-652)在乙醇(2mL)中的溶液用2N盐酸(400μL，0.80mmol)处理，搅拌1小时后，用蒸馏水(5mL)处理，并且搅拌30分钟。过滤所得的混悬液，用蒸馏水(5mL)洗涤，在空气中且在高真空下(65℃)干燥，得到乳油状粉末(276mg，77g)：细的米色粉末，扫描量热学：熔化峰开始于219℃，DH＝83J/g；[a]24 D＝154°(在甲醇中10mg/ml)。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.6(宽，2H，H-4)，1.85(宽，4H，H-3””和5)，2.03(s，3H，CH3)，3.0和3.45(宽，4H，H-2””和6””)，3.47(t，J＝4.9Hz，2H，H-3)，4.26(t，J＝4.9Hz，2H，H-2)，5.82(s，1H，H-2)，6.10(d，J＝2.3Hz，1H，H-8)，6.35(dd，J＝8.4，2.43Hz，1H，H-6)，6.70(d，J＝8.6Hz，2H，H-3’，和H-5’)，6.83(d，J＝8.7Hz，2H，H-3”和H-5”)，7.01(d，J＝8.5Hz，2H，H-2’和H-6’)，7.12(d，J＝8.4Hz，1H，H-5)，7.24(d，J＝8.6Hz，2H，H-2”和H-6”)；13C RMN(CD3OD，75MHz)dppm 14.84，22.50，23.99，54.78，57.03，62.97，81.22，104.38，109.11，115.35，116.01，118.68，125.78，126.33，130.26，130.72，131.29，131.59，134.26，154.42，157.56，158.96，159.33。元素组成：C，H，N，Cl：理论值；70.51，6.53，2.84，7.18，％，实测值：70.31，6.75，2.65，6.89％。
实施例5表明单独或与作为性激素前体的DHEA联合的本发明化合物EM-652.HCl在完整雌性大鼠中对LHRH-A诱导的脂肪增加的预防作用。可以看出，6个月的LHRH-A处理使完整雌性大鼠的机体脂肪的百分比明显增高58％，而采用EM-652.HCl或DHEA的伴随给药，这种增量分别只有35％和19％。利用这两种药物的联合，经LHRH-A处理后观察到没有脂肪增加。
在实施例6中，提供了20天期间对雌性大鼠中肥胖的抑制作用。卵巢切除术分别使全身脂肪的百分比和腹膜后脂肪组织的重量提高了20％和68％。EM-652.HCl、雌二醇、DHEA、或EM-652.HCl与DHEA的联合药物形式或EM-652.HCl与雌二醇的联合药物形式的施用可以预防这些增量，并且甚至可以减少机体脂肪和腹膜后脂肪组织，它们的施用使机体脂肪分别减少46％、46％、59％、56％和45％，同时使腹膜后脂肪组织分别减少59％、78％、75％、69％和68％。实施例7提供了类似的试验。在该情况中，肥胖的预防是在34周内继续，并且随后通过卵巢切除术使机体脂肪和腹膜后脂肪组织的百分比增加了约60％。通过乙炔雌二醇、雷洛昔芬(EM-1105)、EM-652.HCl(EM-1538)、DHEA或EM-652.HCl和DHEA联合药物形式的给药可以预防这种增加。
实施例8A(雄性)和8B(雌性)报告了本发明在肥胖的预防以及治疗中的有效性的数据。给瘦型和肥胖型Zucker雄性和雌性大鼠施用2.5mg/kg/天的EM-652.HCl，共20天。瘦型大鼠代表预防的模型，同时肥胖治疗的模型由业已肥胖的大鼠代表。表7提供雄性动物且表8提供雌性动物的有关体重增量、腹膜后脂肪组织和比目鱼肌中的脂蛋白脂酶活性以及胰岛素、葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯的血浆浓度的数据。(参见实施例3有关这些参数的意义)。
抗雌激素EM-652.HCl分别使瘦型雄性大鼠和肥胖型雄性大鼠的体重增量显著降低38％和35％，同时在两种性别中没有改变腹膜后白脂肪组织和比目鱼肌中的脂蛋白脂酶的活性。瘦型雄性、肥胖型雄性和瘦型雌性的血浆胰岛素分别降低35％、57％和48％，但在具有非常高水平的胰岛素的肥胖型雌性动物中，EM-652.HCl没有产生明显的作用。EM-652.HCl的给药还可以在肥胖组中降低较高的血浆胆固醇。EM-652.HCl的处理对血清葡萄糖没有影响。
实施例9中，EM-652.HCl、DHEA或这两者的联合对于接受含丰富蔗糖和脂肪饲料的完整或卵巢切除雌性大鼠的作用报告了有关的总重量、白色脂肪腹股沟和腹膜后组织、褐色脂肪组织、比目鱼肌、股外肌(VLM)的重量和脂蛋白脂酶活性。还报告了血浆胰岛素、葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯和莱普亭(leptin)以及肝脏的胆固醇和甘油三酯。
实施例10报告了在用文献所述的不同选择性雌激素受体调节剂(TSE424、拉索昔芬(Lasofoxifene)、LY353381和雷洛昔芬)以及用本发明的优选化合物EM-652.HCl的给药后对于大鼠中体重增加和脂质-脂蛋白代谢的影响。试验化合物经口饲管对卵巢切除雌性大鼠给药20天(0.5mg各个化合物/只大鼠)，所述的化合物存在于0.4％甲基纤维素中。用17β-雌二醇(E2)处理的完整对照、卵巢切除(OVX)对照和OVX大鼠用作参照。由卵巢切除术引起的体重和食物消耗量的增加通过用试验化合物处理被显著降低到在完整对照大鼠中所观察到的水平。通过上述处理可以降低白色脂肪腹股沟和腹膜后脂肪组织的重量和脂蛋白脂酶活性(除TSE424和LY353381对白色脂肪腹股沟组织以及TSE424和拉索昔芬对腹股沟组织的脂蛋白脂酶活性之外)，而褐色脂肪组织和肌肉似乎没有受到显著影响。可以看出，所有试验化合物可以有效降低胆固醇和甘油三酯的血浆浓度，但对葡萄糖水平没有影响。用EM-652.HCl、TSE424、拉索昔芬、LY353381和雷洛昔芬对OVX大鼠的处理可以减少血浆胰岛素。
实施例11和12中报告了已知抗雌激素类物质和本发明的化合物在雌激素依赖性细胞系中的体外效能。实施例10的表11中表示出抗雌激素对于人子宫内膜腺癌Ishikawa细胞中碱性磷酸酶的作用。抗雌激素的活性报告在最后一栏中，表示为1nM E2刺激的碱性磷酸酶的抑制作用的IC50(以nM计)，同时试验化合物的内在雌激素活性报告在倒数第二栏中，表示为1nM E2刺激的碱性磷酸酶活性的百分比。可以看出，最具活性的抗雌激素是EM-652.HCl、LY353381、雷洛昔芬、拉索昔芬和TSE424。其它物质的活性至少低10倍。然而，在最佳活性化合物中，一些化合物具有残留的不期望的雌激素活性：LY353381(16％)、拉索昔芬(18％)和雷洛昔芬(13％)。因此，现有数据表明，化合物EM-652.HCl和TSE424在Ishikawa细胞中没有表现出明显的雌激素活性。在实施例12中，本发明优选化合物EM-652.HCl与和TSE424在人乳腺癌MCF-7细胞中的比较显示出EM-652.HCl的优越性。所以，其活性比TSE424作为抗雌激素高4倍以上(抑制作用的EC50为0.8nM对3.7nM)(表12)。
实施例13中，评估了利用EM-652.HCl、TSE424或拉索昔芬的20天处理在市售啮齿动物饲料饲养的卵巢切除雌性大鼠中对于体重、腹膜后脂肪组织、子宫重量和胆固醇水平的作用。卵巢切除术分别引起全身体重和腹膜后脂肪组织重量增加17％和19％，而0.5mg的EM-652.HCl、TSE424或拉索昔芬的给药分别预防了64％、59％和127％的体重增加，并且使脂肪组织重量值低于那些在所有试验化合物的完整对照动物中所观察到的值。EM-652.HCl和TSE424的给药与OVX对照动物相比对子宫重量没有影响。然而，0.5mg的拉索昔芬可以引起子宫重量增加62％(p＞0.01)，但这种增加可以由2.5mg EM-652.HCl的同时给药彻底逆转，这暗示了拉索昔芬的雌激素活性。最后，EM-652.HCl、TSE424和拉索昔芬的给药可以完全预防OVX诱导的血清胆固醇水平的增高，并且使胆固醇值明显低于那些在完整对照动物中所观察到的值。
                    实施例5用EM-652.HCl和DHEA单独或联合给药的处理对于接受或不接受LHRH-A的完整雌性大鼠的脂肪蓄积的影响URMA-r-04-99
本研究的目的在于测定EM-652.HCl和脱氢表雄酮(DHEA)的处理在接受或未接受黄体化激素释放激素激动剂(LHRH-A，LHRH乙酰胺二乙酸酯)的完整雌性大鼠中对脂肪的作用。鉴于此目的，用或未用LHRH-A(1μg/只大鼠)处理的完整雌性大鼠每天接受EM-652.HCl(2.5mg/kg)和DHEA(100mg/kg)单独或联合的给药，共6个月。EM-652.HCl经口服给药，DHEA经局部施用，而LHRH-A经皮下注射。全部处理每天给药1次。试验动物：种类：褐家鼠(Rattus norvegicus)品系：Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD(SD)BR VAF/PlusTM)性别：雌性年龄：开始给药时，大鼠约10至12周龄。笼养和维持a) 笼养：
在适应期和研究期间将大鼠分别笼养在不锈钢笼内。b) 温度和湿度：
用计算机化自动系统连续记录大鼠室内的环境条件(温度，湿度)。目标条件是22±3℃和50±20％相对湿度。c) 光照-黑暗周期：
光周期是12小时的光照和12小时的黑暗。用有效计算机化自动系统连续记录这些参数。光照是自07：15至19：15。d) 饮食：
随意提供合格的啮齿动物饲料(Lab Diet#5002，丸)和自来水。大鼠在尸检前夜禁食(只能接近水)。随机化：
在适应期间随机将大鼠分配为各组。方法和试验设计试验组：
将120只大鼠分配为8组，每组15只动物，用于进行下面的研究：
处理         经口服施用的给药混悬液          经局部施用的给药溶液   LHRH-A(皮下注射)
    剂量(mg/kg)    体积/大鼠(ml)     剂量(mg/kg)   体积/只动物(ml) 剂量1μg/只动物
完整     -     0.5     -     0.5     -
EM-652.HCl     2.5     0.5     -     0.5     -
DHEA     -     0.5     100     0.5     -
DHEA+EM-652.HCl     2.5     0.5     100     0.5     -
