KR20060135615A - 다중-약물 내성 유전자의 발현을 억제하는 방법 및 그유전자의 발현으로부터 유발된 단백질의 생성을 억제하고그로써 암 치료를 위한 화학요법제의 효능을 증강시키는방법 - Google Patents

다중-약물 내성 유전자의 발현을 억제하는 방법 및 그유전자의 발현으로부터 유발된 단백질의 생성을 억제하고그로써 암 치료를 위한 화학요법제의 효능을 증강시키는방법 Download PDF

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타트자나 루킥
다비드 존 스테와르트
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포비스 메디-테크 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 한 측면으로, 동물 세포에서 다중-약물 내성 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 동물에게 투여하는 것으로 이루어진다. 다른 측면으로 본 발명은 동물 세포에서 다중-약물 내성 유전자에 의해 발현된 단백질의 생성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 동물에게 투여하는 것으로 이루어진다. 본 발명은 또 다른 측면으로, 암에 걸린 동물에게서 화합요법제의 효능을 증강시키는 방법을 제공하는데, 그 방법은 최소한 하나의 화학요법제와 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 상기 동물에게 투여하는 것으로 이루어진다. 나아가 본 발명에는 최소한 하나의 화학요법제와 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제를 포함하는, 암 치료에 사용되는 조성물 및 키트가 제공된다.
암치료, 다중약물 내성, 콜레스테롤 흡수 억제제, 화학요법제, 스테롤, 스타놀, 안드로스탄, 안드로스텐, 아스코르브산.

Description

다중-약물 내성 유전자의 발현을 억제하는 방법 및 그 유전자의 발현으로부터 유발된 단백질의 생성을 억제하고 그로써 암 치료를 위한 화학요법제의 효능을 증강시키는 방법{METHOD OF INHIBITING THE EXPRESSION OF A MULTI-DRUG RESISTANCE GENES AND INHIBITING THE PRODUCTION OF PROTEINS RESULTING FROM THE EXPRESSION OF SUCH GENES THEREBY ENHANCING THE EFFECTIVENESS OF CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS TO TREAT CANCERS}
본 발명은 암 치료에 관한 것이다.
특정 화학요법제를 사용하여 사람의 악성종양을 치료하는 것이 내인성 또는 획득된 종양 세포 내성 때문에 효과가 없는 것으로 밝혀지는 것은 빈번한 일이었다. 다수의 종양세포 내성 메커니즘이, 상이한 작용 메커니즘을 가지고 있는 구조적으로 관련이 없는 광범위한 화학요법제에 대해서도 2차적인 내성을 초래하기 때문에 문제는 더욱 심각하다. 이런 상황은 다중-약물 내성으로 언급되며, 이것은 암치료에서는 중요한 문제로, 현재 화학요법제를 사용하여 치료비율을 증가시키는데 주요 장애물로 여겨진다.
전 세계적으로 큰 7개의 제약 시장 (미국, 일본, 독일, 이탈리아, 프랑스, 스페인, 영국)만 보더라도 해마다 약 204만 건의 암 발생이 보고되고 있다.1) 불행하게도 이들 중에서 5 내지 10 %만이 화학요법으로 치료하는 것이 성공할 것이다. 해마다 대략 40 내지 45 %, 또는 800,000명 이상의 환자가 하나 이상의 화학요법 프로그램에 대해 다중약물 내성을 보일 것이다. 다중약물 내성의 출현은 전 세계적으로 성공적인 암 화학요법에 대한 주요한 장애물이라고 말하는 것은 과장이 아니다. 그것은 지금까지 성공적으로 해결되지 않은 문제이다.
분자 및 세포 수준에서, 여러 가지 메커니즘이 다중-약물 내성을 설명해줄 수 있을 것 같다. 다양한 화학요법제에 대한 종양세포 약물 내성의 발현에 대해 제시된 세포 수준 메커니즘으로는 감소된 약물 흡수 또는 증가된 약물 유출, 변경된 산화 환원 전위, 증강된 DNA 수복, 증가된 약물 격리 메커니즘 또는 약물-표적 단백질의 증폭이 있다.
현재까지 사람 게놈에서 다중약물-내성을 보이는 단백질을 코드화하는 2개의 유전자를 확인하였다. 그 첫 번째는 MDR1으로, P-당단백질을 코드화하는 것으로서, ATP 결합 카세트 (ABC) 운반 단백질 슈퍼패밀리에 속하는 170 kDa의 멀티스패닝 경막 단백질이다.2) 종양세포가 MDR을 얻는 한 메커니즘은 P-당단백질 (Pgp)의 과잉 발현에 의해서일 것으로 예상된다.3),4),5),6)
P-당단백질은 소수성 화학요법제를 종양 세포 밖으로 신속하게 뿜어내고, 그로써 특정 화학요법제의 세포 내 축적을 그것의 세포활동을 억제하는 농도 아래로 떨어뜨림으로써 작용하는 것 같다. 한 시험관 내 연구는 화학 약물 농도를 증가시 키는 것이다. 그러나 암 화학요법제가 이미 그것의 생체 내 최대 허용 범위로 투여되었기 때문에 용량을 증가시키는 것은, 대부분의 경우 최대치의 독성을 유발하는 허용될 수 없는 해결책이다.7),8)
P-당단백질은 방광 섬유증 운반 단백질, 주요 조직적합성 복합체-결합 펩티드 운반자, 및 비-P-당단백질-관련 다중약물 내성 단백질 (MRP)과 구조적으로 유사하다.9),10),11),12) P-당단백질은 정상인의 부신피질, 담세관 및 결장 상피의 루미날 애스펙트(luminal aspect), 신장 관형 상피 및 혈-뇌 및 혈액 고환 장벽의 상피 세포를 포함하여 다양한 부위에서 발현된다. 이들 부위에서의 P-당단백질의 기능은 분명하지 않지만 아마도 호르몬의 분비 및 독소에 대한 보호와 관련된 광범위한 특이성을 가진 에너지 의존성 펌프로서 작용하는 것 같다. P-당단백질의 발현은 다량의 소수성, 및 헤테로고리형 암 화학요법제, 이를테면 다른 것뿐만 아니라 아드리아마이신 (독소루비신), 콜키신, 콜세미드, 에토포시드, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴 등을 활발하게 유출시킬 수 있다.
P-당단백질은 고도로 보존된 유전자 패밀리에 의해 코드화된다.13) MDR-1 유전자는 사람에서 다중약물 내성을 부여하는 제 I 부류의 P-당단백질을 코드화한다.14) 햄스터의 pgp-1 및 pgp-2 유전자와 마우스의 mdr-3 및 MDR-1 유전자는 제 I 및 II 부류의 단백질을 코드화하며, 이것들은 둘 다 설치류에서 다중약물 내성을 부여한다.15)
시험관 내에서 증가된 P-당단백질과 다중약물 내성 사이의 인과관계를 지지하는 여러 가지 증거가 있다. 단백질의 구조적 특징은 에너지-의존성 유출 펌프의 특징이다.16) 단백질의 과잉 발현은 다중약물 내성과 관련이 있다.17) 또한 P-당단백질의 발현 정도와 약물-내성 표현형 사이에 분명한 상관관계가 있음이 밝혀졌다.18)
결장암, 신장암, 유방암, 부신 피질암 및 간암은 흔히 진단시에, 환자들이 이전에 항암 약물로 치료된 적이 없음에도 불구하고 P-당단백질 수준이 높은 것으로 나타난다.17) 다양한 종양 유형에서 초기 화학요법 처방 후에 재발되는 질병이나 질병의 진전은 치료되기 어렵고, 흔히는 MDR과 MDR-1의 상승된 수준의 발현을 포함한다.18) 약물 내성은 낮은 유전자 복사 수를 가지는 세포에서 분명하게 나타날 수 있고, 전사, 번역 또는 후-번역 수준에서의 조절에 기인할 수 있다. 시험관 내 연구에서는 때로 MDR-1의 증폭이 약물 내성에 대한 원인으로서 나타나기도 하지만, 증가된 유전자 복사 수는 사람 종양에서는 외견상 보기 힘들다.20)
증가된 수준의 MDR-1 유전자 생성물 또는 그것의 mRNA는 수많은 사람 종양 연구에서 나쁜 예후와 관련되어 있다. 유방암에 대한 임상 연구에서는 상당수의 환자들이 높은 수준의 P-당단백질을 발현하였고, P-당단백질의 발현 수준이 낮았던 환자들은 발현 수준이 높았던 그룹에 비해 상당히 더 나은 속도로 화학요법에 대해 반응하였고 질병의 진전 없이 생존하였다.21),22) 결장암에 대한 지난 연구에서 종양 의 68 %가 높은 수준의 P-당단백질을 발현하였고, 과잉발현은 혈구 침입 및 전이에 의해 측정된 공격과 상관관계가 있었다.23) 급성 골수성 백혈병을 포함한 세 가지의 임상 연구에서 MDR-1 네거티브 그룹은 모두 MDR-1 포지티브 그룹에 비해 완전히 질병이 완화된 비율이 더 높았고, 질병이 없이 생존한 기간이 더 길었다.24),25),26)
신경아세포종에 관한 3 연구에서 연구자들은 MDR-1 발현이 한 부위에 특정되지 않고 처리된 후의 종양에서 빈번하게 발생하였으며, 그것은 나쁜 예후와 상관관계가 있음을 밝혔다.27),28),29) 횡문근육종에서와 같이, P-당단백질 수준은 증가된 악성 단계와 상관관계가 있으며, P-당단백질 네거티브 그룹은 상당히 더 좋은 비율의 반응을 나타냈을 뿐 아니라 재발하지 않고 생존하는 기간이 더 길었다.30) P-당단백질 발현은 또한 진행된 난치성 골수종과 크게 상관관계가 있었다.31) 이런 데이터들은 모두 다양한 사람 악성종양의 임상적 예후와 P-당단백질 발현이 상관관계가 있음을 제시한다.
MDR을 역전시킨다고 알려진 약물들은 약물 유출을 감소시킴으로써 작동하는 것으로 밝혀졌다 (예컨대 칼슘 채널 차단제인 베라프라밀, 딜티아젬 및 니카르디피딘32), 칼모듈린 억제제인 리세르핀, 퀴니딘 또는 퀴네인33 ), 시클로스포린 A34), 시클로스포린 유도체35 ), 또는 FK506 및 라파마이신36 )). 이들 제제 대부분에 대한 내성의 임상적 역전은 주로 내성 역전을 이루기 위하여 요구된 임상적 독성 농도 수준 때 문에 제한되었다.
다중약물 내성 유전자의 발현, 그것들의 단백질 생성물의 생성 및 MDR 표현형의 획득은 임상의가 활용할 수 있는 화학요법의 선택을 상당히 구속하며, 병에 시달리는 환자에 대한 예후를 상당히 더 악화시키는 것이 명백하다.
그러므로 당해기술 분야에서 비독성이면서 보다 효과적인 MDR 역전 및/또는 억제제를 발견할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 MDR을 극복하기 위하여 이전에 사용되었던 공지 화합물의 결점을 제거 또는 완화할 수 있는 신규 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 MDR을 극복하기 위하여 이전에 사용되었던 공지 화합물의 결점을 제거 또는 완화할 수 있는 신규 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 다음의 비-제한적인 도면에 의해 설명된다.
도 1은 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 하나: "FM-VP4"로 불리는 아스코르빌 스타닐 포스페이트 에스테르로 1주일 동안 처리한 후의 CaCo2 세포에서의 MDR-1 발현 수준 (MDR-1/GAPDH의 표준화된 비율; "GAPDH" 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제)을 나타내는 막대 그래프도이다.
도 2는 GAPDH의 프라이머 드롭에 대한 적정을 나타내는 그래프도이다.
도 3은 MDR-1, GAPDH에 대한 중합효소 연쇄 반응 (1.5 % 아가로스 겔) 겔 전기영동 결과를 도시한다.
도 4는 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 하나: "FM-VP4"로 불리 는 아스코르빌 스타닐 포스페이트 에스테르로 CaCo2 세포를 처리한 후의 세포 생존성에 대한 MTS- 및 LDH-분석 결과를 도시하는 막대 그래프도이다.
도 5는 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 하나: "FM-VP4"로 불리는 아스코르빌 스타닐 포스페이트 에스테르로 CaCo2를 처리한 후의 단백질 농도에 대한 BCA-분석 결과를 도시하는 막대 그래프도이다.
도 6은 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 하나: "FM-VP4"로 불리는 아스코르빌 스타닐 포스페이트 에스테르로 1주일 동안 처리한 후의 CaCo2 세포에서의 ABCC1 (MRP-1) 발현 수준 (MDR-1/GAPDH의 표준화된 비율)을 나타내는 막대 그래프도이다.
도 7은 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 하나: "FM-VP4"로 불리는 아스코르빌 스타닐 포스페이트 에스테르의 리포솜 제형으로 CaCo2를 처리한 후에 TRIZOL을 사용한 RNA 분리 → RT-PCR → PCR 후의 MDR-1, GAPDH에 대한 중합효소 연쇄 반응 (1.5 % 아가로스 겔) 겔 전기영동 결과를 도시한다.
도 8은 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 하나: "FM-VP4"로 불리는 아스코르빌 스타닐 포스페이트 에스테르의 리포솜 제형을 2.5, 5 및 10 ㎛로 사용하여 1주일 동안 처리한 후의 CaCo2 세포의 MDR-1 발현 수준 (MDR-1/GAPDH의 표준화된 비율)을 대조 및 빈 리포솜과 비교하여 나타내는 막대 그래프도이다.
도 9는 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 하나: "FM-VP4"로 불리는 아스코르빌 스타닐 포스페이트 에스테르와 함께 인큐베이션한 후의 CaCo2 세포의 P-당단백질의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 10은 샘플 PCR 생성물의 전기영동 겔 프로필 (10 μM의 FM-VP-4로 시간-의존성 처리한 효과로서 CaCo-2 세포의 mdr-1 유전자의 발현 프로필을 측정함)을 도시한다.
도 11은 UV 빛 (UV-Epi Chem II)하에서 영상화되고 UVP-Labworks 소프트웨어로 정량한 도 10의 PCR 생성물의 형광 밴드를 나타내는 막대 그래프도이다.
도 12는 CaCo-2 단층에서의 Rh123의 축적에 대해 미치는 1주일 동안 FM-VP4와 함께 사전-인큐베이션한 효과를 나타내는 막대 그래프도이다. 데이터는 ±SD의 평균을 나타낸다. *P<0.002, **P<0.0001.
도 13은 CaCo-2 단층을 가로지르는 (염기성 측면에서 정점까지) Rh123의 P-gp 운반에 대해 미치는 1주일 동안 FM-VP4와 함께 사전-인큐베이션한 효과를 나타내는 막대 그래프도이다. 데이터는 3±SD의 평균을 나타낸다. *P<0.07, **P<0.009.
본 발명은 한 측면으로, 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는, 동물 세포에서 다중-약물 내성 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 다른 측면으로, 암에 걸린 동물에게 최소한 하나의 화학요법제 및 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는, 암에 걸린 동물에게서 화학요법제의 효능을 증강시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 측면으로, 동물 세포를 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량에 노출시키는 것으로 이루어지는, 동물 세포에 의해 나타난 다중-약물 내성 표현형을 역전시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 다른 측면으로, 동물에게 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는, 동물 세포에서 다중약물 내성 유전자에 의해 발현된 단백질의 생성을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 다른 측면으로, 최소한 하나의 화학요법제와 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제를 포함하는, 암치료에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명은 다른 측면으로, 최소한 두 가지의 별도 성분:
a) 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제를 포함하는 조성물, 및
b) 최소한 하나의 화학요법제를 포함하는 조성물을 각 조성물의 투여방법을 설명하는 지시사항과 함께 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 요점은 콜레스테롤 흡수 억제제와 화학요법제의 제공 및 공동-투여 (반드시 동시적이거나 즉각적으로 연속적이지 않아도 된다)이다. 콜레스테롤 흡수 억제제는 다중-약물 내성 유전자의 발현을 효과적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들 유전자에 의해 발현된 단백질의 생성의 감소는 동물 세포로부터 암 화학요법제의 유출을 방지하여 그것의 효능을 최대화하는 것으로 제시되었다. 이것은 지금까지는 전도양양한 화학요법제들을 다중약물 내성 메커니즘에 의해 실제로는 비효율적으로 만든 것과 관련된 것으로 증명된 문제들 때문에 중요하다.
본 발명의 일부 바람직한 콜레스테롤 흡수 억제제 (하기 식 (i) 내지 (iv)로 표시되는 것들을 포함하여)는 아스코르빌 부분을 포함한다. 이들 특정 화합물은 많은 추가의 장점을 갖는다. 특히 물과 같은 수용액중의 용해도는 아스코르빌 부분에 의해 개선되고, 그로써 경구 투여 자체가 가능해진다. 따라서 본 발명에서 선택된 이들 화합물은 그 자체로서 제조되고 사용될 수 있거나, 임의로 선택된 화학요법제와 함께 약제학적 제제에, 그런 제제가 물을 기초로 한 것인지에 관계없이 쉽게 혼입될 수 있다. 이런 증강된 용해도는 일반적으로 원하는 치료 효과를 얻기 위한 화합물의 투여 단위용량을 낮추게 된다.
이들 효과 및 다른 중요한 장점들을 아래에서 설명하기로 한다.
다음의 상세한 설명은 본 발명의 실시를 돕기 위한 것이다. 그러나 이 상세한 설명은 본 발명의 범주를 부당하게 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본원에서 논의된 구체예에 대한 변형 및 변경은 본 발명의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고서 당업자들에 의해 이루어질 수 있다.
본원에서 사용되는 "동물"은 모든 포유류를 포함하여 동물 왕국의 모든 구성원을 의미하며, 가장 바람직하게는 사람이다. 수의학적 용도 또한 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "화합물"은 용어 "유도체", "구조" 및 "유사체"와 상호교환이 가능하다.
본원에서 사용되는 "효과적" 또는 "치료적으로 효과적"이라는 용어가 의도하는 것은 동물, 특히 사람에게 투여되는 화합물(들) 또는 조성물의 양을 조정하는 것이며, 그 결과 화합물(들) 또는 조성물을 투여하는 사람이 찾고자 하는 세포, 조직, 시스템, 동물 또는 포유류의 생물학적 또는 의학적 반응을 끌어내고, 그러한 화합물(들) 또는 조성물의 양은 다음 목표 중 하나 또는 둘 이상을 달성한다. 즉
a) 암을 치료하거나 완화시킨다;
b) 종양 성장을 방지, 치료 또는 완화시킨다;
c) 하나 또는 둘 이상의 다중약물 내성 유전자의 발현을 억제 또는 감소시킨다;
d) 다중약물 내성 유전자에 의해 발현된 하나 또는 둘 이상의 단백질의 생성을 억제 또는 감소시킨다;
e) 암의 치료에 사용되는 화학요법제의 효능을 증강시킨다; 및
f) 하나 또는 둘 이상의 화학요법제에 대해 세포를 민감하게 만든다.
본원에서 사용되는 용어 "회장 담즙산(ileal bile acid) 운반자" 또는 "IBAT"는 정점의(apical) 나트륨 공동-의존성 담즙산 운반자, 또는 ASBT와 동의어이다.
본원에서 사용되는 "벤조티에핀 IBAT 억제제"는 2,3,4,5-테트라히드로-1-벤조티에핀 1,1-디옥사이드 구조를 포함하는 치료 화합물을 포함하는 회장 담즙산 운반 억제제를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "다중약물 내성 유전자" 또는 그것의 모든 약어는 하나 또는 둘 이상의 다음 유전자를 나타낸다: ABCB1 (MDR-1); ABCA2 (ABC2); ABCB2 (TAP); ABCB3 (TAP); ABCC1 (MRP-1); ABCC3 (MRP-3).
