CN1757707A - 耐高温巴氏杜氏藻诱变选育方法 - Google Patents
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Abstract
耐高温巴氏杜氏藻诱变选育方法，涉及一种单细胞绿藻，提供一种采用紫外线诱变选育耐高温巴氏杜氏藻及其鉴定方法。培养基分装灭菌并冷却，取藻液接种培养，藻液以等量碘液或溴酚蓝液混匀，灭活，取样计算藻液中巴氏杜氏藻密度；取处于对数生长期的巴氏杜氏藻进行诱变后暗培养；暗培养后的藻液和新鲜培养基混匀培养；取诱变藻液和原出发藻液高温筛选后存活的藻细胞扩大培养，藻液光照培养；取黄色单藻落接种扩大培养，检测其诱变效果；测量细胞长短径；提取杜氏藻总DNA，进行随机扩增多态DNA，计算遗传相似系数：提取H－42和原出发株的总蛋白质进行电泳后用考马斯亮蓝R250染色，记录结果；观察电泳图谱获得结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种单细胞绿藻，尤其是涉及一种采用紫外线诱变选育获得耐高温巴氏杜氏藻及其鉴定方法。
背景技术
巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)是一种单细胞真核绿藻，属于绿藻纲(Chlorophyceae)，团藻目(Volvocales)，杜氏藻科(Dunaliellaceae)，杜氏藻属(Dunaliella)。杜氏藻天然没有细胞壁，是迄今为止发现的少数极端耐盐的真核生物之一。杜氏藻富含β-胡萝卜素、甘油和蛋白质，因此成为人类主要的养殖藻类之一，在商业开发中具有很高的利用价值。杜氏藻最适生长温度为25～30℃，当温度超过35℃时，生长完全被抑制，细胞逐渐死亡。我国夏季炎热高温，尤其是南方，杜氏藻难以露天养殖。如果能通过诱变获得耐受高温的藻株，将对我国杜氏藻养殖具有重要意义。
虽然已有用紫外线诱变低等生物，包括杜氏藻的资料，但至今尚未发现用紫外线诱变、培育耐高温巴氏杜氏藻的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对已有杜氏藻无法耐受高温的缺陷，提供一种采用紫外线诱变选育耐高温巴氏杜氏藻及其鉴定方法。
本发明所说的耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42的特征为：
(1)在每天42℃处理6h情况下还能正常生长，达到3.68×106个/mL；
(2)其细胞显著增大，细胞长径达12.5～15.5μm，短径为10.0～12.5μm，体积达到(0.654～1.267)×10-15m3，相当于原出发株细胞体积的3.0～3.4倍；
(3)巴氏杜氏藻突变株H-42与原出发株之间的遗传相似系数I为0.726；
(4)巴氏杜氏藻突变株H-42比原出发株在大约24kD和30kD处分别多出一条新的蛋白带，同时在26kD处缺失一条蛋白带。
本发明所说的用紫外线诱变培育耐高温巴氏杜氏藻的具体步骤如下：
1.配制培养巴氏杜氏藻的人工海水培养基；
2.将上述人工海水培养基分装封口；
3.把封装好的上述培养基灭菌；
4.取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，取巴氏杜氏藻藻液接种在无菌培养基中；
5.将培养液置于光照培养箱中培养；
6.每天或隔天取出藻液，以等量的碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活巴氏杜氏藻，取样在血球计数板上计算藻液中巴氏杜氏藻的密度；
7.取处于对数生长期的巴氏杜氏藻，倾注于无菌培养皿中，置超净工作台中紫外灯下照射进行诱变后，无光暗培养；
8.将暗培养后的藻液和新鲜培养基按1∶1的比例混匀，依步骤5培养；
9.各取诱变藻液和原出发藻液，在夏季强光下照射进行高温筛选；
10.待藻液变为浅黄色；
11.将高温筛选后存活的藻细胞依步骤5扩大培养，使其恢复生长；吸取藻液涂布到杜氏藻固体培养基上，光照培养；
12.挑取生长迅速的黄色单藻落分别接种到液体培养基中，扩大培养，检测其诱变效果；
13.将突变株H-42和原出发株藻液分别制成简易装片，在显微镜下观察、测量细胞的长径和短径；
14.提取杜氏藻总DNA，并以25～30个10聚寡核苷酸随机引物进行随机扩增多态DNA(RAPD)研究，每个引物至少重复进行两次PCR反应；
15.计算相关株系间的遗传相似系数；
16.采用冻融裂解法进一步提取H-42和原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果；