LHRH-A     -     0.5     -     0.5     0.5ml
LHRH-A+EM-652.HCl     2.5     0.5     -     0.5     0.5ml
LHRH-A+DHEA     -     0.5     100     0.5     0.5ml
LHRH-A+DHEA+EM-652.HCl     2.5     0.5     100     0.5     0.5ml
试验品的制备：
使用浓度为1.0mg/ml的LHRH-A溶液。我们利用下面的载体稀释这种浓溶液(目的在于获得0.002mg/ml的终浓度)：含0.3％氯化钠和0.25％单碱价磷酸钠一水合物的水。用氢氧化钠(水溶液)调节pH至5.6-6.2。
除LHRH-A溶液之外，按照最近的体重(组的平均值)每2周一次制备给药混悬液/溶液。为了经口服施用EM-652.HCl，在首次给药日之前至少48小时向预先称重到玻璃瓶中的试验化合物加入载体(0.4％甲基纤维素)。为了确保给药混悬液的均匀性，在2-8℃下搅拌至少48小时。给药混悬液保存在2-8℃下。为了局部施用DHEA溶液，向DHEA中加入乙醇并搅拌该混合物直至DHEA溶解。随后，加入聚丙二醇且搅拌该溶液直至均匀。该给药溶液保存在2-8℃(一部分的溶液可以保存在室温下以便局部施用于动物)。为了皮下注射LHRH-A溶液，每个月用适当的载体制备浓溶液的稀释液一次。给药溶液保存在2-8℃。动物的准备：
在首次给药日之前和在研究期间根据需要，将一部分的背侧皮肤(约5×5cm)剃净用于DHEA的局部涂敷。给药：
试验化合物或载体的给药是在该方案的研究第1天开始。试验化合物作为0.4％甲基纤维素的混悬液经口饲管(0.5ml/管/只动物)每天给药1次，或在50％乙醇-50％丙二醇中(0.5ml/涂敷/只动物)每天局部涂敷1次。5-8组的大鼠通过皮下注射每天还接受1次LHRH-A(0.5ml/注射/只动物)。没有经口服和/或经局部接受试验化合物的大鼠将单独接受适当的载体。机体脂肪的测量
在适应期期间和6个月的处理之后，在异氟烷引起的麻醉下用双能X射线吸光分析(DEXA；QDR 4500A，Hologic)测定全身骨骼和动物右股骨的机体组成。结果
                   表4
    处理完整EM-652.HClDHEADHEA+EM-652.HClLHRH-ALHRH-A+EM-652.HClLHRH-A+DHEALHRH-A+DHEA+EM-652.HCl     脂肪(％)23.1±1.619.1±1.420.2±2.318.8±1.336.4±2.231.2±2.027.4±2.125.0±1.7
                      实施例6EM-652.HCl、雌二醇和DHEA的20天处理对卵巢切除雌性大鼠中机体脂肪和体重参数的作用。URMA-r-27-00
本研究的目的是评价EM-652.HCl、雌二醇和DHEA经口服单独或联合给药对接受含丰富碳水化合物饲料的卵巢切除(OVX)雌性大鼠的机体脂肪和体重参数的影响。试验动物：种类：褐家鼠品系：Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD(SD)BR VAF/PlusTM)性别：雌性体重：开始给药后，体重约200-250g。笼养和维持a) 笼养：
在适应期和研究期间将大鼠分别笼养在常规设计的不锈钢笼内。b) 温度和湿度：
用计算机化自动系统连续记录大鼠室内的环境条件(温度，湿度)。目标条件是22±3℃和50±20％相对湿度。c) 光照-黑暗周期：
光周期是12小时的光照和12小时的黑暗。用计算机化自动系统连续记录这些参数。光照是自07：15至19：15。d) 饮食：
随意提供合格的啮齿动物饲料(Lab Diet#5002，丸)和自来水。研究期间，大鼠随意接受含丰富碳水化合物的饲料。该浓集饲料(#3饲料)由下列成份(g/100g)组成：玉米淀粉，31.2；葡萄糖，31.2；酪蛋白，20.0；玉米油，6.4；dl-蛋氨酸，0.3；复合维生素，1.0；AIN-76复合矿物质，4.9；纤维，5.0。
在尸检前一天，在下午结束时(约16h00)使大鼠禁食(只接近水)。随机化：
在研究的第0天随机将大鼠分配为各组。方法和试验设计 试验组：
80大鼠被分配为8个组，每组10只动物用于进行下面的研究：
    处理                 给药混悬液
   剂量(mg/只动物)    体积/只动物(ml)
    完整     0     0.5ml
    OVX     0     0.5ml
    OVX+EM-652.HCl     0.5     0.5ml
    OVX+E2     0.5     0.5ml
    OVX+DHEA     100     0.5ml
    OVX+E-625.HCl+DHEA     0.5+100     0.5ml+0.5ml
    OVX+EM-652.HCl+E2     0.5+0.5     0.5ml+0.5ml
动物的准备：
在研究的第0天，在异氟烷引起的麻醉下，将2-8组的大鼠通过两侧胁腹切口切除卵巢。对第1组大鼠进行假性手术。给药：
试验品或载体的给药在第一天开始(卵巢切除术后第二天)。试验化合物经口饲管(0.5ml/管)作为0.4％甲基纤维素的混悬液施用20天。机体组成的测量
在研究的第21天(尸检之前)，在异氟烷引起的麻醉下用双能X射线吸光分析(DEXA；QDR 4500A，Hologic)测定全身骨骼和动物右股骨的机体组成，从而测出处理对脂肪百分比的影响。采集的器官和组织
收集右和左腹膜后脂肪组织且称重。结果
                               表5
    处理完整OVXOVX+EM-652.HClOVX+E2OVX+DHEAOVX+EM-652.HCl+DHEAOVX+EM-652.HCl+E2     脂肪％15.7±0.818.9±1.510.2±1.210.3±0.67.8±0.88.4±0.910.4±0.7     腹膜后脂肪组织g2.20±0.203.70±0.411.52±0.180.81±0.170.92±0.171.15±0.171.17±0.19
                    实施例7利用乙炔雌二醇、EM-652.HCl、雷洛昔芬和DHEA的34周处理对卵巢切除雌性大鼠中的机体脂肪和体重参数的影响URMA-r-42-98
本研究的目的在于评估利用EM-652.HCl与DHEA的联用处理对卵巢切除大鼠中机体脂肪和体重参数的影响。鉴于此目的，卵巢切除大鼠每天接受EM-652.HCl(1mg/kg)和DHEA(80mg/kg)单独或联合的给药，共34周。经口服给予EM-652.HCl，同时将DHEA局部涂敷在背侧皮肤上。一组动物经口服用17α-乙炔雌二醇(0.1mg/kg)和雷洛昔芬(EM-1105；1mg/kg)处理以便比较。材料和方法动物和处理
在处理开始时选用10-12周龄的重量约235-250g的雌性Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD(SD)Br)。将80只动物随机分配为7组，每组11-12只动物，各组为：1)完整对照；2)OVX对照；3)OVX+EE2(0.1mg/kg)；4)OVX+雷洛昔芬(1mg/kg)；5)OVX+EM-652.HCl(1mg/kg)；6)OVX-DHEA(80mg/kg)；7)OVX+EM-652.HCl+DHEA。在研究的第一天，在异氟烷麻醉下将适当组的动物两侧卵巢切除(OVX)。通过口饲管每天施用1次在0.4％甲基纤维素中为混悬液(0.5ml/只大鼠)的EM-652.HCl、雷洛昔芬和EE2(Steraloids)，共34周，同时每天将在50％乙醇-50％丙二醇中为溶液的DHEA每天局部涂敷在背侧皮肤(0.5ml/大鼠)共34周。末次给药后约24小时，在异氟烷麻醉下通过在腹主动脉处放血来处死禁食过夜的动物。收集左和右腹膜后脂肪组织且称重。机体组成的测定
34周的处理之后，在异氟烷麻醉下用双能X射线吸光分析(DEXA；QDR 4500A，Hologic，Waltham，MA)和局部高分辨扫描软件扫描各大鼠的全身骨骼。测定机体组成(包括脂肪百分比)。统计学分析
数据表示为平均值±SEM。结果
                                    表6
    处理完整对照OVX对照OVX+EE2(0.1mg/kg)OVX+雷洛昔芬(1mg/kg)OVX+EM-652HCl(1mg/kg)OVX+DHEA(80mg/kg)OVX+EM-652HCl+DHEA     右腹膜后脂肪组织g1.43±0.122.53±0.241.29±0.221.29±0.122.07±0.182.16±0.251.62±0.18     左腹膜后脂肪组织g1.80±0.262.64±0.181.15±0.181.41±0.132.19±0.281.98±0.171.47±0.18     脂肪％25.7±2.542.1±1.519.8±1.922.8±1.627.7±1.826.8±2.325.1±1.8
                         实施例8AEM-652.HCl对瘦型和肥胖型Zucker雄性大鼠中的能量平衡和脂质-脂蛋白代谢的作用URMA-r-61-99本研究的目的是测定EM-652.HCl对瘦型和肥胖型Zucker雄性大鼠中的能量平衡和脂质-脂蛋白代谢的作用。鉴于此目的，EM-659.HCl(2.5mg/kg)经口服(口饲管)每天给瘦型和肥胖型Zucker雄性大鼠施用1次，共14天。
              试验动物：
           种类：褐家鼠
           品系：Zucker
            性别：雄性
       体重：开始给药时，体重约瘦型大鼠：175±15g；肥胖型大鼠：235±15g。
               适应在试验开始之前至少5天时使大鼠适应实验室条件。笼养和维持a) 笼养：
在适应期和研究期间将大鼠分别笼养在常规设计的不锈钢笼内。b) 温度
每天记录1次大鼠室内的温度。目标温度为22±3℃c) 光照-黑暗周期：
光周期是10小时的光照和14小时的黑暗。灯光在07：00打开并且在17：h00关闭。d) 饮食：
