RU2373698C2

RU2373698C2 - Способ получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности brassica napus, имеющих хорошее агрономическое качество

Info

Publication number: RU2373698C2
Application number: RU2006103259/13A
Authority: RU
Inventors: Катрин ПРИМАР-БРИССЕ (FR); Катрин Примар-Бриссе; Режин ДЕЛУРМ (FR); Режин Делурм; Жан-Пьер ПУПАР (FR); Жан-Пьер Пупар; Раймонд ОРВЭ (FR); Раймонд ОРВЭ; Франсуаз БЮДАР (FR); Франсуаз Бюдар; Жорж ПЕЛЛЕТЬЕ (FR); Жорж Пеллетье; Мишель РЕНАР (FR); Мишель Ренар
Original assignee: Энститю Насьональ Де Ля Решерш Агрономик
Priority date: 2003-07-04
Filing date: 2004-07-05
Publication date: 2009-11-27
Also published as: SI2179643T1; WO2005002324A3; ES2532641T3; ES2394990T8; DK2298066T3; CN1816276A; EP2179643B1; US7812217B2; PT2298066E; EP2179643A2; EP2298066B1; US20070256150A1; EP2298066A9; DK2179643T3; EP2179643A3; PL2179643T3; WO2005002324A2; AU2010200255A1; US8097776B2; EP1641336A2

Abstract

Получают двухнулевую линию-восстановитель фертильности Brassica napus для мужской цитоплазматической стерильности (ЦМС) Ogura, представляющую собой интрогрессию редьки, несущую ген-восстановитель фертильности Rfo, вырезанную из аллели Pgi-2 редьки и рекомбинированную с геном Pgi-2 из Brassica oleracea, характеризующейся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью. Для характеризации полученной линии-восстановителя фертильности используют комбинацию маркеров PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и СР418. Линия отличается хорошим агрономическим качеством. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 24 ил.

Description

Изобретение относится к способу получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности рапса Brassica napus с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) Ogura, представляющего собой интрогрессию редьки, несущую ген-восстановитель фертильности Rfo, вырезанный из аллели Pgi-2 редьки и рекомбинированный с геном Pgi-2 Brassica oleracea, имеющих хорошее агрономическое качество, отличающееся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью. Изобретение также относится к способу получения гибридных семян Brassica napus и их потомства, а также использования маркеров для селекции.

Линии-восстановители фертильности для размножения системы мужской цитоплазматической стерильности (ЦМС) Ogu-INRA рапса (Brassica napus L.) были основой целью исследований в течение последних нескольких лет. Широкое обратное скрещивание и селекция были необходимы для улучшения их женской фертильности и получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности. Так называемые «double low-двухнулевые» разновидности - это те, которые содержат низкий уровень эруковой кислоты, а также низкий уровень глюкозинолатов в шроте после экстракции масла. Однако в размножении этих линий все еще могут встречаться трудности (перестройки интрогрессии, возможная связь с негативными особенностями) вследствие большой величины интрогрессии редьки.

Поэтому авторы изобретения поставили себе цель получить новую улучшенную двухнулевую линию-восстановитель фертильности с хорошим агрономическим качеством.

Эта цель была достигнута новым способом получения рекомбинантной двухнулевой линии-восстановителя фертильности для ЦМС Ogu-INRA рапса. Первая задача данного изобретения относится к способу получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности Brassica napus для мужской цитоплазматической стерильности (ЦМС) Ogura, представляющего собой интрогрессию редьки, несущую ген-восстановитель фертильности Rfo, лишенный аллели Pgi-2 редьки и рекомбинированный с геном Pgi-2 из Brassica oleracea; которые имеют хорошее агрономическое качество, отличающееся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью, упомянутый способ включает в себя следующие стадии:

а) скрещивание двухнулевых линий ЦМС ярового рапса Brassica napus с вырезанной вставкой генома редьки с двухнулевой линией ярового рапса сорта Drakkar для формирования гетерозиготного растения Brassica napus с восстановленной фертильностью,

b) облучение перед мейозом гетерозиготных растений с восстановленной фертильностью, полученных на стадии а), гамма-лучами,

с) перекрестное опыление цветков, полученных на стадии b), с двухнулевой яровой линией ЦМС Wesroona,

d) тестирование потомства на мощность, женскую фертильность и уровень переноса гена ЦМС,

e) селекция линий потомства.

В данном изобретении термин «линия(и)» означает растение, которое в основном гомозиготно и воспроизводится самоопылением.

Способ по п.1, в котором доза облучения на стадии b) составляет 65 Грэй в течение 6 минут.

В соответствии с одной из предпочтительных форм реализации способа по данному изобретению двухнулевая линия ЦМС ярового Brassica napus на стадии а) является линией R211.

R211 представляет собой яровую линию-восстановитель фертильности INRA. Drakkar - это зарегистрированная яровая французская разновидность. Wesroona - это зарегистрированная яровая австралийская разновидность.

В соответствии с одной из предпочтительных форм реализации способа по данному изобретению тестирование выполняется с комбинацией из пяти маркеров, избранных из PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и СР418.

Другая задача данного изобретения относится к двухнулевым линиям-восстановителям фертильности Brassica napus для ЦМС Ogura, представляющим собой делецию вставки Rfo в аллели Pgi-2 редьки, рекомбинированной с геном Pgi-2 Brassica oleracea и имеющим хорошие агрономические качества, отличающееся женской фертильностыо, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью.

В соответствии с одной из предпочтительных форм реализации двухнулевые линии-восстановители фертильности представляют собой уникальную комбинацию пяти маркеров, избранных из PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и СР418.

Другая задача данного изобретения относится к способу формирования гибридных растений Brassica napus и их потомства, полученных следующими стадиями:

а) получение линий-восстановителей фертильности, продуцированных по пункту 1, и скрещивание их для получения гомозигот,

b) использование упомянутой линии-восстановителя фертильности на делянке для получения гибрида как опылителя,

с) использование ЦМС стерильных растений для получения гибридов на делянке в качестве растений, продуцирующих гибридные семена и

d) сбор гибридных семян с мужских стерильных растений.

Другая задача данного изобретения относится к семенам растений Brassica, полученных способом по данному изобретению.

Еще одна задача изобретения относится к семенам Brassica napus, депонированным в NCIMB Limited (Национальные Коллекции индустриальных пищевых и морских бактерий), 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB24 3RY, UK, 4 июля , 2003 под номером NCIMB41183.