17.观察突变株H-42和原出发株两者的蛋白电泳图谱获得结果。
由于突变株H-42具有稳定的耐高温生长新特点，藻细胞比原出发株显著增大，RAPD和SDS-PAGE检测都发现不同的DNA和蛋白质条带，可见H-42的确是原出发株的突变株。
具有耐高温(42℃，6h)特征的巴氏杜氏藻H-42将能显著延长一年中杜氏藻的露天养殖时间，大大提高养殖场的生产效率；同时还能使杜氏藻的养殖区域南移，有利于开辟我国南方养殖杜氏藻的新局面。此外，H-42超大的细胞体积(约为原出发株的3.0～3.4倍)，十分有利于突破杜氏藻因细胞微小而产生的难以收获的瓶颈。可见，成功诱变、培育耐高温的杜氏藻H-42具有重要的经济和应用价值。
在步骤1中，通常是将各成份事先配成50～1000倍的母液，使用时再按需取一定的量配制成培养液，配制培养巴氏杜氏藻的人工海水培养基的组成如表1所示。
表1巴氏杜氏藻培养基成份
| 成分 | 浓度 |
| KNO3NaNO3K2HPO4·3H2OTris·HCl pH7.4CaCl2·2H2OMgSO4·7H2OMgCl2·6H2OH3BO3FeCl3·6H2OMnCl2·4H2OZnCl2CoCl2CuCl2·2H2OEDTA·Na2NaClpH | 1mmol/L4mmol/L0.1mmol/L10mmol/L10mmol/L24mmol/L20mmol/L0.185mmol/L1.5μmol/L7.0μmol/L0.8μmol/L0.02μmol/L0.2μmol/L30μmol/L1.5mol/L7.4 |
在步骤2中，可将人工海水培养基分装在100～250mL的锥形瓶中，每瓶装量20～50mL，棉花塞塞紧或用8层纱布封口，包上牛皮纸。
在步骤3中，可把包装好的上述培养基放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15～20min。
在步骤4中，取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，取1～5mL巴氏杜氏藻藻液接种在无菌培养基中，轻轻摇匀，塞上棉花塞或封好纱布。
在步骤5中，可将培养液置于光照培养箱中，光照强度1000～4000lux，培养温度20～30℃，每日光照时间12～24h，旋转摇动，90～120rpm；或静止培养，每天轻摇1～3次，每次10～20s。
在步骤6中，可每天或隔天取出0.3～0.5mL藻液，以等量的碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活巴氏杜氏藻。立即取样在血球计数板上计算藻液中巴氏杜氏藻的密度。重复计数3次，取平均值，绘制巴氏杜氏藻的生长曲线。所用的碘液为：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水100mL。先用少量蒸馏水溶解碘和碘化钾，待完全溶解后再定容到100mL。所用的溴酚蓝溶液为：0.25％的溴酚蓝溶解在40％的蔗糖溶液中。
在步骤7中，可取10～15mL处于对数生长期的巴氏杜氏藻(约培养4～8d)，倾注于直径9cm的无菌培养皿中，置超净工作台中30W紫外灯下12～14cm处，分别照射60～70s进行诱变。关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好，在22～30℃无光培养48～60h。所取藻液的量以刚能覆盖无菌培养皿底部即可，以利紫外线对所有细胞进行均匀照射；所用超净工作台应事先擦净并以紫外线杀菌15～20min。
在步骤8中，可将暗培养后的藻液和新鲜培养基按1∶1的比例在锥形瓶中混匀，依步骤5培养12～14d。将暗培养后的藻液和新鲜培养基的混合应在超净工作台中进行以免染菌。
在步骤9中，可各取诱变藻液和原出发藻液100mL，分装250mL锥形瓶中，塞上棉花塞或封好纱布；选择8月晴天，每天从10时至17时将上述藻液置于室外花岗岩石板上，在夏季强光下照射进行高温筛选；每隔1h用温度计测藻液温度，连续7d；每天17时后取回藻液置室内光照培养箱中以2000～3000lux在22～30℃继续静止或摇动培养。
在步骤10中，当高温筛选时，前2d原出发株藻液由绿色逐渐变为淡绿色，到第3～4d藻液几乎无色，并出现大量白色絮状沉淀，显微镜下未能发现完整的藻细胞，说明原出发株经受不了高温考验大量死亡。突变株藻液第2d绿色才变浅，第3d藻液变为黄绿色，以后逐渐成为浅黄色。镜检表明，突变株藻液中尚存少量耐高温的藻细胞存活。