在适应期中，大鼠随意接受市售啮齿动物饲料(Purina，#5075)和自来水。在研究期间，大鼠接受下面的饲料(#3饲料)，其组成为(g/100g)：玉米淀粉，31.2；葡萄糖，31.2；酪蛋白，20.0；玉米油，6.4；dl-蛋氨酸，0.3；复合维生素，1.0；AIN-76复合矿物质，4.9；纤维，5.0。
在尸检当天早晨约07h00时使大鼠禁食(只能接近水)。随机化：
在首次给药日前1天，称重大鼠且分配到各组，以便使各组具有相同的平均体重。方法和试验设计 试验组：
将16只瘦型和16只肥胖型完整雄性大鼠分配为4组大鼠，每组8只大鼠用于进行下面的研究：
   大鼠的Nb/组   大鼠状况     处理   剂量(mg/kg)
    88   瘦型肥胖型   EM-652.HClEM-652.HCl     2.52.5
    88   瘦型肥胖型     对照对照     00
                           给药：
在研究的第一天开始施用试验化合物或载体。试验化合物EM-652.HCl作为0.4％甲基纤维素的混悬液经口饲管(0.5ml/管/大鼠)每天一次施用14天。在此期间对照组的大鼠接受单独的载体(0.5ml/口饲管/大鼠)。
                       体重
在适应期中，在给药开始前1天称重动物以随机化。随后，在首次给药日并且此后每2天以及尸检当天称重大鼠。记录体重，精确度为1g。
                      食物消耗在研究期间每2天评估食物的消耗量。
                     处死的方法
约6个小时的禁食期之后，将动物尸检(末次给药后约30小时)。用氯胺酮-赛拉嗪麻醉且通过心脏穿刺放血。血样
利用Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911分析器(Boehriuger Mannlleim Diagnostic Laboratory Systems)测定冷冻血浆样本的血脂(总胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG))和葡萄糖。用下列试剂盒测定冷冻血浆样本的循环激素和底物(莱普亭，胰岛素)：莱普亭：Linco RIA试剂盒胰岛素：Linco RIA试剂盒收集的器官和组织
将1片的肝脏(～1g)在液氮中冷冻用于TG和CHOL含量的测定(Folch氏法)。收集腹膜后脂肪组织和比目鱼肌并且在液氮中冷冻用于脂蛋白脂酶(LPL)活性的进一步测定。收集腹侧前列腺、睾丸和精囊。称重前列腺、睾丸(右睾丸和左睾丸之和)和右精囊(液体排空)。弃去右精囊。
                                                             表7
                                                          雄性Zucker大鼠
  组    重量增量    脂蛋白脂酶活性白色腹膜后    脂蛋白脂酶活性比目鱼肌   血浆胰岛素   血浆葡萄糖    血浆总胆固醇    血浆甘油三酯
  表现类型     处理       g   μU/g蛋白   μU/g蛋白       nmol/L     mmol/L     mmol/L     mmol/L
  瘦型     对照 73.0±4.2  2066±353   71.7±7.9  0.095±0.025  10.74±0.87  2.10±0.15  1.47±0.20
  瘦型   EM-652.HCl2.5mg/kg 44.9±3.5  1701±348   69.5±8.4  0.062±0.005  9.35±0.51  1.18±0.09  1.52±0.13
  肥胖型   对照 110.5±0.7  7233±511   51.9±8.8  1.092±0.369  11.06±0.84  5.07±0.28  4.21±0.78
  肥胖型   EM-652.HCl2.5mg/kg 71.6±3.3  7046±1185   58.1±4.6  0.475±0.087  11.84±0.62  2.28±0.25  7.16±1.06
                              实施例8BEM-652.HCl对瘦型和肥胖型Zucker雌性大鼠中能量平衡和脂质-脂蛋白代谢的作用URMA-r-47-99本研究的目的是测定EM-652.HCl对瘦型和肥胖型Zucker雌性大鼠中能量平衡和脂质-脂蛋白代谢的作用。鉴于此目的，EM-659.Cl(2.5mg/kg)经口服(口饲管)每天一次给完整瘦型和肥胖型Zucker雌性大鼠施用，共14天。
试验动物：
种类：褐家鼠
品系：Zucker
性别：雌性
年龄：开始给药时，体重约
瘦型大鼠：114±2g；肥胖型大鼠：182±6g。适应
在试验开始之前至少5天时使大鼠适应实验室条件。笼养和维持
a) 笼养：
在适应期和研究期间将大鼠分别笼养在常规设计的不锈钢笼内。
b) 温度
每天记录1次大鼠室内的温度。目标温度为22±3℃
c) 光照-黑暗周期：
光周期是10小时的光照和14小时的黑暗。灯光在07：00打开并且在17h00关闭。
d) 饮食：
在适应期期间，大鼠随意接受市售啮齿动物饲料(Purina，#5075)和自来水。在研究期间，大鼠接受下面的饲料(#3饲料)，其组成为(g/100g)：玉米淀粉，31.2；葡萄糖，31.2；酪蛋白，20.0；玉米油，6.4；dl-蛋氨酸，0.3；复合维生素，1.0；AIN-76复合矿物质，4.9；纤维，5.0。在尸检当天早晨约07h00时使大鼠禁食(只能接近水)。随机化：
在首次给药日前2天，称重大鼠且随机分配到各组，以便使各组具有相同的平均体重。方法和试验设计 试验组：
将16只瘦型和16只肥胖型完整雌性大鼠分配为4组大鼠，每组8只大鼠用于进行下面的研究：
 大鼠的Nb/组  大鼠状况     处理  剂量(mg/kg)
    88   瘦型肥胖型  EM-652.HClEM-652.HCl     2.52.5
    88   瘦型肥胖型     对照对照     00
给药：
在研究的第一天开始施用试验化合物或载体。试验化合物EM-652.HCl作为0.4％甲基纤维素的混悬液经口饲管(0.5ml/管)每天一次施用14天。在此期间对照组的大鼠接受单独的载体(0.5ml/口饲管/大鼠)。体重
在适应期中，在给药开始前1天称重动物以随机化。随后，在研究的第1天且在研究期间每2天以及尸检当天称重大鼠。记录体重，精确度为1g。食物消耗
研究期间每2天对食物的消耗量进行评估。处死的方法
约6个小时的禁食期之后，将动物尸检(末次给药后约30小时)。用氯胺酮-赛拉嗪麻醉且通过心脏穿刺放血。血样
利用Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911分析器(Boehriuger Mannlleim Diagnostic Laboratory Systems)测定冷冻血浆样本的血脂(总胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG))和葡萄糖。用下列试剂盒测定冷冻血浆样本的循环激素和底物(莱普亭，胰岛素)：莱普亭：Linco RIA试剂盒胰岛素：Linco RIA试剂盒收集的器官和组织
收集并称重肝脏。将1片肝脏(～1g)在液氮中冷冻用于TG和CHOL含量的测定(Folch氏法)。收集肾上腺，称重(右侧和左侧之和)并弃去。收集子宫和卵巢、称重并保存在10％缓冲福尔马林中用于进一步的组织学检验。将左卵巢和右卵巢一起称重(不包括输卵管)。
                                                      表8
    组   重量   脂蛋白脂酶活性白色腹膜后   脂蛋白脂酶活性比目鱼肌     血浆胰岛素    血浆葡萄糖      血浆总胆固醇     血浆甘油三酯
 表现类型     处理    (g)     μU/g     μU/g      mmol/L      mmol/L     mmol/L      mmol/L
  瘦型   对照   175±4   1586±155    55.8±8.1   0.122±0.022   9.45±0.68   2.33±0.10  1.25±0.16
  瘦型   EM-652.HCl2.5mg/kg   154±5   1349±246    60.8±11.1   0.063±0.012   9.60±0.41   1.57±0.14  0.83±0.07
  肥胖型   对照   313±9   3980±327    36.9±8.6   0.410±0.033   10.63±0.55   4.83±0.27  12.51±3.25
  肥胖型   EM-652.HCl2.5mg/kg   291±9   3819±485    36.6±7.1   0.515±0.091   11.70±0.47   3.27±0.97  22.20±4.44
                       实施例9EM-652.HCl和DHEA单独或联合给药对于大鼠中能量平衡和脂质-脂蛋白代谢的作用URMA-r-03-99
本研究的目的是测定EM-652.HCl和DHEA单独或联合给药对于大鼠中能量平衡和脂质-脂蛋白代谢的作用。在用EM-652.HCl(0.5mg/只大鼠，～2.5mg/kg，经口服)和DHEA(20mg/只大鼠，～100mg/kg，局部涂敷)单独或联合施用给接受高糖-高脂肪饲料的完整(INT)和卵巢切除(OVX)雌性大鼠后，针对多个参数评估处理的效果。为了比较，一完整和卵巢切除对照组接受该浓集饲料，同时其它对照动物(完整和OVX)接受市售啮齿动物饲料。试验动物：
种类：褐家鼠
品系：Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD(SD)BR VAF/PlusTM)
性别：雌性
年龄：开始给药时，体重约190-220g。适应
在试验开始之前至少5天时使大鼠适应实验室条件。笼养和维持
a) 笼养：
在适应期和研究期间将大鼠分别笼养在常规设计的不锈钢笼内。
b) 温度
每天记录1次大鼠室内的温度。目标温度为22±3℃
c) 光照-黑暗周期：
光周期是10小时的光照和14小时的黑暗。灯光在06：00打开并且在16h00关闭。
