CN1816276B - 生产具有良好农业经济价值的甘蓝型油菜双低恢复系的方法 - Google Patents

Abstract

生产Ogura胞质雄性不育(cms)的甘蓝型油菜(Brassica napus)双低恢复系的方法，所述甘蓝型油菜呈现出携带Rfo恢复基因的萝卜渐渗物，其中缺失萝卜Pgi-2等位基因并重组入甘蓝(Brassica oleracea)的Pgi-2基因，所述甘蓝型油菜还具有良好农业经济价值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo传递率和高营养势。形成甘蓝型油菜杂交种子及其后代的方法。甘蓝型油菜的种子以及组合标志物PGIol、PGIunt、PGIint、BolJon和CP418用于表征的用途。

Description

生产具有良好农业经济价值的甘蓝型油菜双低恢复系的方法

本发明涉及产生Ogura胞质雄性不育(cms)的甘蓝型油菜(Brassica napus)双低恢复系的方法，所述甘蓝型油菜呈现出携带Rfo恢复基因的萝卜渐渗物(introgression)，其中缺失萝卜Pgi-2等位基因并重组入甘蓝(Brassica oleracea)的Pgi-2基因，所述甘蓝型油菜还具有良好农业经济价值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo传递率和高营养势。本发明还涉及形成甘蓝型油菜杂交种子及其后代的方法以及选择标志物的用途。

培育油菜籽(Brassica napus L.)Ogu-INRA胞质雄性不育(Cytoplasmic MaleSterility，cms)系统的恢复系一直是几年的主要目标。繁杂的回交和系谱育种对于提高雌性可育性并获得双低恢复系是必要的。所谓“双低”品种是油中的芥酸低且炼油后剩余固体食物中芥子油苷(glucosinolate)低的那些品种。然而，大规模的萝卜基因渐渗导致繁育这些系时仍遇到一些困难(基因渐渗重排，可能与负性性状连锁)。

因此发明人为自己设定目标提供新的改进的具有良好农业经济价值的双低恢复系。

通过生产油菜籽中Ogu-INRA cms的重组双低恢复系的新方法而实现这个目标。

本发明第一个目标涉及生产Ogura胞质雄性不育(cms)的甘蓝型油菜双低恢复系的方法，所述甘蓝型油菜呈现出携带Rfo恢复基因的萝卜渐渗物，其中缺失萝卜Pgi-2等位基因并重组入甘蓝的Pgi-2基因，所述甘蓝型油菜还具有良好农业经济价值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo传递率和高营养势，所述方法包括以下步骤：

a)将含缺失萝卜插入物的春性甘蓝型油菜的双低cms系与春性Drakkar的双低系杂交，以形成甘蓝型油菜的杂合恢复植株，

b)减数分裂前用γ射线辐照由步骤a)获得的杂合恢复植株，

c)将步骤b)所得花的花粉与cms双低春性Wesroona系杂交，

d)测试后代的营养势、雌性可育性和cms基因传递率，

e)选择后代品系。

本发明中，术语“品系”表示基本纯合的并可经自花传粉繁殖的植物。

根据前述方法，其中步骤b)的辐照剂量是6mn期间65Gray。

根据本发明方法实施方案的一种有利形式，步骤a)中春性甘蓝型油菜的双低cms系是R211。

R211是INRA春性恢复系。

Drakkar是法国春性注册品种。

Wesroona是澳大利亚春性注册品种。

根据本发明方法实施方案的一种有利形式，用选自PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418的五个标志物的组合进行测试。

本发明的另一个目标涉及Ogura cms的甘蓝型油菜双低恢复系，所述甘蓝型油菜呈现出Rfo插入，其中缺失萝卜Pgi-2等位基因并重组入甘蓝的Pgi-2基因，所述甘蓝型油菜还具有良好农业经济价值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo传递率和高营养势。

根据一种有利形式的实施方案，所述双低恢复系呈现出选自PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418的五个标志物的独特组合。

本发明另一个目标涉及形成甘蓝型油菜植物及其后代的方法，它们通过以下步骤获得：

a)提供根据前述方法生产并繁育成纯合的恢复系，

b)将所述恢复系作为传粉者用于杂交生产领域，

c)将cms不育植物作为生产杂交种种子的植物用于杂交生产领域，和

d)从所述雄性不育植物收获杂交种种子。

本发明另一个目标涉及由根据本发明方法获得的甘蓝型油菜的种子。

本发明的另一个目标涉及甘蓝型油菜的种子，其于2003年7月4日以参考编号NCIMB41183保藏于NCIMB Limited，23 St Machar Drive，Aberdeen，Scotland，AB243RY，UK。

本发明的另一个目标涉及至少四个标志物PGIol、PGIint、BolJon和CP418的组合、或其中包含至少一个多态性位点的任意部分用于表征Ogura cms的甘蓝型油菜重组恢复系的用途，所述甘蓝型油菜呈现Rfo插入，其中缺失萝卜Pgi-2等位基因并重组入甘蓝的Pgi-2基因，所述甘蓝型油菜还具有良好农业经济价值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo传递率和高营养势。

在一个优选实施方案中，所述组合是五种标志物PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418的组合。

在本发明中，表述“其中包含至少一个多态性位点的任意部分”表示显示出甘蓝型序列和芜菁(B.rapa)型序列之间至少一种差异的序列的任意部分。

这些标志物在关于R2000品系的以下附图和序列表中被示出。

根据一种有利形式的实施方案，本发明涉及：

-标志物PGIol，用引物PGIol U和PGIol L扩增：

(PGIol U：5′TCATTTGATTGTTGCGCCTG3′；

PGIol L：5′TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3′)

-标志物PGIint，用引物PGIint U和PGIint L扩增：

(PGIint U：5′CAGCACTAATCTTGCGGTATG3′；

PGIint L：5′CAATAACCCTAAAAGCACCTG3′)

-标志物PGIUNT，用引物PGIol U和PGIint L扩增：

(PGIol U：5′TCATTTGATTGTTGCGCCTG3′；

PGIint L：5′CAATAACCCTAAAAGCACCTG3′)

-标志物BolJon，用引物BolJon U和BolJon L扩增：

(BolJon U：5′GATCCGATTCTTCTCCTGTTG3；

BolJon L：5′GCCTACTCCTCAAATCACTCT3′)