Другая задача данного изобретения относится к использованию по меньшей мере четырех маркеров PGIol, PGIint, BolJon и CP418 или какой-либо их части, образующей по меньшей мере один полиморфный сайт, для характеризации рекомбинированных линий-восстановителей фертильности Brassica napus для ЦМС Ogura, имеющих делецию вставки Rfo в аллели Pgi-2 редьки и рекомбинированных с геном Pgi-2 Brassica oleracea и обладающих хорошим агрономическим качеством, отличающимся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью.

В предпочтительном варианте реализации комбинация образована пятью маркерами PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и CP418.

В данном изобретении выражение "какая-либо часть их, образующая по меньшей мере один полиморфный сайт" означает какую-либо часть последовательности, демонстрирующую по меньшей мере отличие между последовательностью типа B.oleracea и последовательностью типа B.rapa.

Такие маркеры представлены в нижеследующих чертежах и списках последовательностей линии R2000.

В соответствии с одной из предпочтительных форм реализации данное изобретение относится к:

- маркеру PGIol, который амплифицирован с использованием праймеров PGIol U и PGIol L

(PGIol U: 5TCATTTGATTGTTGCGCCTG3^',

PGIol L: 5TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3');

- маркеру PGIint, который амплифицирован с использованием праймеров PGIint U и PGIint L

(PGIint U: 5'CAGCACTAATCTTGCGGTATG3',

PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3');

- маркеру PGIUNT, который амплифицирован с использованием праймеров PGIol U и PGIint L

(PGIol U: 5'TCATTTGATTGTTGCGCCTG3',

PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3');

- маркеру BolJon, который амплифицирован с использованием праймеров BolJon U и BolJon L

(BolJon U: 5'GATCCGATTCTTCTCCTGTTG3',

BolJon L: 5'GCCTACTCCTCAAATCACTCT3');

- маркеру CP418, который амплифицирован с использованием праймеров SG129 U и pCP418 L

(SG129 U: cf Giancola et al., 2003. Theor Appl. Genet (in press);

pCP418 L: 5'AATTTCTCCATCACAAGGACC3').

Другая задача данного изобретения относится к маркерам PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и CP418 со следующими последовательностями:

маркер PGIol R2000:

Маркер PGIUNT R2000:

Маркер PGIint R2000:

Маркер BolJon R2000:

Маркер CP418L R2000:

В прилагающихся нижеследующих чертежах использованы следующие сокращения:

Dra	Drakkar
Rel-15-1,E38,R15	R2000
Hete, Hel, R211 .Drakkar	гетерозиготный R211 *Drakkar,
Darm	Darmor
Bol	Brassica oleracea
Bra,B.rap	Brassica rapa
GCP A18-A19, Wes, Aust	Wesroona
Sam, SamlPGIolSunt5	Samourai
RRH1, ba2c	RRH1
rav, N.WR	гибрид Brassica napus*дикая редька

Фиг.1 иллюстрирует облучение гамма-лучами и продукцию F2.

Фиг.2 иллюстрирует результаты посадки семян "R211" и "R2000".

Фиг.3 иллюстрирует число семян на стручок в различных линиях.

Фиг.4 иллюстрирует локализацию праймера PGIol в сегменте последовательности PGI из базы данных. На этой фигуре:

PGIol: - праймер PGIolU (именуемый в SGAP (Society for Growing Australian Plants - Общество австралийских растений): BnPGIch 1 U);

- праймер PGIol L (именуемый в SGAP: Bn PGIch 1 L);

PGIint: - праймер PGIint U;

- праймер PGIint L (за пределами приведенной последовательности).

Фиг.5 иллюстрирует гель-электрофорез гена PGI-2 (PGIol), маркера ПЦР (полимеразная цепная реакция) и SG34, маркера ПЦР, близкого к Rfo.

Фиг.6 иллюстрирует сегмент ДНК Pgi-2, амплифицированный с помощью ПЦР с праймерами PGIol.

Фиг.7 иллюстрирует переваривание продукта ПЦР PGIol с помощью Msel. На этой фигуре:

Sam и Darm представлены полосой 75 bp (пар оснований).

Drak, R21 l.Dk и R2000 представлены полосой 70 bр (Акриламид 15%).

8 - сходно с Samourai (75 bp); смесь с Drakkar (70 bр) позволяет визуализацию двух полос.

Фиг.8 иллюстрирует электрофорез маркера PGIUNT в агарозном геле.

На этой фигуре:

полоса PGIUNT (около 980 bp) представлена в B.oleracea, B.rapa cv Asko, поддерживающей и восстанавливающей фертильность в линиях за исключением "R211".

Амплификация в редьке и Arabidopsis отсутствует.

В различных генотипах Brassica амплифицировалась только одна полоса. Размер полосы сходен, но последовательности различны.

Фиг.9 иллюстрирует гель-электрофорез маркера ПЦР PGIint.

На этой фигуре PGIint линии 7 редьки имеет около 950 bp. Это такая же полоса, как в восстановленных RRH1 и R113. Она не обнаружена в R211. Ее также нет в R2000. Однако полоса PGIint имеет сходный размер около 870 bp в различных видах рода Brassica, но последовательности отличаются.

Фиг.10 иллюстрирует электрофорез маркера ПЦР BolJon в агарозном геле.

Фиг.11 иллюстрирует электрофорез маркера CP418 в агарозном геле.

На этой фигуре полоса CP418 (около 670 bp) специфична для генома B.oleracea. Она представлена у B.ol*, B.napus (Samourai, Drakkar, Pactol и гетерозиготного R2111*Dk). Она отсутствует у рапса с восстановленной фертильностью (RRH, R113 и R211). Она присутствует у гомозиготной R2000.

Фиг.12 иллюстрирует суммарную таблицу маркеров.

Фиг.13 (13(a), 13(b)) иллюстрируют сравнительный анализ первичной структуры маркера PGIol с Arabidopsis, редькой, B.rapa, B.oleracea и R2000.

Фиг.14 (14(a), 14(b), 14(c), 14(d)) иллюстрируют сравнительный анализ первичной структуры маркера PGlint-UNT с Arabidopsis, редькой, B.rapa, B.oleracea и R2000.