d) 饮食：
在适应期期间，大鼠随意接受市售啮齿动物饲料(Purina，#5075)和自来水。在研究期间，第1和2组继续接受市售饲料，同时第3-10组接受高蔗糖-高脂肪饲料，其组成如下(g/100g)：蔗糖，45；玉米油，10；猪油，10；酪氨酸，22.5；dl-蛋氨酸，0.3；复合维生素，1.2；AIN-76复合矿物质，5.5；纤维，5.5。
在其尸检前夜约22h00时使大鼠禁食(只能接近水)。随机化：
在其抵达后数天，称重大鼠且分配为各组，以便使各组具有相同的平均体重。方法和试验设计 试验组：将80大鼠分配为10组大鼠，每组8只大鼠用于进行下面的研究：
    饮食     处理      剂量(mg/只大鼠)
    口服  局部涂敷
 食物1特殊食物2     INT     0     0
    OVX     0     0
    INT     0     0
    INT+EM-652.HCl     0.5     0
    INT+DHEA     0     20
  INT+EM-652.HCl+DHEA     0.5     20
    OVX     0     0
    OVX+EM-652.HCl     0.5     0
    OVX+DHEA     0     20
  OVX+EM-652.HCl+DHEA     0.5     20
1：市售啮齿动物食物2：高糖-高脂肪饲料动物的准备：
在研究的第0天，在异氟烷麻醉下将适当组的大鼠切除卵巢(两侧胁腹切口)。完整大鼠进行假性手术。给药：
卵巢切除术后第二天(第1天)施用试验化合物或载体。试验化合物EM-652.HCl作为0.4％甲基纤维素的混悬液经口饲管(0.5ml/管)每天一次施用20天，同时在此期间将DHEA局部涂敷在背侧皮肤(0.5ml/涂布/只大鼠)。对照组的大鼠接受单独的载体(口服和局部涂敷)。在研究的第21天在末次给药后约24小时时处死大鼠。体重
在第0天、研究期间每2天和在尸检当天称重大鼠。记录体重，精确度为1g。食物消耗
研究期间每2天对食物的消耗量进行评估。处死的方法
在研究的第21天，末次给药后约24小时时处死禁食过夜的大鼠。它们用氯胺酮-赛拉嗪麻醉且通过心脏穿刺放血。血样
利用Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911分析器(Boehriuger Mannlleim Diagnostic Laboratory Systems)测定冷冻血浆样本的血脂(总胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG))和葡萄糖。用下列试剂盒测定冷冻血浆样本的循环激素和底物(胰岛素，莱普亭，葡萄糖)：胰岛素：Linco R1A试剂盒，葡萄糖：Beckmann自动葡萄糖分析仪莱普亭：Linco RI试剂盒收集的器官和组织收集所有动物的下列组织并称重：
肌肉(比目鱼肌和VLM)、脂肪(腹膜后和腹股沟)、心脏、褐色脂肪组织。
也收集脑。
将1片肝脏冷冻用于TG和CHOL含量的后续测定(Folch氏法)，并且其它组织用于测定LPL活性。取出子宫(和完整组的卵巢)，将残余脂肪剥去，称重且保存在10％缓冲福尔马林中。结果
                                     白色脂肪组织                白色脂肪组织                褐色脂肪组织
                                        腹股沟                      腹膜后
                                                脂蛋白                       脂蛋白                       脂蛋白
   组                  总重量       重量                      重量                         重量
                                               脂酶活性                     脂酶活性                     脂酶活性饮食          处理            g          g           μU/g          g            μU/g           g            μU/g
                                                  蛋白                        蛋白                         蛋白食物       假性手术对照    239±6   0.410±0.043    252±55    0.983±0.104    1526±217    0.329±0.035    1053±138食物       OVX对照         294±6   0.888±0.146    570±100   1.472±0.199    2415±147    0.466±0.041    688±88蔗糖+脂肪  假性手术对照    257±10  0.716±0.107    344±73    1.765±0.292    1470±242    0.376±0.033    1073±152蔗糖+脂肪  假性手术+EM-    238±5   0.435±0.043    160±23    1.058±0.162    1277±56     0.306±0.044    1196±83
       652.HCl蔗糖+脂肪  假性手术        252±5   0.659±0.075    194±45    1.067±0.149    1177±188    0.373±0.036    982±72
       +DHEA蔗糖+脂肪  假性手术+EM-    249±4   0.489±0.083    224±45    0.909±0.124    1349±133    0.322±0.026    885±78
       652.HCl
       +DHEA蔗糖+脂肪  OVX对照         316±8   1.800±0.251    725±106   3.058±0.297    2503±215    0.519±0.064    867±99蔗糖+脂肪  OVX+EM-         268±5   0.709±0.085    310±63    1.370±0.211    1612±186    0.408±0.025    678±65
       652.HCl蔗糖+脂肪  OVX+DHEA        274±9   0.885±0.156    583±134   1.699±0.151    1905±112    0.342±0.049    1069±96蔗糖+脂肪  OVX+EM-         263±5   0.658±0.088    306±42    1.436±0.162    1542±118    0.373±0.040    876±75
       652.HCl
       +DHEA
                                   比目鱼肌                     股外肌                 肝总
    组                       重量          脂蛋白        重量           脂蛋白         胆固醇          甘油三酯
                                          脂酶活性                     脂酶活性饮食            处理              g         μU/g  蛋白        g         μU/g  蛋白       mmol/L           mmol/L食物         假性手术对照    0.106±0.002    62.7±3.0    0.872±0.027    11.7±3.5    0.076±0.004     0.134±0.019食物         OVX对照         0.116±0.005    43.8±3.3    1.000±0.042    13.1±3.7    0.082±0.004     0.169±0.027蔗糖+脂肪    假性手术对照    0.096±0.005    55.0±5.1    0.927±0.040    13.1±3.2    0.083±0.002     0.123±0.014蔗糖+脂肪    假性手术        0.098±0.005    53.9±3.3    0.965±0.034    16.2±3.1    0.096±0.011     0.360±0.102
         +EM-652.HCl蔗糖+脂肪    假性手术+DHEA   0.105±0.004    53.6±7.5    0.893±0.043    11.5±2.0    0.068±0.003     0.038±0.007蔗糖+脂肪    假性手术+EM-    0.098±0.005    56.6±4.5    0.971±0.029    19.5±3.5    0.101±0.008     0.184±0.033
         652.HCl+DHEA蔗糖+脂肪    OVX对照         0.110±0.004    39.2±3.9    1.037±0.026    10.9±1.82   0.097±0.007     0.262±0.052蔗糖+脂肪    OVX+EM-         0.104±0.004    39.1±5.0    0.944±0.030    10.8±3.2    0.092±0.006     0.348±0.078