본원에서 사용되는 용어 "선구약물"은 환자에게 투여된 후 생체 내에서 어떤 화학적 또는 생리적 과정을 통하여 약물을 방출하는 약물 선구체이다 (예를 들면 선구약물은 생리적 pH가 되거나 효소 작용을 통하여 원하는 약물 형태로 전환된다).
본원에서 사용되는 용어 "용매 화합물"은 용매의 분자 또는 이온과 용질의 분자 또는 이온과의 분자 또는 이온 복합체 (예를 들면 식 a) 내지 f)의 화합물 또는 화합물 a) 내지 f)의 선구약물)을 말한다. 유용한 용매의 제한적이지 않은 실례로는 극성의 프로틱(protic) 용매, 예컨대 물 및/또는 알코올 (예컨대 메탄올)이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "스테롤"은 제한 없이 모든 스테롤을 포함하며, 예를 들면 (모든 공급원으로부터 유래된 것들 및 모든 형태: α, β 및 γ를 포함하여) 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라씨카스테롤 (디히드로브라씨카스테롤 포함), 데스모스테롤, 칼리노스테롤, 포리페라스테롤, 클리오나스테롤, 에르고스테롤, 코프로스테롤, 코디스테롤, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 클레로스테롤, 네비스테롤, 라토스테롤, 스텔라스테롤, 스피나스테롤, 콘드릴라스테롤, 페포스테롤, 아베나스테롤, 이소아베나스테롤, 페코스테롤, 폴리나스타스테롤, 콜레스테롤 및 그것들의 모든 천연 또는 합성 형태 및 유도체, 및 이성질체가 포함된다.
용어 "스타놀"은 예를 들면 (모든 공급원으로부터 유래된 것들 및 모든 형태: α, β 및 γ를 포함하여) 모든 천연 또는 합성 형태 및 유도체와 이성질체를 포함하여 포화된 또는 수소첨가된 스타놀, 이를테면 시토스타놀, 캄페스타놀, 스티그마스타놀, 브라씨카스타놀 (디히드로브라씨카스타놀 포함), 데스모스타놀, 칼리노스타놀, 포리페라스타놀, 클리오나스타놀, 에르고스타놀, 코프로스타놀, 코디스타놀, 이소푸코스타놀, 푸코스타놀, 클레로스타놀, 네비스타놀, 라토스타놀, 스텔라스타놀, 스피나스타놀, 콘드릴라스타놀, 페포스타놀, 아베나스타놀, 이소아베나스타놀, 페코스타놀, 및 폴리나스타스타놀이 있다.
스테롤과 스타놀에 대한 변형, 즉 측사슬을 포함하는 것 또한 본 발명의 영역 내에 속한다는 것이 인지될 것이다. 또한 본 명세서 전체를 통하여 의심스러울 때나 다른 언급이 없다면 용어 "스테롤"은 스테롤과 스타놀 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "피토스테롤"과 "피토스타놀"이 또한 사용될 수 있으며, 각각 식물-유도된 모든 스테롤 또는 스타놀을 말한다.
본 발명에 따르는 유도체를 형성하는 데 사용하기 위한 스테롤과 스타놀은 다양한 천연 공급원으로부터 얻거나 인공적으로 합성될 수 있다. 예를 들어 그것들은 식물성 오일 (수생 식물을 포함함), 예컨대 옥수수 기름 및 다른 식물유, 맥아 기름, 콩 추출물, 쌀 추출물, 쌀겨, 면실유, 해바라기 기름, 참기름 및 어류 (및 다른 수산-자원) 기름으로부터 얻을 수 있다. 그것들은 또한 효모와 진균류로부터도 유도될 수 있는데, 예컨대 에르고스테롤이 그것이다. 따라서 본 발명은 스테롤의 어떠한 하나의 공급원에 제한되지 않는다. 미국 특허 일련번호 제 4,420,427호는 메탄올과 같은 용매를 사용하여 식물성 기름 슬러지로부터 스테롤을 제조하는 것을 교시하고 있다. 또는 달리 피토스테롤과 피토스타놀은 미국 특허 제 5,770,749호에서 설명된 것처럼 삼림 실습의 부산물인 톨유 피치 또는 비누로부터 얻을 수 있다. 톨유 피치로부터 스테롤과 스타놀을 추출하는 추가의 방법은 캐나다 특허 출원 제 2,230,373호 (1998. 2. 20 출원, 1998. 2. 19일에 출원된 PCT/CA99/00150에 상응함) 및 미국 특허 출원 제 10/060,022호 (2002. 1. 28. 출원)에 설명되어 있다.
따라서 본원에서 사용되는 용어 "스테롤"과 "스타놀"에 대해 허용될 수 있는 가장 광범위한 적절한 정의는 유리 스테롤 및 스타놀, 에스테르화된 스테롤 및 스타놀과 지방족 또는 방향족 산 (각각 지방족 또는 방향족 에스테르를 형성할 수 있다), 페놀산 에스테르, 신남산염 에스테르, 페룰레이트 에스테르, 피토스테롤 및 피토스타놀 글리코시드 및 아실화된 글리코시드 또는 아실글리코시드를 포함하며, 그것들에 한정되지 않는다. 그러므로 용어 "스테롤"과 "스타놀"은 대부분의 천연 스테롤에서처럼 고리 단위의 5-위치에 이중 결합을 가지고 있거나 고리의 다른 위치 (예컨대 6, 7, 8(9), 8(14), 14 5/7)에 하나 이상의 이중 결합을 가지고 있거나 또는 스타놀에서처럼 고리 단위에 이중 결합이 없는 모든 유사체를 포함한다. 나아가 예를 들면 α1-시토스테롤에서처럼 추가의 메틸기가 있을 수 있다.
스테롤은 중요한 많은 세포 기능을 수행하는 천연 발생 화합물이다. 식물의 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤, 진균의 에르고스테롤 및 동물의 콜레스테롤과 같은 스테롤은 각각 그것들의 각각의 세포 유형에서 세포 및 하위-세포막이의 주요 성분이다. 특히 피토스테롤은 그것이 사람을 포함하여 많은 포유류 종에게 투여되었을 때 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있었기 때문에 대단한 관심의 대상이 되었다.
임의로, 본 발명의 화합물은 천연-유도된 또는 인공 합성된 베타-시토스테롤, 캄페스타놀, 시토스타놀 및 캄페스테롤로 형성되고, 그렇게 형성된 이들 화합물 각각은 그런 다음 약제학적 조성물에 혼합된 후 다양한 비율로 투여된다. 대부분의 바람직한 형태에서 본 발명의 화합물은 2개의 주요 성분: 2나트륨 아스코르빌 캄페스타닐 포스페이트 ("DACP") 및 2나트륨 아스코르빌 시토스타닐 포스페이트 ("DASP")를 포함하는 하나 이상의 2나트륨 아스코르빌 피토스타닐 포스페이트 ("FM-VP4"로 언급함)를 포함한다.
본 발명의 범주 내에서 "콜레스테롤 흡수 억제제"는 어떤 메커니즘에 의해서든지 콜레스테롤 운반, 빨아들임 또는 흡수에 대해 네거티브 효과를 나타내는 모든 화합물을 말하며, 담즙산 재흡수 또는 운반을 억제하는 모든 화합물을 포함한다.
바람직하게는 콜레스테롤 흡수 억제제는 본원에서 설명되는 것과 같이 하나 또는 둘 이상의 스테롤, 스타놀 또는 그것들의 혼합물 또는 그것들의 유도체를 포함한다. 전술한 설명에 대한 일반성을 제한하는 일 없이 그것은 모든 유리 스테롤 및 스타놀, 및 모든 스테롤 및 스타놀 지방족 및 방향족 에스테르, 스테롤 및 스타놀 페놀산 에스테르, 스테롤 및 스타놀 신남산염 에스테르, 스테롤 및 스타놀 페룰레이트 에스테르, 스테롤 및 스타놀 글리코시드, 스테롤 및 스타놀 아실화된 글리코시드 또는 아실글리코시드를 포함한다.
대부분의 바람직한 형태에서 콜레스테롤 흡수 억제제는 하나 또는 둘 이상의 다음 식을 가지는 스테롤 또는 스타놀을 포함하는 화합물 또는 유도체, 및 그것들의 생물학적으로 허용될 수 있는 염을 하나 이상 포함하며, 이를테면 최소한 하나의 그런 화합물 또는 그것의 염 또는 용매 화합물의 생물학적으로 허용될 수 있는 염 또는 용매 화합물 또는 선구약물을 포함한다:
Figure 112006021027945-PCT00001
상기 식들에서 R은 스테롤 또는 스타놀 부분이고, R4는 아스코르브산으로부터 유도되며, n은 1 내지 5이다.
바람직하게는 콜레스테롤 흡수 억제제는 2나트륨 아스코르빌 캄페스타닐 포스페이트와 2나트륨 아스코르빌 시토스타닐 포스페이트의 혼합물을 포함하는 2나트륨 아스코르빌 스타닐 포스페이트 조성물이다.
상기 식 i) 내지 iv)의 화합물은 공지된 방법, 예를 들면 하기 및 2000. 6. 20일에 출원된 PCT/CA00/00730 (2000. 6. 20 출원, 1999. 6. 23일에 출원된 미국 특허 출원 09/339,903에 우선권을 둠)에 설명되어 있는 방법들에 의해 제조될 수 있다.
일반적으로 식 i) 내지 iv)의 화합물은 다음과 같이 제조될 수 있다: 선택된 스테롤 또는 스타놀 (또는 그것의 할로포스페이트, 할로카보네이트 또는 할로-옥살레이트 유도체) 및 아스코르브산이 반응 조건하에서 함께 혼합되어 "산" 부분이 "알코올"(스테롤)로 축합될 수 있다. 이들 조건은 산 성분과 알코올 성분이 직접 반응하거나 적당한 산 촉매, 예컨대 미네랄산, 황산, 인산, p-톨루엔술폰산의 존재하에 반응할 수 있는 피셔 에스테르화 반응 과정과 같은 다른 통상적인 에스테르화 반응에 사용되는 것과 같다. 그런 에스테르화 반응에 일반적으로 사용된 유기 용매는 디에틸 에테르, 테트라히드로푸란, 또는 벤젠과 같은 에테르, 톨루엔 또는 유사한 방향족 용매이고, 온도는 반응이 진행되고 있는 반응물의 반응성에 따라 실온에서부터 고온까지 다양할 수 있다.
바람직한 구체예에서 에스테르를 형성하기 위한 방법은 아스코르브산 또는 그것의 유도체의 히드록실기를 에스테르 (예컨대 아세테이트 에스테르로서) 또는 에테르 (예컨대 메틸 에테르)로서 "보호하기"와 그런 다음 보호된 아스코르브산을 스테롤/스타놀 할로포스페이트, 할로카보네이트 또는 할로옥살레이트로 적당한 반응 조건하에서 축합하는 것을 포함한다. 일반적으로 그런 축합 반응은 유기 용매, 예컨대 디에틸 에테르, 테트라히드로푸란, 또는 벤젠, 톨루엔 또는 유사한 방향족 용매 중에서 수행된다. 반응물의 성질과 반응성에 따라 반응 온도는 저온 (-15 ℃)에서부터 고온까지 다양할 수 있다.
보다 상세하게 설명하자면, 다음은 식 i) 내지 iv)의 화합물, 특히 식 i)의 화합물을 제조하는 바람직한 방법이다: 아스코르브산은 처음에 5,6-이소프로필리덴-아스코르브산을 형성함으로써 분해되는 것이 방지된다. 이것은 아세톤을 아스코르브산 및 황산 또는 염산과 같은 산성 촉매와 함께 적당한 반응 조건하에서 혼합함으로써 이루어질 수 있다. 피토스타놀 클로로포스페이트는 톨루엔 및 피리딘 (지방족 및 방향족 아민과 같은 다른 질소 염기가 대신 사용될 수도 있다) 중의 피토스타놀 용액을 형성한 후 그 용액을 옥시염화 인과 같은 인 유도체로 처리함으로써 제조된다. 모액(mother liquor)을 여과하고 농축한 후에 형성된 잔류물은 피토스타놀 클로로포스페이트이다. 그런 다음 그것을 5,6-이소프로필리덴-아스코르브산과 혼합한 후, 에탄올 및 HCl과 같은 적당한 알코올을 첨가한 다음, 농축한다. 또는 달리 피리딘/THF가 첨가될 수 있으며, 그 생성물이 농축된다. 최종적으로 세척 및 건조한 후에 결과적으로 생성된 신규 생성물은 스타놀-포스페이트-아스코르베이트이다.
식 i) 내지 iv)의 화합물을 제조하기 위한 다른 바람직한 방법은 아스코르브산을 히드록실 부위에서 5,6-이소프로필리덴-아스코르브산으로서가 아니라 에스테르로서 (예컨대 아세테이트, 포스페이트 등으로서) 보호하는 것이다. 에스테르는 스테롤 또는 스타놀과 축합될 수 있고, 화합물을 제조하기 위해 최종적으로 공지된 에스테르화 방법을 사용하여 상술된 것처럼 유도될 수 있다. 아스코르브산의 모노 및 디포스페이트의 형성은 문헌에 설명되어 있다 (Kato et al., 미국 특허 제 4,939,128호 참조, 아스코르브산의 인산 에스테르의 형성에 대해 설명되어 있다). 유사하게 도블러 등 (Dobler et al.,)의 미국 특허 제 4,999,437호에는 아스코르브산 2-포스페이트의 제조가 설명되어 있다. 도블러 등의 문헌에는 삼차 아민 (독일 공개 출원 DOS 2,719,303)의 존재 하에 아스코르브산 또는 아스코르브산 유도체와 POCl3의 포스포릴화 핵심 반응이 반응 용액에 마그네슘 화합물, 바람직하게는 마그네슘 화합물의 수용액을 첨가함으로써 개선된다고 설명되어 있다. 이들 공지된 아스코르브산 유도체 중 어느 것이든지 사용될 수 있다.
보다 상세한 설명으로, 다음은 식 i) 내지 iv), 특히 식 ii)의 화합물을 제조하는 바람직한 다른 방법이다: "보호된" 아스코르브산을 제조하는 것은 상기의 상세한 설명에서 설명된 것과 동일한 과정을 따르지만, 옥시염화 인은 옥살릴 할라이드로 대체되고, 그로 인해 스타놀-옥살레이트-아스코르베이트가 생성된다.
바람직한 형태에서, 본 발명의 콜레스테롤 흡수 억제제는 2가지 주요 성분: 2나트륨 아스코르빌 캄페스타닐 포스페이트 ("DACP") 및 2나트륨 아스코르빌 시토스타닐 포스페이트 ("DASP")를 포함하는 하나 또는 둘 이상의 2나트륨 아스코르빌 피토스타닐 포스페이트 ("FM-VP4"로 언급함)를 포함한다.
또는 달리 및 본 발명의 바람직한 다른 형태에서, 콜레스테롤 흡수 억제제는 히드록시 치환된 아제티디논 부류의 화합물을 포함한다. 가장 바람직하게는 이 아제티디논은 다음 식으로 표시되는 히드록시 치환된 아제티디논 화합물:
Figure 112006021027945-PCT00002
또는 그것의 생물학적으로 허용될 수 있는 염을 포함하며,
상기 식에서 Ar1 및 Ar2는 독립적으로 아릴 및 R4-치환된 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
Ar3은 아릴 또는 R5-치환된 아릴이며;
X, Y 및 Z는 독립적으로 --CH2--, --CH(저급 알킬)- 및 --C(2저급 알킬)-로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
R과 R2는 독립적으로 --OR6, --O(CO)R6, -O(CO)OR9 및 --O(CO)NR6R7으로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
R1과 R3은 독립적으로 수소, 저급 알킬 및 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
q는 0 또는 1; r은 0 또는 1; m, n 및 p는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4이며; 단 q와 r 중 적어도 하나는 1이고, m, n, p, q 및 r의 합은 2, 3, 4, 5 또는 6이며, p가 0이고 r이 1일 때 m, q, 및 n의 합은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
R4는 저급 알킬, --OR6, --O(CO)R6, --O(CO)OR9, --O(CH2)1-5OR6, --O(CO) NR6R7, --NR6R7, --NR6(CO)R7, -NR6(CO)OR9, --NR6(CO)NR7R8, --NR6SO2R9, --COOR6, --CONR6R7, -COR6, -SO2NR6R7, S(O)0-2R9, --O(CH2)1-10--COOR6, --O(CH2)1-10CONR6R7, -(저급 알킬렌)COOR6, --CH.dbd.CH--COOR6, --CF3, --CN, --NO2 및 할로겐으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체이며;
R5는 --OR6, --O(CO)R6, --O(CO)OR9, --O(CH2)1-5OR6, --O(CO) NR6R7, --NR6R7, --NR6(CO)R7, -NR6(CO)OR9, --NR6(CO)NR7R8, --NR6SO2R9, --COOR6, --CONR6R7, -COR6, -SO2NR6R7, S(O)0-2R9, --O(CH2)1-10--COOR6, --O(CH2)1-10CONR6R7, -(저급 알킬렌)COOR6, 및 --CH.dbd.CH--COOR6로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체이고;
R6, R7 및 R8은 수소, 저급 알킬, 아릴 및 아릴-치환된 저급 알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
R9는 저급 알킬, 아릴 또는 아릴-치환된 저급 알킬이다.
보다 바람직하게는 식 V의 화합물에서 Ar1은 페닐 또는 R4-치환된 페닐이고, Ar2는 페닐 또는 R4-치환된 페닐이며, Ar3은 R5-치환된 페닐이다.
식 V의 다른 구체예에서는, Ar1은 R4-치환된 페닐이고 이때 R4는 할로겐이며, Ar2는 R4-치환된 페닐이고 이때 R4는 할로겐 또는 --OR6이며, 이때 R6은 저급 알킬 또는 수소이고, Ar3은 R5-치환된 페닐이고 이때 R5는 --OR6이며, 이때 R6은 저급 알킬 또는 수소이다.
식 V의 또 다른 구체예에서는 화합물 X, Y, 및 Z는 각각 --CH2--이고, R1 및 R3은 각각 수소이며, R과 R2는 각각 --OR6이고, 이때 R6은 수소이며, m, n, p, q 및 r의 합은 2, 3 또는 4이다.
식 V의 화합물의 또 다른 구체예에서 m, n 및 r은 각각 0이고, q는 1이며 p는 2이다.
식 V의 화합물의 다른 구체예에서 p, q 및 n은 각각 0이고, r은 1이며 m은 2 또는 3이다.
식 V의 바람직한 구체예에서 화합물은 다음 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
3(R)-(2(R)-히드록시-2-페닐에틸)-4(R)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
3(R)-(2(R)-히드록시-2-페닐에틸)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
3(S)-(1(S)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
3(S)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
3(R)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
rel-3(R)→(S)-히드록시-(2-나프탈레닐)메틸!-4(3S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
rel-3(R)→(R)-히드록시-(2-나프탈레닐)메틸!-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필)-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필)-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
4(S)-(4-히드록시페닐)-3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필-1-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
4(S)-(4-히드록시페닐)-3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필-1-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
rel 3(R)→3(RS)-히드록시-3→4-(메톡시메톡시)-페닐!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
1-(4-플루오로페닐)-3(R)→3(S)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4(S)-(.sup.4-히드록시페닐)-2-아제티디논;
1-(4-플루오로페닐)-3(R)→3(R)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4 (S)-(4-히드록시페닐)-2-아제티디논;
4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필)-1-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필)-1(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
1-(.sup.4-플루오로페닐)-3(R)-3(S)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4 (S)→4-(페닐메톡시)페닐!-2-아제티디논;
3(R)→3(R)-아세틸옥시)-3-페닐프로필!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
3(R)→3(S)-아세틸옥시)-3-페닐프로필!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
3(R)→3(R)-(아세틸옥시)-3-(4-f플루오로페닐)프로필!-4(S)-4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-플루오로페닐)-2-아제티디논;
3(R)→3(S)-(아세틸옥시)-3-(4-플루오로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시) 페닐!-1-(4-플루오로페닐)-2-아제티디논;
3(R)→3(R)-(아세틸옥시)-3-(4-클로로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-클로로페닐)-2-아제티디논;
3(R)→3(S)-(아세틸옥시)-3-(4-클로로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-클로로페닐)-2-아제티디논; 및
rel 1-(4-플루오로페닐)-4(S)-(4-히드록시페닐)-3(1R)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-2-아제티디논.