Фиг.15 (15(a), 15(b), 15(c)) иллюстрируют сравнительный анализ первичной структуры маркера CP418L с Arabidopsis, редькой, B. rapa, B.oleracea и R2000.

Фиг.16 (16 и 16bis) иллюстрирует маркеры BolJon у Arabidopsis, редьки и B.rapa. Их первичная структура сравнивается с последовательностями DB Arabidopsis (AC007190 концевой участок - AC011000 начальный участок), концевым участком EMBH959102 и начальным участком EMBH448336 B.oleracea и репрезентативной консенсусной последовательностью полос 1 и 2 маркеров SG129 в B.napus (в линиях Drakkar и Samourai соответственно).

Начиная с 836-й bp, последовательности ACG7190 - AC11000 и GCPATpBOJ не проявляют близкой гомологии с последовательностями Brassica.

Последовательности редьки и B.rapa (GCPconsen RsRf BOJ и BR) все еще близко гомологичны таковым B.napus с 858-й bp до 900-й bp и 981-й bp соответственно.

Кроме того, в редьке обнаружена только частичная гомология с последовательностью Brassica.

У вида B.rapa cv Asko остаток последовательности BolJon может быть после делеции 78 bp снова сравнен по структуре с таковыми B.oleracea и B.rapa в B.napus, начиная с 1057 bp до праймера BolJon L.

Фиг.17 (17 и 17bis) иллюстрируют локализацию праймеров Pgi-2 в последовательности th MJB21.12 Arabidopsis.

Фиг.18 иллюстрирует локализацию праймеров BolJon в гене mipsAtl62850 и перекрывающиеся участки клонов th AC007190 и AC011000 Arabidopsis. Представлено сравнение его первичной структуры с продуктом ПЦР BolJon в Arabidopsis (740 bp). Следует понимать, однако, что примеры приводятся как способ иллюстрации задачи изобретения, но никоим образом не образуют ограничений изобретения.

Пример I: Способ получения двухнулевой линии-восстановителя фертильности Brassica napus с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) Ogura, представляющего собой интрогрессию редьки, несущую ген-восстановитель фертильности Rfo, вырезанный из аллели Pgi-2 редьки, рекомбинированный с геном Pgi-2 Brassica oleracea, имеющих хорошее агрономическое качество, отличающееся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью.

Материалы и методы:

Генотипы: линию «R211» с вырезанной вставкой редьки скрещивали с яровым низкоглюкозинолятным (GLS) рапсом «Drakkar» для получения потомства Fl ('R211*Dk'). Яровая низкоглюкозинолятная ЦМС линия «Wesroona» (австралийского происхождения) использовалась для последующих скрещиваний. В качестве контроля в молекулярном анализе использовались: озимая линия с восстановленной фертильностью, происходящая от линии «Samourai» и несущая полную («RRHl») или неполную («R113») интрогрессию, а также европейская линия 7 редьки, азиатская редька с восстановленной фертильностью D81, гибрид Brassica napus*дикая редька, Brassica oleracea и B.rapa cv Asko, Arabidopsis thaliana.

Гамма-облучение: цветущие растения целиком были обработаны гамма-лучами от источника ⁶⁰Cо на контролируемой делянке. Сублетальная доза в 65 Грэй давалась перед мейозами.

Скрещивания и получение [поколения] F2: облученные растения переносили в защищенную от насекомых оранжерею после удаления цветочных почек, размер которых превышает 2 мм. Облученное потомство Fl использовали для опыления линии ЦМС «Wesroona» вручную. Восстановленным растениям F1 позволяли дать урожай семей растений F2, который собирали индивидуально и тщательно высевали на полевые испытания параллельно с необлученным контролем (Фиг.1).

Фенотипическая селекция: при полевых испытаниях оценивали три визуальных критерия (по шкале от 1 до 5) в течение 2 лет на 1200 растениях потомства F2 плюс 44 контрольных (82 330 оцененных растений):

1 - вегетационная мощность,

2 - нормальность соотношения фертильных/стерильных растений в расщеплении F2 и

3 - женская фертильность (развитие стручка и высев семян).

Последующие самоопыленные поколения избранных семей получали как на делянке, так и в оранжерее и продуцировали гомозиготные линии (F4) для дальнейшего анализа. Изозимный анализ выполняли, как описано в Delourme R. and Eber F. 1992. Theor Appl Genet 85: 222-228, развитие маркера (Fourmann M et al. 2002. Theor Appl Genet 105:1196-1206.): ПЦР-продукты оценены по секвенированию. Проверка первичной структуры выполнена с использованием программы Blast NCBI (Национальный Центр Биотехнологической информации США) и Uk Crop Net Brassica DB, а также программного обеспечения Multialin INRA Toulouse.

Способ:

Была выбрана одна низкоглюкозинолятная яровая гомозиготная линия с восстановленной фертильностью «R211», для которой уже показаны делеции в интрогрессии (Delourme R. and Eber F. 1992. Tlieor Appl Genet 85: 222-228. Delourme R et al. 1998. Theor Appl Genet 97: 129-134. Delourme R. et al. 1999.10 Int. Rapeseed Congress, Canberra.). Несколько молекулярных маркеров утрачены на обеих сторонах Rfo, такие как spATCHIA (Fourmann M et al. 2002. Theor Appl. Genet 105:1196-1206), spSG91 (Giancola S et al. 2003. Theor Appl Genet (in press)). "R211" утратила изозимную экспрессию аллели Pgi-2 гена редьки, но также и одну из аллелей Pgi-2 генома B.oleracea (1,2). Далее, гомозиготная "R211" демонстрирует сцепленные негативные черты, такие как низкая вегетационная мощность и очень малое количество семян. Было предположено, что эти растения утратили хромосомный сегмент рапса. Соотношение фертильности в поколении F2, полученном из этого материала, ниже ожидаемого (64% вместо 75%). Была начата программа, в которой попытались добиться рекомбинации между Rfo, несущим интрогрессию из этой вырезанной линии, и гомологичной хромосомой из двухнулевой линии B.napus.

Известно, что ионизирующая радиация индуцирует хромосомные перестройки в результате двухнитевых разрывов и последующих аберрантных соединений концов. Облучение гамма-лучами использовалось на гетерозиготных растениях F1, полученных от линии "R211", для индуцирования разрывов хромосом непосредственно перед мейозом, с целью добиться рекомбинации вырезанной интрогрессии редьки в геноме рапса.