         652.HCl蔗糖+脂肪    OVX+DHEA        0.103±0.005    45.9±4.7    0.920±0.049    13.1±5.4    0.079±0.005     0.165±0.047蔗糖+脂肪    OVX+EM-         0.101±0.001    48.4±4.8    0.929±0.038    11.0±4.1    0.106±0.008     0.273±0.031
         652.HCl+DHEA
                                 血浆           血浆         血浆总           血浆           血浆组                                  胰岛素         葡萄糖        胆固醇         甘油三酯        莱普亭饮食            处理                nmol/L         mmol/L        mmol/L          mmol/L          ng/mL食物         假性手术对照        0.071±0.010    7.56±0.24    1.61±0.17      0.49±0.12    1.404±0.224食物         OVX对照             0.146±0.027    8.69±0.57    2.10±0.10      0.68±0.10    2.388±0.737蔗糖+脂肪    假性手术对照        0.079±0.013    9.07±0.48    1.60±0.12      0.66±0.17    3.572±0.699蔗糖+脂肪    假性手术+EM-652.HCl 0.057±0.004    9.03±0.49    1.15±0.06      0.60±0.12    2.019±0.402蔗糖+脂肪    假性手术+DHEA       0.048±0.012    8.05±0.51    1.59±0.17      0.61±0.11    1.977±0.255蔗糖+脂肪    假性手术+EM-        0.049±0.013    7.99±0.44    0.93±0.08      0.95±0.21    1.071±0.162
         652.HCl+DHEA蔗糖+脂肪    OVX对照             0.125±0.022    10.46±0.72   1.62±0.26      0.83±0.13    7.900±1.982蔗糖+脂肪    OVX+EM-652.HCl      0.089±0.013    9.06±0.30    1.15±0.11      0.97±0.16    1.989±0.326蔗糖+脂肪    OVX+DHEA            0.052±0.009    8.64±0.24    1.57±0.12      0.62±0.08    2.757±0.631蔗糖+脂肪    OVX+EM-             0.060±0.010    8.65±0.38    0.87±0.09      0.92±0.21    1.672±0.327
         652.HCl+DHEA
                 实施例10EM-652.HCl、TSE424、拉索昔芬、LY353381和雷洛昔芬对卵巢切除雌性大鼠中能量平衡和脂质-脂蛋白代谢的作用URMA-r-45-00
本研究的目的测定用文献所述的不同选择性雌激素受体调节剂测定大鼠中能量平衡和脂质-脂蛋白代谢代谢的作用，并将所得的结果与EM-652.HCl的结果比较。鉴于此目的，试验化合物经口饲管在0.4％甲基纤维素中施用给卵巢切除雌性大鼠(0.5mg各化合物/只大鼠；0.5ml/只大鼠)，共20天。用17β-雌二醇(E2)处理的完整对照、卵巢切除(OVX)对照和OVX大鼠用作参照。试验动物：
种类：褐家鼠
品系：Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD(SD)BR VAF/PlusTM)
性别：雌性
体重：开始给药时，体重约200-225g。笼养和维持
a) 笼养：
在适应期和研究期间将大鼠分别笼养在常规设计的不锈钢笼内。
b) 温度
用计算机化自动系统连续记录大鼠室内环境条件(温度，湿度)。目标条件是22±3℃和50±20％相对湿度。
c) 光照-黑暗周期：
光周期是10小时的光照和14小时的黑暗。灯光在07：15打开并且在17h15关闭。
d) 饮食：
在适应期间，大鼠随意接受合格的啮齿动物饲料(Lab Diet#5002，丸)和自来水，同时在研究期间，它们随意接受高碳水化合物饲料(#3饲料)和自来水。饲料组成如下(g/100g)：玉米淀粉，31.2；葡萄糖，31.2；酪蛋白，20.0；玉米油，6.4；dl-蛋氨酸，0.3；复合维生素，1.0；AIN-76复合矿物质，4.9；纤维，5.0。在其尸检当天早晨约07h00时使大鼠禁食(只能接近水)。随机化：
大鼠分配为各组以便使各组具有相同的平均体重。方法和试验设计 试验组：
将77大鼠分配为8组大鼠，每组9-10只大鼠用于进行下面的研究：
大鼠的Nb            处理          剂量混悬液
    口服(mg/只大鼠)   局部涂敷(ml)
    9   完整     0     0.5ml
    9   OVX     0     0.5ml
    10   OVX+EM-652.HCl     0.5     0.5ml
    10   OVX+TSE424(EM-3527)     0.5     0.5ml
    10   OVX+拉索昔芬(EM-3555)     0.5     0.5ml
    10   OVX+LY353381(EM-1665)     0.5     0.5ml
    10   OVX+雷洛昔芬(EM-1105)     0.5     0.5ml
    9   OVX+E2     0.5     0.5ml
动物的准备：
在研究的第0天，在异氟烷麻醉下将第2-8组的大鼠切除卵巢(通过两侧胁腹切口)。第1组的大鼠进行假性手术。体重
在第0天(手术)、研究期间每2天和在尸检当天称重大鼠。食物消耗
每2天对食物的消耗量进行评估。机体组成(脂肪百分比)
为了测定处理对这百分比的作用，在研究的第17天用双能X射线吸光分析(DEXA；QDR 4500A.Hologic，Waltham，MA)测定机体组成。处死的方法
在研究的第21天，末次给药后约24小时和禁食6小时后，在氯胺酮-赛拉嗪麻醉下于腹部主动脉处通过放血处死动物。血样
利用Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911分析器(Boehriuger Mannlleim Diagnostic Laboratory Systems)测定冷冻血浆样本的血脂(总胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG))和葡萄糖。用下列试剂盒测定血清样本的循环激素和底物(胰岛素，莱普亭，葡萄糖)：胰岛素：Linco RIA试剂盒，莱普亭：Linco RIA试剂盒收集的器官和组织收集所有动物的下列组织并称重：
肌肉(右比目鱼肌和右VLM)、脂肪(右腹膜后和右腹股沟)、褐色脂肪组织、心脏、肝脏、子宫和阴道。
将1片(～0.5g)的肝脏冷冻在液氮中用于TG和CHOL含量的后续测定(Folch氏法)。将所有组织的一片～0.1g(除子宫和阴道之外)冷冻在液氮中并且在-80℃下保存用于脂蛋白-脂酶(LPL)活性的后续测定。子宫和阴道保存在10％缓冲福尔马林中用于组织学检验。动物的尸体置于金属盒内并且保存在-20℃下直至测定的能量平衡。结果
                                           表10处理       总重量        白色脂肪组织腹股沟           白色脂肪组织                  褐色脂肪组织
                                                     腹膜后
                     重量        脂蛋白       重量           脂蛋白          重量         脂蛋白
                                脂酶活性                    脂酶活性                     脂酶活性
          g           g        μU/g 蛋白       g          μU/g 蛋白         g         μU/g 蛋白完整       232±7    0.350±0.037    379±69    1.31±0.09      1537±253    0.410±0.030    973±115OVX        284±5    0.320±0.048    797±97    1.55±0.15      2664±338    0.380±0.027    880±130OVX+EM-    252±4    0.244±0.028    684±216   1.32±0.21      1917±365    0.339±0.038    900±91652.HClOVX+TSE424 260±5    0.326±0.042    766±173   1.27±0.15      1750±140    0.350±0.019    1017±83OVX+       210±2    0.187±0.023    801±138   0.867±0.132    1417±163    0.244±0.022    982±98拉索昔芬OVX+LY     231±4    0.290±0.038    559±165   0.968±0.120    1365±119    0.368±0.031    888±65353381OVX+       230±3    0.245±0.047    579±46    1.32±0.24      1510±52     0.307±0.26     960±116雷洛昔芬OVX+E2    198±4    0.158±0.019    416±74    0.550±0.102    1442±243    0.211±0.021    1198±62