在步骤11中，可将高温筛选后存活的藻细胞依步骤5扩大培养7～14d，使其恢复生长；吸取0.1～0.3mL藻液涂布到杜氏藻固体培养基上，24h光照培养12～16d，光强2000～3000lux。所说的杜氏藻固体培养基上，是在原有液体培养基中添加琼脂0.8％～1.0％配制而成；杜氏藻涂抹到固体培养基上后，培养皿要倒扣培养防止水珠产生，并以封口膜贴封上下皿盖间的接缝，防止培养基水分逃逸。
在步骤12中，可挑取若干生长迅速的黄色单藻落分别接种到液体培养基中，扩大培养。并从各方面检测其诱变效果。
在步骤13中，可将突变株与原出发株一同置于24h光照培养箱中，每天42℃处理6h。取样，以血球记数板在OLYMPUS显微镜下直接计数藻细胞，每株藻计三次，取平均值，测定杜氏藻突变株在高温下的生长曲线。实验发现突变株(代号H-42)能持续进行细胞分裂，藻细胞的密度逐渐增大，到第7d藻细胞的密度达到最高值为3.68×106个/mL，是起始密度的4.5倍，以后细胞密度基本维持在动态平衡状态；而原出发株(对照)从第2d开始细胞密度急剧下降，到第5d细胞密度几乎接近于零(参见图1)。所说的取样并在血球记数板上计数藻液浓度，是指取出藻液后还需按1∶1比例滴加等量的碘液或溴酚蓝液混匀、灭活巴氏杜氏藻才可计数。在OLYMPUS显微镜下测量杜氏藻的长径和短径以前，要以台微尺校正目微尺每格的实际长度(μm)。
在步骤14中，将突变株H-42和原出发株藻液分别制成简易装片，在OLYMPUS显微镜下观察、测量各50个细胞的长径和短径。根据以下公式计算其体积：细胞体积＝4/3π·[a/2]2·[b/2]，式中，a为细胞短径，b为细胞长径。检测发现，H-42的短径为10.0～12.5μm，长径为12.5～15.5μm，原出发株的短径为7.0～8.5μm，长径为8.5～10.0μm。根据上述公式计算，H-42的体积达到(0.654～1.267)×10-15m3，而原出发株仅为(0.218～0.378)×10-15m3，前者的细胞体积相当于后者的3.0～3.4倍，增大的效果非常显著(参见表2：H-42和原出发株的细胞形态比较)。
表2H-42和原出发株的细胞形态比较
| 藻株 | 藻液颜色 | 细胞短径(a)(μm) | 细胞长径(b)(μm) | 细胞体积(×10-15m3) |
| D.bardawilD.bardawil var.H-42 | 绿色黄绿色 | 7.0-8.510.0-12.5 | 8.5-10.012.5-15.5 | 0.218-0.3780.654-1.267 |
注：杜氏藻细胞体积公式：V＝4/3π·[a/2]2·[b/2]
在步骤15中，为了进一步从分子水平对H-42是否为原出发株的突变株进行判别，提取杜氏藻总DNA，并以25～30个10聚寡核苷酸随机引物进行随机扩增多态DNA(RAPD)研究，每个引物至少重复进行两次PCR反应。以25个10聚寡核苷酸随机引物进行的RAPD实验发现，7个引物产生不清晰和无法检测的产物，18个能产生多态性条带。从这18个引物中遴选条带清晰、重复性良好的12个引物进行正式扩增。实验共检测到146个位点(参见表3：十聚寡核苷酸随机引物序列及其扩增结果)，其中10条引物扩增出差异条带，其大小在250～2000bp之间(参见图2)。每个引物所进行的RAPD扩增，至少要进行两次。两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。
表3十聚寡核苷酸随机引物序列及其扩增结果
| 引物 | 序列 | 总扩增带数 | 共有带数 | 引物 | 序列 | 总扩增带数 | 共有带数 |
| S260S262S263S264S265S266 | ACAGCCCCCAACCCCGCCAAGTCCGGAGTGCAGAAGCGGAGGCGGATAAGAGGCCCGATG | 15201414108 | 676544 | S267S275S276S277S278S279 | CTGGACGTCAACACCGGAACCAGCCTACCAGTCCTGGGTTTTCAGGGCACCAAAGCGCTC | 10141510412 | 544314 |
| 总计 | 12 | 146 | 53 | ||||
在步骤16中，计算相关株系间的遗传相似系数的公式为I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。根据表3计算H-42和原出发株的遗传相似系数I为0.726，符合变异株的特征。