-标志物CP418，用引物SG129U和pCP418L扩增：

(SG129 U：参见Giancola et al，2003 Theor Appl.Genet.(in press)

pCP418 L：5′AATTTCTCCATCACAAGGACC3′)

本发明的另一个目标涉及标志物PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418，它们的序列如下：

PGIol R2000标志物：

TCATTTGATT GTTGCGCCTG TCGCCTTGTT GTGTTATGAT GAATGAACAG CAGTCATTTA   60

ACATGTGGTT AACTTAACAG GGCTCCGGCT GTTGCAAAAC ACATGGTTGC TGTCAGCACT  120

AATCTTGCGG TATGAATTTG TGATTAAATT TGTTTGTTTG TGACTCTTTC TTCATTGTTC  180

GTTTTCGTAC AATAAACCGA ATGTATAATC TTTTTACAAA CTGAATTTTC TACCGGGTCT  240

GATGTACA                                                           248

PGIUNT R2000标志物：

TCATTTGATT GTTGCGCCTG TCGCCTTGTT GTGTTATGAT GAATGAACAG CAGTCATTTA   60

ACATGTGGTT AACTTAACAG GGCTCCGGCT GTTGCAAAAC ACATGGTTGC TGTCAGCACT  120

AATCTTGCGG TATGAATTTG TGATTAAATT TGTTTGTTTG TGACTCTTTC TTCATTGTTC  180

GTTTTCGTAC AATAAACCGA ATGTATAATC TTTTACAAAC TGAATTTTCT ACCGGGTCTG  240

ATGTACAATG CTAGTCTCCA TGTTCTTGGG GATCATGATT TATTTTCTAC ATGTATTCAG  300

ACAGTACAGA AGAAAGTGTT CAAAACTCTG GATGTTTTAA TTTACAGTTA GTGGAGAAGT  360

TCGGCATTGA TCCGAACAAT GCATTTGCAT TTTGGGACTG GGTTGGTGGA AGGTACAGTG  420

GTAAGTGCTT GTTTATTTGG TTGTATAAAT TTCTCGTCCA TTTCCGCTTG CTTAGTGTAT  480

AACTGAAATT CTTTTGCAGT TTGCAGTGCT GTTGGAGTCT TACCATTGTC TCTACAGTAT  540

GGCTTCTCTG TGGTTGAGAA GTACGGTACC TTCTACTTTA TCAGCCATCT CATAAAATGT  600

CTTAGGCATA TTCTTTCTAT TTTATTTCCC TCTTAATGAT TTCTTCTTTT TTTTATTGCA  660

TTCCCGTTTT ATTTTCAAAA GTTGTTACTG TCTCTAAATC AAGAAGAAAC CTTCTTAGTA  720

GATCCAGCTG ATATTCAGCC TTTTTTAAAT TGGACTGCAG GTTTTTAAAG GGGAGCTTCA  780

AGCATTGATA AGCATTTCCA GTCCACACCG TTTGAGAAGA ATATACCCGT GAGTTGCATT  840

AGTTGTGTGA TTATACAGTT TTCTTGTCTT TTTGCTATGT CCATCAACAC TAGAGATTCG  900

TGAAGTTATT AGTGTAGTCA ACGCATAGGG AGAGGTGATT GGTGACTTTT GGACGATTTC  960

AGGTGCTTTA GGGTTATTG                                               979

PGIint R2000标志物：

CAGCACTAAT CTTGCGGTAT GAATTTGTGA TTAAATTTGT TTGTTTGTGA CTCTTTCTTC   60

ATTGTTCGTT TTCGTACAAT AAACCGAATG TATAATCTTT TACAAACTGA ATTTTCTACC  120

GGGTCTGATG TACAATGCTA GTCTCCATGT TCTTGGGGAT CATGATTTAT TTTCTACATG  180

TATTCAGACA GTACAGAAGA AAGTGTTCAA AACTCTGGAT GTTTTAATTT ACAGTTAGTG  240

GAGAAGTTCG GCATTGATCC GAACAATGCA TTTGCATTTT GGGACTGGGT TGGTGGAAGG  300

TACAGTGGTA AGTGCTTGTT TATTTGGTTG TATAAATTTC TCGTCCATTT CCGCTTGCTT  360

AGTGTATAAC TGAAATTCTT TTGCAGTTTG CAGTGCTGTT GGAGTCTTAC CATTGTCTCT  420

ACAGTATGGC TTCTCTGTGG TTGAGAAGTA CGGTACCTTC TACTTTATCA GCCATCTCAT  480

AAAATGTCTT AGGCATATTC TTTCTATTTT ATTTCCCTCT TAATGATTTC TTCTTTTTTT  540

TATTGCATTC CCGTTTTATT TTCAAAAGTT GTTACTGTCT CTAAATCAAG AAGAAACCTT  600

CTTAGTAGAT CCAGCTGATA TTCAGCCTTT TTTAAATTGG ACTGCAGGTT TTTAAAGGGG  660

AGCTTCAAGC ATTGATAAGC ATTTCCAGTC CACACCGTTT GAGAAGAATA TACCCGTGAG  720

TTGCATTAGT TGTGTGATTA TACAGTTTTC TTGTCTTTTT GCTATGTCCA TCAACACTAG  780

AGATTCGTGA AGTTATTAGT GTAGTCAACG CATAGGGAGA GGTGATTGGT GACTTTTGGA  840

CGATTTCAGG TGCTTTAGGG TTATTG                                       866

BolJon R2000标志物：

GATCCGATTC TTCTCCTGTT GAGATCAGCT CCAAACATCA AACAACTTGT ACACAAATAT  60

CTTTACTTGC TAAATGGAAC ATGACAAGAG ATAGAAAATC TTGCTCATAG TATTGTACAA 120

GGGATAACAG TGTAGAAAAC AAACCGTCTG TAAGATTTTC TCCCTGATCC TCTCACTTAA 180

CCAGTAGGCG TTTTTCACAT TGAAGCGCAT ATCTACTTTG GTATTCACTG AATAAAAAAA 240