                    比目鱼肌肉                     股外肌处理                重量          脂蛋白          重量       脂蛋白
                             脂酶活性                   脂酶活性
                  g         μU/g  蛋白         g       μU/g 蛋白完整             0.113±0.020    17.2±2.2    0.924±0.031    NDOVX              0.108±0.006    17.6±3.9    0.963±0.045    NDOVX+EM-652.HCl   0.118±0.018    14.5±4.1    1.00±0.047     NDOVX+TSE424       0.100±0.004    11.7±1.9    0.993±0.33     NDOVX+拉索昔芬     0.096±0.003    10.9±1.5    0.800±0.048    NDOVX+LY353381     0.092±0.002    10.1±1.0    0.955±0.20     NDOVX+雷洛普芬     0.099±0.003    10.2±2.0    0.795±0.055    NDOVX+E2          0.086±0.003    10.9±2.0    0.718±0.026
             累积食物     血浆           血浆        血浆总          血浆          血浆处理
              完整       胰岛素         葡萄糖       胆固醇        甘油三酯       莱普亭
               g         nmol/L         mmol/L        mmol/L        mmol/L         ng/mL完整            332±14   0.086±0.11     13.6±0.7     2.41±0.16    0.62±0.07    2.46±0.37OVX             389±8    0.178±0.030    15.9±1.9     2.58±0.11    0.63±0.05    3.48±0.40OVX+EM-652.HCl  324±5    0.122±0.021    15.9±1.4     1.41±0.0.9   0.91±0.17    1.10±0.22OVX+TSE424      347±9    0.113±0.029    16.5±2.7     1.66±0.16    0.93±0.24    2.12±0.44OVX+拉索昔芬    283±14   0.095±0.017    15.8±1.32    1.29±0.06    0.81±0.21    0.97±0.29OVX+LY353381    312±7    0.104±0.11     17.1±0.72    1.15±0.08    1.23±0.28    1.22±0.21OVX+雷洛昔芬    307±8    0.077±0.10     13.8±1.2     1.19±0.08    1.20±0.35    1.39±0.30OVX+E2         255±9    0.070±0.007    11.8±1.35    2.03±0.15    0.43±0.04    0.309±0.097
                            实施例11本发明的化合物以及现有技术的化合物对人子宫内膜腺癌Ishikawa细胞中碱性磷酸酶活性的作用材料储备细胞培养基的维持
Dr.Erlio Gurpide，The Mount Sinai Medical Center，New York，NY.友好提供了由良好分化的腺癌衍化的人Ishikawa细胞。Ishikawa细胞一般维持在Eagle最小必需培养基(MEM)中，含有5％(vol/vol)FBS且补充有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM非必需氨基酸溶液。在37℃下将细胞置于Falcon T75烧瓶内，密度1.5×106细胞。细胞培养试验
试验开始之前24小时，近融合的Ishikawa细胞的培养基用新制的无雌激素基础培养基(EFBM)置换，其由1∶1(v∶v)无酚红Ham′s F-12和Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)的混合物，其中补充了100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM谷酰胺和5％FBS，该FBS用葡聚糖涂层的炭处理2次除去内源性甾类物质。细胞随后用0.1％胰酶制剂(Sigma)和0.25mM HEPES收获，重新悬浮在EFBM中且铺在Falcon 96孔平底微量滴定平板中，在100μl的体积中密度为2.2×104细胞/孔且令其在平板的表面附着24小时。此后，培养基用新制的EFBM更换，其中含有指定浓度的化合物，终体积为200μl。将细胞培养5天，48小时后改变培养基。碱性磷酸酶试验
在培养期结束时，反转微量滴定平板且倾出生长培养基。在孔内用200μL PBS(0.15M NaCl，10mM磷酸钠，pH7.4)漂洗平板。随后除去平板的PBS，同时小心地留下少许残余PBS，再重复1次该洗涤过程。随后弃去缓冲盐水，并将反转平板轻轻印迹在纸巾上。随后更换覆盖物，将平板在-80℃下放置15分钟，随后在室温下融化10分钟。然后将平板置于冰上，加入50μl的冰冷溶液，其中含有5mM对硝基苯基磷酸酯、0.24mM MgCl2和1M的二乙醇胺(pH9.8)。随后温热平板至室温，让由对硝基苯基的产生黄色显色(8分钟)。在405nm下在酶联免疫吸着测定平板读取器(BIO-RAD，model250 EIA Reader)中监测平板。计算
利用加权迭代非线性乘方回归(weighted iterative nonlinearsquares regression)计算剂量-反应曲线以及IC50。
                     表11
Figure A0081247400711
*1nM E2刺激的％＝
OD 405nm化合物-OD 405nm基础/OD 405nm 1nME2-OD405nm基础
请另外参见Labrie等的EM-652(SCH57068)，第三代SERM活性物质，可在乳腺和子宫内膜中作为纯抗雌激素，J.Steroid Biochem.和Mol.Bio.69，51-84，1999。
                       实施例12EM-652.HCl和FCE424对人乳腺癌MCF-7细胞系的增殖的作用
                        方法：
                  储备细胞培养基的维持
从American Type Culture Collection#HTB 22的第147传代得到MCF-7人乳腺癌细胞并且按常规在无酚红Dulbecco改进的Eagle的Ham F12培养基、上述补充物和5％FBS中生长。MCF-7人乳腺癌细胞系衍生自69岁高加索女性患者的胸膜渗漏液。采用第148至165传代之间的MCF-7细胞并且每周进行传代培养。细胞增殖研究
用0.1％胰酶制剂(Sigma)收获其后对数生长期的细胞并且重新悬浮在适当的培养基中，该培养基含有50ng牛胰岛素/ml和5％(v/v)FBS，该FBS用葡聚糖涂层炭处理2次以除去内源性甾类化合物。将细胞以指定密度铺板在24孔Falcon塑料培养平板(2cm2/孔)上且令其附着在平板的表面上72小时。此后，该培养基用含有指定浓度的化合物的新制培养基更换，该化合物溶液在E2存在或不存在下用99％双蒸乙醇稀释1000x储备溶液得到。对照细胞只接受乙醇载体(0.1％EtOH，v/v)。在规定时间间隔培养细胞同时每隔2-或3-天更换培养基。通过测定DNA含量测定细胞数量。
                     计算和统计学分析
用加权迭代非线性最小二乘方回归计算剂量-反应曲线以及IC50值。所有结果表示为平均值±SEM。
                                       表12
    名称     名称代码     试验化合物对DNA的刺激％的1nmE2刺激*(试验编号) 试验化合物对DNA的1nM E2刺激的抑制作用IC50(nM)(试验编号)
 EM-652.HCl  EM-652.HCl；EM-1538     N.S     0.796
 TSE424  EM-1538EM-3527     N.S     3.68
                         实施例13EM-652.HCl、TSE424以及拉索昔芬单独或与EM-652.HCl联合给药对卵巢切除雌性大鼠的子宫重量、脂肪和脂质的相对作用URMA-r-44-00
本研究的目的是比较EM-652.HCl、TSE424和拉索昔芬单独或与EM-652.HCl联合给药对卵巢切除雌性大鼠的子宫和阴道组织学的作用。鉴于这个目的，各化合物经口服给卵巢切除雌性大鼠施用20天，并且在处理期结束时，收集子宫和脂肪且称重。
                   试验动物说明：
                  种类：褐家鼠品系：Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD(SD)BR VAF/PlusTM)
                   性别：雌性
        体重：开始给药时，体重约200-225g。笼养和维持
a) 笼养：
在适应期和研究期间将大鼠分别笼养在常规设计的不锈钢笼内。
b) 温度
用计算机化自动系统连续记录大鼠室内环境条件(温度，湿度)。目标条件是22±3℃和50±20％相对湿度。