그런 히드록시 치환된 아제티디논은 쉐링사(Schering Corporation)의 미국 특허 제 5,846,966호 및 5,767,115호에 설명되어 있고 청구되어 있다. 특히 "Ezetimibe"로 언급되는 2-아제티디논 유도된 억제제 및 쉐링사에서 ZetiaTM이라는 상표로 시판되는 2-아제티디논 유도된 억제제가 본원에서 바람직하게 사용된다.
또 다른 구체예에서 본 발명의 범주 내에 있는 콜레스테롤 흡수 억제제는 담즙산 운반체 또는 재흡수의 억제제일 수 있으며, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 회장의, 정점의 및 간 운반 억제제를 포함한다.
창자의 루멘으로부터 담즙산의 재순환과 혈청 콜레스테롤 감소 사이의 인과관계가 밝혀졌으며, 회장 담즙산 운반 억제제인 "IBAT"는 현재 콜레스테롤을 저하시키고 아테롬성 동맥경화증을 치료하는 데 있어서의 그것의 역할에 대해 광범위하게 연구조사되고 있다. 스테드론스키37 )는 담즙산과 콜레스테롤을 둘러싼 생화학, 생리학 및 공지의 활성 제제에 대해 논의한 바 있다.
본 발명에 유용한 일부 IBAT 억제제는 PCT/US95/10863에 개시되어 있다. 더 많은 IBAT 억제제가 PCT/US97/04076에 기재되어 있다. 본 발명에 유용한 추가의 IBAT 억제제는 미국 출원 일련번호 제 08/816,065호에 기재되어 있다. 본 발명에 유용한 더 많은 IBAT 억제제 화합물이 WO 98/40375에 개시되어 있다. 본 발명에 유용한 추가의 IBAT 억제제 화합물의 목록은 미국 특허 제 5,994,391호에 개시되어 있다.
추가의 IBAT가 담즙산 운반 억제 화합물을 개시한 다양한 획스트 악티엔게젤샤프트 특허 출원에 의해 개시되었고, 각 출원을 별도로 표시하면 다음과 같다:
H1. 캐나다 특허 출원 제 2,025,294호.
H2. 캐나다 특허 출원 제 2,078,588호.
H3. 캐나다 특허 출원 제 2,085,782호.
H4. 캐나다 특허 출원 제 2,085,830호.
H5. 유럽 특허 출원 제 0 379 161호.
H6. 유럽 특허 출원 제 0 549 967호.
H7. 유럽 특허 출원 제 0 559 064호.
H8. 유럽 특허 출원 제 0 563 731호.
본 발명의 범주 내에서 다른 담즙산 운반 억제제로는 선택된 벤조티에핀, 예컨대 WO 93/321146, PCT/US97/04076, PCT/US95/10863, EP 508425, FR 2661676, WO 99/35135, WO 92/18462, 및 미국 특허 제 5,994,391호 (Lee et al.)에 개시된 것들이 있다.
웰컴사 (Wellcome Foundation Limited)의 WO 92/16055에는 많은 수의 적당한 벤조티아제핀 화합물이 기재되어 있다. 추가의 히포리피데믹(hypolipidemic) 벤조티아제핀 화합물 (특히 2,3,4,5-테트라히드로벤조-1-티-4-아제핀 화합물)은 특허 출원 제 WO 96/05188, WO 96/05188 및 WO 96/16051에 개시되어 있다.
추가의 IBAT 억제제 화합물로는 이치하시 등의 문헌에 설명된 나프탈렌 부류 화합물이 있다 (T. Ichihashi et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 284(1), 43-50 (1998)). 이 부류에서 S-8921 (메틸 1-(3,4-디메톡시페닐)-3-(3-에틸발레릴)-4-히드록시-6,7,8-트리메톡시-2-나프토에이트)가 특히 유용하다. S-8921의 구조는 상기 공보에서 식 B-20으로 표시되었다. 추가의 나프탈렌 화합물 또는 리그닌 유도체는 PCT 특허 출원 제 WO 94/24087에 기재되어 있다.
다른 IBAT로는 예를 들면 파마시아사(Pharmacia Corporation, IL & Monsanto, MO)에 의해 개발된 SC-635; 글락소스미스클라인사(GlaxoSmithKline)가 개발한 264W94; 시온지사(Shiongi)가 개발한 S-8921 및 (3R,5R)-3-부틸-3-에틸-2,3,4,5-테트라히드로-7,8-디메톡시-5-페닐-1,4-벤조티아제핀 1,1-디옥사이드가 있다.
다른 구체예에서 본 발명의 범주 내에 속하는 콜레스테롤 흡수 억제제는 안드로스탄 및/또는 안드로스텐 유도체이며, 안드로스탄 및/또는 안드로스텐은 아스코르브산과 결합되어 다음의 하나 또는 둘 이상의 일반식으로 표시된다:
Figure 112006021027945-PCT00003
상기 식에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6은 각각 수소, OH, 카보닐, 및 아스코르빌 부분으로부터 선택되며, R7은 수소이거나 어떠한 할로겐일 수 있다.
가장 바람직하게는 안드로스탄 또는 안드로스텐 패밀리의 화합물에 결합된 아스코르빌 부분은 다음 구조 중 하나 또는 둘 이상으로부터 개별적으로 선택된다:
Figure 112006021027945-PCT00004
Figure 112006021027945-PCT00005
Figure 112006021027945-PCT00006
Figure 112006021027945-PCT00007
Figure 112006021027945-PCT00008
상기 식들에서 M+는 어떠한 금속, 알칼리 토금속, 또는 알칼리 금속을 나타낸다.
식 ix) 내지 xx)의 아스코르빌 링커를 하나 또는 둘 이상 포함하고 있는 상기 식 vi) 내지 viii)의 안드로스탄/안드로스텐 화합물은 공지 방법에 의하여, 예를 들면 PCT/CA03/00824에 개시되어 있는 방법에 의하여 제조되거나, 또는 식 i) 내지 iv)의 화합물의 제조에 대하여 상술된 방법에 의하여 제조된 후 조정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "생물학적으로 허용될 수 있는 염"은 본원에서 설명되는 것과 같은 화합물의 원하는 생물학적 및/또는 생리적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 말한다. 따라서 본원의 모든 화합물에 대한 언급은 무기 및/또는 유기 산 및 염기와 함께 형성된 각각의 산 및/또는 염기 염에 대한 언급을 포함한다.
예시적인 산 부가 염으로는 아세트산염 (예컨대 아세트산 또는 트리할로아세트산, 예를 들면 트리플루오로아세트산으로 형성된 것들), 아디프산염, 알긴산염, 아스코르브산염, 아스파르트산염, 벤조산염, 벤젠술폰산염, 중황산염, 붕산염, 부티르산염, 시트르산염, 캄포산염, 캄포술폰산염, 시클로펜탄프로피온산염, 디글루콘산염, 도데실황산염, 헵탄산염, 핵산산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 2-히드로에탄술포네이트, 락트산염, 말레산염, 메탄술폰산염, 2-나프탈렌술폰산염, 니코틴산염, 질산염, 옥살산염, 펙틴산염, 과술폰산염, 3-페닐프로피온산염, 인산염, 피크르산염, 피발산염, 프로피온산염, 살리실산염, 숙신산염, 황산염, 술폰산염, 타르타르산염, 티오시안산염, 톨루엔술폰산염, 운데칸산염 등이 있다.
산 부분을 함유하는 그런 화합물은 다양한 또는 유기 및 무기 염기와 염을 형성할 수 있다.
따라서 본 발명은 예를 들어 선택된 스테롤 및/또는 스타놀을 포함하는 원래의 화합물뿐 아니라, 가능하다면 (즉 원래의 화합물이 유리 히드록실기를 포함하는 경우) 본 발명은 개시된 화합물의 생물학적으로 허용될 수 있는 금속, 알칼리토금속, 또는 알칼리 금속 염을 포함한다.
본원에서 설명되는 바와 같은 염은 상응하는 원래 화합물보다 수용성이므로 그것들의 효력 및 평가는 생체내에서나 시험관내에서 모두 증대될 수 있다.
본 발명의 화합물의 염 형성은 쉽게 수행될 수 있는데, 예를 들면 유리 OH 기를 함유하는 어떠한 원래 화합물을 일련의 염기 (예컨대 나트륨 메톡시드 또는 다른 금속 알콕시드)로 처리함으로써 상응하는 알칼리 금속염이 생성된다. 칼슘, 마그네슘, 망간, 구리, 아연, 등의 다른 금속 염도 원래 화합물을 적당한 금속 알콕시드와 반응시킴으로써 생성될 수 있다.
이들 유도체의 형성과 관련하여, 선택된 합성 과정이 설명된 한편으로, 개시되고 청구되는 다양한 유도체가 제조될 수 있는 많은 다른 방법들이 있음이 명백하다. 일단 특정 유도체가 선택되면, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 기법들을 사용하여 합성을 수행하는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자들의 영역에 속할 것이다. 이런 이유로 각각의 모든 청구되는 유도체의 완전한 합성 과정은 생략하기로 한다.
본원에 기재된 화합물 및 그것의 염은 그것들의 토토머 형태로 존재할 수 있기 때문에 그런 토토머 형태는 모두 본 발명의 일부로서 본원에 포함된다.
본 발명의 화합물들의 모든 입체이성질체, 예컨대 경상이성질체 형태 (비대칭 탄소가 없을 때에도 존재할 수 있다)와 부분입체 이성질체 형태를 포함하여 다양한 구성요소에 대한 비대칭 탄소로 인해 존재할 수 있는 모든 화합물들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 발명의 화합물의 각 입체이성질체는 예를 들면 라세미 혼합물로서 또는 다른 나머지 모든 입체이성질체, 또는 선택된 다른 입체이성질체와 혼합될 수 있다. 화합물의 키랄 중심은 IUPAC 1974 권장사항에 의해 규정되는 바 S 또는 R 형태를 취할 수 있다. 그런 입체이성질체는 종래의 기법, 즉 경상이성질체 출발 물질을 반응시키거나 본 발명의 화합물의 이성질체를 분리함으로써 제조될 수 있다. 부분입체이성질체 또는 경상이성질체 생성물이 제조되면 그것들은 종래 방법에 의해, 예를 들면 크로마토그래피 또는 분획 결정에 의해 분리될 수 있다.
이성질체는 기하학적 이성질체, 예를 들면 cis-이성질체 또는 이중 결합을 가로지르는 trans-이성질체를 포함한다. 그런 이성질체는 모두 본 발명에 유용한 화합물로 간주된다.
본 발명에 유용한 화합물은 또한 토토머를 포함한다.
본 발명은 다음의 다중약물 내성 유전자: ABCB1 (MDR-1); ABCA2 (ABC2); ABCB2 (TAP); ABCB3 (TAP); ABCC1 (MRP-1); ABCC3 (MRP-3)의 발현을 전체적으로 억제하는 한편, 본원에 개시되는 콜레스테롤 흡수 억제제는 특히 그것의 유전자 생성물로서 P-당단백질을 생성하는 MDR-1 (ABCB1)의 발현을 억제하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다. 또한 본원에서 설명되는 것과 같은 콜레스테롤 흡수 억제제는 MDR-1 유전자에 의해 발현되는 P-당단백질의 생성을 억제하는 데 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.
사용 방법
본 발명의 한 측면에 따르면 동물 세포에서 다중-약물 내성 유전자의 발현을 억제하는 방법이 제공되는데, 그 방법은 본원에서 설명되는 것과 같은 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 동물에게 투여하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 최소한 하나의 화학요법제와 본원에서 설명되는 것과 같은 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제를 포함하는, 암치료에 사용하기 위한 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 암에 걸린 동물에게서 화학요법제의 효능을 증강시키는 방법이 제공되는데, 그 방법은 최소한 하나의 화학요법제와 본원에서 설명되는 것과 같은 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 상기 동물에게 투여하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 동물 세포가 나타내는 다중-약물 내성 표현형을 역전시키는 방법이 제공되는데, 그 방법은 본원에서 설명되는 것과 같은 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량에 세포를 노출시키는 것으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 동물 세포에서 다중약물 내성 유전자에 의해 발현된 단백질의 생성을 억제하는 방법이 제공되는데, 그 방법은 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 동물에게 투여하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면 최소한 2가지 별도 성분:
a) 본원에서 설명되는 것과 같은 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제를 포함하는 조성물; 및
b) 최소한 하나의 화학요법제를 포함하는 조성물을 각 조성물의 투여에 대해 설명하는 지시사항과 함께 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 일반적으로 암, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 유방암, 전립선암, 간암, 췌장암, 신장암, 위암, 장암, 결장암, 폐암, 뇌암, 부신피질암, 골수암, 태내 간(stem)세포암, 유조직암, 상피암, 림프 변종 (호지킨성 및 비-호지킨성 임파종 포함), 뼈암, 고환암, 자궁경부암, 자궁암, 식도암, 구강암 및 피부암의 치료에 사용하기에 적당하다.
환자가 이전에 화학요법제 (하나 또는 둘 이상의 항암 약물의 조합)로 치료받지 않았을지라도, 진단시 높은 수준의 P-당단백질을 빈번하게 나타내는 그런 암을 치료할 때 효과가 뚜렷한 것으로 추정된다. 그런 암으로는 결장암, 신장암, 유방암, 부신피질암 및 간암이 있으며, 그것들에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법, 조성물 및 키트를 어떠한 하나의 특정 암 화학요법제 또는 제제들의 조합에 한정시키려는 의도는 없다. 그러나 바람직한 화학요법제로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 모든 소수성, 및 헤테로고리형 암 화학요법제, 예를 들면 아드리아마이신 (독소루비신), 포스페이트, 콜세미드, 에토포시드, 파클리탁셀, 비산텐, 빈크리스틴, 및 빈블라스틴이 있다.
본 발명의 조성물은 콜레스테롤 흡수 억제제와 선택된 화학요법제가 실질적으로 동시적인 방법으로, 예를 들면 정해진 비율의 활성 성분을 가지는 단일 정제 또는 캡슐로 공동-투여되거나, 또는 각 부분에 대하여 별도로 여러 번 투여되는 "연합 치료"를 가능하게 한다. 이 별도의 투여는 순차적인 단위용량 형태를 포함한다.
더욱 명백하게 설명하자면, 이 "연합 투여"는 이들 치료제를 실질적으로 동시적인 방식으로, 예컨대 고정된 비율의 활성 성분을 가지는 단일 단위용량 형태로 공동-투여하거나 또는 각 제제에 대하여 별도의 단위용량 형태를 여러 번 투여하는 것을 포함한다. 또한 그런 투여는 순차적인 방식으로 각 유형의 제제를 사용하는 것도 포함한다. 어느 경우든지 치료 처방은 본원에서 약술한 하나 또는 둘 이상의 치료 목표를 달성하는 데 약물 조합이 유익한 효과를 가져다 줄 것이다.
따라서 본 발명은 하나 또는 둘 이상의 다음의 치료 목표:
a) 암을 치료하거나 완화시킨다;
b) 종양 성장을 방지, 치료 또는 완화시킨다;
c) 하나 또는 둘 이상의 다중약물 내성 유전자의 발현을 억제 또는 감소시킨다;
d) 다중약물 내성 유전자에 의해 발현된 하나 또는 둘 이상의 단백질의 생성을 억제 또는 감소시킨다;
e) 암의 치료에 사용되는 화학요법제의 효능을 증강시킨다; 및
f) 하나 또는 둘 이상의 화학요법제에 대해 세포를 민감하게 만든다;
를 이루는 다양한 수단을 제공하는데, 그것은 동물 또는 동물로부터 유도된 세포 또는 상기 동물 체내에, 비-독성의 치료적으로 효과적인 양의, 본원에서 설명된 것과 같은 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제 및 최소한 하나의 암 화학요법제를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 본원에 개시된 어떠한 징후에 대해, 보다 구체적으로 말하면 상기에서 규정된 하나 또는 둘 이상의 치료 목표를 달성하기 위하여 개시된 화합물 및 조성물 중 어느 것이든지 사용하는 것을 포함한다.
특히, 또는 보다 확실하게 말하자면, 콜레스테롤 흡수 억제제와 화학요법제의 공동-투여 (반드시 동시에 투여되거나 바로 이어서 투여되지 않더라도)는 다중-약물 내성 유전자의 발현을 효과적으로 억제함으로써, 그것의 해당하는 단백질, 예컨대 P-당단백질의 생성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 그런 감소는 암 화학요법제가 동물 세포로부터 유출되는 것을 방지하여 제제의 효능을 최대화한다.
지금까지는 콜레스테롤 흡수 억제제가 다중-약물 내성에 미치는 상당한 효과에 대해 인지되지 않았었다. 그런 약물 내성을 극복하는 분야의 연구가 있긴 하였지만 그 초점은 예를 들면 MDR-1 유전자에 선택적으로 결합하는 화합물의 고안에 의해 P-당단백질 억제나 MDR 발현에 미치는 다른 화합물의 효과를 조절하는 것에 맞추어져 있었다. 그렇게 철저하지는 않지만 그런 연구에 대한 개요를 아래에 제시한다.
WO0213815는 그 자체로서는 약리학적 활성이 없지만 장 벽에 존재하는 p-당단백질을 억제함으로써 다른 활성 성분의 생체 내 활용성을 증강시키는 것으로 주장되는 선택 화합물 (상기 공보에서 식 I로 표시됨)을 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다. 이것은 그렇지 않았으면 빈약하게 흡수되었을 활성 성분 (예컨대 항암제)의 흡수를 가능하게 한다.
WO02034291은 MDR-1 유전자에 결합하여 유전자 발현을 선택적으로 억제하는 분자를 개시한다. 이들 약물에 대한 전달 시스템은 지질을 내포하는 비-중합체 시스템을 포함한다. 또한 상기 공보에는 MDR 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 HIF-1 SUMO-1 복합체 차단제와 접촉시키는 것으로 이루어지는, MDR 유전자 발현의 억제 방법이 개시된다.
WO0160349는 피콜린산, 푸사르산 및 그것들의 유도체를 포함하는 약리학적 제제를 개시한다. 푸사르산 성분은 고수준의 p-당단백질로 세포의 성장을 조절하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 푸사르산은 MDR-결합 약물에 내성인 종양의 처리에 어떤 역할을 할 것으로 추측된다. 동일한 발명자에 의한 WO0220486에는 또한 유사한 정보가 개시되어 있음이 주지된다.
WO0048571은 n-벤조일-스타우로스포린을 포함하는 약제학적 조성물과 그것의 항종양, 항증식제로서의 용도를 개시한다. WO0226208은 화학요법제를 전달하기 위한 토콜-기저 과립 에멀션을 개시한다. 그 에멀션은 하나 또는 둘 이상의 토콜, 계면활성제, 임의의 보조-용매 및 화학요법제를 포함한다.