GAAAGCTGGT AACATGTGAA GGATATACAA GCATTGATAC ACCAAGTAGT CACAAACTAC 300

ATTATAAAGG TCAGACCTTT GTTCACATTC TGGCCTCCAG GACCACCGCT TCTAGCAAAG 360

TTAAGCGTAA CATGGTCTGC ACGTATACAA ATGAAAATGT TTCTATCAAA ATCCTATAAA 420

ATAGAGCTCT ATAACATTGT CGATACATAG TTTCACTAAC TCTGCAAGTA CTAAACACAT 480

ATACAAACAA AACTATGCGA ACAGATCAAA ACTACTACAG AACACAGTTC TATGACACTG 540

TCGATAGTAA CATCCTCTGC AAGTACCAAA GAGATAGCAA ATGAAACTAT GTAAACAAAT 600

CAAAATTCTA AATTTCTCCA TCACAAGGAC CTACAGAATA GAGTTATCAT AACATTTTCT 660

GTAAATATTT CCATCAAAAT GACTAGAGAA CAGAGTTCTT ATAACATTAT CTGTAAATGT 720

TCCAACAAAA CCACTACATA GCAGAGTTCT TATAACATTG TCTGTAAATG TCCAATCAAA 780

ACCACTACAG AACAAAGCTC CTATAACATT GTTTATACAA AGTTTCACTA AATCTACAAA 840

CTTTCCCCGT AAATGAGCTT AATATCACCC AAAGATGTTT CAATCAGATA AAGAGTACGA 900

CATCGTTTTG AGATTAGAAC AAACTGAAAC TTACGTAGAG TGATTTGAGG AGTAGGC    957

CP418L R2000标志物：

AATTTCTCCA TCACAAGGAC CTACAGAATA GAGTTATCAT AACATTTTCT GTAAATATTT  60

CCATCAAAAT GACTAGAGAA CAGAGTTCTT ATAACATTAT CTGTAAATGT TCCAACAAAA 120

CCACTACATA GCAGAGTTCT TATAACATTG TCTGTAAATG TCCAATCAAA ACCACTACAG 180

AACAAAGCTC CTATAACATT GTTTATACAA AGTTTCACTA AATCTACAAA CTTTCCCCGT 240

AAATGAGCTT AATATCACCC AAAGATGTTT CAATCAGATA AAGAGTAACG ACATCGTTTT 300

GAGATTAGAA CAAACTGAAA CTTACGTAGA GTGATTTGAG GAGTAGGCTC GTTGCCAGCA 360

GAGCTAGCTC TCTCCTCCGC CTCATGAAGC ATCTGTTGCA CCTGAGACAA CCGTGACGAA 420

ACTTTCCGAT CACCGCCACC AGAATTCGAC GCCGCGCATC GGAAGGATCC GAATCGGGAA 480

CTGAGTGAAC CCGAGCGATC CCGGGAGTGC GACGGAGCGA TGGGAAAAGA GAGTGGCACG 540

ATTTCGACGA AGAGTGGAAG AGGAGAGGGT GGTGGATAAA CTCGCGTATG ATCAAGTTCG 600

TCATCGTCCT GATTGCCGCC ATTTTTTTTG TCAGGGCGCT CTGTGGCTTA GAAGTTTCCG 660

ATGTCAATGA AC                                                     672

在下面的附图中，使用以下缩写：

Dra                                   Drakkar

Rel-15-1，E38，R15                    R2000

Hete，Hel，R211.Drakkar               杂合R211*Drakkar

Darm                                  Darmor

Bol：                                 甘蓝

Bra，B.rap：                          芜菁

GCPA18-A19，Wes，Aust：               Wesroona

Sam，SamlPGIolSunt5                   Samourai

RRH1，ba2c                            RRH1

rav，N.WR                             杂交种甘蓝型油菜*野生萝卜

-图1表示γ射线辐照和F2产生。

-图2表示‘R211’和‘R2000’上产生的种子。

-图3表示不同品系每个荚中的种子数。

-图4表示PGIol引物在数据库中PGI序列片段上的定位。在该图中：

PGIol：-引物PGIol U(在SGAP中称为：BnPGIch 1 U)

       -引物PGIol L(在SGAP中称为：Bn PGIch 1L)

PGIint：-引物PGIint U

        -引物PGIint L(位于序列以外)

-图5表示PGI-2基因(PGIol)、PCR标记物和SG34、接近Rfo的PCR标记物的电泳凝胶。

-图6表示用PGIol引物经PCR扩增的Pgi-2DNA片段。

-图7表示PCR产物PGIol经Mse1消化的结果。

图中：

Sam和Darm具有75bp带。

Drak、R211.Dk和R2000显示70bp带(丙烯酰胺15％)。

8与Samourai相似(75bp)；与Drakkar(70bp)混合使得显示两条带。

-图8表示PGIUNT标志物的电泳琼脂糖凝胶。

图中：

PGIUNT带(约980bp)存在于甘蓝、芜菁(B.rapa cv Asko)，除‘R211’以外的保持系和恢复系。

在萝卜和拟南芥中扩增不到。

在多种芸苔属基因型中仅扩增一条带。片段大小相似但序列不同。

-图9表示PGIint PCR标志物的电泳凝胶。

图中萝卜品系7的PGIint约为950bp。该带与恢复系RRH1和R113的相同。未在R211中发现。也未在R2000中发现。然而PGIint带与多种芸苔属物种中的约870bp具有相似大小但序列不同。

-图10表示BolJon PCR标志物的电泳凝胶。

图11表示CP418标志物的电泳凝胶。

图中，CP418带(约670bp)对所述甘蓝基因组是特异的。它存在于甘蓝、甘蓝型油菜(Samourai，Drakkar，Pactol和杂合的R2111*Dk)。它不存在于恢复的油菜籽(RRH，R113和R211)。它存在于所述纯合的R2000。

-图12表示标志物总结表。

-图13(13(a)，13(b))表示拟南芥、萝卜、芜菁、甘蓝和R2000之间的PGIol标志物序列匹配。

-图14(14(a)，14(b)，14(c)，14(d))表示拟南芥、萝卜、芜菁、甘蓝和R2000之间的PGIint-UNT标志物序列匹配.