c) 光照-黑暗周期：
光周期是12小时的光照和12小时的黑暗。灯光在07：15打开并且在19：15关闭。
d) 饮食：
随意提供合格的啮齿动物饲料(Lab Diet#5002，丸)和自来水。随机化：
在卵巢切除术时将大鼠随机分配为各组。试验组：
将70大鼠分配为7组大鼠，每组9-11只大鼠用于进行下面的研究：
    处理     给药混悬液剂量(mg/只大鼠)
    INTACT     -
    OVX     -
    OVX+EM-652.HCl     0.5
    OVX+EM-3527     0.5
    OVX+EM-652.HCl+EM-3527     2.5+0.5
    OVX+EM-3555     0.5
    OVX+EM-652.HCl+EM-3555     2.5+0.5
动物的准备：
在研究的第1天，在异氟烷麻醉下将第2-9组的大鼠切除卵巢。给药
在研究的第2至21天，载体或试验化合物作为0.4％甲基纤维素中的混悬液经口饲管(0.5ml/管/大鼠)给药。体重
在研究第1天和在尸检当天(SD22)称重大鼠。处死的方法
在末次给药后约24小时，在异氟烷引起的麻醉下于腹部主动脉处通过放血处死过夜禁食的大鼠。收集的器官和组织
取出子宫和腹膜后脂肪组织且称重。结果
                                         表13
    处理   最终的体重(g)    腹膜后脂肪组织(g)      子宫重量(mg)       胆固醇(mmol/L)
    完整   222±5**   1.04±0.13*   485.8±28.4**   1.52±0.09**
    OVX   266±5   1.42±0.24   152.9±4.7   1.91±0.09
    OVX+EM-652.HCl   238±4**   0.63±0.08**   173.0±7.1   1.00±0.11**
    OVX+TSE424   248±5**   0.84±0.09**   162.6±5.2   1.20±0.10**
    OVX+TSE424+EM-652.HCl(2.5mg)   241±1**   0.91±0.17**   180.2±5.2   0.99±0.07**
    OVX+拉索昔芬   210±3**   0.52±0.05**   247.4±9.1**   0.95±0.09**
    OVX+拉索昔芬+EM-652.HCl(2.5mg)   234±3**   0.74±0.10**   182.3±4.6   0.95±0.07**
*，p＜0.05；**，p＜0.001，试验组对OVX对照组。药物组合物实施例
下面通过举例而不是限定的方式给出数种药物组合物，所述的组合物使用了优选的活性物质SERM EM-800或EM-652.HCl，其单独或与一种优选活性的性类固醇前体DHEA、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇3-乙酸酯或雄甾-5-烯-3b，17b-二醇二半琥珀酸酯联合使用。本发明或其联合药物形式的其它化合物可以用来代替(或除此之外)EM-800或EM-552.HCl、DHEA、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇3-乙酸盐和雄甾-5-烯-3b，17b-二醇二半琥珀酸酯。活性成分的浓度可以在本发明所讨论的宽范围内变化。其它可包含的成分的用量和种类为所属领域熟知。
                      实施例A本发明的优选SERM类物质经口服给药。
                    表
    成分   重量％(以组合物的总重量计)
    EM-652.HCl     5.0
    明胶     5.0
    乳糖     73.5
    淀粉     16.5
               实施例B
                胶囊
    成分  重量％(以组合物的总重量计)
    EM-652.HCl     5.0
    含水乳糖     80.0
    淀粉     4.8
    微晶纤维素     9.8
    硬脂酸镁     0.4
       联合疗法的药物组合物
             实施例C
             片剂
    成分    重量％(以组合物总重量计)
    EM-652.HCl     5.0
    DHEA     15.0
    明胶     5.0
    乳糖     58.5
    淀粉     16.5
               实施例D
               明胶胶囊
    成分    重量％(以组合物总重量计)
    EM-652.HCl     5.0
    DHEA     15.0
    含水乳糖     65.0
    淀粉     4.8
    微晶纤维素     9.8
    硬脂酸镁     0.4
                     试剂盒实施例
下面通过实施例而不是限定的方式给出数种试剂盒，这些试剂盒利用另外优选的活性SERM EM-800或EM-652.HCl与优选的性类固醇前体DHEA、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇3-乙酸酯或雄甾-5-烯-3b，17b-二醇二半琥珀酸酯。
本发明或其联合药物形式的其它化合物可以用来代替(或除此之外)EM-800或EM-652.HCl、DHEA、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇3-乙酸酯或雄甾-5-烯-3b，17b-二醇而半琥珀酸酯。活性成分的浓度可以在本发明所讨论的宽范围内变化。其它可包含的成分的用量和种类为所属领域熟知。
                     实施例A
SERM是经口服给药同时性类固醇前体是经皮给药，口服给药的SERM组合物(胶囊)
    成分    重量％(以组合物总重量计)
    EM-652.HCl     5.0
    含水乳糖     80.0
    淀粉     4.8
    微晶纤维素     9.8
    硬脂酸镁     0.4
     局部给药的性类固醇前体组合物
              (凝胶)
   成分  重量％(以组合物的总重量计)
   DHEA     10.0
   辛酸-癸酸甘油三酯(Neobee M-5)     5.0
   己二醇     15.0
   Trsanscutol(二甘醇一甲醚)     5.0
   苄醇     2.0
   环甲基硅酮(Dow Corning 345)     5.0
   乙醇(绝对)     56.0
   羟丙基纤维素(1500cps)(KLUCEL)     2.0
                    实施例BSERM和性类固醇前体是经口服给药的非甾类抗雌激素组合物
                     (胶囊)
    成分    重量％(以组合物总重量计)
    EM-652.HCl     5.0
    含水乳糖     80.0
    淀粉     4.8
    微晶纤维素     9.8
    硬脂酸镁     0.4
     经口服给药的性类固醇前体组合物
             (明胶胶囊)
    成分    重量％(以组合物总重量计)
    DHEA     15.0
    微晶纤维素     84.6
    硬脂酸镁     0.4
其它SERM类物质可以代替上述制剂中的EM-800或EM-652.HCl，以及其它性类固醇抑制剂可以代替DHEA、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇3-乙酸酯或雄甾-5-烯-3b，17b-二醇二半琥珀酸酯。可以含有一种以上的SERM或一种以上的前体，在这种情况中，其重量百分比之和优选是上述实施例中所给出的单一前体或单一SERM的重量百分比。
本发明描述了优选实施方式和实施例，但不限于此。所属领域的那些技术人员很容易认识到更宽适用性，并且本发明的范围只由本文的权利要求书限定。

Claims (38)

1.一种治疗或减少肥胖发展的方法，该方法包括给需要上述治疗或减少的对象施用治疗有效量的具有下面通式的化合物或其可药用盐：
其中R1和R2独立地选自选自氢、羟基、-OM(M选自直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C3-C4链烯基、直链或支链C3-C4炔基)和可体内转化为羟基的部分；
其中G是-H或-CH3；和
其中R3是选自吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代和NRaRb(Ra和Rb独立地是氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C3-C6链烯基和直链或支链C3-C6炔基)的基团。
2.权利要求1的方法，其中所述化合物是光学活性的，因为它具有大于50％的、在碳2上具有绝对构型S的立体异构体化合物。
3.权利要求2的方法，其中所述化合物或其盐基本上没有(2R)-对映异构体。
4.权利要求3的方法，包括给需要这种治疗或减少的患者施用治疗有效量的下列化合物：
Figure A0081247400031
5.权利要求1的方法，其中所述的化合物是酸的盐，所述的酸选自乙酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、富马酸、氢碘酸、氢溴酸、氢氯酸、氢氯噻嗪酸、羟萘甲酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、棕榈酸、新戊酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对苯二甲酸、对甲苯磺酸和戊酸。
6.权利要求1的方法，其中所述的酸是盐酸。
7. 权利要求3的方法，包括给需要这种治疗或减少的患者施用治疗有效量的下面结构化合物的盐酸盐：