미국 특허 제 5,639,887호에는 독소루비신, 빈크리스틴 및 비산트렌과 같은 화학요법제에 대하여 다중약물 내성 세포를 다시 민감하게 만드는 데 효과적인 다양한 이중고리형 아민이 설명되어 있다. 미국 특허 제 5,670,507호에는 mdr-1의 과잉 발현 때문에 소수성 화학요법제에 둔감한 종양의 MDR 표현형을 역전시키는 방법이 교시되는데, 그 방법은 두 가지 개시된 식으로부터 선택된 긴 사슬 아미노 알코올 화합물의 유효량을 투여하는 것으로 이루어진다.
미국 특허 제 5,866,699호에는 뉴클레오시드 결합 부위를 코드화하는 부분인 최소한 일부분의 MDR-1 유전자, 또는 그것의 전사물에 상보하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 합성 올리고뉴클레오티드가 개시되어 있다. 또한 이 특허에는 그런 올리고뉴클레오티드를 함유하는 약제학적 제형, 및 MDR 암세포의 처리 방법, 세포에서 P170의 발현을 방지하는 방법, 및 암세포에서 MDR의 유도를 방지하는 방법이 개시되어 있다.
미국 특허 제 5,874,567호에는 사람 MDR-1 유전자의 상보하는 서열과 사람 세포에서 특이하게 혼성화하는 서열과 그 세포에 의해 나타난 다중약물 내성 표현형의 발현을 억제하기 위한 그것의 대립 유전자 변이체를 가지는 것을 포함하여 길이가 15 내지 30 뉴클레오티드 사이인 변형 올리고뉴클레오티드가 교시된다. 상보하는 서열은 SEQ ID No: 103, 104 및 105 (본원에 기재됨)로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 변형은 디티오에이트, 메틸포스포네이트, 모르폴리노, 폴리아미드, 또는 이것들의 어떠한 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 골격 변형을 포함한다.
미국 특허 제 6,162,616호에는 변종 MRP-베타를 약화시키는 데 사용하기 위한 조성물이 개시된다. 유전자 발현, 단백질 생성 및/또는 단백질 기능은 MRP-베타를 포함한다. 핵산, 프로브와 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며, MRP-베타. 폴리펩티드 및 항체, MRP-베타. 숙주 세포, 및 MRP-베타에 대하여 형질 전환된 또는 불활성화(nullizygous)된 비-사람 포유류의 발현.
MDR을 극복하기 위하여 콜레스테롤 흡수 억제제를 사용하는 것에는 추가의 장점이 따른다. 본원에 기술된 몇 가지 콜레스테롤 흡수 억제제 (상기에서 식 i) 내지 식 iv)로 표시되는 화합물들)는 아스코르빌 부분을 포함한다. 이들 특정 화합물은 수많은 부가 장점을 나타낸다. 첫 번째이면서 가장 중요한 것은 화합물의 용해도가 수용액과 비-수성 매질, 예컨대 오일과 지방에서 모두 크게 증가했다는 것이다. 이런 보다 큰 용해도를 이용하면 치료 단위용량은 효율적이 되고 부수적으로 비용도 절감될 수 있다. 두 번째로 이들 유도체는 열에 안정성이고 (산화 및 가수분해에 안정하다), 이것은 일부 가공처리 메커니즘에는 필수적이다.
본원에 기술된 바람직한 효과는 상이한 많은 방법으로 이루어질 수 있다. 콜레스테롤 흡수 억제제 및 화학요법제는 약물과 함께 사용하기 위해 활용할 수 있는 종래 수단에 의해, 즉 약제학적으로 허용될 수 있는 담체와 함께 별도로 또는 함께 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 약 1 % 내지 99 %의 "활성" 성분을 포함하며, 바람직하게는 약 5 % 내지 95 %의 활성 성분을 포함한다.
제형 및 약제학적 조성물은 종래의 약제학적으로 허용될 수 있는 부형제, 및 첨가제를 사용하여, 종래 기법에 의해 제조될 수 있다. 그런 약제학적으로 허용될 수 있는 부형제 및 첨가제로는 비-독성 적합성 충전제, 결합제, 붕괴제, 완충제, 보존제, 항산화제, 윤활제, 풍미제, 농축제, 착색제, 유화제 등이 있다.
원하는 효과를 이루기 위해 필요한 콜레스테롤 흡수 억제제의 정확한 양 또는 단위용량은 물론 많은 요인, 예컨대 선택된 특정 화합물 또는 조성물, 투여된 화합물 또는 조성물의 효능, 투여되는 제형 형태, 투여 방식 및 환자의 연령, 체중, 상태 및 반응에 따라 달라질 것이다. 다른 것들 중에서도 이들 요인들이 임상의가 각각의 개체 또는 환자와 관련하여 주의를 기울여 고려하는 사항이 될 것이다.
일반적으로 식 (i) 내지 viii) 중 하나로 표시되고 스테롤 및/또는 스타놀을 포함하는 콜레스테롤 흡수 억제제의 하루의 총 단위용량은 하루에 10 mg 내지 약 20 g, 더욱 바람직하게는 10 mg 내지 1.5 g, 가장 바람직하게는 800 mg까지의 단위용량 범위로, 1회에 또는 여러 번으로 나뉘어 투여될 수 있다.
선택된 콜레스테롤 흡수 억제제가 스테롤 또는 스타놀이면, 그것이 화합물 또는 유도체의 부분으로서든 유리 형태로든 하루에 6 g의 스테롤 및/또는 스타놀을 포함하는 형태로 투여될 수 있다. 하루에 더 많은 양의 스테롤, 스타놀 및 그것들의 유도체의 규정이라도 과잉량은 단순히 정상적인 분비 채널을 통과할 것이기 때문에 동물 숙주에는 해롭지 않다는 것이 인지되어야 한다.
콜레스테롤 흡수 억제제가 치환된 아제티디논이라면, 하루 용량으로 체중 kg 당 약 0.1 내지 약 30 mg의 양으로, 바람직하게는 약 0.1 내지 15 mg/kg의 양으로, 가장 바람직하게는 10 mg/kg/일의 양으로 투여될 수 있다. 평균 체중이 70 kg이라면 단위용량 수준은 약 5 gm 내지 약 1000 mg의 약물이고, 이것은 바람직하게는 하루에 1회 또는 2 내지 4회로 나누어진 단위용량으로 투여된다.
콜레스테롤 흡수 억제제가 담즙산 재흡수를 억제하는 어떠한 화합물인 경우, 그것은 개별적인 동물의 체중 kg당 약 0.003 mg 내지 20 mg의 양으로 투여될 수 있다. 일반적으로 IBAT 억제제의 하루의 총 용량은 약 0.01 내지 약 1000 mg/일, 바람직하게는 약 0.1 mg 내지 약 50 mg/일, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 10 mg/일의 범위일 수 있다.
콜레스테롤 흡수 억제제 및 화학요법제가 별도로 투여되는 경우에는 하루에 제공되는 각 성분의 단위용량의 수와 그런 단위용량의 양은 반드시 동일할 필요는 없다. 예를 들어 콜레스테롤 흡수 억제제는 하루에 화학요법제보다 더 여러 번 투여될 필요가 있거나 및/또는 더 많은 용량으로 투여될 필요가 있을 수 있다.
이들 콜레스테롤 흡수 억제제의 하루 용량은 1회의 단위용량으로 또는 여러번의 단위용량으로 필요에 따라 개체에게 투여될 수 있다. 지속적인 방출 단위용량이 사용될 수 있다.
본 발명의 실시를 위하여 본원에 개시된 화합물 및 조성물을 전신 투여에 적당한 단위용량 형태로 제형하기 위하여 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 사용하는 것은 본 발명의 범주 내에 속한다. 담체와 적당한 제조 실시를 적절하게 선택함으로써 본 발명의 화합물 및 조성물, 특히 용액으로서 제형되는 본 발명의 화합물 및 조성물은 비경구로, 예컨대 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 화합물 및 조성물은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 사용하여 경구 투여에 적당한 단위용량 형태로 쉽게 제형될 수 있다. 그런 담체는 본 발명의 화합물 및 조성물이 치료될 환자가 경구 섭치하기 위해 정제, 환, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 좌제 등으로 제형되는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 화합물을 하나 또는 둘 이상 포함하는 약제학적 조성물은 활성 성분이 그것의 의도된 목적을 달성하기 위한 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 유효량의 결정은, 특히 본원에 개시된 상세한 설명의 관점에서 당해 기술분야의 숙련자들의 영역 내에 있다.
활성 성분 외에 이들 약제학적 조성물은 활성 성분이 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공처리되는 것을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적당한 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위해 제형된 제제는 정제, 당의정, 캡슐, 또는 용액의 형태일 수 있다.
바람직한 형태로, 콜레스테롤 흡수 억제제는 리포솜의 형태로 투여된다. 리포솜은 하나 또는 둘 이상의 이중 지질층으로 구성된 중공 미소구이다. 그것은 30여년 전 이전부터 다양한 약물 물질에 대한 비히클로서 처음 사용되었는데, 그때 이래로 시험관 내에서 그것의 작용 방식을 알게 됨으로써 특정 질병의 특이한 치료에 대해 보다 합리적인 디자인을 집중할 수 있게 되었다.
리포솜의 형성은 얇은 지질막이 수화될 때 형성되어 일어난다. 수화된 지질 쉬트는 교반 중에 분리되고 자체-폐쇄되어 다중-라멜라 소포가 형성된다.
리포솜을 제조하는 방법은 당해 기술분야에 많이 알려져 있고 널리 실시되고 있다. 독소루비신과 같은 화학요법제는 흔히 수립된 방법을 사용하여 리포솜 내에 캡슐화된다.
전형적으로 100 nm 직경의 리포솜은 다양한 지질 혼합물의 클로로포름산 용액을 고진공에 노출하고, 계속해서 그 결과의 액체 막 (DSPC/CHOL, EPC/CHOL, DSPC/PEG-PE/CHOL)을 pH 4의 완충액으로 수화하고, 그것을 폴리카보네이트 처리된 필터를 통하여 축출한 다음 동결과 해동 과정을 거침으로써 제조된다. 그런 다음 경막 pH 구배를, 알칼리화제를 첨가함으로써 소포 밖의 매질의 pH를 7.5로 조정함으로써 만든다. 이 기법은 약염기가 pH 구배를 나타내는 막을 가로질러 재분배할 수 있는 능력을 이용한 것으로, 안의 [약물]/밖의 [약물]=안의 [H+]/밖의 [H+]이다.
그런 다음 선택된 약물은 소량의 약물 용액을 고온에서 소포 용액에 첨가함으로써 약물이 리포솜 내부에 축적되는 것을 가능하게 함으로써 소포 안에 포획된다. 트래핑 능률은 겔 여과 칼럼 상에서 리포솜으로부터 캡슐화된 약물을 분리하고, 지질 및 약물 함량에 대하여 액체 신틸레이션 카운팅, 형광 분광학 또는 UV-VIS 분광학에 의해 2개의 분획을 정량함으로써 측정된다. 그런 다음 이들 리포솜은 크기 분포 (준탄성 광산란, 주사 전자 현미경), 약물 흡수 및 방출 연구, 안정성, 및 생체 내 종양 표적화 효력에 대해 평가된다.
리포솜을 제조하는 데 사용하기 위한 바람직하지만 제한하지 않는 한 가지 방법은 아래의 실시예에서 설명된다.
보다 확실하게 설명하자면, 본 발명의 약제학적 조성물은 자체 공지된 어떠한 방식으로든지, 예컨대 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 트랩핑 또는 동결건조 방법에 의해 제조될 수 있다.
비경구 투여를 위한 약제학적 제형은 물에 녹을 수 있는 형태의 활성 성분의 수용액을 포함한다. 또한 활성 성분의 현탁액은 필요에 따라 기름기 있는 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예컨대 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜이 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로 현탁액은 또한 적당한 안정화제 또는 화합물이 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하기 위하여 화합물의 용해도를 증가시키는 제제를 함유할 수 있다.
경구 사용을 위한 약제학적 제제는 고체 부형제와 활성 성분을 조합하고, 그 결과의 혼합물을 임의로 갈아서 가루로 만든 다음, 과립 혼합물을 가공처리한 후 필요에 따라 적당한 보조제를 첨가하여 정제 또는 당의정 코어를 얻는다. 적당한 부형제로는 락토스, 슈크로스, 만니톨, 소르비톨, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 고무, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)이 있다. 필요에 따라 붕괴제, 예컨대 교차결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 그것의 염, 예컨대 알긴산 나트륨이 첨가될 수 있다.
당의정 코어에는 적당한 코팅이 제공된다. 이 목적을 위해서 농축된 당 용액이 사용될 수 있으며, 그것은 임의로 검 포스포, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 티타늄 디옥사이드, 락커 용액, 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 또는 안료가 정제 또는 당의정 코팅에 식별을 위해 또는 활성 화합물 용량의 상이한 조합의 특성을 나타내기 위해 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 약제학적 제제는 젤라틴으로 제조된 한번에 밀어넣는 (푸쉬-핏, push-fit) 캡슐, 및 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질의 밀폐된 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 활성 성분을 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 및/또는 탈크 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 및 임의로 안정화제화의 혼합 상태로 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서 활성 화합물은 적당한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한 안정화제가 첨가될 수 있다.
경구용 액체 제제는 예를 들면 에멀션, 시럽, 또는 연금약액의 형태일 수 있고, 또는 물 또는 다른 적당한 비히클로 사용 전에 재구성될 수 있는 건조 생성물로서 제공될 수 있다. 그런 액제 제제는 종래의 첨가제, 예컨대 현탁제, 예를 들면 소르비톨, 시럽, 메틸 셀룰로스, 젤라틴, 히드록시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 알루미늄 스테아레이트 겔, 수소 첨가된 식용 지방; 유화제, 예컨대 레시틴, 소르비탄 모노올레에이트, 또는 아카시아; 비-수성 비히클 (식용 오일을 포함할 수도 있다), 예컨대 아몬드유, 분류된 코코넛 오일, 오일성 에스테르, 예컨대 글리세린의 에스테르, 프로필렌 글리콜의 에스테르, 또는 에틸 알코올의 에스테르; 및 필요에 따라 종래의 풍미제 또는 착색제를 함유할 수 있다.
본 발명이 함께 또는 별도로 투여될 수 있는 활성 성분들이 조합된 조성물에 관한 것이기 때문에, 본원에는 그런 목적을 위한 키트가 또한 제공된다. 키트는 두개의 별도의 유닛이 연결되어 있으리라 예상되는데, 그것은 본원에서 설명되는 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제를 포함하는 약제학적 조성물과, 최소한 하나의 화학요법제를 포함하는 별도의 약제학적 조성물이다. 키트는 바람직하게는 별도의 성분들을 투여하기 위한 지시사항들을 포함할 것이다. 이런 유형의 키트 배열은 특히 성분들이 별도로 상이한 단위용량 형태로 (예컨대 경구 대 비경구 대 정맥내) 투여되어야 하거나, 상이한 단위용량 간격으로 투여되거나 또는 상이한 단위용량 양으로 투여되는 경우에 유용하다.
더 이상의 부연설명 없이 전술한 설명은 다른 사람들이 본원에서 설명되고 청구된 다양한 조건 하에서 현재의 또는 미래의 지식을 적용함으로써 본 발명을 응용할 수 있는 본 발명을 전체적으로 예시한다.
실시예 1 - 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 하나: 본원에서 "FM-VP4"로 불리는 아스코르빌 스타닐 포스페이트 에스테르의 형성
단계 1: 아스코르브산의 보호
발연 황산 (24 %, 8.3 g)을 아세톤 (50 ml)에 한 방울씩 첨가하였다. 그 혼합물에 0 ℃에서 아스코르브산 (12 g)을 첨가하고, 그 반응 혼합물을 0 ℃에서 6시간 동안 교반하였다. 얻어진 결정을 흡인(suction)하에 여과하고, 여과한 케이크를 건고상태로 압착한 다음 아세톤 (30 ml)으로 세척하였다. 생성물 5,6-이소프로필리덴 아스코르브산 (14 g)을 얻었다.
단계 2: 피토스타놀에의 부착
톨루엔 (500 ml)과 피리딘 (25 ml) 중의 피토스타놀 혼합물 (24 g)(캄페스타놀: 36.4 %; 시토스타놀: 62.3 %)의 용액을 톨루엔 (200 ml)중의 옥시염화 인 (9 ml) 혼합물에 0 ℃에서 한 방울씩 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 피리딘 염산염을 여과로 제거하고, 모액을 농축하여 톨루엔을 회수하였다. 그 잔류물을 건조 THF (100 ml)에 녹이고, 건조 THF (400 ml)중의 상기 보호된 아스코르브산 (14 g)용액을 0 ℃에서 한 방울씩 첨가하였다. 그것을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용액을 농축하여 용매를 제거하였다. 에탄올 (400 ml)과 3 N HCl (200 ml)을 첨가하고, 그 혼합물을 50 ℃로 30분 동안 가열한 후 농축하였다. 에틸 아세테이트 (600 ml)를 첨가하고, 그 결과의 용액을 물로 세척한 후 (3×300 ml), 인산 나트륨 상에서 건조한 후, 농축하여 생성물 (피토스타놀-포스페이트-아스코르브산염)을 백색 분말로서 얻었다. 22 g.
단계 3: 나트륨 염으로의 전환
상기 제조된 산 (17 g)을 에탄올 (100 ml)에 녹이고, 에탄올 (50 ml)중의 메톡시화 나트륨 (2.7 g) 용액을 교반하면서 실온에서 첨가하였다. 교반을 첨가 후 30분 동안 계속하였다. 그 결과의 백색 케이크를 여과하고, 건조한 후 중량을 측정하였고, 백색 분말 20 g을 얻었다 (피토스타놀-포스페이트-아스코르스반 나트륨).
실시예 2 - 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 하나: 데히드로이소안드로스테론의 2나트륨 아스코르빌 포스페이트 에스테르의 형성
건조한 둥근 바닥 플라스크에 아세톤 (150 ml)과 L-아스코르브산 (50 g)을 0 ℃에서 첨가하였다. 염화 아세틸 (7.5 ml)을 첨가 깔때기를 통하여 10분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 0 ℃에서 24시간 동안 교반하였다. 침전을 여과로 제거하고, 아세톤으로 세척하였다 (3×20 ml). 백색 생성물인 5,6-이소프로필리덴 아스코르브산을 1.5시간 동안 진공 하에 건조시켜서 건조한 분말 (52 g)을 얻었다. 수율 85 %.
건조한 3개의 둥근 바닥 플라스크에 교반 막대, 아르곤 유입구와 첨가 깔때기를 장착하였다. 무수 THF (15 ml)와 피리딘 (2.4 ml)중의 데히드로이소안드로스테론 (1.73 g, 6 mmol)의 용액을 무수 THF (12 ml)와 POCl3 (0.7 ml, 7.5 mmol)의 혼합물에 0 ℃에서 10분 동안 한 방울씩 첨가하였다. 백색 침전이 즉시 형성되었다. 현탁액을 0 ℃에서 40분 동안 교반하고, 실온에서 1시간 40분 동안 교반하였다.
상기 현탁액에, 무수 피리딘 (3 ml)과 THF (30 ml)중의 5,6-이소프로필리덴 아스코르브산 (3.6 g, 16.67 mmol)의 용액을 0 ℃에서 20분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 현탁액을 0 ℃에서 30분 동안 교반하고, 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 형성된 염화 피리디늄을 여과로 제거하여 THF로 2회 세척하였다. 용매를 감압하에 40 ℃에서 증발시켜서 잔류물을 얻었다.