-图15(15(a)，15(b)，15(c))表示拟南芥、萝卜、芜菁、甘蓝和R2000之间的CP418L标志物序列匹配。

-图16(16et16bis)表示拟南芥、萝卜、芜菁BolJon标志物。

对拟南芥的DB序列(AC007190end-AC011000begining)、甘蓝EMBH959102end和EMBH448336 begining以及甘蓝型油菜中SG129标志物带1和2的代表性共有序列(分别在Drakkar和Samourai中)进行匹配。

从位点836bp开始，AC07190-AC11000和GCPATpBOJ序列不再与芸苔属序列紧密同源。

分别从858bp位点到900bp和981位点，所述萝卜和芜菁(GCPconsen RsRfBOJ和BR)序列仍然与甘蓝型油菜序列紧密同源。

萝卜中，在芸苔属序列上向下仅发现部分同源。

在芜菁(B.rapa species cv Asko)中，在78bp缺失后，其BolJon序列的左侧，与甘蓝和芜菁(B.rapa)从1057bp位点到BolJon L引物的甘蓝型油菜序列可再次匹配。

-图17(17et 17bis)表示Pgi-2引物在拟南芥MJB21.12序列上的定位。

-图18表示BolJon引物在mipsAtl62850基因以及AC007190和AC011000拟南芥克隆的重叠区上的定位。与拟南芥BolJon PCR产物(740bp)的匹配被表示出。

然而应该明白，给出所述实例只是为了举例说明本发明目的，而绝不构成对本发明的限制。

实施例I：产生Ogura胞质雄性不育(cms)的甘蓝型油菜双低恢复系的方法，所述甘蓝型油菜呈现出携带Rfo恢复基因的萝卜渐渗物，其中缺失萝卜Pgi-2等位基因并重组入甘蓝的Pgi-2基因，所述甘蓝型油菜还具有良好农业经济价值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo传递率和高营养势。

材料和方法：

基因型：缺失萝卜插入物的“R211”与春性低GLS油菜“Drakkar”杂交产生F1子代(‘R211*Dk’)。春性GLS cms系‘Wesroona’(澳大利亚来源)用于后续的杂交。在分子分析中用作对照：来源于携带完全(‘RRH1’)或不完全(‘R113’)基因渐渗的‘Samourai’的冬性恢复系、以及欧洲萝卜品系7、亚洲恢复萝卜D81、杂交种甘蓝型油菜*野生萝卜、甘蓝、和B.rapa cv Asko、拟南芥。

γ射线辐照：在受控区域用Co60源的γ射线处理整株开花中的植株。减数分裂前给予65Gray亚致死剂量。

测交和F2产生：去除大于2mm的花蕾后将辐照植株转移入防虫温室。辐照过的F1子代用于手工授粉cms‘Wesroona’品系。使恢复系来源的F1’植株产生F2家族，单独收获并与非辐照对照一起精确播种于试验田中(图1)。

表型选择：在两年田间试验中对1200个F2子代和44个对照(82 330引用植株)进行三个视觉标准评分(1到5分)，

1-营养势，

2-F2分离中可育/不育植株比例的正规性，和

3-雌性可育性(生荚和结种)。

从大田或温室中获得所选家族的自交后代并产生纯合系(F4)，供进一步分析。

同工酶分析按下文操作(Delourne R.and Eber F.1992.Theor Appl Genet85：222-228)，标志物开发根据(Fourmann M et al 2002.Theor Appl.Genet.105：1196-1206)：经测序验证PCR产物。用Blast Ncbi和Uk Crop Net Brassica DB和Multialin软件INRA Toulouse进行匹配分析。

方法：

我们选择已经表现出基因渐渗的缺失的一种低GLS春性纯合恢复系‘R211’(Delourme R.and Eber F.1992.Theor Appl Genet 85：222-228.Delourme R et al 1998.Theor Appl Genet 97：129-134.Delourme R.et al 1999.10^th Int.Rapeseed Congress，Canberra.)。在Rfo两侧缺少几个分子标志物，如spATCHIA(Fourmann M et al 2002.Theor Appl.Genet.105：1196-1206)，spSG91(Giancola S et al 2003 Theor Appl.Genet.(in press))。‘R211’丢失萝卜基因的Pgi-2等位基因的同工酶表达，也丢失甘蓝基因组Pgi-2等位基因(1，2)之一的表达。进而，纯合‘R211’表现连锁的负性性状如低营养势和结种(seed set)极差。我们假设这些植株缺乏油菜染色体片段。来源于这些材料的F2代中的可育比例低于预期(64％，而不是75％)。我们从这种‘R211’系启动了项目，并试图进行来自该缺失系的携带渐渗物的Rfo和来自双低甘蓝型油菜品系的油菜同源染色体之间的重组。

已知电离辐射诱导通过双链断裂随后异常重连接断裂末端而进行的染色体重排。在即将减数分裂之前使用γ射线辐照来源于‘R211’的杂合F1，从而诱导染色体断裂，以使缺失的萝卜渐渗物重组入油菜基因组中。

结果：

在测试的1200个F2家族中，很少家族在三个标准方面有最好得分。

只有一个，即‘R2000’被证明每个自交后代产生正常比例的可育植株，并具有稳定恢复良好的农业经济性状如良好的雌性可育性，与‘R211’比较还正常结种(图2和3)。这个家族从以65Gray/h剂量流的6mn辐照处理中获得。

芥子油苷分析确认了它的低含量。

图2(‘R211’和‘R2000’上产生的种子)中R2000显示正常花序，具有正常外观结构。

图3(每荚种子数)中，我们观察：

-最佳‘R2000’F4家族的自花传粉(自交)和测交

-‘Pactol’cms系、油菜和‘R211’对照。

实施例II：在Pgi-2基因中选择标志物

PGI同工酶分析：‘R2000’代，表达甘蓝基因组的油菜Pgi-2等位基因，该基因原本在‘R211’中丢失。

定义三个PCR标志物用于表征所述R2000家族，与已知恢复系油菜RRH1和R113比较。

1)开发来自所述BrassicaDB序列的PGIol标志物，特异性针对所述芸苔属(Brassica)基因组。在萝卜和拟南芥中都没有扩增，而仅在芸苔属中扩增到一个248bp的带。

2)PGIint标志物扩增所述Pgi-2基因的较长部分，使得明确区分所述多种测试物种芸苔属物种(Brassica)、萝卜属物种(Raphanus)和阿布属物种(Arabidopsis)。所述物种芜菁和甘蓝无法由琼脂糖凝胶上的此带大小区分，但可由它们的PGIINT带序列区分。

3)PGIUnt标志物，PGI ol U和PGI intL引物的组合。这个标志物具有PGIol标志物的特异性，但对于PGIint扩增更长部分。

II.1PGIol标志物

用PGIol引物，‘R211’亲代品系不显示扩增，而所述春性测试系显示248bp带。其DNA序列与芸苔属物种中Crop Net UK DB以及我们组以前的工作(称为SGAP序列)的PGI-2序列同源(引物SG PGI chou的位置，图4)。