在步骤17中，可采用冻融裂解法进一步提取H-42和原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离胶浓度为10％～12％，浓缩胶浓度为4％～5％，电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果。
在步骤18中，从观察两者的蛋白电泳图谱(参见图3)可以看到，H-42在大约24kD和30kD处分别比原出发株多出一条新的蛋白带，同时在大约26kD处缺失一条蛋白带(箭头指处)。
本方法也适用于诱变、培育其它生物的耐高温突变株系。
附图说明
图1为突变株H-42和原出发株在42℃(每天6h)的生长曲线，横坐标为天数/d，Ba代表原出发株。由图1可见，H-42在每天6h高温42℃的情况下仍能正常生长，而原出发株不能经受高温的考验而死亡。
图2为突变株H-42和原出发株的RAPD扩增图谱。图中M代表DNA分子量标志物，其单位为bp，即碱基对；图上方的英文字母和数字的组合代表各种10聚寡核苷酸随机引物。
图3为突变株H-42与原出发株的蛋白质SDS-PAGE电泳图谱。其中M代表蛋白质分子量标志物，其单位为kD；Ba代表原出发株。斜向左上的两个箭头分别指向突变株H-42多出的两条蛋白带，分子量大约为24kD和30kD；水平向右的箭头指向原出发株比H-42多出的一条蛋白带，也就是说，由于突变，H-42缺失了一条大约26kD的蛋白带。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步说明。
实施例1：
用紫外线诱变、培育耐高温巴氏杜氏藻的具体步骤如下：
1.配制培养巴氏杜氏藻的人工海水培养基；
2.将上述人工海水培养基分装在100mL的锥形瓶中，每瓶装量20mL，棉花塞塞紧，包上牛皮纸；
3.把包装好的上述培养基放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15min；
4.取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，取1mL巴氏杜氏藻藻液接种在无菌培养基中，轻轻摇匀，塞上棉花塞；
5.将培养液置于光照培养箱中，光照强度1000lux，培养温度20℃，每日光照时间12h，旋转摇动，90rpm；
6.每天取出0.3mL藻液，以等量的碘液混匀，灭活巴氏杜氏藻。立即取样在血球计数板上计算藻液中巴氏杜氏藻的密度。重复计数3次，取平均值，绘制巴氏杜氏藻的生长曲线：
7.取10mL处于对数生长期的巴氏杜氏藻(培养4d)，倾注于直径9cm的无菌培养皿中，置超净工作台中30W紫外灯下12cm处，照射60s进行诱变。关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好，在22℃无光培养48h；
8.将暗培养后的藻液和新鲜培养基按1∶1的比例在锥形瓶中混匀，依方法5培养12d；
9.各取诱变藻液和原出发株藻液100mL，分装250mL锥形瓶中，塞上棉花塞。选择8月晴天，每天从10时至17时将上述藻液置于室外花岗岩石板上，在夏季强光下照射进行高温筛选；每隔1h用温度计测藻液温度，连续7d；每天17时后取回藻液置室内光照培养箱中以2000lux在22℃继续静止培养；
10.期间测得午后最高培养液温度达52℃，每天48.0℃以上高温可维持至少2.5h，到17:00放回室内时藻液的温度仍在38℃以上。高温筛选时，前2d原出发株藻液由绿色逐渐变为淡绿色，到第3～4d藻液几乎无色，并出现大量白色絮状沉淀，显微镜下未能发现完整的藻细胞，说明原出发株经受不了高温考验大量死亡。突变株藻液第2d绿色才变浅，第3d藻液变为黄绿色，以后逐渐成为浅黄色。镜检表明，突变株藻液中尚存少量耐高温的藻细胞存活。
11.将高温筛选后存活的突变株藻细胞依方法5扩大培养7d，使其恢复生长；吸取0.1mL藻液涂布到杜氏藻固体培养基上，24h光照培养12d，光强2000lux。
12.挑取若干生长迅速的黄色单藻落分别接种到液体培养基中，扩大培养。从以下各方面检测其诱变效果。
13.将突变株与原出发株一同置于24h光照培养箱中，每天42℃处理6h。取样，以血球记数板在OLYMPUS显微镜下直接计数藻细胞，每株藻计三次，取平均值，测定杜氏藻突变株在高温下的生长曲线。实验发现突变株(代号H-42)能持续进行细胞分裂，藻细胞的密度逐渐增大，到第7d藻细胞的密度达到最高值为3.68×106个/mL，是起始密度的4.5倍，以后细胞密度基本维持在动态平衡状态；而原出发株(对照)从第2d开始细胞密度急剧下降，到第5d细胞密度几乎接近于零(图1)。