잔류물을 THF (40 ml)에 녹이고, 거기에 2 N HCl (30 ml)을 일부씩 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. THF를 감압하에 증발시켰다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다 (4×50 ml). 에틸 아세테이트 용액을 조합하여 염수로 세척하고 (100 ml), Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시켜서 잔 류물을 얻었다. 그 잔류물을 CHCl3에 녹인 후, 핵산을 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 침전된 고체를 여과하고, 핵산으로 세척한 다음 진공하에 건조시켰다 (2.43 g, 미정제 생성물, 수율: 77 %). 포스페이트 에스테르의 정제를 역상 C-18 크로마토그래피 (Waters, 물/메탄올=90/10 내지 60/40)에 의해 수행하였다. 순수한 화합물 4 (도 1, 39 mg)를 50 mg의 미정제 생성물로부터 분리하였다. 전체 수율은 60 %였다 (데히드로이소안드로스테론을 토대로 함).
데히드로이소안드로스테론의 아스코르빌 포스페이트 에스테르 (0.5 g, 0.95 mmol)를 실온에서 메탄올 (30 ml)에 녹인 후, 메탄올중의 메톡시화 나트륨 (1 ml, 20 %)을 첨가하였다. 그 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과하고, 메탄올, 아세톤 및 핵산으로 세척하였다. 모액을 2 ml로 농축하고, 아세톤을 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 추가의 백색 고체를 얻었다. 고체를 조합하여 진공하에 실온에서 건조시켰다. 데히드로이소안드로스테론의 2나트륨 아스코르빌 포스페이트 에스테르를 얻었다 (0.49 g, 91 % 수율).
실시예 3 - 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 다른 하나: 5α-안드로스탄-3β-올-17-온의 2나트륨 아스코르빌 포스페이트 에스테르의 합성
건조한 둥근 바닥 플라스크에 5α-안드로스탄-3β-올-17-온 (1.0 g, 3.4 mmol), THF (8.6 ml) 및 피리딘 (1.38 ml)을 넣었다. 그 혼합물을 실온에서 투명한 용액이 얻어질 때까지 교반하였다. 다른 건조한 둥근 바닥 플라스크에 THF (6.9 ml)와 POCl3 (0.4 ml, 4.25 mmol)를 첨가하고, 0 ℃에서 5분 동안 교반하였다. 이 혼합물에 상기에서 제조한 5α-안드로스탄-3β-올-17-온 용액을 아르곤 분위기 하에서 10분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 첨가후 백색 현탁액을 0 ℃에서 35분 동안 교반하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응을 중지하고, 백색 현탁액을 여과 없이 결합 반응에 사용하였다.
5,6-이소프로필리덴 아스코르브산 (2.0 g, 9.52 mmol)을 피리딘 (1.71 ml)과 THF (17 ml)에 녹였다. 앞서 제조한 백색 현탁액을 포함하고 있는 둥근 바닥 플라스크를 냉수조에 담갔다. 이 혼합물에 상기 제조된 5,6-이소프로필리덴 아스코르브산의 THF 용액을 교반하에 0 ℃에서 15분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 첨가 후에 혼합물을 0 ℃에서 25분 동안 교반하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 염화 피리디늄의 백색 용액을 여과하고, THF (8 ml)로 세척하였다. 여과물을 농축하여 THF와 과잉 피리딘을 제거하여 잔류물을 얻었다 (2.38 g).
잔류물을 THF (30 ml)에 녹이고, 1 N HCl (30 ml)을 일부씩 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 16시간 45분 동안 교반하였다. 그 반응 혼합물에 실온에서 12 N HCl (4 ml)을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 추가로 4시간 45분 동안 교반하였다. THF를 감압하에 증발시켰다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3×60 ml). 에틸 아세테이트 용액을 조합하여 식염수 (60 ml)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 추출물을 약 3 ml로 농축하였다. 핵산 (15 ml)을 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 침전된 고체를 여과로 제거하여 핵산으로 세척한 다음 감압하에 건조하였다 (1.48 g).
5α-안드로스탄-3β-올-17-온 (0.5 g, 0.95 mmol)의 아스코르빌 포스페이트 에스테르를 메탄올 (3 ml)중에 실온에서 녹인 후, 메탄올 중의 메톡시화 나트륨(1.5 ml, 20 %)을 첨가하였다. 그 현탁액을 실온에서 25분 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과하고, 메탄올, 아세톤 및 핵산으로 세척하였다. 모액을 2 ml로 농축한 후, 아세톤을 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 추가의 생성물을 얻었다. 고체를 조합하여 감압하에 실온에서 건조하여 5α-안드로스탄-3β-올-17-온의 2나트륨 아스코르빌 포스페이트 에스테르를 얻었다 (0.38 g). 전체 수율은 57 %였다 (5α-안드로스탄-3β-올-17-온을 토대로 함).
실시예 4 - 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 다른 하나: 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올의 2나트륨 아스코르빌 포스페이트 에스테르의 합성
건조한 둥근 바닥 플라스크에 3β-아세톡시안드로스트-5-엔-17β-올 (1.0 g, 3.0 mmol), 무수 THF (6.3 ml) 및 피리딘 (0.73 ml)을 넣었다. 그 혼합물을 실온에서 투명한 용액이 얻어질 때까지 교반하였다. 다른 건조한 둥근 바닥 플라스크에 THF (2 ml)와 POCl3 (0.35 ml, 3.22 mmol)를 첨가하고, -5 ℃ 내지 -10 ℃에서 5분 동안 교반하였다. 이 혼합물에 상기에서 제조한 3β-아세톡시안드로스트-5-엔-17β-올 용액을 아르곤 분위기 하에서 20분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 첨가 후 백색 현탁액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 혼합물을 농축하여 THF와 과잉 POCl3를 제거하고 잔류물을 얻었다.
5,6-이소프로필리덴 아스코르브산 (0.98 g, 4.55 mmol)을 무수 피리딘 (0.70 ml)과 THF (6.2 ml)에 녹였다. 잔류물을 건조 THF (40 ml)에 녹였다. 이 혼합물에 상기에서 제조한 5,6-이소프로필리덴 아스코르브산의 THF 용액을 교반하에 0 ℃에서 20분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 첨가 후에 혼합물을 실온에서 1시간 25분 동안 교반하였다. 염화 피리디늄의 백색 용액을 여과하고, THF (6 ml)로 세척하였다. 여과물을 농축하여 THF와 과잉 피리딘을 제거하여 잔류물을 얻었다.
그 잔류물을 에탄올 (12.5 ml)과 1 N HCl (12.5 ml)의 혼합물에 녹였다. 그 혼합물을 50 ℃ 내지 55 ℃에서 추가로 3시간 45분 동안 교반을 계속하였다 (TLC 모니터링). 혼합물을 에틸 아세테이트 (60 ml)로 추출하고, 10 % 수성 NaCl로 2회 세척한 다음 (30 ml, 20 ml), Na2SO4 (10 g)상에서 1.5시간 동안 건조하였다. 여과 후에 여과물을 5 ml로 농축하였다. 거기에 핵산 (10 ml)을 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 침전을 수집하고, 핵산으로 세척한 다음 (10 ml) 감압하에 건조하여 약간 노란색의 분말을 얻었다 (0.95 g, 미정제 생성물, 수율 60 %). 순수한 생성물을 예비 HPLC에 의해 얻었다.
기구는 Waters Delta Preparative 4000 HPLC 시스템이다. 칼럼은 Waters Symmetry C18, 5 ㎛, 30×100 mm이다. 이동 상은 물과 아세토니트릴 중의 0.1 % H3PO4이다. 물과 아세토니트릴은 HPLC 등급이거나 그것과 동등하다.
미정제 생성물을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 수집하여 회전 증발기상에서 증발시켜서 아세토니트릴을 제거하였다. 수용액을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 후 감압하 에 건조시켜서 백색 분말 생성물을 얻었다. 이 생성물에 대해 NMR 분석 및 질량 스펙트럼 분석을 하였다. 두 가지 스펙트럼 모두 생성물이 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올의 아스코르빌 포스페이트 에스테르인 것을 나타냈다.
안드로스트-5-엔-3β,17β-디올의 2나트륨 아스코르빌 포스페이트 에스테르 (5, 도 3)의 제조는 실시예 3에서 설명한 과정과 유사하였다.
실시예 5 - 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 다른 하나: 안드로스트-5-엔-17β-올의 2나트륨 아스코르빌 포스페이트 에스테르의 합성
0 ℃의 무수 THF (10 ml)중의 피리딘 (0.41 ml) 및 1,2-페닐렌포스포로클로리다이트 (0.6 ml, 5 mmol)의 용액에 무수 THF (10 ml)중의 데히드로이소안드로스테론 (1.44 g, 5 mmol)을 10분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 그 반응을 TLC (핵산/EtOAc = 2/1)로 모니터하였다. 형성된 염화 피리디늄을 여과하고, THF로 세척하였다. 용매를 40 ℃에서 증발시켜서 백색 분말을 얻었다.
미정제 포스페이트 에스테르를 염화 메틸렌 (25 ml)에 녹이고, 요오드 (1.27 g)로 4시간 동안 실온에서 처리하였다. 그 반응 혼합물을 염화 메틸렌 (75 ml)으로 희석하고, 1 N NaOH (2×50 ml) 및 물 (2×50 ml)로 세척한 후, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 제거하고, 생성물 (1.4 g, 수율 71 %)을 염화 메틸렌 및 메탄올로부터 결정화하였다.
3β-요오도안드로스트-5-엔-17-온 (1.27 g, 3.19 mmol)을 얼음상 아세트산 (40 ml)에 50 내지 55 ℃에서 녹이고, 활성화된 아연 분진 (2.7 g)을 일부씩 첨가하였다. 그 혼합물을 50 내지 55 ℃에서 2시간 동안 교반하고, 아연 분진을 여과한 후 염화 메틸렌으로 세척하였다. 그 용액을 염화 메틸렌 (120 ml)으로 희석하고, 물 (2×100 ml), 1 N NaOH (2×100 ml) 및 물 (100 ml)로 세척한 후, Na2SO4 상에서 건조하였다. 용매를 제거하여 백색 분말을 얻었다. 백색 분말을 진공하에 건조시켜서 안드로스트-5-엔-17-온 (0.83 g, 수율: 95 %)을 얻었다.
안드로스트-5-엔-17-온 (0.65 g, 2.34 mmol)을 메탄올 (25 ml)중에 실온에서 녹였다. 그 용액을 0 ℃로 냉각하고, NaBH4 (50 mg)를 일부씩 첨가하였다. 그 혼합물을 0 ℃에서 3시간 동안 교반하고, TLC (핵산/EtOAc = 3/1)로 모니터하였다. 3시간 후 다른 부분의 NaBH4 (20 mg)을 첨가하고, 그 반응 혼합물을 0 ℃에서 추가로 반시간 동안 교반하였다. 수성 NH4Cl (5 %, 25 ml) 및 HCl (6 N, 5 ml)을 0 ℃에서 서서히 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 물 (100 ml)을 첨가하여 생성물을 완전히 침전시켰다. 침전된 고체를 여과하고 물로 세척한 후, 진공하에서 건조시켰다. 순수한 생성물 (0.62 g, 수율: 95 %)을 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻었다.
무수 THF (8 ml)와 피리딘 (1 ml)중의 안드로스트-5-엔-17β-올 (0.63 g, 2.3 mmol) 용액을 무수 THF (6 ml)와 POCl3 (0.28 ml, 3 mmol)의 혼합물에 0 ℃에서 5분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 그 현탁액을 0 ℃에서 50분 동안 교반한 후 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
상기 현탁액에 무수 피리딘 (1.2 ml)과 THF (12 ml)중의 5,6-이소프로필리덴 아스코르브산 (1.38 g)의 용액을 0 ℃에서 15분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 그 현탁액을 0 ℃에서 1.5시간 동안 교반한 후, 밤새 실온에서 교반하였다. 형성된 피리딘 염산염을 여과로 제거하여 THF로 2회 세척하였다. 용매를 40 ℃에서 감압하에 증발시켜서 잔류물을 얻었다.
그런 다음 잔류물을 THF (35 ml)에 녹이고, 거기에 2 N HCl (30 ml)을 일부씩 첨가하였다. 그 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. THF를 감압하에 증발시켰다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3×100 ml). 에틸 아세테이트 용액을 조합하여 식염수로 세척하고 (100 ml), Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시켜서 잔류물을 얻었다. 그 잔류물을 아세톤에 녹이고, 핵산을 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 침전된 백색 고체를 여과하고, 핵산으로 세척한 다음 진공하에서 건조시켰다 (0.82 g, 미정제 생성물, 수율: 70 %).
안드로스트-5-엔-17β-올의 2나트륨 아스코르빌 포스페이트의 제조는 실시예 2와 유사하였다.
실시예 6 - 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 다른 하나: 3β-아세톡시안드로스트-5-엔-7β,17β-디올의 4나트륨 모노아스코르빌 디포스페이트 에스테르의 합성
건조한 둥근 바닥 플라스크에 3β-아세톡시안드로스트-5-엔-7β,17β-디올 (0.5 g, 1.43 mmol), 피리딘 (0.83 ml) 및 THF (4 ml)을 넣었다. 그 혼합물을 실온 에서 투명한 용액이 얻어질 때까지 교반하였다. 다른 건조한 둥근 바닥 플라스크에 THF (5 ml)와 POCl3 (0.33 ml)를 첨가하고, -5 ℃ 내지 0 ℃에서 5분 동안 교반하였다. 이 혼합물에 상기에서 제조한 3β-아세톡시안드로스트-5-엔-7β,17β-디올 용액을 아르곤 분위기 하에서 15분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 첨가 후 백색 현탁액을 실온에서 2시간 45분 동안 교반하였다. 반응을 중지하고, 백색 현탁액을 여과 없이 결합 반응에 사용하였다.
5,6-이소프로필리덴 아스코르브산 (1.30 g, 6.02 mmol)을 피리딘 (1.16 ml)과 THF (5.8 ml)에 녹였다. 앞서 제조한 백색 현탁액을 포함하고 있는 둥근 바닥 플라스크를 냉수조에 담갔다. 이 혼합물에 상기 제조된 5,6-이소프로필리덴 아스코르브산의 THF 용액을 교반하에 0 ℃에서 15분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 첨가 후에 혼합물을 0 ℃에서 40분 동안 교반하고, 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 염화 피리디늄의 백색 고체를 여과하고, THF (5 ml)로 세척하였다. 여과물을 농축하여 THF와 과잉 피리딘을 제거하여 잔류물을 얻었다 (2.76 g).
이 미정제 화합물을 THF (30 ml)와 1 N HCl (30 ml)의 혼합물에 녹였다. 그 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반을 계속하였다 (TLC 모니터링). 1 N HCl (10 ml)의 두 번째 부분을 첨가하였다. 그 혼합물을 추가로 18.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물 중의 THF를 감압하에 제거하였다. 수성 현탁액을 에틸 아세테이트와 n-부탄올 (1:1, 110 ml)로 추출하였다. 유기 층을 증류수 (11 ml)로 세척하였다. 유기 층을 회전 증발기 상에서 농축하여 잔류물을 얻었다. 이 잔류물을 핵산으로 세척하고 (2×10 ml) 감압하에 건조시켜서 미정제 생성물을 얻었다 (1.15 g).
이 화합물의 나트륨염의 제조는 실시예 3과 유사하였다.
실시예 7 - 본원에서 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 다른 하나: 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올의 4나트륨 디아스코르빌 디포스페이트 에스테르의 합성
건조한 둥근 바닥 플라스크에서 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올 (1.5 g, 5.17 mmol)을 피리딘 (3.0 ml) 및 THF (15 ml)에 녹였다. 다른 건조한 둥근 바닥 플라스크에 THF (20 ml)와 POCl3 (1.77 ml, 12.56 mmol)를 첨가하였다. 후자를 -5 ℃에서 5분 동안 교반한 후에, 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올을 20분에 걸쳐 첨가하였다. 이 첨가 및 -5 ℃에서 반응한 지 처음 20분 후에 짧은 시간 동안 백색 침전을 관찰하였고, 반응을 실온에서 2.5시간 동안 계속하였다.
그런 다음 플라스크를 0 ℃로 냉각하고, 피리딘 (3 ml) 및 THF (15 ml)중의 5,6-이소프로필리덴 아스코르브산 (3.19 g, 14.78 mmol) 용액을 20분에 걸쳐서 한 방울씩 격렬하게 교반하면서 첨가하였다. 반응을 추가로 2시간 동안 계속하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축하여 두꺼운 시럽으로 만들었다. 거기에 헵탄을 첨가하고, 그 혼합물을 감압하에 증류하였다. 미정제 고체를 얻었다.
이 미정제물을 THF/1 N HCl (1:1, 150 ml)에 녹이고, 가수분해를 실온에서 격렬하게 교반하면서 수행하였다. 반응 12시간 후, TLC 시험은 가수분해가 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물 중의 THF를 감압하에 실온에서 제거하고, n-부탄올 및 에틸 아세테이트 (1:1, 100 ml)를 추출에 사용하였다. 유기 층을 물로 세척한 후 (2×20 ml), 농축하여 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올의 디아스코르빌 디포스페이트 에스테르의 미정제 생성물을 얻었다 (3.0 g).
안드로스트-5-엔-3β,17β-디올 (400 mg)의 미정제 디아스코르빌 디포스페이트 에스테르를 메탄올 (5 ml)에 녹였다. 이 용액에 메탄올 중의 메톡시화 나트륨 용액 2 ml (20 %, w/v)을 자기 교반하에 첨가하였다. 메톡시화 나트륨 메탄올 용액을 첨가할 때 백색 침전을 관찰하였다. 그 현탁액을 반시간 동안 교반한 후에 여과하고 메탄올 및 아세톤으로 세척하였다. 고체 생성물을 고진공하에서 건조시켜서 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올의 4나트륨 디아스코르빌 디포스페이트 에스테르 (330 mg)를 얻었다.
실시예 8 - FM-VP4로 1주일 동안 처리한 후의 CaCo2 세포에서의 MDR-1 발현의 측정
T-75 플라스크에 있는 집밀성 CaCo2 세포 (P33-39)를 상이한 양의 FM-VP4 (0.5 ㎛, 1.0 ㎛, 5.0 ㎛ 및 10.0 ㎛)로 1주일 동안 처리하였다. 배지와 처리는 이틀에 한 번씩 교환하였다. 7일 후에 세포를 수득하여 총 RNA를 TRIZOLTM으로 분리하였다. 분석은 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 역 전사→cDNA에 의해 수행하였다.
GAPDH 과정의 프라이머 드롭에 대한 적정:
50 ng의 cDNA (CaCo2 세포)
0.5 μM의 MDDR_1 전방 및 0.5 μM의 MDDR-1 역
PCR 프로그램: 94 ℃에서 5분, 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분 30초, 단계 2로부터 29회 반복, 72 ℃에서 10분, 4 ℃.
주기마다의 프라이머 드롭: 0, 6, 9, 12, 16, 20, 23, 26, 28 및 30.
도 1은 이들 결과를 도시하는 그래프인데, 도면으로부터 콜레스테롤 흡수 억제제의 농도가 증가할수록 MDR-1 유전자 발현이 상당히 감소되는 것이 명백하다. 이들 결과를 한층 더 지지하는 것은 도 2에 도시되는데, 도 2의 그래프는 GAPDH의 프라이머 드롭에 대한 적정을 도시하며, 도 3은 MDR-1 및 GAPDH에 대한 중합효소 연쇄 반응 (1.5 % 아가로스 겔) 전기영동 플레이트 결과를 도시한다.
10 mM의 FM-VP4와 함께 인큐베이션하는 것은 분명히 MDR-1의 상당한 하향 조절을 유도한다.
실시예 9 - FM-VP4로 1주일 동안 처리한 후의 CaCo2 세포에서의 MDR-1 발현의 측정
전체 프로토콜은 다른 다중약물 내성 유전자: MRP-1의 발현에 미치는 콜레스테롤 흡수 억제제의 효과를 확인하기 위하여 MDR-1 유전자를 사용한 것과 관련하여 실시예 8에서와 같다.