Результаты:

Очень малое количество семей из 1200 тестированных семей F2 имели лучшие оценки по трем критериям.

Только одна, «R2000», оказалась способной продуцировать нормальное соотношение фертильных растений у самоопыленного потомства со стабильным восстановлением хороших агрономических характеристик, таких как хорошая женская фертильность при нормальном числе семян по сравнению с линией «R211» (Фиг.2 и 3). Эта семья была получена в результате 6-минутной обработки облучением при дозе 65 Грэй в час.

Анализ глюкозинолятов подтвердил их низкое содержание.

На Фиг.2 (растения «R211» и «R2000») R2000 демонстрирует нормальное цветение с нормальной внешней архитектурой.

На Фиг.3 (число семян на стручок) мы видим:

- показатели лучших семей F4 «R2000» при самоопылении и при тестовых скрещиваниях;

- показатели ЦМС-линии "Pactol" рапса и контрольных "R211".

Пример II: селекция маркеров в гене Pgi-2

Изозимный анализ PGI: потомство от «R2000» экспрессирует аллель Pgi-2 рапса из генома B.oleracea, исходно утраченного в «R211».

Были определены три ПЦР-маркера для того, чтобы охарактеризовать семейство R2000 по сравнению с известными восстановителями фертильности рапса RRH1 и R113.

1) Маркер PGIol получен из последовательностей BrassicaDB, специфичных для генома Brassica. Амплификация отсутствует как в редьке, так и в Arabidopsis th., но присутствует в Brassica в виде одной полосы 248 bp.

2) Маркер PGIint амплифицировал более длинную часть гена Pgi-2, позволяя четкое различение между различными испытанными видами Brassica, Raphanus и Arabidopsis. Виды B.rapa и B.oleracea различались не по размеру полосы в агарозном геле, а по последовательности их полосы PGINT.

3) Маркер PGIUnt представляет собой комбинацию праймеров PGI ol U и PGI int L. Этот маркер обладал специфичностью маркера PGIol, но амплифицировал более длинный участок, чем маркер PGIint.

II.1 Маркер PGIol

С праймерами PGIol родительская линия «R211» демонстрирует отсутствие амплификации, тогда как в протестированных озимых линиях присутствует полоса 248 bp. Ее последовательность ДНК гомологична последовательности PGI-2 из Crop Net UK DB для вида Brassica и последовательности из предыдущей работы авторов (наименованной последовательностями SGAP) (Локализация праймеров SGPGI chou, Фиг.4).

Это ортолог клона MJB21-12 на хромосоме V (34543 bp) у Arabidopsis (NCBI DB).

PGIol плюс SG34 для проведения теста на гомозиготность:

комбинированное использование двух наборов праймеров в смешанной ПЦР: PGIol, маркирующего ген Pgi-2, отсутствующего в гомозиготном растении с восстановленной фертильностью, и SG34 (из S. Giancola et al., Giancola S et al. 2003. Theor Appl. Genet. (in press)) - маркера, очень близкого к гену Rfo, было направлено на различение гомозиготных и гетерозиготных растений среди фертильных растений в расщеплении потомства F2, полученного из "R211". Вместо использования SG34 возможно использование какого-либо другого маркера, близкого к гену Rfo или входящего в его состав.

Только одно семейство "R2000" продемонстрировало отсутствие различий между гомозиготным и гетерозиготным потомством:

ген Pgi-2 присутствует в гомозиготе "R2000" при том, что он отсутствует в родительской гомозиготной R211.

На Фиг.5 (маркеры ПЦР PGIol и SG34):

гомозиготное семейство "R2000" восстанавливает полосу PGIol.

Последовательность ДНК полосы подтверждает гомологию с известными последовательностями Pgi-2 в Arabidopsis и Brassica. Контрольные генотипы (Drakkar, Pactol, и Samourai, Darmor) имеют такой же паттерн на геле. Последовательность этой общей полосы позволяет подтвердить высокую степень их гомологии, поскольку они практически сходны, за исключением замены одного основания.

У гомозиготного семейство «R2000» восстанавливается полоса PGIol типа Brassica oleracea. Это отличает ее от известного восстановителя фертильности группы Samourai.

Эта амплифицированная часть Pgi-2 очень консервативна, и трудно обнаружить какие-либо отличия между различными генотипами. Более длинная часть гена Pgi-2 была исследована.

II.2 Маркеры PGIUNT и PGIint

Паттерн электрофореза продуктов ПЦР:

маркер PGIUNT: второй обратный праймер PGIint L был сконструирован по большей части последовательности Pgi-2, чтобы амплифицировать и консервативные, и вариабельные участки гена.

При использовании праймера PGIol U амплифицируется полоса 980 bp только в геноме Brassica.

В «R211» не наблюдается каких-либо полос, а в гомозиготной «R2000» наблюдается полоса PGIUNT, как и в родительской линии Drakkar.

На Фиг.8 (маркер PGIUNT):

маркер PGIint амплифицировал сегмент PGIUNT. Верхний праймер PGIint позволяет амплификацию у всех тестируемых видов, что дает возможность провести ясное различие между Arabidopsis, редькой и Brassica. B.rapa и B.oleracea не различались по величине полосы в агарозном геле, но различались по своим последовательностям PGIint. Все протестированные генотипы с восстановленной фертильностью, за исключением линии «R211», демонстрируют полосу европейской редьки и одну полосу Brassica, гомологичную таковой B.rapa.

Гомозиготная «R2000» не демонстрирует полосу PGIint редьки, как в вырезанной родительской линии «R211», но демонстрирует полосу Brassica, гомологичную таковой B.oleracea.

Электрофорез маркера PGIint представлен на Фиг.9.

Анализ последовательности:

сравнение последовательностей PGI из баз данных.

Известен сегмент PGI величиной около 490 bp.

Последовательности сегмента величиной около 490 bp из различных генотипов (B.oleracea, B.rapa, B.napus) были изучены в лаборатории авторов, и некоторые последовательности переданы в Brassica Crop Net DB: EMAF 25875 до 25788 (M.Fouramnn) (4). Эти последовательности очень консервативны.

Сравнение последовательностей PGI B.rapa и B.oleracea (Фиг.13 и 14):

сравнение между последовательностями PGI мы получили из протестированных генотипов видов B.oleracea и B.rapa, оно показало, что эти последовательности различаются заменами 21 основания. Эти замены позволили различить последовательности PGIint из каждого из других протестированных генотипов рапса, гомологичных либо B.rapa cv Asko (RRH1 и R113) или B.oleracea (Drakkar, R211*DK, но также R2000).