8.一种治疗或减少肥胖的发展的方法，包括给需要这种治疗或减少肥胖发展的患者施用治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂，和治疗有效量的雌激素或甾类物质，其选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇的和体内转化为任何这些甾类物质的化合物。
9.权利要求8的方法，其中所述的选择性雌激素受体调节剂具有下面的通式：
其中R1和R2独立地选自氢、羟基、-OM(M选自直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C3-C4链烯基、直链或支链C3-C4炔基)和体内转化为羟基的部分；
其中G是-H或-CH3；和
其中R3是选自吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代和NRaRb(Ra和Rb独立地是氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C3-C6链烯基和直链或支链C3-C6炔基)的基团。
10.一种药物组合物，含有可药用稀释剂或载体、治疗可接受量的具有下面通式的选择性雌激素受体调节剂：
Figure A0081247400042
其中R1和R2独立地选自氢、羟基、-OM(M选自直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C3-C4链烯基、直链或支链C3-C4炔基)和体内转化羟基的部分；
其中G是-H或-CH3；
其中R3是选自吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代和NRaRb(Ra和Rb独立地是氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C3-C6链烯基和直链或支链C3-C6炔基)的基团；和
雌激素或性甾类前体选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇和体内转化为任何所述前体的化合物。
11.一种药物组合物，含有可药用赋形剂、稀释剂或载体，治疗可接受量的选自下面的选择性雌激素受体调节剂：
Figure A0081247400051
和雌激素或性甾类前体，其选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇和体内转化为任一个的化合物。
12.一种减少腹部脂肪或减少腹部脂肪蓄积的方法，包括给需要这种治疗或减少的对象施用治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂或其可药用盐。
13.权利要求12的方法，其中所述的选择性雌激素受体调节剂具有下面通式：
其中R1和R2独立地选自氢、羟基、-OM(M选自直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C3-C4链烯基、直链或支链C3-C4炔基)和体内转化为羟基的部分；
其中G是-H或-CH3；和
其中R3是选自吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代和NRaRb(Ra和Rb独立地是氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C3-C6链烯基和直链或支链C3-C6炔基)的基团。
14.权利要求13的方法，其中所述的选择性雌激素受体调节剂是光学活性的，因为它具有大于50％的在碳2上具有绝对构型S的立体异构体化合物。
15.权利要求13的方法，其中所述化合物或其盐基本上没有(2R)-对映异构体。
16.权利要求14的方法，包括给需要这种治疗或减少的患者施用治疗有效量的下面的化合物：
17.权利要求12的方法，其中所述的化合物是酸的盐，所述的酸选自乙酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、富马酸、氢碘酸、氢溴酸、氢氯酸、氢氯噻嗪酸、羟萘甲酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、棕榈酸、新戊酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对苯二甲酸、对甲苯磺酸和戊酸。
18.权利要求12的方法，其中所述的酸是盐酸。
19.权利要求15的方法，包括给患者施用治疗有效量的下面结构的盐酸盐化合物：
Figure A0081247400071
20.一种减少腹部脂肪或减少腹部脂肪蓄积的发展的方法，该方法包括给需要这种治疗或减少的患者施用治疗有效量的任何选择性雌激素受体调节剂，和雌激素或治疗有效量的选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇和体内转化为任何上述前体的甾类物质。
21.权利要求20的方法，其中所述的选择性雌激素受体调节剂具有下面的通式：
其中R1和R2独立地选自氢、羟基、-OM(M选自直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C3-C4链烯基、直链或支链C3-C4炔基)和体内转化为羟基的部分；
其中G是-H或-CH3；和
其中R3是选自吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代和NRaRb(Ra和Rb直链或支链C3-C6链烯基和直链或支链C3-C6炔基)的基团。
22.权利要求3的方法，其中所述的选择性雌激素受体调节剂选自：
Figure A0081247400091
23.权利要求15的方法，其中所述的选择性雌激素受体调节剂选自：
24.一种药物组合物，含有可药用赋形剂、稀释剂或载体和治疗有效可接受量的选择性雌激素受体调节剂，其选自：
Figure A0081247400121
和选自雌二醇和premarin的雌激素或选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇和体内转化为它们的化合物的性甾族化合物前体。
25.一种治疗或降低胰岛素耐药性发展危险性的方法，该方法包括给需要这种治疗或降低的对象施用治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂。
26.权利要求25的方法，进一步包括施用治疗有效量的选自雌二醇和premarin的雌激素或选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇和体内转化为它们的化合物的性甾族化合物前体
27.权利要求25的方法，其中所述的选择性雌激素受体调节剂具有下面通式：
Figure A0081247400141
其中R1和R2独立地选自氢、羟基、-OM(M选自直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C3-C4链烯基、直链或支链C3-C4炔基)和体愉转化为羟基的部分；
其中G是-H或-H或-CH3；和
其中R3是选自吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代和NRaRb(Ra和Rb独立地是氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C3-C6链烯基和直链或支链C3-C6炔基)的基团。
28.权利要求27的方法，其中该选择性雌激素受体是EM-652.HCI:
29.一种降低血液甘油三酯水平的方法，包括给需要这种降低的患者施用治疗有效量的具有下面通式的化合物或其可药用盐：
其中R1和R2独立地选自氢、羟基、-OM(M选自直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C3-C4链烯基、直链或支链C3-C4炔基)和体内转化为羟基的部分；
其中G是-H或-CH3；和
其中R3是选自吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代和NRaRb(Ra和Rb独立地是氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C3-C6链烯基和直链或支链C3-C6炔基)的基团。
30.权利要求29的方法，其中该化合物是光学活性的，因为它具有大于50％的在碳2上具有绝对构型S的立体异构体化合物。
31.权利要求30的方法，其中所述的化合物或盐基本上不含有(2R)-对映异构体。
32.权利要求31的方法，包括给需要这种治疗或减少的患者施用治疗有效量的下面的化合物：
Figure A0081247400152
33.权利要求29的方法，其中所述的化合物是酸的盐，所述的酸选自乙酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、富马酸、氢碘酸、氢溴酸、氢氯酸、氢氯噻嗪酸、羟萘甲酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、棕榈酸、新戊酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对苯二甲酸、对甲苯磺酸和戊酸。
34.权利要求29的化合物，其中该酸是盐酸。
35.权利要求31的方法，包括给需要这种治疗或减少的患者施用治疗有效量的下面结构的盐酸盐化合物：
Figure A0081247400161
36.一种治疗或减少肥胖的发展的方法，包括给需要这种治疗或减少的患者施用治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂，和治疗有效量的甾类物质，其选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄甾-5-烯-3b，17b-二醇、雌激素和体内转化为任何所述甾类物质的化合物。
37.一种具有下述分子结构的化合物：
Figure A0081247400162
38.一种药物组合物，其中含有药用赋形剂、稀释剂或载体和治疗有效量的EM-652.HCl。
Figure A0081247400171
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