도 6의 결과인, FM-VP4로 1주일 동안 처리한 후에 CaCo2 세포에서 ABCC1 (MRP-1) 발현 수준 (MRP-1/GAPDH의 표준화된 비율)을 도시하는 막대 그래프는 유전자 발현에 미치는 억제 효과를 분명하게 증명한다.
실시예 10 - 세포독성 연구: 시험된 콜레스테롤 흡수 억제제의 비-독성은 MTS, LDH 및 BCA 분석에 의해 증명되었다.
CaCo2 세포를 48- 또는 96-웰 플레이트에 심었다. 성장 배지는 매 2-3일마다 흡인하여 새 배지로 교체하였다. 세포를 37 ℃에서 5 % CO2의 보습된 분위기에서 유지하였다. 그런 다음 세포를 배지, 0.1 % 트리톤 X-100 (독성에 대한 포지티브 대조군), FM-VP4, 선택된 콜레스테롤 흡수 억제제로 처리하였다.
24시간 후에 50 ml의 각 웰을 새로운 96-웰 플레이트로 옮겨서 LDH-분석을 수행하였다. MTS-분석 (CellTiter 96 AQueous One Solution kit (PromegaTM)을 원래의 플레이트에 대해 수행하였다.
세포 생존성은 미토콘드리아의 보전에 의해 반영되었다. MTS-분석은 처리 후에 생존한 세포의 수 (세포독성)를 측정하기 위한 비색 방법이다. MTS 시약 (테트라졸리움 염)이 살아있는 세포에 적용될 때는 492 nm에서 빛을 내는 색 화합물 (포르마잔)로 전환된다. 세포 생존성은 미토콘드리아의 보전성에 의해 반영되었다.
이 분석을 수행한 후에 배지와 용액을 흡인하고, 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 BCA 단백질 분석 (PIERCE)을 위해 용해하였다. 이 특별한 비색 분석은 특이한 펩티드 결합을 확인함으로써 총 단백질 수준을 측정한다. 단백질 농도는 단백질 표준 (소의 혈청 알부민 또는 "BSA")으로 제작한 보정 곡선으로부터 계산한다.
LDH-분석은 세포막의 보전성을 고찰하고, 화합물 또는 다른 제제에 의해 중재된 세포독성에 대해 사용될 수 있다. 세포 손상은 세포내의 세포질 내용물 및 락테이트 데히드로게나제 또는 "LDH" (안정한 시토졸 효소)의 누출과 관련되며, 이 사건에 대한 보고된 분자로서 사용될 수 있다. 세포로부터 배양 배지로 방출된 LDH 는 PromegaTM으로부터의 키트 (Cytotox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)를 사용하여 측정하였다. 이 방법은 일련의 결합된 효소 반응을 토대로 하며, 최종 반응은 테트라졸리움 염의 착색되고 불용성의 포르마젠 생성물로의 환원이고, 그것은 492 nm에서 측정될 수 있다. 배지 단독 및 치료된 배지로부터의 흡광도 바탕값을 판독값으로부터 빼서 값을 보정하였다.
도 4는 CaCo2를 "FM-VP4"로 처리한 후의 세포 생존성에 대한 MTS- 및 LDH-분석 결과를 나타낸 막대 그래프도이다. 도 5는 CaCo2를 "FM-VP4"로 처리한 후의 단백질 농도의 BCA-분석 결과를 나타내는 막대 그래프도이다.
시험된 콜레스테롤 흡수 억제제인 FM-VP4는 처리가 24시간 동안 이루어졌는지 (세포 생존성은 90.9 +/- 9.8 %) 또는 96시간 동안 이루어졌는지 (94.6 +/-4.4 %)에 관계 없이 100 mM까지의 농도 범위에 대하여 어떠한 독성 (미토콘드리아 활성)도 보이지 않는다. 250 mM에서 24시간 동안 처리하면 59.2+/-8.1 %까지 떨어지고, 96시간 동안 처리하면 19.3+/-7.6 %로 떨어진다. 가장 높은 시험 농도인 75 mM의 FM-VP4는 24시간 후에 18.5+/-5.8 %와 22.1+/-1.6 %의 세포 생존성을 보였다.
이들 발견은 처리 후 단백질 농도와 일치한다. 이것은 MTS-분석으로 발견한 것과도 동일한 경향을 나타낸다.
실시예 11 - FM-VP4와 함께 인큐베이션한 후의 CaCo2 세포에서의 P-당단백질의 웨스턴 블롯 분석 (→ 단백질 발현)
실험:
＊ CaCo2 세포가 들어있는 10개의 플라스크 (T75)
＊ 시딩 후 약 28일이 지나서 세포를 2 그룹으로 나눈다 (I과 II)
＊ 두 그룹에게 1주일 동안 동일한 처리를 한 후 나누어 분석한다.
＊ 처리군 I: TRIZOL → RT-PCR → PCR ⇒ mdr-1 발현
＊ 처리군 II: 단백질 분리 → SDS-PAGE 겔 → 웨스턴 블롯 ⇒ P-당단백질 발현
그룹 I로부터의 세포를 수득하여 총 세포 RNA를 프로토콜에 따라 TRiZOLIR로 추출하였다. RNA를 cDNA로 역전사하고 특정 프라이머를 사용하여 MDR-1의 발현 수준을 평가하였다. 내부 대조군에는 GAPDH (프라이머 드롭)를 사용하여 똑같이 진행하였다. 각 PCR 생성물로부터 취한 샘플에 대해 1.5 % 아가로스 겔 (에티디움브로마이드 함유) 상에서 전기영동을 수행하였다. 100bp 표준을 정하여 생성물의 크기를 확인하였다. 형광 밴드를 UV 빛 (UVP-Epi Chemi II Darkroom) 하에서 영상화하고, UVP-Labworks 소프트웨어로 정량하였다.
그룹 II로부터의 세포에는 단백질 추출 과정을 수행하였다. PIERCE BCA 단백질 분석 시약 키트를 사용하여 농도를 측정하였다. 각 샘플로부터 15 ㎍의 총 단백질을 취하여 11 % SDS Page 겔 상에서 전기영동하고, PVDF 막으로 옮겼다 (습식 이동). P-gp의 확인은 면역블롯 기법을 사용하여 수행하였다. P-gp에 대해 사용한 단클론성 항체는 JSB-1이었고, 두 번째 항체는 양고추냉이 퍼옥시드 토끼 항-마우스 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.)였다. 분석을 최적화한 후에 항체 용액에 대한 최상의 희석률은 일차 항체에 대해서는 1:200으로, 이차 항체에 대해서는 1:1000으로 조절하였다. 단백질 밴드를 PerkinElmer사의 화학발광 키트를 사용하여 가시화하고 X-선 필름을 막 위에 놓았다. 필름을 약 1분 동안 노출한 후 현상하였다.
도 9는 선택된 콜레스테롤 흡수 억제제: "FM-VP4"와 함께 인큐베이션한 후의 CaCo2 세포에서의 P-당단백질의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
FM-VP4와의 인큐베이션은 명백하게 MDR-1의 하향-조절을 유도하였다. 달리 표현하자면, mdr-1에 의해 코드화된 P-당단백질의 더 낮은 수준이 검출되었다. 10 μM의 FM-VP4와 함께 7일 동안 인큐베이션한 결과 mdr-1의 하향 조절이 유발되었다 (앞의 실험을 확증해줌). 또한 단백질의 수준은 이 발견과 상관이 있었다. MDR-1에 의해 코드화된 P-당단백질의 더 낮은 수준이 검출되었다.
이들 데이터는 mdr-1 유전자 발현의 변화가 상관관계가 있는 mdr-1에 의해 코드화되는 단백질 P-gp 수준의 변화를 유도하였음을 시사한다.
실시예 12 - FM-VP4 리포솜으로 처리한 후의 CaCo2 세포에서의 MDR-1 유전자 발현
이 실시예의 목표는 다중약물 내성 유전자의 유전자 발현에 미치는 콜레스테롤 흡수 억제제 ("FM-VP4")의 콜레스테롤-유리 리포솜 제형의 영향을 확인하는 것이다.
물 중의 FM-VP4의 희석을 CaCo2 세포에 적용하였다. 그 중에서도 콜레스테롤-유리 리포솜 제제의 리포솜 FM-VP4의 집밀도에 관심을 기울였다 (DMPC 100:0, 비 율 10:1 DMPC:FM-VP4). FM-VP4 리포솜을 3가지의 상이한 농도에서 사용하였다 (2.5, 5 및 10 μM의 FM-VP4).
과정: CaCo2 세포를 T-75 플라스크 (Corning)에 10,000 세포/cm2으로 시딩하였다. 성장 배지를 이틀마다 교환하였다. 세포를 37 ℃에서 5 % CO2의 가습 분위기에서 유지하였다. 처리 그룹은 FM-VP4가 없는 빈 콜레스테롤-유리 리포솜뿐만 아니라 2.5, 5 및 10 μM의 콜레스테롤-유리 리포솜 FM-VP4를 포함하였다. 세포를 처리 후 1주일에 수득하고, 총 RNA를 TRIZOLR로 프로토콜을 따라 분리하였다. 그런 다음 RT-PCR을 수행하고 특정 프라이머를 사용하여 MDR-1의 발현 수준을 평가하였다. PCR 생성물을 1.5 %의 아가로스 겔 (에티디움브로마이드 함유) 상에서의 전기영동에 의해 가시화하고, 형광 밴드를 UV 빛 하에서 영상화한 다음 UVP-Labworks 소프트웨어를 사용하여 정량하였다.
도 7은 MDR-1, GAPDH에 대한 중합효소 연쇄 반응 (1.5 % PCR아가로스 겔) 전기영동 결과를 도시한다; 본원에 설명된 콜레스테롤 흡수 억제제 중 하나인 "FM-VP4"로 불리는 아스코르빌 스타닐 포스페이트 에스테르의 리포솜 제형으로 CaCo2 세포를 처리한 후 TRIZOL을 사용한 RNA 분리 → RT-PCR → PCR.
도 8은 대조 및 빈 리포솜과 비교하여 2.5, 5 및 10 μM에서 리포솜 FM-VP4로 1주일 동안 처리한 후의 CaCo2 세포에서의 MDR-1 발현 수준 (MDR-1/GAPDH의 표준화된 비율)을 도시하는 막대 그래프도이다.
3개의 시험된 농도 모두 MDR-1 유전자의 하향 조절을 유발하였다. 그러나 빈 리포솜과의 인큐베이션은 가설처럼 어떠한 효과도 나타내지 않았고, 따라서 대조군으로서 사용할 수 있었다. 하향 조절은 콜레스테롤 흡수 억제제가 물에 용해되었을 때 현저하게 더 효과적이었다.
따라서 더 낮은 농도의 리포솜 FM-VP4로 처리한 후의 CaCo2 세포에서의 MDR-1 유전자 발현이 크게 감소되고, 그것은 비-리포솜 제형보다 더 낮은 농도이다.
실시예 13 - 콜레스테롤 흡수 억제제를 포함하는 리포솜의 제조
일반 프로토콜
건조 지질 필름의 제조
1. 클로로포름 중에 지질의 스톡 용액을 제조하였다 (DMPC/콜레스테롤 55:45 몰비율).
2. 스톡 용액의 적절한 양을 시험관으로 옮겼다.
3. 건조된 용매를 질소 가스의 기류 하에서 건조시켰다.
4. 질소를 다운시켰다.
5. 지질이 거의 말랐을 때 그것을 진공 장치에 넣어 최소한 2시간 동안 잔류하는 클로로포름을 제거하였다.
6. 건조된 지질 필름을 그것에 뚜껑을 씌우고 냉동기에 넣음으로써 보관하였다.
리피드의 수화
1. 수조를 55 ℃로 설정하였다.
2. 약간의 HBS 또는 수조의 HBS에 녹인 선택한 콜레스테롤 흡수 억제제 (예 컨대 FM-VP4)를 가온하였다.
3. 적절한 양의 HBS 또는 HBS 중의 FM-VP4를 시험관에 넣었다.
4. 격렬하게 흔들었다.
5. 수조에서 시험관을 가온하였다.
냉동 해동 주기
1. 보온병을 액체 질소로 채웠다.
2. 지질 혼합물을 플라스틱 냉동 튜브로 옮겼다.
3. 냉동 튜브를 크레인에 부착하였다.
4. 액체 질소 중의 샘플을 냉동한 후, 수조에서 해동하였다. 이것을 5회 반복하였다.
5. 샘플을 냉동기에 보관하였다.
소포의 압출/크기 조정
1. 수조를 55 ℃로 설정하였다.
2. 압출기를 조립하였다.
3. 압출기를 질소로 시험한 후 HBS로 시험하였다.
4. 압력을 300 내지 600 psi로 증가시켰다.
5. 샘플을 압출하기 전에 500 ㎕로 나누고, 그것을 에펜도르프 튜브에 옮긴 후 BE로 표지하였다.
6. 지질 현탁액을 2개의 폴리카보네이트 필터를 통해 인가하였다.
7. 0.1 ㎛ 필터를 사용하여 100 nm의 크기로 샘플을 압출하였다.
8. 샘플을 10회 압출하였다.
9. 500 ㎕로 나누고 그것을 AE로 표지하였다.
10. 투석 후에 500 ㎕로 나누고, 그것을 AD로 표지하였다.
실시예 14 - 콜레스테롤 흡수 억제제로 처리한 후의 CaCo2 세포에서의 MDR-1 유전자 발현
목적: 콜레스테롤 흡수 억제제로 처리한 후의 CaCo2 세포에서의 시간-의존성 mdr-1 유전자 발현을 연구하는 것이다.
실험 과정: CaCo-2 세포를 T-75 플라스크 (Corning)에 10,000 세포/cm2으로 시딩하였다. 10 %의 열-활성화된 태내 송아지 혈청, 292 ㎍/ml의 글루타민, 0.1 mM의 비-필수 아미노산, 100 U/ml의 페니실린 및 100 mg/ml의 글루타민을 함유하는 성장 배지 (둘베코 최소 필수 배지-DMEM)를 이틀마다 교체하였다. 세포를 37 ℃에서 5 % CO2의 가습 분위기에서 유지하였다. 상술한 바와 같이 세포가 약 95 %의 집밀도에 도달하였을 때 세포를 10 μM의 "FM-VP4"로 처리하고, 물에 용해시켰다. 대조군에는 배지만으로 처리하였다.
세포를 60, 90분 후, 6, 24 및 48시간 후에 수득하였다. 총 RNA를 TRizol 시약을 사용하여 분리한 후, 단일 가닥의 cDNA로 역전사하였다. PCR 반응을 mdr-1과 내부 대조군으로서 하우스키핑 유전자 GAPDH에 대한 특정 프라이머들을 사용하여 수행하였다. 각 PCR 생성물로부터 샘플을 취하여 1.5 % 아가로스 겔 상에서 전기영동을 수행하였다. 형광 밴드를 UV 빛 (UV-Epi Chemi II)하에서 가시화하고, UVP- labworks 소프트웨어로 정량하였다.
도 10 및 11: CaCo-2 세포에서의 mdr-1 유전자의 발현 프로필을 10 μM의 FM-VP4를 사용한 시간-의존성 처리의 효과로서 조사하였다. 각 PCR 생성물로부터 샘플을 취하여 1.5 % 아가로스 겔 상에서 전기영동을 수행하였다 (10). 형광 밴드를 UV 빛 (UV-Epi Chemi II)하에서 영상화하고, UVP-labworks 소프트웨어로 정량하였다 (11).
실시예 15 - CaCo-2 세포에 의한 로다민 123의 세포상 축적에 미치는 콜레스테롤 흡수 억제제의 효과
목적: 다중약물 유출 운반자 P-당단백질 (P-gp)의 활성에 대한 지수인 로다민의 축적을 조사하는 것이다. 더 낮은 P-gp 활성이 세포에서의 로다민 123의 축적을 유발한다.
로다민 123은 P-gp 기질 (형광 염료)이고, P-gp의 기능적 활성을 측정하기 위한 프로브 기질로서 사용되어 왔다. 여기 파장은 485 nm이고, 발광 파장은 520 nm이다. 세포를 본원에서 설명한 것처럼 "FM-VP4"와 함께 인큐베이션하고, 로다민 123을 염기성 측면 쪽(basolateral side)에 첨가한다. 세포를 용해한 후에 로다민 123의 함량을 측정하였다.
CaCo-2 세포를 12 mm 직경의 폴리카보네이트 필터 삽입물 (Transwell, Costar)에 40,000 세포/cm2의 밀도로 시딩하였다. 10 %의 열-활성화된 태내 송아지 혈청, 292 ㎍/ml의 글루타민, 0.1 mM의 비-필수 아미노산, 100 U/ml의 페니실린 및 100 mg/ml의 글루타민을 함유하는 성장 배지 (둘베코 최소 필수 배지-DMEM)를 이틀마다 교체하였다. 세포를 37 ℃에서 5 % CO2의 가습 분위기에서 유지하였다. 처리 실험을 위해 상이한 농도의 FM-VP4를 배지에 첨가하고, 트란스웰 플레이트의 정점 및 염기성 측면 쪽에 적용하였다. 단층의 경상피 (transepithelial) 전기 저항 (TEER)을 측정하여 단층의 밀도를 확인하였다. 그런 다음 TEER 값이 400 Ω/cm2 이상인 CaCo-2 세포를 P-gp 연구에 사용하였다.
세포를 처리하고 1주일 후에 세포를 10 mM의 Hepes, pH 7.4가 첨가된 HBSS (페놀 레드는 없음)로 여러 번 세척하고, HBSS 및 10 mM의 Hepes중의 FM-VP4와 함께 1시간 동안 예비-인큐베이션하였다. Teer 값을 측정하여 단층의 밀도를 조사하였다. Teer 값이 400 Ω/cm2 아래인 트란스웰은 실험에서 제외하였다. 5 μM의 로다민 123을 염기성 측면 쪽에 첨가하고 37 ℃에서 3시간 후에 배지를 제거하고 세포를 저온 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 막을 절단하고, 그것을 1.5 ml의 에펜도르프 튜브에 옮긴 후, 250 ㎕의 1 % 트리톤 X-100을 첨가하고 격렬하게 회전시켰다. 실온에서 10분이 지난 후 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거한 다음, 25 ㎕ (3개 한 벌)를 96-웰 플레이트에 옮기고 형광을 측정하였다 (여기: 485 nm; 발광: 530 nm). 마지막으로 단백질 함량을 BCA 단백질 분석 (PIERCE)을 사용하여 측정하고, 로다민 123 축적을 표준화하였다.
도 12: CaCo-2 단층에서의 Rh123의 축적에 미치는 1주일 동안 FM-VP4로 예비-인큐베이션한 효과. 데이터는±SD의 평균을 나타낸다. *P<0.002; **P<0.0001.
100 μM의 베라파밀을 사용한 P-gp 억제에 대한 포지티브 대조군은 mg의 단백질당 1604 pmol의 로다민 123의 축적을 유발한다. P-gp 기질인 로다민 123의 증가된 세포상 축적 및 그로 인한 감소된 P-gp 활성은 7일 동안 5 μM 이상의 FM-VP4 농도를 사용하여 관찰할 수 있었다.
실시예 16 - 다중약물 유출 운반자 P-당단배질 (P-gp)의 기능적 활성에 미치는 콜레스테롤 흡수 억제제의 영향
실험은 FM-VP4를 사용한 처리 후의 CaCo-2 세포에서의 P-gp의 활성을 측정하기 위해 수행하였다. 앞의 실험에서 FM-VP4는 FM-VP4 (10 μM)를 투여하고 1주일 후에 mdr-1 (P-gp를 코드화함)의 유전자 발현을 감소시키는 것이 확인되었다. mdr-1의 하향 조절은 웨스턴 블롯 분석에서 알 수 있는 것처럼 더 낮은 수준의 P-gp 단백질 발현을 유발하였다.