Пример III: отбор маркера в области, близкой к Rfo

Окружающие ген Rfo во вставке редьки маркеры определены, чтобы облегчить клонирование гена (Desloires S. et al. 2003. EMBO reports 4, 6:588-594). Один из них, маркер ПЦР SGI 29, располагается очень близко к Rfo (Giancola S. et al. 2003. Theor Appl. Genet. (in press)): он коамплифицировал различающиеся полосы геномов B.oleracea и B.rapa у B.napus, однако полосу редьки очень трудно разглядеть на агарозном геле.

Мишенью последовательности SG129 был ортолог клона (AC011000, в локусе F16P17) у Arabidopsis thaliana. Этот клон перекрывается с соседним примыкающим (контиг) клоном Arabidopsis (AC07190).

В базе данных Brassica Crop Net DB авторы обнаружили один клон B.oleracea (EMBH448336, 764 bp), близкий по первичной структуре к начальному участку A011000, а второй клон B.oleracea (EMBH53971), который на карте генома Arabidopsis удален на приблизительно 300 bp, близкий к концевому участку AC07190.

Мы сконструировали новый ПЦР-маркер BolJon, занимающий место между двумя клонами B.oleracea. Мы удостоверились в том, что этот маркер позволяет амплифицировать специфические полосы ПЦР в различных генотипах, сравниваемых в данной заявке.

На Фиг.16 (гель-электрофорез ПЦР-продуктов BolJon):

- У Arabidopsis амплифицировалась полоса BolJon 815 bp, гомологичная перекрывающемуся сегменту примыкающих участков.

- В диплоидных видах Brassiceae маркер BolJon демонстрирует различающиеся полосы: одна - 950 bp у B.oleracea и одна - 870 bp у B.rapa. Это показывает, что два клона B.oleracea (EMBH53971 и EMBH448336) представляют собой непрерывность в геноме Brassica, как это имеет место в ортологической последовательности у Arabidopsis.

- У B.napus эти две полосы коамплифицируются в поддерживающих линиях Samourai или Drakkar.

- В линии 7 редьки амплифицировалась одна полоса BolJon длиной около 630 bp. Полоса у редьки с восстановленной фертильностью cmsRd81 была немного меньше. У всех линий с восстановленной фертильностью одна из полос BolJon была такой же величины, как у линии 7 редьки. BolJon - это маркер интрогрессии редьки.

- Гомозиготные линии рапса с восстановленной фертильностью «RRH1», «R113», а также «R211» демонстрируют только полосу B.rapa и полосу редьки 630 bp, что предполагает, что ортолог B.oleracea гена-мишени отсутствует или он был модифицирован, когда сегмент хромосомы редьки был вставлен в исходный геном рапса B.oleracea.

Гомозиготные растения «R2000» демонстрируют присутствие маркера ПЦР редьки BolJon плюс две полосы BolJon Brassica, которые снова восстанавливают полосу B.oleracea, утраченную у «R211» и в других линиях-восстановителях фертильности.

Мы сконструировали праймер pCP418L, специфический для генома B.oleracea у тестируемых видов. С праймером SG129U он амплифицирует только одну полосу ПЦР (670 bp) у вида B.oleracea species (Фиг.17).

Амплификации ни у B.rapa, ни у редьки, ни у Arabidopsis не было, но присутствовала ясная полоса CP418 у поддерживающих линий B.napus. Ее последовательность строго гомологична последовательности EMBH448336. Этот маркер представляет собой очень консервативную последовательность ДНК, не допускающую полиморфизма между генотипами, за исключением присутствия или отсутствия.

У RRH1, R113 и у R211 отсутствовала полоса CP418, что показывает, как в предыдущем случае, что ортолог гена-мишени B.oleracea отсутствует или был модифицирован вследствие вставки сегмента генома редьки.

Гомозиготные растения «R2000» демонстрируют полосу CP418, восстанавливающую таковую, специфичную для B.oleracea.

В данном изобретении новая рекомбинантная низкоглюкозинолятная линия-восстановитель фертильности селекционирована с хорошей женской фертильностью. Низкое качество линии «R211» позволяет селекцию в поле редких рекомбинантных событий и характеризации семьи «R2000».

Гомозиготная линия «R2000» представляет собой уникальную комбинацию маркеров PGIol, PGIUNT, PGIint и BolJon по сравнению с до сих пор анализированными восстановителями фертильности рапса:

маркер PGIinT демонстрирует, что у гомозиготных линий рапса с восстановленной фертильностью RRH1 и R113 присутствует полоса европейской редьки плюс одна полоса Brassica, гомологичная геному B.rapa. «R2000» демонстрирует отсутствие полосы редьки, утраченной, как и в родительской вырезанной линии R211, но демонстрирует одну полосу Brassica, гомологичную B.oleracea. Ортологическая последовательность PGIint в собственном геноме B.rapa не амплифицируется с этим маркером в генетическом окружении линий R211 и Drakkar.

Последовательности маркера PGIol и маркера PGIUNT в линиях с восстановленной фертильностью RRH1 и R113 были гомологичны таковой B.rapa cv Asko. У «R2000» последовательность PGIUNT гомологична B.oleracea. Ортологическая последовательность в ее геноме B.rapa не амплифицируется с этим маркером в генетическом окружении линий R211 и Drakkar.

Маркер BolJon показал, что гомозиготные линии рапса с восстановленной фертильностью, включая "R211", демонстрируют присутствие полосы европейской редьки плюс только полосу B.rapa. 'R2000' демонстрирует две полосы «R211» плюс восстановленную полосу BolJon B.oleracea.

Маркер CP418 показал, что у «R2000» восстановился консервативный сегмент B.oleracea.

Гипотеза авторов состоит в том, что событие рекомбинации имело место в опыленной материнской клетке, которая дала растения «R2000». Вырезанная интрогрессия редьки затем интегрировалась в нормальный гомологичный сегмент хромосомы, несущий ген Pgi-2 типа B.oleracea, а последовательность - мишень BolJon, охарактеризованная этими маркерами, вероятно, происходит из двухнулевого генома Drakkar «00», присутствующего в облученном гетерозиготном гибриде «R211*DK».