它是克隆MJB21-12在阿布属物种(NCBI DB)的染色体V(34543bp)上的同源基因。

PGIol加SG34设定纯合性测试：

在混合PCR中组合使用两组引物，PGIol标记在纯合恢复植株中缺少的Pgi-2基因，而SG34(S.Giancola et al.，Giancola S et al 2003 Theor Appl.Genet.(in press))是与Rfo基因非常临近的标志物，用于区分在来源于‘R211’的F2代中分离的可育植株中间的纯合和杂合植株。可以使用与Rfo基因临近或Rfo基因中的任何其它标志物，代替使用SG34。

只有一个家族R2000在纯合和杂合子代中没有区别：

Pgi-2基因存在于R2000纯合子中，这与纯合亲代R211不同。

图5(PGIol和SG34PCR标志物)中：

纯合‘R2000’家族已恢复PGIol带。

确认了所述带DNA序列与已知阿布属和芸苔属Pgi-2序列的同源性。对照基因型(Drakkar，Pactol和Samourai，Darmor)在凝胶上具有相同模式。这个常见带的序列允许确认它们的高度同源性，因为除了一个碱基替换以外它们基本相似。

纯合‘R2000’家族已恢复甘蓝型PGIol带。它与Samourai组的已知恢复系不同。Pgi-2的这个扩增部分非常保守，在多种基因型中几乎没有任何差异。研究了Pgi-2的更长部分。

II.2PGIUNT和PGIint标志物：

PCR产物的电泳模式：

PGIUNT标志物：在Pgi-2序列进一步向下设计第二个反向引物PGIint L，以扩增所述基因的保守和可变区。当与PGIol U引物一起使用时，它只在芸苔属基因组中扩增980bp带。

R211不显示任何带，纯合‘R2000’显示PGIUNT带，这与Drakkar亲代相同。图8(PGIUNT标志物)中：

PGIint标志物扩增PGIUNT的片段。上游引物PGIint允许在所有测试物种中扩增，允许明确区分阿布属物种、萝卜属物种和芸苔属物种。芜菁和甘蓝无法由琼脂糖凝胶上的此带大小区分，但可由它们的PGIint序列区分。除了‘R211’系，所有测试的恢复基因型都表现欧洲萝卜的带和与所述芜菁序列同源的一条芸苔属带。

纯合‘R2000’不显示所述萝卜PGIint带，这与缺失的‘R211’亲代系相同，但显示与所述甘蓝序列同源的一条芸苔属带。

PGIint标志物的电泳表示于图9。

序列分析：

比较数据库中的PGI序列。

已知约490bp的PGI片段。

我们实验室小组中已研究了来自不同基因型(甘蓝、芜菁、甘蓝型油菜)的约490bp片段的序列，一些序列被M.Fouramnn给予Brassica Crop Net DB：EMAF25875-25788(4)。这些序列非常保守。

比较芜菁和甘蓝物种的PGI序列(图13和14)：

从甘蓝和芜菁中的测试基因型中我们已经获得PGI序列，这些PGI序列之间的比较显示它们有21个碱基替换的区别。这些替换允许区分PGIint序列和油菜的其它测试基因型，它们与芜菁(B.rapa cv Asko)(RRH1和R113)或甘蓝(Drakkar、R211*DK以及R2000)同源。

实施例III：在临近Rfo区域选择标志物

测定萝卜基因插入物中Rfo基因周围的标志物，以利于克隆Rfo基因(Desloires Set al 2003 EMBO reports 4，6：588-594)。其中SG129PCR标志物位置与Rfo非常临近(Giancola S et al 2003 Theor Appl.Genet.(in press))：它在甘蓝型油菜的甘蓝和芜菁基因组中同时扩增不同带，但在琼脂糖凝胶上非常难以看到所述萝卜带。

目标SG129序列是克隆(AC011OOO，在F16P17基因座)在拟南芥中的同源基因。这个克隆与拟南芥相邻重叠群克隆(AC07190)重叠。

从Brassica Crop Net DB，我们发现与所述A011000起始匹配的一个甘蓝克隆(EMBH448336，764bp)，和与ACO7190末端匹配、在拟南芥图谱上距离约300bp的第二个甘蓝克隆(EMBH53971)。

我们设计了两个甘蓝克隆之间的新PCR标志物BolJon。我们证实了它可以在此处比较的不同基因型中扩增特异性PCR带。

在图16(BolJon PCR产物的电泳凝胶)中：

-在阿布属物种中扩增到BolJon 815bp带，它与所述重叠群的重叠片段同源。

-在芸苔属二倍体物种中，BolJon标志物显示不同的带：甘蓝中的950bp带和芜菁中的870bp带。它表明所述甘蓝克隆(EMBH53971和EMBH448336)在芸苔属基因组中序列连续，因为它对应阿布属物种的同源序列。

-在甘蓝型油菜中，这两条带在保持系Samourai或Drakkar中同时扩增。

-在萝卜品系7中，扩增到一条约630bp长的BolJon带。所述恢复萝卜cmsRd81中的带稍小。

-在所有恢复油菜品系中，一条BolJon带与萝卜品系7中的大小相同。BolJon是萝卜基因渐渗的标志物。

-纯合恢复的油菜品系‘RRH1’、‘R113’和‘R211’只显示所述芜菁带和630bp萝卜带，这提示当萝卜染色体片段插入油菜甘蓝的结构基因组中时，目标基因的甘蓝同源基因缺失或被修饰，。

‘R2000’纯合植物显示萝卜型PCR BolJon，以及所述两条芸苔属BolJon带，还已经恢复了‘R211’和其它恢复系中丢失的所述甘蓝带。

我们设计了引物pCP418L，在所述测试物种中对甘蓝基因组特异。和引物SG129U一起，它在甘蓝物种中只扩增一条PCR带(670bp)(图17)。

在芜菁、萝卜、阿布属物种中都没有扩增，但在甘蓝型油菜保持系中有清晰的CP418带。其序列与EMBH448336序列严格同源。这个标志物是非常保守的DNA序列，除了有或无，不允许基因型之间的多态性。