사람의 장 상피 단층 CaCo-2 세포는 P-gp를 그것의 정점 막에 발현한다. 단층을 가로지르는 정점 및 염기성 측면 운반을 측정하고 특정 물질의 투과도를 측정하기에 좋은 시스템은 트란스웰 플레이트이다. 세포를 두개의 챔버 사이에 놓인 반-투과 막위에서 성장시킨다. CaCo-2 세포는 고도로 기능화된 상피 장벽으로 분화한다. 형태학적으로나 생화학적으로 그것은 소장의 원주 상피와 유사하다.
장의 환경과 같은 약물 흡수를 측정하기 위하여, 물질을 정점 쪽에 넣고, 염기성 측면 쪽의 농도를 측정한다. 이것은 장 흡수를 나타낸다. 분비성 운반은 물질이 염기성 측면 쪽에 첨가되고 정점 챔버로의 운반이 측정되면 측정할 수 있다. P-gp에 대한 좋은 기질은 로다민 123이고 그것은 P-gp의 기능적 활성을 측정하기 위 한 프로브로서 사용되어 왔다. 그것은 형광 염료이다. 로다민 123은 511 nm에서 85,200 M-1cm-1의 몰 흡광 계수를 갖는다.
CaCo-2 세포를 12 mm 직경의 폴리카보네이트 필터 삽입물 (Transwell, Costar)에 시딩하였다. 10 %의 열-활성화된 태내 송아지 혈청, 292 ㎍/ml의 글루타민, 0.1 mM의 비-필수 아미노산, 100 U/ml의 페니실린 및 100 mg/ml의 글루타민을 함유하는 성장 배지 (둘베코 최소 필수 배지-DMEM)를 이틀마다 교체하였다. 세포를 37 ℃에서 5 % CO2의 가습 분위기에서 유지하였다. 처리 실험을 위해 상이한 농도의 FM-VP4를 배지에 첨가하고, 트란스웰 플레이트의 정점 및 염기성 측면 쪽에 1주일 동안 적용하였다. 대조 웰은 배지만을 함유하였다. P-gp의 억제에 대한 포지티브 대조군은 베라파밀 (칼슘 채널 차단제)이었다.
단층의 경상피 전기 저항 (TEER)을 측정하여 단층의 밀도를 확인하였다. 그런 다음 TEER 값이 400 Ω/cm2 이상인 CaCo-2 세포를 운반 연구에 사용하였다. 2차 운반 (염기성 측면에서 정점으로의)을 측정하기 위하여 5 μM의 로다민을 염기성 측면 챔버에 첨가하였다. 시간 의존성 방식으로 샘플을 정점 쪽으로부터 취하여 형광을 측정하였다. 즉시 샘플을 새로운 리시버 배지 (배지, 배지+FM-VP4 또는 배지+P-gp 억제제)로 교체하였다.
요약하면, 도 13에서 알 수 있는 것처럼 CaCo-2 세포 트란스웰 시스템에서 로다민 123의 정점 흡수에 미치는 콜레스테롤 흡수 억제제의 효과를 관찰할 수 있었다. 두 사이드 (정점 및 염기성 측면 쪽)에서 인큐베이션하였을 때 25 μM의 FM- VP4의 농도에서 상당한 P-gp 억제가 발생하였다.
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본 발명에 의하여 종래 암치료에서 사용되던 화학요법제의 다중약물 내성 문제를 제거 또는 완화할 수 있게 되었고, 그러므로 당해기술 분야에서 비독성이면서 보다 효과적인 다중약물 내성의 역전 및/또는 억제가 가능해졌다.

Claims (91)

  1. 동물 세포에서 다중-약물 내성 유전자의 발현을 억제하는 방법으로, 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 상기 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 동물 세포가 다중-약물 내성 유전자의 과잉 발현으로 인해 화학요법제에 둔감한 종양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 천연 또는 인공적으로 합성된 형태의 스테롤 또는 스타놀, 또는 그것들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. -
  5. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 이성질체 형태들 중 어느 하나의 형태의 스테롤 또는 스타놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라씨카스테롤 (디히드로브라씨카스테롤 포함), 데스모스테롤, 칼리노스테롤, 포리페라스테롤, 클리오나스테롤, 에르고스테롤, 코프로스테롤, 코디스테롤, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 클레로스테롤, 네비스테롤, 라토스테롤, 스텔라스테롤, 스피나스테롤, 콘드릴라스테롤, 페포스테롤, 아베나스테롤, 이소아베나스테롤, 페코스테롤, 및 폴리나스타스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스테롤인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 시토스타놀, 캄페스타놀, 스티그마스타놀, 브라씨카스타놀 (디히드로브라씨카스타놀 포함), 데스모스타놀, 칼리노스타놀, 포리페라스타놀, 클리오나스타놀, 에르고스타놀, 코프로스타놀, 코디스타놀, 이소푸코스타놀, 푸코스타놀, 클레로스타놀, 네비스타놀, 라토스타놀, 스텔라스타놀, 스피나스타놀, 콘드릴라스타놀, 페포스타놀, 아베나스타놀, 이소아베나스타놀, 페코스타놀, 및 폴리나스타스타놀로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스타놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 지방족 에스테르, 방향족 에스테르, 페놀산 에스테르, 신남산염 에스테르, 페룰레이트 에스테르, 글리코시드, 아실화된 글리코시드 및 아실글리코시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 스테롤 유도체 또는 스타놀 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 다음 식 중 하나로 표시되 는 스테롤 또는 스타놀을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 화합물, 및 그것들의 생물학적으로 허용될 수 있는 염 또는 용매 화합물 또는 최소한 하나의 그런 화합물 또는 그것들의 염 또는 용매 화합물의 선구약물인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00009
    상기 식에서 R은 스테롤 또는 스타놀 부분이고, R4는 아스코르브산으로부터 유도되며, n은 1 내지 5이다.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 2나트륨 아스코르빌 캄페스타닐 포스페이트와 2나트륨 아스코르빌 시토스타닐 포스페이트를 포함하는 2나트륨 아스코르빌 스타닐 포스페이트 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 히드록시 치환된 아제티디논인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 다음 식으로 표시되는 히드록시 치환된 아제티디논 또는 그것의 생물학적으로 허용될 수 있는 염인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00010
    상기 식에서, Ar1 및 Ar2는 독립적으로 아릴 및 R4-치환된 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    Ar3은 아릴 또는 R5-치환된 아릴이며;
    X, Y 및 Z는 독립적으로 --CH2--, --CH(저급 알킬)- 및 --C(2저급 알킬)-로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    R과 R2는 독립적으로 --OR6, --O(CO)R6, -O(CO)OR9 및 --O(CO)NR6R7으로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
    R1과 R3은 독립적으로 수소, 저급 알킬 및 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    q는 0 또는 1; r은 0 또는 1; m, n 및 p는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4이며; 단 q와 r 중 적어도 하나는 1이고, m, n, p, q 및 r의 합은 2, 3, 4, 5 또는 6이며, p가 0이고 r이 1일 때 m, q, 및 n의 합은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    R4는 저급 알킬, --OR6, --O(CO)R6, --O(CO)OR9, --O(CH2)1-5OR6, --O(CO) NR6R7, --NR6R7, --NR6(CO)R7, -NR6(CO)OR9, --NR6(CO)NR7R8, --NR6SO2R9, --COOR6, --CONR6R7, -COR6, -SO2NR6R7, S(O)0-2R9, --O(CH2)1-10--COOR6, --O(CH2)1-10CONR6R7, -(저급 알킬렌)COOR6, --CH.dbd.CH--COOR6, --CF3, --CN, --NO2 및 할로겐으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체이며;
    R5는 --OR6, --O(CO)R6, --O(CO)OR9, --O(CH2)1-5OR6, --O(CO) NR6R7, --NR6R7, --NR6(CO)R7, -NR6(CO)OR9, --NR6(CO)NR7R8, --NR6SO2R9, --COOR6, --CONR6R7, -COR6, -SO2NR6R7, S(O)0-2R9, --O(CH2)1-10--COOR6, --O(CH2)1-10CONR6R7, -(저급 알킬렌)COOR6, 및 --CH.dbd.CH--COOR6로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체이고;
    R6, R7 및 R8은 수소, 저급 알킬, 아릴 및 아릴-치환된 저급 알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R9는 저급 알킬, 아릴 또는 아릴-치환된 저급 알킬이다.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 화합물에서 Ar1은 페닐 또는 R4-치환된 페닐이고, Ar2는 페닐 또는 R4-치환된 페닐이며, Ar3은 R5-치환된 페닐인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 화합물에서 Ar1은 R4-치환된 페닐이고 이때 R4는 할로겐이며, Ar2는 R4-치환된 페닐이고 이때 R4는 할로겐 또는 --OR6이며, R6은 저급 알킬 또는 수소이고, Ar3은 R5-치환된 페닐이고 이때 R5는 --OR6이며, R6은 저급 알킬 또는 수소인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 화합물에서 X, Y, 및 Z는 각각 --CH2--이고, R1 및 R3은 각각 수소이며, R과 R2는 각각 --OR6이고, 이때 R6은 수소이며, m, n, p, q 및 r의 합은 2, 3 또는 4인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12항에 있어서, 상기 화합물에서 m, n 및 r은 각각 0이고, q는 1이며 p는 2인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 12항에 있어서, 상기 화합물에서 p, q 및 n은 각각 0이고, r은 1이며 m은 2 또는 3인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 12항에 있어서, 상기 화합물이 다음 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    3(R)-(2(R)-히드록시-2-페닐에틸)-4(R)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(R)-(2(R)-히드록시-2-페닐에틸)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(S)-(1(S)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(S)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(R)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    rel-3(R)→(S)-히드록시-(2-나프탈레닐)메틸!-4(3S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    rel-3(R)→(R)-히드록시-(2-나프탈레닐)메틸!-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필)-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필)-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)-(4-히드록시페닐)-3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필-1-(4-메톡시페닐) -2-아제티디논;
    4(S)-(4-히드록시페닐)-3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필-1-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    rel 3(R)→3(RS)-히드록시-3→4-(메톡시메톡시)-페닐!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    1-(4-플루오로페닐)-3(R)→3(S)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4(S)-(.sup.4-히드록시페닐)-2-아제티디논;
    1-(4-플루오로페닐)-3(R)→3(R)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4 (S)-(4-히드록시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필)-1-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필)-1(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    1-(.sup.4-플루오로페닐)-3(R)-3(S)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4 (S)→4-(페닐메톡시)페닐!-2-아제티디논;
    3(R)→3(R)-아세틸옥시)-3-페닐프로필!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(S)-아세틸옥시)-3-페닐프로필!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(R)-(아세틸옥시)-3-(4-f플루오로페닐)프로필!-4(S)-4-(아세틸옥시) 페닐!-1-(4-플루오로페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(S)-(아세틸옥시)-3-(4-플루오로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시) 페닐!-1-(4-플루오로페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(R)-(아세틸옥시)-3-(4-클로로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-클로로페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(S)-(아세틸옥시)-3-(4-클로로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-클로로페닐)-2-아제티디논; 및
    rel 1-(4-플루오로페닐)-4(S)-(4-히드록시페닐)-3(1R)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-2-아제티디논.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 안드로스탄 및/또는 안드로스텐 유도체이고, 상기 안드로스탄 및/또는 안드로스텐은 아스코르브산과 결합되며 다음 식 중 하나 또는 둘 이상으로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00011
    상기 식에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6은 개별적으로 수소, OH, 카보닐, 및 아스코르빌 부분으로부터 선택될 수 있고, R7은 수소 또는 어떠한 할로겐일 수 있다.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 안드로스탄 또는 안드로스텐 부류의 화합물과 결합되는 아스코르빌 부분이 개별적으로 다음 구조식 중 하나 또는 둘 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00012
    Figure 112006021027945-PCT00013
    Figure 112006021027945-PCT00014
    Figure 112006021027945-PCT00015
    Figure 112006021027945-PCT00016
    상기 식들에서 M+는 어떠한 금속, 알칼리 토금속, 또는 알칼리 금속을 나타낸다.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 담즙산 운반 또는 재흡수의 억제제이고, 모든 회장, 정점 및 간 운반 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 암에 걸린 동물에게서 화학요법제의 효능을 증강시키는 방법으로서, 상기 동물에 유효량의
    a) 화학요법제; 및
    b) 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제를 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 천연 또는 인공적으로 합성된 형태의 스테롤 또는 스타놀, 또는 그것들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 이성질체 형태들 중 어느 하나의 형태의 스테롤 또는 스타놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라씨카스테롤 (디히드로브라씨카스테롤 포함), 데스모스테롤, 칼리노스테롤, 포리페라스테롤, 클리오나스테롤, 에르고스테롤, 코프로스테롤, 코디스테롤, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 클레로스테롤, 네비스테롤, 라토스테롤, 스텔라스테롤, 스피나스테롤, 콘드릴라스테롤, 페포스테롤, 아베나스테롤, 이소아베나스테롤, 페코스테롤, 및 폴리나스타스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스테롤인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 시토스타놀, 캄페스타놀, 스티그마스타놀, 브라씨카스타놀 (디히드로브라씨카스타놀 포함), 데스모스타놀, 칼리노스타놀, 포리페라스타놀, 클리오나스타놀, 에르고스타놀, 코프로스타놀, 코디스타놀, 이소푸코스타놀, 푸코스타놀, 클레로스타놀, 네비스타놀, 라토스타놀, 스텔라스타놀, 스피나스타놀, 콘드릴라스타놀, 페포스타놀, 아베나스타놀, 이소아베나스타놀, 페코스타놀, 및 폴리나스타스타놀로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스타놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 지방족 에스테르, 방향족 에스테르, 페놀산 에스테르, 신남산염 에스테르, 페룰레이트 에스테르, 글리코시드, 아실화된 글리코시드 및 아실글리코시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 스테롤 유도체 또는 스타놀 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 다음 식 중 하나로 표시 되는 스테롤 또는 스타놀을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 화합물, 및 그것들의 생물학적으로 허용될 수 있는 염 또는 용매 화합물 또는 최소한 하나의 그런 화합물 또는 그것들의 염 또는 용매 화합물의 선구약물인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00017
    상기 식에서 R은 스테롤 또는 스타놀 부분이고, R4는 아스코르브산으로부터 유도되며, n은 1 내지 5이다.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 2나트륨 아스코르빌 캄페스타닐 포스페이트와 2나트륨 아스코르빌 시토스타닐 포스페이트를 포함하는 2나트륨 아스코르빌 스타닐 포스페이트 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 히드록시 치환된 아제티디논인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 다음 식으로 표시되는 히 드록시 치환된 아제티디논 또는 그것의 생물학적으로 허용될 수 있는 염인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00018
    상기 식에서, Ar1 및 Ar2는 독립적으로 아릴 및 R4-치환된 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    Ar3은 아릴 또는 R5-치환된 아릴이며;
    X, Y 및 Z는 독립적으로 --CH2--, --CH(저급 알킬)- 및 --C(2저급 알킬)-로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    R과 R2는 독립적으로 --OR6, --O(CO)R6, -O(CO)OR9 및 --O(CO)NR6R7으로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
    R1과 R3은 독립적으로 수소, 저급 알킬 및 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    q는 0 또는 1; r은 0 또는 1; m, n 및 p는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4이며; 단 q와 r 중 적어도 하나는 1이고, m, n, p, q 및 r의 합은 2, 3, 4, 5 또는 6이며, p가 0이고 r이 1일 때 m, q, 및 n의 합은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    R4는 저급 알킬, --OR6, --O(CO)R6, --O(CO)OR9, --O(CH2)1-5OR6, --O(CO) NR6R7, --NR6R7, --NR6(CO)R7, -NR6(CO)OR9, --NR6(CO)NR7R8, --NR6SO2R9, --COOR6, --CONR6R7, -COR6, -SO2NR6R7, S(O)0-2R9, --O(CH2)1-10--COOR6, --O(CH2)1-10CONR6R7, -(저급 알킬렌)COOR6, --CH.dbd.CH--COOR6, --CF3, --CN, --NO2 및 할로겐으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체이며;
    R5는 --OR6, --O(CO)R6, --O(CO)OR9, --O(CH2)1-5OR6, --O(CO) NR6R7, --NR6R7, --NR6(CO)R7, -NR6(CO)OR9, --NR6(CO)NR7R8, --NR6SO2R9, --COOR6, --CONR6R7, -COR6, -SO2NR6R7, S(O)0-2R9, --O(CH2)1-10--COOR6, --O(CH2)1-10CONR6R7, -(저급 알킬렌)COOR6, 및 --CH.dbd.CH--COOR6로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체이고;
    R6, R7 및 R8은 수소, 저급 알킬, 아릴 및 아릴-치환된 저급 알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R9는 저급 알킬, 아릴 또는 아릴-치환된 저급 알킬이다.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 화합물에서 Ar1은 페닐 또는 R4-치환된 페닐이고, Ar2는 페닐 또는 R4-치환된 페닐이며, Ar3은 R5-치환된 페닐인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31항에 있어서, 상기 화합물에서 Ar1은 R4-치환된 페닐이고 이때 R4는 할로겐이며, Ar2는 R4-치환된 페닐이고 이때 R4는 할로겐 또는 --OR6이며, R6은 저급 알킬 또는 수소이고, Ar3은 R5-치환된 페닐이고 이때 R5는 --OR6이며, R6은 저급 알킬 또는 수소인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 31항에 있어서, 상기 화합물에서 X, Y, 및 Z는 각각 --CH2--이고, R1 및 R3은 각각 수소이며, R과 R2는 각각 --OR6이고, 이때 R6은 수소이며, m, n, p, q 및 r의 합은 2, 3 또는 4인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 31항에 있어서, 상기 화합물에서 m, n 및 r은 각각 0이고, q는 1이며 p는 2인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 31항에 있어서, 상기 화합물에서 p, q 및 n은 각각 0이고, r은 1이며 m은 2 또는 3인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 31항에 있어서, 상기 화합물이 다음 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    rel 3(R)-(2(R)-히드록시-2-페닐에틸)-4(R)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티 디논;
    rel 3(R)-(2(R)-히드록시-2-페닐에틸)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(S)-(1(S)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(S)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(R)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    rel-3(R)→(S)-히드록시-(2-나프탈레닐)메틸!-4(3S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    rel-3(R)→(R)-히드록시-(2-나프탈레닐)메틸!-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필)-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필)-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)-(4-히드록시페닐)-3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필-1-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)-(4-히드록시페닐)-3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필-1-(4-메톡시페닐) -2-아제티디논;
    rel 3(R)→3(RS)-히드록시-3→4-(메톡시메톡시)-페닐!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    1-(4-플루오로페닐)-3(R)→3(S)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4(S)-(.sup.4-히드록시페닐)-2-아제티디논;
    1-(4-플루오로페닐)-3(R)→3(R)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4 (S)-(4-히드록시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필)-1-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필)-1(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    1-(.sup.4-플루오로페닐)-3(R)-3(S)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4 (S)→4-(페닐메톡시)페닐!-2-아제티디논;
    3(R)→3(R)-아세틸옥시)-3-페닐프로필!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(S)-아세틸옥시)-3-페닐프로필!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(R)-(아세틸옥시)-3-(4-f플루오로페닐)프로필!-4(S)-4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-플루오로페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(S)-(아세틸옥시)-3-(4-플→루오로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥 시) 페닐!-1-(4-플루오로페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(R)-(아세틸옥시)-3-(4-클로로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-클로로페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(S)-(아세틸옥시)-3-(4-클로로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-클로로페닐)-2-아제티디논; 및
    rel 1-(4-플루오로페닐)-4(S)-(4-히드록시페닐)-3(1R)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-2-아제티디논.