Паттерн, наблюдавшийся для BolJon, предполагает, что событие рекомбинации привело в результате к формированию в семействе «R2000» особого сдвоенного участка, одна часть которого происходит от редьки, а другая - от B.oleracea.

Claims

1. Способ получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности Brassica napus для мужской цитоплазматической стерильности (ЦМС) Ogura, представляющий собой интрогрессию редьки, несущую ген-восстановитель фертильности Rfo, вырезанный из аллели Pgi-2 редьки и рекомбинированный с геном Pgi-2 из Brassica oleracea, характеризующейся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью, где упомянутый способ включает следующие стадии: a) скрещивание двухнулевых ЦМС-линий ярового Brassica napus, содержащих вырезанную вставку генома редьки, с двухнулевой линией яровой Drakkar для формирования гетерозиготных растений с восстановленной фертильностью Brassica napus, b) облучение перед мейозом гетерозиготных растений с восстановленной фертильностью, полученных на стадии а), гамма-лучами, c) перекрестное опыление пыльцой из цветков, полученных на стадии b), с двухнулевой яровой ЦМС-линией Wesroona, d) тестирование потомства на мощность, женскую фертильность и уровень переноса гена ЦМС, e) селекция линий потомства.

2. Способ по п.1, где доза облучения на стадии b) составляет 65 Гр в течение 6 мин.

3. Способ по п.1, где двухнулевой ЦМС-линией ярового Brassica napus на стадии а) является R211.

4. Способ по п.1, где тестирование на стадии d) выполнялось с комбинацией пяти маркеров, избранных из PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и СР418, где указанные маркеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:
маркер PGIol: TCATTTGA GTTGCGC TCGCCTTG GTGTTAT GAATGAA CAGTCAT 60 TT CTG TT GAT CAG TTA 120 ACATGTG AACTTAA GGCTCCG GTTGCAA ACATGGT TGTCAGC 180 GTT CAG GCT AAC TGC ACT 240 AATCTTG TATGAAT TGATTAA TGTTTGTT TGACTCTT TTCATTGT 248 CGG TTG ATT TG TC TC GTTTTCGT AATAAAC ATGTATA TTTTTACA CTGAATTT TACCGGG AC CGA АТС AA TC TCT GATGTAC A маркер РGIUNT: TCATTTGA GTTGCGC TCGCCTTG GTGTTAT GAATGAA CAGTCAT 60 TT CTG TT GAT CAG TTA 120 ACATGTG AACTTAA GGCTCCG GTTGCAA ACATGGT TGTCAGC 180 GTT CAG GCT AAC TGC ACT 240 AATCTTG TATGAAT TGATTAA TGTTTGTT TGACTCTT TTCATTGT 300 CGG TTG ATT TG TC TC 360 GTTTTCGT AATAAAC ATGTATA TTTTACAA TGAATTTT ACCGGGT 420 AC CGA АТС AC CT CTG 480 ATGTACA CTAGTCTC TGTTCTTG GATCATG TATTTTCT ATGTATTC 540 ATG CA GG ATT AC AG 600 ACAGTAC AGAAAGT CAAAACT GATGTTTT TTTACAGT GTGGAGA AGA GTT CTG AA ТА AGT TCGGCAT TCCGAAC GCATTTG TTTGGGA GGTTGGT AGGTACA TGA AAT CAT CTG GGA GTG GTAAGTG GTTTATTT TTGTATA TTCTCGTC TTTCCGCT CTTAGTGT CTT GG AAT CA TG AT AACTGAA CTTTTGCA TTGCAGT GTTGGAG TACCATT TCTACAG ATT GT GCT TCT GTC TAT GGCTTCTC TGGTTGA GTACGGT TTCTACTT TCAGCCA CATAAAA TG GAA ACC ТА TCT TGT CTTAGGC TTCTTTCT TTTATTTC TCTTAATG TTCTTCTT TTTTATTG 660 ATA AT CC AT TT CA 720 TTCCCGTT ATTTTCAA GTTGTTAC TCTCTAA AAGAAGA CTTCTTAG 780 TT AA TG АТС AAC ТА 840

GATCCAG ATATTCA TTTTTTAA TGGACTG GTTTTTAA GGGAGCT 900 CTG GCC AT CAG AG TCA 960 AGCATTG AGCATTT GTCCACA TTTGAGA ATATACC GAGTTGC 979 ATA CCA CCG AGA CGT ATT AGTTGTG TTATACA TTCTTGTC TTTGCTAT CCATCAA TAGAGAT TGA GTT TT GT CAC TCG TGAAGTT AGTGTAG ACGCATA AGAGGTG GGTGACT GGACGAT ATT TCA GGG ATT TTT TTC AGGTGCT GGGTTAT TTA TG маркер PGIint: CAGCACT CTTGCGG GAATTTG TTAAATTT TTGTTTGT СТСТТГСТ 60 AAT TAT TGA GT GA TC 120 ATTGTTCG TTCGTAC AAACCGA TATAATCT TACAAAC ATTTTCTA 180 TT AAT ATG TT TGA CC 240 GGGTCTG TACAATG GTCTCCAT TCTTGGG CATGATTT TTTCTACA 300 ATG СТА GT GAT AT TG 360 TATTCAG GTACAGA AAGTGTT AACTCTG GTTTTAAT ACAGTTA 420 АСА AGA CAA GAT TT GTG 480 GAGAAGT GCATTGA GAACAAT TTTGCATT GGGACTG TGGTGGA 540 TCG TCC GCA TT GGT AGG 600 TACAGTG AGTGCTT TATTTGGT TATAAAT TCGTCCAT CCGCTTG 660 GTA GTT TG TTC TT CTT 720 AGTGTAT TGAAATT TTGCAGTT CAGTGCT GGAGTCT CATTGTCT 780 AAC CTT TG GTT TAC CT 840 ACAGTAT TTCTCTGT TTGAGAA CGGTACC TACTTTAT GCCATCT 866 GGC GG GTA TTC CA CATAAGA AAAATGT AGGCATA TTTCTATT ATTTCCCT TAATGAT AACCTT CTT TTC TT CT TTC TTTAAAG TATTGCAT CCGTTTTA TTCAAAA GTTACTGT CTAAATC GGG TC TT GTT CT AAG TACCCGT CTTAGTA CCAGCTG TTCAGCCT TTTAAATT ACTGCAG GAG GAT ATA TT GG GTT TCAACAC AGCTTCA ATTGATA ATTTCCA CACACCG GAGAAGA TAG AGC AGC GTC TTT ATA GACTTTTG TTGCATTA TGTGTGA TACAGTTT TTGTCTTT GCTATGT GA GT TTA TC TT CCA AGATTCG AGTTATT GTAGTCA CATAGGG GGTGATT TGA AGT ACG AGA GGT CGATTTC TGCTTTAG TTATTG AGG GG