在RRH1、R113和R211中没有CP418带，与先前一样这表明在萝卜插入以后目标基因的甘蓝同源基因缺失或者被修饰。

‘R2000’纯合植物显示CP418带，还已经恢复甘蓝特异性带。

本发明中，选择了一个具有良好雌性可育性的新型重组低GLS恢复系。‘R211’品系的低价值允许在大田中选择罕见的重组事件并表征‘R2000’家族。

当与已经分析的恢复系油菜比较时，纯合‘R2000’表现PGIol、PGIUNT、PGIint和BolJon标志物的独特组合：PGIinT标志物显示：纯合恢复的油菜品系RRH1和R113呈现所述欧洲萝卜带，以及与芜菁基因组同源的一条芸苔属带。‘R2000’不显示萝卜带，如同其亲代缺失品系R211一样而丢失，但显示一条与甘蓝同源的芸苔属带。在R211和Drakkar遗传背景中用该标志物扩增不到芜菁基因组中的同源PGIint序列。

BolJon标志物显示：包括‘R211’在内的纯合恢复油菜品系呈现出欧洲萝卜带并仅加上芜菁带。‘R2000’显示‘R211’的两条带加上恢复甘蓝的BolJon带。

CP418标志物显示：‘R2000’恢复了这个保守的甘蓝片段。

我们的假设是重组事件发生在产生‘R2000’植株的花粉母细胞中。然后所述缺失的萝卜渐渗物被整合到正常同源的染色体片段中，其中携带甘蓝型Pgi-2基因和BolJon目标序列，其特征是这些标志物，它们可能来自存在于辐照的杂合’R211*DK’中的Drakkar‘00’基因组。

观察到的BolJon模式提示：重组事件导致‘R2000’家族中的独特重复区域，一个来自萝卜而一个来自甘蓝。

序列表

<110>国家农艺研究院(INRA)