  38. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 안드로스탄 및/또는 안드로스텐 유도체이고, 상기 안드로스탄 및/또는 안드로스텐은 아스코르브산과 결합되며 다음 식 중 하나 또는 둘 이상으로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00019
    상기 식에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6은 개별적으로 수소, OH, 카보닐, 및 아스코르빌 부분으로부터 선택될 수 있고, R7은 수소 또는 어떠한 할로겐일 수 있다.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 안드로스탄 또는 안드로스텐 부류의 화합물과 결합되는 아스코르빌 부분이 개별적으로 다음 구조식 중 하나 또는 둘 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00020
    Figure 112006021027945-PCT00021
    Figure 112006021027945-PCT00022
    Figure 112006021027945-PCT00023
    Figure 112006021027945-PCT00024
    상기 식들에서 M+는 어떠한 금속, 알칼리 토금속, 또는 알칼리 금속을 나타낸다.
  40. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 담즙산 운반 또는 재흡수의 억제제이고, 모든 회장, 정점 및 간 운반 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 동물 세포에 의해 나타나는 다중-약물 내성 표현형을 역전시키는 방법으로서, 상기 동물 세포를 유효량의 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제에 노출시키는 것으로 이루어지는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 동물 세포가 다중-약물 내성 유전자의 과잉 발현으로 인해 화학요법제에 둔감한 종양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 41항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 천연 또는 인공적으로 합성된 형태의 스테롤 또는 스타놀, 또는 그것들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 41항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 이성질체 형태들 중 어느 하나의 형태의 스테롤 또는 스타놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 41항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라씨카스테롤 (디히드로브라씨카스테롤 포함), 데스모스테롤, 칼리노스테롤, 포리페라스테롤, 클리오나스테롤, 에르고스테롤, 코프로스테롤, 코디스테롤, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 클레로스테롤, 네비스테롤, 라토스테롤, 스텔라스테롤, 스피나스테롤, 콘드릴라스테롤, 페포스테롤, 아베나스테롤, 이소아베나스테롤, 페코스테롤, 및 폴리나스타스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스테롤인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 41항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 시토스타놀, 캄페스타놀, 스티그마스타놀, 브라씨카스타놀 (디히드로브라씨카스타놀 포함), 데스모스타놀, 칼리노스타놀, 포리페라스타놀, 클리오나스타놀, 에르고스타놀, 코프로스타놀, 코디스타놀, 이소푸코스타놀, 푸코스타놀, 클레로스타놀, 네비스타놀, 라토스타놀, 스텔라스타놀, 스피나스타놀, 콘드릴라스타놀, 페포스타놀, 아베나스타놀, 이소아베나스타놀, 페코스타놀, 및 폴리나스타스타놀로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스타놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 41항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 지방족 에스테르, 방향족 에스테르, 페놀산 에스테르, 신남산염 에스테르, 페룰레이트 에스테르, 글리코시드, 아실화된 글리코시드 및 아실글리코시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 스테롤 유도체 또는 스타놀 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 41항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 다음 식 중 하나로 표시되는 스테롤 또는 스타놀을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 화합물, 및 그것들의 생물학적으로 허용될 수 있는 염 또는 용매 화합물 또는 최소한 하나의 그런 화합물 또는 그것들의 염 또는 용매 화합물의 선구약물인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00025
    상기 식에서 R은 스테롤 또는 스타놀 부분이고, R4는 아스코르브산으로부터 유도되며, n은 1 내지 5이다.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 2나트륨 아스코르빌 캄페스타닐 포스페이트와 2나트륨 아스코르빌 시토스타닐 포스페이트를 포함하는 2나트륨 아스코르빌 스타닐 포스페이트 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 41항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 히드록시 치환된 아제티디논인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 41항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 다음 식으로 표시되는 히드록시 치환된 아제티디논 또는 그것의 생물학적으로 허용될 수 있는 염인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00026
    상기 식에서, Ar1 및 Ar2는 독립적으로 아릴 및 R4-치환된 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    Ar3은 아릴 또는 R5-치환된 아릴이며;
    X, Y 및 Z는 독립적으로 --CH2--, --CH(저급 알킬)- 및 --C(2저급 알킬)-로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    R과 R2는 독립적으로 --OR6, --O(CO)R6, -O(CO)OR9 및 --O(CO)NR6R7으로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
    R1과 R3은 독립적으로 수소, 저급 알킬 및 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    q는 0 또는 1; r은 0 또는 1; m, n 및 p는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4이며; 단 q와 r 중 적어도 하나는 1이고, m, n, p, q 및 r의 합은 2, 3, 4, 5 또는 6 이며, p가 0이고 r이 1일 때 m, q, 및 n의 합은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    R4는 저급 알킬, --OR6, --O(CO)R6, --O(CO)OR9, --O(CH2)1-5OR6, --O(CO) NR6R7, --NR6R7, --NR6(CO)R7, -NR6(CO)OR9, --NR6(CO)NR7R8, --NR6SO2R9, --COOR6, --CONR6R7, -COR6, -SO2NR6R7, S(O)0-2R9, --O(CH2)1-10--COOR6, --O(CH2)1-10CONR6R7, -(저급 알킬렌)COOR6, --CH.dbd.CH--COOR6, --CF3, --CN, --NO2 및 할로겐으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체이며;
    R5는 --OR6, --O(CO)R6, --O(CO)OR9, --O(CH2)1-5OR6, --O(CO) NR6R7, --NR6R7, --NR6(CO)R7, -NR6(CO)OR9, --NR6(CO)NR7R8, --NR6SO2R9, --COOR6, --CONR6R7, -COR6, -SO2NR6R7, S(O)0-2R9, --O(CH2)1-10--COOR6, --O(CH2)1-10CONR6R7, -(저급 알킬렌)COOR6, 및 --CH.dbd.CH--COOR6로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체이고;
    R6, R7 및 R8은 수소, 저급 알킬, 아릴 및 아릴-치환된 저급 알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R9는 저급 알킬, 아릴 또는 아릴-치환된 저급 알킬이다.
  52. 최소한 하나의 화학요법제와 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제를 포함하는 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 천연 또는 인공적으로 합성된 형태의 스테롤 또는 스타놀, 또는 그것들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  54. 제 52항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 이성질체 형태들 중 어느 하나의 형태의 스테롤 또는 스타놀, 또는 그것들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  55. 제 52항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라씨카스테롤 (디히드로브라씨카스테롤 포함), 데스모스테롤, 칼리노스테롤, 포리페라스테롤, 클리오나스테롤, 에르고스테롤, 코프로스테롤, 코디스테롤, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 클레로스테롤, 네비스테롤, 라토스테롤, 스텔라스테롤, 스피나스테롤, 콘드릴라스테롤, 페포스테롤, 아베나스테롤, 이소아베나스테롤, 페코스테롤, 및 폴리나스타스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스테롤인 것을 특징으로 하는 조성물.
  56. 제 52항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 시토스타놀, 캄페스타놀, 스티그마스타놀, 브라씨카스타놀 (디히드로브라씨카스타놀 포함), 데스모스타놀, 칼리노스타놀, 포리페라스타놀, 클리오나스타놀, 에르고스타놀, 코프로스타놀, 코 디스타놀, 이소푸코스타놀, 푸코스타놀, 클레로스타놀, 네비스타놀, 라토스타놀, 스텔라스타놀, 스피나스타놀, 콘드릴라스타놀, 페포스타놀, 아베나스타놀, 이소아베나스타놀, 페코스타놀, 및 폴리나스타스타놀로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스타놀인 것을 특징으로 하는 조성물.
  57. 제 52항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 지방족 에스테르, 방향족 에스테르, 페놀산 에스테르, 신남산염 에스테르, 페룰레이트 에스테르, 글리코시드, 아실화된 글리코시드 및 아실글리코시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 스테롤 유도체 또는 스타놀 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  58. 제 52항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 다음 식 중 하나로 표시되는 스테롤 또는 스타놀을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 화합물, 및 그것들의 생물학적으로 허용될 수 있는 염 또는 용매 화합물 또는 최소한 하나의 그런 화합물 또는 그것들의 염 또는 용매 화합물의 선구약물인 것을 특징으로 하는 조성물:
    Figure 112006021027945-PCT00027
    상기 식에서 R은 스테롤 또는 스타놀 부분이고, R4는 아스코르브산으로부터 유도되며, n은 1 내지 5이다.
  59. 제 52항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 2나트륨 아스코르빌 캄페스타닐 포스페이트와 2나트륨 아스코르빌 시토스타닐 포스페이트를 포함하는 2나트륨 아스코르빌 스타닐 포스페이트 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  60. 제 52항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 히드록시 치환된 아제티디논인 것을 특징으로 하는 조성물.
  61. 최소한 두 개의 별도 성분:
    a) 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제를 포함하는 조성물; 및
    b) 최소한 하나의 화학요법제를 포함하는 조성물을,
    각 조성물의 투여를 설명하는 지시사항과 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  62. 동물 세포에서 다중약물 내성 유전자에 의해 발현된 단백질의 생성을 억제하는 방법으로서, 상기 동물에게 최소한 하나의 콜레스테롤 흡수 억제제의 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
  63. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 천연 또는 인공적으로 합성된 형태의 스테롤 또는 스타놀, 또는 그것들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 이성질체 형태들 중 어느 하나의 형태의 스테롤 또는 스타놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라씨카스테롤 (디히드로브라씨카스테롤 포함), 데스모스테롤, 칼리노스테롤, 포리페라스테롤, 클리오나스테롤, 에르고스테롤, 코프로스테롤, 코디스테롤, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 클레로스테롤, 네비스테롤, 라토스테롤, 스텔라스테롤, 스피나스테롤, 콘드릴라스테롤, 페포스테롤, 아베나스테롤, 이소아베나스테롤, 페코스테롤, 및 폴리나스타스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스테롤인 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 시토스타놀, 캄페스타놀, 스티그마스타놀, 브라씨카스타놀 (디히드로브라씨카스타놀 포함), 데스모스타놀, 칼리노스타놀, 포리페라스타놀, 클리오나스타놀, 에르고스타놀, 코프로스타놀, 코디스타놀, 이소푸코스타놀, 푸코스타놀, 클레로스타놀, 네비스타놀, 라토스타놀, 스텔라스타놀, 스피나스타놀, 콘드릴라스타놀, 페포스타놀, 아베나스타놀, 이소아베나스타놀, 페코스타놀, 및 폴리나스타스타놀로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스타놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 지방족 에스테르, 방향족 에스테르, 페놀산 에스테르, 신남산염 에스테르, 페룰레이트 에스테르, 글리코시드, 아실화된 글리코시드 및 아실글리코시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 스테롤 유도체 또는 스타놀 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 다음 식 중 하나로 표시되는 스테롤 또는 스타놀을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 화합물, 및 그것들의 생물학적으로 허용될 수 있는 염 또는 용매 화합물 또는 최소한 하나의 그런 화합물 또는 그것들의 염 또는 용매 화합물의 선구약물인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00028
    상기 식에서 R은 스테롤 또는 스타놀 부분이고, R4는 아스코르브산으로부터 유도되며, n은 1 내지 5이다.
  69. 제 68항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 2나트륨 아스코르빌 캄페스타닐 포스페이트와 2나트륨 아스코르빌 시토스타닐 포스페이트를 포함하는 2나트륨 아스코르빌 스타닐 포스페이트 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 히드록시 치환된 아제티디논인 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 다음 식으로 표시되는 히드록시 치환된 아제티디논 또는 그것의 생물학적으로 허용될 수 있는 염인 것을 특징으로 하는 방법:
    상기 식에서, Ar1 및 Ar2는 독립적으로 아릴 및 R4-치환된 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    Ar3은 아릴 또는 R5-치환된 아릴이며;
    X, Y 및 Z는 독립적으로 --CH2--, --CH(저급 알킬)- 및 --C(2저급 알킬)-로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    R과 R2는 독립적으로 --OR6, --O(CO)R6, -O(CO)OR9 및 --O(CO)NR6R7으로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
    R1과 R3은 독립적으로 수소, 저급 알킬 및 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    q는 0 또는 1; r은 0 또는 1; m, n 및 p는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4이며; 단 q와 r 중 적어도 하나는 1이고, m, n, p, q 및 r의 합은 2, 3, 4, 5 또는 6이며, p가 0이고 r이 1일 때 m, q, 및 n의 합은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    R4는 저급 알킬, --OR6, --O(CO)R6, --O(CO)OR9, --O(CH2)1-5OR6, --O(CO) NR6R7, --NR6R7, --NR6(CO)R7, -NR6(CO)OR9, --NR6(CO)NR7R8, --NR6SO2R9, --COOR6, --CONR6R7, -COR6, -SO2NR6R7, S(O)0-2R9, --O(CH2)1-10--COOR6, --O(CH2)1-10CONR6R7, -(저급 알킬렌)COOR6, --CH.dbd.CH--COOR6, --CF3, --CN, --NO2 및 할로겐으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체이며;
    R5는 --OR6, --O(CO)R6, --O(CO)OR9, --O(CH2)1-5OR6, --O(CO) NR6R7, --NR6R7, --NR6(CO)R7, -NR6(CO)OR9, --NR6(CO)NR7R8, --NR6SO2R9, --COOR6, --CONR6R7, -COR6, -SO2NR6R7, S(O)0-2R9, --O(CH2)1-10--COOR6, --O(CH2)1-10CONR6R7, -(저급 알킬렌)COOR6, 및 --CH.dbd.CH--COOR6로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 치환체이고;
    R6, R7 및 R8은 수소, 저급 알킬, 아릴 및 아릴-치환된 저급 알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R9는 저급 알킬, 아릴 또는 아릴-치환된 저급 알킬이다.
  72. 제 71항에 있어서, 상기 화합물에서 Ar1은 페닐 또는 R4-치환된 페닐이고, Ar2는 페닐 또는 R4-치환된 페닐이며, Ar3은 R5-치환된 페닐인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 71항에 있어서, 상기 화합물에서 Ar1은 R4-치환된 페닐이고 이때 R4는 할로겐이며, Ar2는 R4-치환된 페닐이고 이때 R4는 할로겐 또는 --OR6이며, R6은 저급 알킬 또는 수소이고, Ar3은 R5-치환된 페닐이고 이때 R5는 --OR6이며, R6은 저급 알킬 또는 수소인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 71항에 있어서, 상기 화합물에서 X, Y, 및 Z는 각각 --CH2--이고, R1 및 R3은 각각 수소이며, R과 R2는 각각 --OR6이고, 이때 R6은 수소이며, m, n, p, q 및 r의 합은 2, 3 또는 4인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 71항에 있어서, 상기 화합물에서 m, n 및 r은 각각 0이고, q는 1이며 p는 2인 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 71항에 있어서, 상기 화합물에서 p, q 및 n은 각각 0이고, r은 1이며 m은 2 또는 3인 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 71항에 있어서, 상기 화합물이 다음 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    3(R)-(2(R)-히드록시-2-페닐에틸)-4(R)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(R)-(2(R)-히드록시-2-페닐에틸)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(S)-(1(S)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(S)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(R)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    rel-3(R)→(S)-히드록시-(2-나프탈레닐)메틸!-4(3S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    rel-3(R)→(R)-히드록시-(2-나프탈레닐)메틸!-4(S)-(4-메톡시페닐)-1-페닐-2-아제티디논;
    3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필)-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디 논;
    3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필)-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)-(4-히드록시페닐)-3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필-1-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)-(4-히드록시페닐)-3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필-1-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    rel 3(R)→3(RS)-히드록시-3→4-(메톡시메톡시)-페닐!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    1-(4-플루오로페닐)-3(R)→3(S)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4(S)-(.sup.4-히드록시페닐)-2-아제티디논;
    1-(4-플루오로페닐)-3(R)→3(R)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4 (S)-(4-히드록시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-3(R)-(3(R)-히드록시-3-페닐프로필)-1-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-3(R)-(3(S)-히드록시-3-페닐프로필)-1(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    1-(.sup.4-플루오로페닐)-3(R)-3(S)-(4-플루오로페닐)-3-히드록시프로필)!-4 (S)→4-(페닐메톡시)페닐!-2-아제티디논;
    3(R)→3(R)-아세틸옥시)-3-페닐프로필!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제 티디논;
    3(R)→3(S)-아세틸옥시)-3-페닐프로필!-1,4(S)-비스-(4-메톡시페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(R)-(아세틸옥시)-3-(4-f플루오로페닐)프로필!-4(S)-4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-플루오로페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(S)-(아세틸옥시)-3-(4-플루오로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시) 페닐!-1-(4-플루오로페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(R)-(아세틸옥시)-3-(4-클로로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-클로로페닐)-2-아제티디논;
    3(R)→3(S)-(아세틸옥시)-3-(4-클로로페닐)프로필!-4(S)→4-(아세틸옥시)페닐!-1-(4-클로로페닐)-2-아제티디논; 및
    rel 1-(4-플루오로페닐)-4(S)-(4-히드록시페닐)-3(1R)-(1(R)-히드록시-3-페닐프로필)-2-아제티디논.
  78. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 안드로스탄 및/또는 안드로스텐 유도체이고, 상기 안드로스탄 및/또는 안드로스텐은 아스코르브산과 결합되며 다음 식 중 하나 또는 둘 이상으로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00029
    상기 식에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6은 개별적으로 수소, OH, 카보닐, 및 아스코르빌 부분으로부터 선택될 수 있고, R7은 수소 또는 어떠한 할로겐일 수 있다.
  79. 제 78항에 있어서, 상기 안드로스탄 또는 안드로스텐 부류의 화합물과 결합되는 아스코르빌 부분이 개별적으로 다음 구조식 중 하나 또는 둘 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112006021027945-PCT00030
    Figure 112006021027945-PCT00031
    Figure 112006021027945-PCT00032
    Figure 112006021027945-PCT00033
    Figure 112006021027945-PCT00034
    상기 식들에서 M+는 어떠한 금속, 알칼리 토금속, 또는 알칼리 금속을 나타낸다.
  80. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 담즙산 운반 또는 재흡수의 억제제이고, 모든 회장, 정점 및 간 운반 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 1항에 있어서, 상기 다중약물 내성 유전자가 ABCB1 (MDR-1); ABCA2 (ABC2); ABCB2 (TAP); ABCB3 (TAP); ABCC1 (MRP-1); 및 ABCC3 (MRP-3)로 이루어지는 군 중 하나 또는 둘 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 22항에 있어서, 상기 다중약물 내성 유전자가 ABCB1 (MDR-1); ABCA2 (ABC2); ABCB2 (TAP); ABCB3 (TAP); ABCC1 (MRP-1); 및 ABCC3 (MRP-3)로 이루어지 는 군 중 하나 또는 둘 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 41항에 있어서, 상기 다중약물 내성 유전자가 ABCB1 (MDR-1); ABCA2 (ABC2); ABCB2 (TAP); ABCB3 (TAP); ABCC1 (MRP-1); 및 ABCC3 (MRP-3)로 이루어지는 군 중 하나 또는 둘 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 52항에 있어서, 상기 다중약물 내성 유전자가 ABCB1 (MDR-1); ABCA2 (ABC2); ABCB2 (TAP); ABCB3 (TAP); ABCC1 (MRP-1); 및 ABCC3 (MRP-3)로 이루어지는 군 중 하나 또는 둘 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  85. 제 62항에 있어서, 상기 다중약물 내성 유전자가 ABCB1 (MDR-1); ABCA2 (ABC2); ABCB2 (TAP); ABCB3 (TAP); ABCC1 (MRP-1); 및 ABCC3 (MRP-3)로 이루어지는 군 중 하나 또는 둘 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 리포솜의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제 22항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 리포솜의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제 41항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 리포솜의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제 52항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 리포솜의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  90. 제 61항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 리포솜의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 키트.
  91. 제 62항에 있어서, 상기 콜레스테롤 흡수 억제제가 리포솜의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
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