маркер BolJon: GATCCGA TTCTCCTG GAGATCA CCAAACA AACAACT ACACAAA 60 TTC TT GCT TCA TGT TAT 120 CTTTACTT TAAATGG ATGACAA ATAGAAA TTGCTCAT TATTGTAC 180 GC AAC GAG АТС AG AA 240 GGGATAA TGTAGAA AAACCGT TAAGATT TCCCTGAT TCTCACTT 300 CAG AAC CTG TTC CC AA 360 CCAGTAG TTTTTCAC TGAAGCG ATCTACTT GTATTCA AATAAAA 420 GCG AT CAT TG CTG AAA 480 GAAAGCT AACATGT GGATATA GCATTGA ACCAAGT CACAAAC 540 GGT GAA CAA TAC AGT TAC 600 ATTATAA TCAGACC GTTCACA TGGCCTC GACCACC TCTAGCA 660 AGG TTT TTC CAG GCT AAG 720 TTAAGCG CATGGTC ACGTATA ATGAAAA TTCTATCA ATCCTAT 780 TAA TGC CAA TGT AA AAA 840 ATAGAGC ATAACAT CGATACA TTTCACTA TCTGCAA CTAAACA 900 TCT TGT TAG AC GTA CAT 957 ATACAAA AACTATG ACAGATC ACTACTA AACACAG TATGACA CAA CGA AAA CAG TTC CTG TCGATAG CATCCTCT AAGTACC GAGATAG ATGAAAC GTAAACA TAA GC AAA CAA TAT AAT CAAAATT AATTTCTC TCACAAG CTACAGA GAGTTAT AACATTTT СТА CA GAC ATA CAT CT GTAAATA CCATCAA GACTAGA CAGAGTT ATAACAT CTGTAAA TTT AAT GAA CTT TAT TGT TCCAACA CCACTAC GCAGAGT TATAACA TCTGTAA TCCAATC AAA ATA TCT TTG ATG AAA ACCACTA AACAAAG CTATAAC GTTTATAC AGTTTCA AATCTAC CAG CTC ATT AA СТА AAA CTTTCCCC AAATGAG AATATCA AAAGATG CAATCAG AAGAGTA GT CTT CCC TTT ATA CGA CATCGTTT AGATTAG AAACTGA TTACGTA TGATTTG AGTAGGC TG AAC AAC GAG AGG маркер СР418: AATTTCTC TCACAAG CTACAGA GAGTTAT AACATTTT GTAAATA 60 CA GAC ATA CAT CT TTT 120 CCATCAA GACTAGA CAGAGTT ATAACAT CTGTAAA TCCAACA 180 AAT GAA CTT TAT TGT AAA 240 CCACTAC GCAGAGT TATAACA TCTGTAA TCCAATC ACCACTA 300 ATA TCT TTG ATG AAA CAG 360 AACAAAG CTATAAC GTTTATAC AGTTTCA AATCTAC CTTTCCCC 420 CTC ATT AA СТА AAA GT 480

AAATGAG AATATCA AAAGATG CAATCAG AAGAGTA ACATCGT 540 CTT CCC TTT ATA ACG TTT 600 GAGATTA CAAACTG CTTACGT GTGATTT GAGTAGG GTTGCCA 660 GAA AAA AGA GAG CTC GCA 672 GAGCTAG TCTCCTCC CTCATGA ATCTGTTG CCTGAGA CCGTGAC CTC GC AGC CA CAA GAA ACTTTCCG CACCGCC AGAATTC GCCGCGC GGAAGGA GAATCGG AT ACC GAC АТС TCC GAA CTGAGTG CCGAGCG CCGGGAG GACGGAG TGGGAAA GAGTGGC AAC АТС TGC CGA AGA ACG ATTTCGA AGAGTGG AGGAGAG GGTGGAT CTCGCGT ATCAAGT CGA AAG GGT AAA ATG TCG TCATCGTC GATTGCC ATTTTTTT TCAGGGC CTGTGGC GAAGTTT CT GCC TG GCT TTA CCG atgtcaatga ac

5. Применение комбинации по меньшей мере четырех маркеров PGIol, PGIint, BolJon и СР418 или какой-либо части их, содержащей по меньшей мере один полиморфный сайт, для характеризации рекомбинированной линии-восстановителя фертильности Brassica napus для ЦМС Ogura, содержащей вставку Rfo, вырезанную из аллели Pgi-2 редьки рекомбинированную с геном Pgi-2 Brassica oleracea, характеризующееся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью, где указанные маркеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:
маркер PGIol: TCATTTGA GTTGCGC TCGCCTTG GTGTTAT GAATGAA CAGTCAT 60 ТТ CTG ТТ GAT CAG TTA 120 ACATGTG ААСТТАА GGCTCCG GTTGCAA ACATGGT TGTCAGC 180 GTT CAG GCT AAC TGC ACT 240 AATCTTG TATGAAT TGATTAA TGTTTGTT TGACTCTT TTCATTGT 248 CGG TTG АТТ TG ТС ТС GTTTTCGT ААТАААС ATGTATA ТТТТТАСА CTGAATTT TACCGGG АС CGA АТС АА TC ТСТ GATGTAC А