<120>生产具有良好农业经济价值的甘蓝型油菜双低恢复系的方法

<130>D21413

<160>5

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>248

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜

<220>

<223>PGIo1标志物

<400>1

tcatttgatt gttgcgcctg tcgccttgtt gtgttatgat gaatgaacag cagtcattta     60

acatgtggtt aacttaacag ggctccggct gttgcaaaac acatggttgc tgtcagcact    120

aatcttgcgg tatgaatttg tgattaaatt tgtttgtttg tgactctttc ttcattgttc    180

gttttcgtac aataaaccga atgtataatc tttttacaaa ctgaattttc taccgggtct    240

gatgtaca                                                             248

<210>2

<211>979

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜

<220>

<223>PGI-UNT标志物

<400>2

tcatttgatt gttgcgcctg tcgccttgtt gtgttatgat gaatgaacag cagtcattta     60

acatgtggtt aacttaacag ggctccggct gttgcaaaac acatggttgc tgtcagcact    120

aatcttgcgg tatgaatttg tgattaaatt tgtttgtttg tgactctttc ttcattgttc    180

gttttcgtac aataaaccga atgtataatc ttttacaaac tgaattttct accgggtctg    240

atgtacaatg ctagtctcca tgttcttggg gatcatgatt tattttctac atgtattcag    300

acagtacaga agaaagtgtt caaaactctg gatgttttaa tttacagtta gtggagaagt    360

tcggcattga tccgaacaat gcatttgcat tttgggactg ggttggtgga aggtacagtg    420

gtaagtgctt gtttatttgg ttgtataaat ttctcgtcca tttccgcttg cttagtgtat    480

aactgaaatt cttttgcagt ttgcagtgct gttggagtct taccattgtc tctacagtat    540

ggcttctctg tggttgagaa gtacggtacc ttctacttta tcagccatct cataaaatgt    600

cttaggcata ttctttctat tttatttccc tcttaatgat ttcttctttt ttttattgca    660

ttcccgtttt attttcaaaa gttgttactg tctctaaatc aagaagaaac cttcttagta    720

gatccagctg atattcagcc ttttttaaat tggactgcag gtttttaaag gggagcttca    780

agcattgata agcatttcca gtccacaccg tttgagaaga atatacccgt gagttgcatt    840

agttgtgtga ttatacagtt ttcttgtctt tttgctatgt ccatcaacac tagagattcg    900

tgaagttatt agtgtagtca acgcataggg agaggtgatt ggtgactttt ggacgatttc    960

aggtgcttta gggttattg                                                 979

<210>3

<211>866

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜

<220>

<223>PGI-int标志物

<400>3

cagcactaat cttgcggtat gaatttgtga ttaaatttgt ttgtttgtga ctctttcttc     60

attgttcgtt ttcgtacaat aaaccgaatg tataatcttt tacaaactga attttctacc    120

gggtctgatg tacaatgcta gtctccatgt tcttggggat catgatttat tttctacatg    180

tattcagaca gtacagaaga aagtgttcaa aactctggat gttttaattt acagttagtg    240

gagaagttcg gcattgatcc gaacaatgca tttgcatttt gggactgggt tggtggaagg    300

tacagtggta agtgcttgtt tatttggttg tataaatttc tcgtccattt ccgcttgctt    360

agtgtataac tgaaattctt ttgcagtttg cagtgctgtt ggagtcttac cattgtctct    420

acagtatggc ttctctgtgg ttgagaagta cggtaccttc tactttatca gccatctcat    480

aaaatgtctt aggcatattc tttctatttt atttccctct taatgatttc ttcttttttt    540

tattgcattc ccgttttatt ttcaaaagtt gttactgtct ctaaatcaag aagaaacctt    600

cttagtagat ccagctgata ttcagccttt tttaaattgg actgcaggtt tttaaagggg    660

agcttcaagc attgataagc atttccagtc cacaccgttt gagaagaata tacccgtgag    720

ttgcattagt tgtgtgatta tacagttttc ttgtcttttt gctatgtcca tcaacactag    780

agattcgtga agttattagt gtagtcaacg catagggaga ggtgattggt gacttttgga    840

cgatttcagg tgctttaggg ttattg                                         866

<210>4

<211>957

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜

<220>

<223>BolJon标志物

<400>4

gatccgattc ttctcctgtt gagatcagct ccaaacatca aacaacttgt  acacaaatat    60

ctttacttgc taaatggaac atgacaagag atagaaaatc ttgctcatag tattgtacaa    120

gggataacag tgtagaaaac aaaccgtctg taagattttc tccctgatcc tctcacttaa    180

ccagtaggcg tttttcacat tgaagcgcat atctactttg gtattcactg aataaaaaaa    240

gaaagctggt aacatgtgaa ggatatacaa gcattgatac accaagtagt cacaaactac    300

attataaagg tcagaccttt gttcacattc tggcctccag gaccaccgct tctagcaaag    360

ttaagcgtaa catggtctgc acgtatacaa atgaaaatgt ttctatcaaa atcctataaa    420

atagagctct ataacattgt cgatacatag tttcactaac tctgcaagta ctaaacacat    480

atacaaacaa aactatgcga acagatcaaa actactacag aacacagttc tatgacactg    540

tcgatagtaa catcctctgc aagtaccaaa gagatagcaa atgaaactat gtaaacaaat    600

caaaattcta aatttctcca tcacaaggac ctacagaata gagttatcat aacattttct    660

gtaaatattt ccatcaaaat gactagagaa cagagttctt ataacattat ctgtaaatgt    720

tccaacaaaa ccactacata gcagagttct tataacattg tctgtaaatg tccaatcaaa    780

accactacag aacaaagctc ctataacatt gtttatacaa agtttcacta aatctacaaa    840

ctttccccgt aaatgagctt aatatcaccc aaagatgttt caatcagata aagagtacga    900

catcgttttg agattagaac aaactgaaac ttacgtagag tgatttgagg agtaggc       957

<210>5

<211>672

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜

<220>

<223>CP418L标志物

<400>5

aatttctcca tcacaaggac ctacagaata gagttatcat aacattttct gtaaatattt     60

ccatcaaaat gactagagaa cagagttctt ataacattat ctgtaaatgt tccaacaaaa    120

ccactacata gcagagttct tataacattg tctgtaaatg tccaatcaaa accactacag    180

aacaaagctc ctataacatt gtttatacaa agtttcacta aatctacaaa ctttccccgt    240

aaatgagctt aatatcaccc aaagatgttt caatcagata aagagtaacg acatcgtttt    300

gagattagaa caaactgaaa cttacgtaga gtgatttgag gagtaggctc gttgccagca    360

gagctagctc tctcctccgc ctcatgaagc atctgttgca cctgagacaa ccgtgacgaa    420

actttccgat caccgccacc agaattcgac gccgcgcatc ggaaggatcc gaatcgggaa    480

ctgagtgaac ccgagcgatc ccgggagtgc gacggagcga tgggaaaaga gagtggcacg    540

atttcgacga agagtggaag aggagagggt ggtggataaa ctcgcgtatg atcaagttcg    600

tcatcgtcct gattgccgcc attttttttg tcagggcgct ctgtggctta gaagtttccg    660

atgtcaatga ac                                                        672

Claims (2)

1.五个标志物PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418的组合用于表征Ogura cms的甘蓝型油菜重组恢复系的用途，所述甘蓝型油菜呈现携带雄性可育Rfo恢复基因的萝卜渐渗物，其中缺失萝卜同工酶Pgi-2等位基因并重组入甘蓝的Pgi-2基因，所述甘蓝型油菜还具有雌性可育性、良好的Rfo传递率和高营养势的农业经济价值，所述标志物具有以下序列：