маркер PGIint: CAGCACT CTTGCGG GAATTTG TTAAATTT TTGTTTGT CTCTTTCT 60 AAT TAT TGA GT GA TC 120 ATTGTTCG TTCGTAC AAACCGA TATAATCT TACAAAC ATTTTCTA 180 TT AAT ATG TT TGA CC 240 GGGTCTG TACAATG GTCTCCAT TCTTGGG CATGATTT TTTCTACA 300 ATG СТА GT GAT AT TG 360 TATTCAG GTACAGA AAGTGTT AACTCTG GTTTTAAT ACAGTTA 420 АСА AGA CAA GAT TT GTG 480 GAGAAGT GCATTGA GAACAAT TTTGCATT GGGACTG TGGTGGA 540 TCG TCC GCA TT GGT AGG 600 TACAGTG AGTGCTT TATTTGGT TATAAAT TCGTCCA7 CCGCTTG 660 GTA GTT TG TTC TT CTT 720 AGTGTAT TGAAATT TTGCAGTT CAGTGCT GGAGTCT CATTGTCT 780 AAC CTT TG GTT TAC CT 840 ACAGTAT TTCTCTGT TIGAGAAG CGGTACC TACTTTAT GCCATCT 866 GGC GG ТА TTC CA CAT AAAATGT AGGCATA TTTCTATT ATTTCCCT TAATGAT TTCTTTTT CTT TTC TT CT TTC TT TATTGCAT CCGTTTTA TTCAAAA GTTACTGT CTAAATC AAGAAAC TC TT GTT CT AAG CTT CTTAGTA CCAGCTG TTCAGCCT TTTAAATT ACTGCAG TTTAAAG GAT ATA TT GG GTT GGG AGCTTCA ATTGATA ATTTCCA CACACCG GAGAAGA TACCCGT AGC AGC GTC TTT ATA GAG TTGCATTA TGTGTGA TACAGTTT TTGTCTTT GCTATGT TCAACAC GT TTA TC TT CCA TAG AGATTCG AGTIATTA GTAGTCA CATAGGG GGTGATT GACTTTTG TGA GT ACG AGA GGT GA CGATTTC TGCTTTAG TTATTG AGG GG

AAATGAG ААТАТСА AAAGATG CAATCAG AAGAGTA ACATCGT 540 СТТ ССС ТТТ АТА ACG ТТТ 600 GAGATTA CAAACTG CTTACGT GTGATTT GAGTAGG GTTGCCA 660 GAA ААА AGA GAG СТС GCA 672 GAGCTAG ТСТССТСС CTCATGA ATCTGTTG CCTGAGA CCGTGAC СТС GC AGC СА САА GAA ACTTTCCG CACCGCC AGAATTC GCCGCGC GGAAGGA GAATCGG AT АСС GAC АТС ТСС GAA CTGAGTG CCGAGCG CCGGGAG GACGGAG TGGGAAA GAGTGGC ААС АТС TGC CGA AGA ACG ATTTCGA AGAGTGG AGGAGAG GGTGGAT CTCGCGT ATCAAGT CGA AAG GGT ААА ATG TCG TCATCGTC GATTGCC АТТТТТТТ TCAGGGC CTGTGGC GAAGTTT СТ GCCac TG GCT ТТА CCG atgtcaatga

6. Применение по п.5, где комбинация указанных маркеров дополнительно включает маркер PGIUNT и состоит из пяти маркеров PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon и СР418, где указанный маркер PGIUNT имеет следующую нуклеотидную последовательность:
TCATTTGA GTTGCGC TCGCCTTG GTGTTAT GAATGAA CAGTCAT 60 TT CTG TT GAT CAG ТТА 120 ACATGTG AACTTAA GGCTCCG GTTGCAA ACATGGT TGTCAGC 180 GTT CAG GCT ААС TGC ACT 240 AATCTTG TATGAAT TGATTAA TGTTTGTT TGACTCTT TTCATTGT 300 CGG TTG ATT TG TC TC 360 GTTTTCGT AATAAAC ATGTATA TTTTACAA TGAATTTT ACCGGGT 420 AC CGA АТС AC СТ CTG 480 ATGTACA CTAGTCTC TGTTCTTG GATCATG TATTTTCT ATGTATTC 540 ATG СА GG ATT AC AG 600 ACAGTAC AGAAAGT CAAAACT GATGTTTT TTTACAGT GTGGAGA AGA GTT CTG AA ТА AGT TCGGCAT TCCGAAC GCATTTG TTTGGGA GGTTGGT AGGTACA TGA AAT CAT CTG GGA GTG GTAAGTG GTTTATTT TTGTATA TTCTCGTC TTTCCGCT CTTAGTGT СТТ GG AAT СА TG AT AACTGAA CTTTTGCA TTGCAGT GTTGGAG TACCATT TCTACAG ATT GT GCT TCT GTC TAT GGCTTCTC TGGTTGA GTACGGT TTCTACTT TCAGCCA CATAAAA TG GAA АСС ТА TCT TGT

CTTAGGC TTCTTTCT TTTATTTC TCTTAATG TTCTTCTT TTTTATTG 660 ATA Al CC AT TT CA 720 TTCCCGTT ATTTTCAA GTTGTTAC TCTCTAA AAGAAGA CTTCTTAG 780 TT АД TG АТС AAC ТА 840 900 GATCCAG ATATTCA TTTTTTAA TGGACTG GTTTTTAA GGGAGCT CTG GCC AT CAG AG TCA 960 AGCATTG AGCATTT GTCCACA TTTGAGA ATATACC GAGTTGC 979 ATA CCA CCG AGA CGT ATT AGTTGTG TTATACA TTCTTGTC TTTGCTAT CCATCAA TAGAGAT TGA GTT TTACGCA GT CAC TCG TGAAGTT AGTGTAG TAGGG AGAGGTG GGTGACT GGACGAT ATT TCA ATT TTT TTC AGGTGCT GGGTTAT TTA TG

7. Применение по п.5 или 6, где
маркер PGIol амплифицируется с использованием праймеров PGIol U и PGIol L, имеющих следующие последовательности:
PGIol U: 5'TCATTTGATTGTTGCGCCTG3';
PGIol L: 5'TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3';
маркер PGIint амплифицируется с использованием праймеров PGIint U и PGIint L, имеющих следующие последовательности:
PGImtU: 5'CAGCACTAATCTTGCGGTATG3';
PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3';
маркер PGIUNT амплифицируется с использованием праймеров PGIol U и PGIint L, имеющих следующие последовательности:
PGIol U: 5'TCATTTGATTGTTGCGCCTG3';
PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3';
маркер BolJon амплифицируется с использованием праймеров BolJon U и BolJon L, имеющих следующие последовательности:
BolJon U: 5'ATCCGATTCTTCTCCTGTTG5';
BolJon L: 5'GCCTACTCCTCAAATCACTCT3';
маркер СР418 амплифицируется с использованием праймера рСР418 L, имеющего следующую последовательность:
рСР418 L: 5'AATTTCTCCATCACAAGGACC3'.