PGIol标志物：

TCATTTGATT GTTGCGCCTG TCGCCTTGTT GTGTTATGAT GAATGAACAG CAGTCATTTA   60

ACATGTGGTT AACTTAACAG GGCTCCGGCT GTTGCAAAAC ACATGGTTGC TGTCAGCACT  120

AATCTTGCGG TATGAATTTG TGATTAAATT TGTTTGTTTG TGACTCTTTC TTCATTGTTC  180

GTTTTCGTAC AATAAACCGA ATGTATAATC TTTTTACAAA CTGAATTTTC TACCGGGTCT  240

GATGTACA                                                           248

PGIUNT标志物：

TCATTTGATT GTTGCGCCTG TCGCCTTGTT GTGTTATGAT GAATGAACAG CAGTCATTTA   60

ACATGTGGTT AACTTAACAG GGCTCCGGCT GTTGCAAAAC ACATGGTTGC TGTCAGCACT  120

AATCTTGCGG TATGAATTTG TGATTAAATT TGTTTGTTTG TGACTCTTTC TTCATTGTTC  180

GTTTTCGTAC AATAAACCGA ATGTATAATC TTTTACAAAC TGAATTTTCT ACCGGGTCTG  240

ATGTACAATG CTAGTCTCCA TGTTCTTGGG GATCATGATT TATTTTCTAC ATGTATTCAG  300

ACAGTACAGA AGAAAGTGTT CAAAACTCTG GATGTTTTAA TTTACAGTTA GTGGAGAAGT  360

TCGGCATTGA TCCGAACAAT GCATTTGCAT TTTGGGACTG GGTTGGTGGA AGGTACAGTG  420

GTAAGTGCTT GTTTATTTGG TTGTATAAAT TTCTCGTCCA TTTCCGCTTG CTTAGTGTAT  480

AACTGAAATT CTTTTGCAGT TTGCAGTGCT GTTGGAGTCT TACCATTGTC TCTACAGTAT  540

GGCTTCTCTG TGGTTGAGAA GTACGGTACC TTCTACTTTA TCAGCCATCT CATAAAATGT  600

CTTAGGCATA TTCTTTCTAT TTTATTTCCC TCTTAATGAT TTCTTCTTTT TTTTATTGCA  660

TTCCCGTTTT ATTTTCAAAA GTTGTTACTG TCTCTAAATC AAGAAGAAAC CTTCTTAGTA  720

GATCCAGCTG ATATTCAGCC TTTTTTAAAT TGGACTGCAG GTTTTTAAAG GGGAGCTTCA  780

AGCATTGATA AGCATTTCCA GTCCACACCG TTTGAGAAGA ATATACCCGT GAGTTGCATT  840

AGTTGTGTGA TTATACAGTT TTCTTGTCTT TTTGCTATGT CCATCAACAC TAGAGATTCG  900

TGAAGTTATT AGTGTAGTCA ACGCATAGGG AGAGGTGATT GGTGACTTTT GGACGATTTC  960

AGGTGCTTTA GGGTTATTG                                               979

PGIint标志物：

CAGCACTAAT CTTGCGGTAT GAATTTGTGA TTAAATTTGT TTGTTTGTGA CTCTTTCTTC    60

ATTGTTCGTT TTCGTACAAT AAACCGAATG TATAATCTTT TACAAACTGA ATTTTCTACC   120

GGGTCTGATG TACAATGCTA GTCTCCATGT TCTTGGGGAT CATGATTTAT TTTCTACATG   180

TATTCAGACA GTACAGAAGA AAGTGTTCAA AACTCTGGAT GTTTTAATTT ACAGTTAGTG   240

GAGAAGTTCG GCATTGATCC GAACAATGCA TTTGCATTTT GGGACTGGGT TGGTGGAAGG   300

TACAGTGGTA AGTGCTTGTT TATTTGGTTG TATAAATTTC TCGTCCATTT CCGCTTGCTT   360

AGTGTATAAC TGAAATTCTT TTGCAGTTTG CAGTGCTGTT GGAGTCTTAC CATTGTCTCT   420

ACAGTATGGC TTCTCTGTGG TTGAGAAGTA CGGTACCTTC TACTTTATCA GCCATCTCAT   480

AAAATGTCTT AGGCATATTC TTTCTATTTT ATTTCCCTCT TAATGATTTC TTCTTTTTTT   540

TATTGCATTC CCGTTTTATT TTCAAAAGTT GTTACTGTCT CTAAATCAAG AAGAAACCTT   600

CTTAGTAGAT CCAGCTGATA TTCAGCCTTT TTTAAATTGG ACTGCAGGTT TTTAAAGGGG   660

AGCTTCAAGC ATTGATAAGC ATTTCCAGTC CACACCGTTT GAGAAGAATA TACCCGTGAG   720

TTGCATTAGT TGTGTGATTA TACAGTTTTC TTGTCTTTTT GCTATGTCCA TCAACACTAG   780

AGATTCGTGA AGTTATTAGT GTAGTCAACG CATAGGGAGA GGTGATTGGT GACTTTTGGA   840

CGATTTCAGG TGCTTTAGGG TTATTG                                        866

BolJon标志物：

GATCCGATTC TTCTCCTGTT GAGATCAGCT CCAAACATCA AACAACTTGT ACACAAATAT    60

CTTTACTTGC TAAATGGAAC ATGACAAGAG ATAGAAAATC TTGCTCATAG TATTGTACAA   120

GGGATAACAG TGTAGAAAAC AAACCGTCTG TAAGATTTTC TCCCTGATCC TCTCACTTAA   180

CCAGTAGGCG TTTTTCACAT TGAAGCGCAT ATCTACTTTG GTATTCACTG AATAAAAAAA   240

GAAAGCTGGT AACATGTGAA GGATATACAA GCATTGATAC ACCAAGTAGT CACAAACTAC   300

ATTATAAAGG TCAGACCTTT GTTCACATTC TGGCCTCCAG GACCACCGCT TCTAGCAAAG   360

TTAAGCGTAA CATGGTCTGC ACGTATACAA ATGAAAATGT TTCTATCAAA ATCCTATAAA   420

ATAGAGCTCT ATAACATTGT CGATACATAG TTTCACTAAC TCTGCAAGTA CTAAACACAT   480

ATACAAACAA AACTATGCGA ACAGATCAAA ACTACTACAG AACACAGTTC TATGACACTG   540

TCGATAGTAA CATCCTCTGC AAGTACCAAA GAGATAGCAA ATGAAACTAT GTAAACAAAT   600

CAAAATTCTA AATTTCTCCA TCACAAGGAC CTACAGAATA GAGTTATCAT AACATTTTCT   660

GTAAATATTT CCATCAAAAT GACTAGAGAA CAGAGTTCTT ATAACATTAT CTGTAAATGT   720

TCCAACAAAA CCACTACATA GCAGAGTTCT TATAACATTG TCTGTAAATG TCCAATCAAA   780

ACCACTACAG AACAAAGCTC CTATAACATT GTTTATACAA AGTTTCACTA AATCTACAAA   840

CTTTCCCCGT AAATGAGCTT AATATCACCC AAAGATGTTT CAATCAGATA AAGAGTACGA   900

CATCGTTTTG AGATTAGAAC AAACTGAAAC TTACGTAGAG TGATTTGAGG AGTAGGC      957

CP418标志物：

AATTTCTCCA TCACAAGGAC CTACAGAATA GAGTTATCAT AACATTTTCT GTAAATATTT    60

CCATCAAAAT GACTAGAGAA CAGAGTTCTT ATAACATTAT CTGTAAATGT TCCAACAAAA   120

CCACTACATA GCAGAGTTCT TATAACATTG TCTGTAAATG TCCAATCAAA ACCACTACAG   180

AACAAAGCTC CTATAACATT GTTTATACAA AGTTTCACTA AATCTACAAA CTTTCCCCGT   240

AAATGAGCTT AATATCACCC AAAGATGTTT CAATCAGATA AAGAGTAACG ACATCGTTTT   300

GAGATTAGAA CAAACTGAAA CTTACGTAGA GTGATTTGAG GAGTAGGCTC GTTGCCAGCA   360

GAGCTAGCTC TCTCCTCCGC CTCATGAAGC ATCTGTTGCA CCTGAGACAA CCGTGACGAA   420

ACTTTCCGAT CACCGCCACC AGAATTCGAC GCCGCGCATC GGAAGGATCC GAATCGGGAA   480

CTGAGTGAAC CCGAGCGATC CCGGGAGTGC GACGGAGCGA TGGGAAAAGA GAGTGGCACG   540

ATTTCGACGA AGAGTGGAAG AGGAGAGGGT GGTGGATAAA CTCGCGTATG ATCAAGTTCG   600

TCATCGTCCT GATTGCCGCC ATTTTTTTTG TCAGGGCGCT CTGTGGCTTA GAAGTTTCCG   660

ATGTCAATGA AC                                                       672。

2.根据权利要求1的用途，其中：

-用引物PGIol U和PGIol L扩增标志物PGIol：

PGIol U：5′TCATTTGATTGTTGCGCCTG3′；

PGIol L：5′TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3′；

-用引物PGIint U和PGIint L扩增标志物PGIint：

PGIint U：5′CAGCACTAATCTTGCGGTATG3′；

PGIint L：5′CAATAACCCTAAAAGCACCTG3′；

-用引物PGIol U和PGIint L扩增标志物PGIUNT：

PGIol U：5′TCATTTGATTGTTGCGCCTG3′；

PGIint L：5′CAATAACCCTAAAAGCACCTG3′；

-用引物BolJon U和BolJon L扩增标志物BolJon：

BolJon U：5′GATCCGATTCTTCTCCTGTTG3’；

BolJon L：5′GCCTACTCCTCAAATCACTCT3′。

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