14.将突变株(H-42)和原出发株藻液分别制成简易装片，在OLYMPUS显微镜下观察、测量各50个细胞的长径和短径。根据以下公式计算其体积：细胞体积＝4/3π·[a/2]2·[b/2]，式中，a为细胞短径，b为细胞长径。检测发现，H-42的短径为10.0～12.5μm，长径为12.5～15.5μm；原出发株的短径为7.0～8.5μm，长径为8.5～10.0μm。根据上述公式换算，H-42的体积达到(0.654～1.267)×10-15m3，而原出发株仅为(0.218-0.378)×10-15m3，前者的细胞体积相当于后者的3.0～3.4倍，增大的效果非常显著(参见表1)。
15.为了进一步从分子水平对H-42是否为原出发株的突变株进行判别，提取杜氏藻总DNA，并以25个10聚寡核苷酸随机引物进行随机扩增多态DNA(RAPD)研究，每个引物至少重复进行两次PCR反应。实验发现，7个引物产生不清晰和无法检测的产物，18个能产生多态性条带。从这18个引物中遴选条带清晰、重复性良好的13个引物进行正式扩增。实验共检测到148个位点，其中11条引物扩增出差异条带，其大小在250～2000bp之间。
16.计算相关株系间的遗传相似系数，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。经计算H-42和原出发株的遗传相似系数I为0.702，符合变异株的特征。
17.采用冻融裂解法进一步提取H-42和原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为4％，电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果。
18.观察两者的蛋白电泳图谱可以看到，H-42在大约24kD和30kD处分别比原出发株多出一条新的蛋白带，同时在大约26kD处缺失一条蛋白带。
综上所述，由于H-42具有稳定的耐高温生长新特点，藻细胞比原出发株显著增大，RAPD和SDS-PAGE检测分别发现不同的DNA和蛋白质条带，可见H-42的确是原出发株的突变株。
实施例2：
与实施例1类似，其区别在于将人工海水培养基分装在250mL的锥形瓶中，每瓶装量50mL，用8层纱布封口，包上牛皮纸。把包装好的上述培养基放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌20min。取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，取5mL巴氏杜氏藻藻液接种在无菌培养基中，轻轻摇匀，封好纱布。将培养液置于光照培养箱中，光照强度4000lux，培养温度30℃，每日光照24h，静止培养，每天轻摇1～3次，每次10～20s。
隔天取出0.3mL藻液，以等量的溴酚蓝液混匀，灭活巴氏杜氏藻。立即取样在血球计数板上计算巴氏杜氏藻的密度。重复计数3次，取平均值，绘制巴氏杜氏藻的生长曲线。
取15mL处于对数生长期的巴氏杜氏藻(约培养8d)，倾注于直径9cm的无菌培养皿中，置超净工作台中30W紫外灯下14cm处，照射70s进行诱变。关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好，在30℃无光培养60h。将暗培养后的藻液和新鲜培养基按1∶1的比例在锥形瓶中混匀，依方法5培养14d。
各取诱变藻液和原出发株藻液100mL，分装250mL锥形瓶中，塞上棉花塞。选择8月晴天，每天从10时至17时将上述藻液置于室外花岗岩石板上，在夏季强光照射下进行高温筛选；每隔1h用温度计测藻液温度，连续7d；期间测得午后最高培养液温度达52℃，每天48.0℃以上高温可维持至少2.5h，到17时放回室内时藻液的温度仍在38℃以上。每天17时后取回藻液，置室内光照培养箱中以3000lux在30℃摇动培养。在高温筛选时，前2d原出发株藻液由绿色逐渐变为淡绿色，第3～4d藻液褪色到几乎无色，并出现大量白色絮状沉淀，显微镜下未能发现完整的藻细胞，说明原出发株经受不了高温考验大量死亡。突变株藻液第2d绿色才变浅，第3d藻液变为黄绿色，以后逐渐成为浅黄色。镜检表明，突变株藻液中尚有少量耐高温的藻细胞存活。
将高温筛选后存活的藻细胞依方法5扩大培养14d，使其恢复生长；吸取0.3mL藻液涂布到杜氏藻固体培养基上，24h光照培养16d，光强3000lux。挑取若干生长迅速的黄色单藻落分别接种到液体培养基中，扩大培养。从以下各方面检测其诱变效果。
将突变株与原出发株一同置于24h光照培养箱中，每天42℃处理6h。取样，以血球记数板在OLYMPUS显微镜下直接计数藻细胞，每株藻计三次，取平均值，测定杜氏藻突变株在高温下的生长曲线。实验发现突变株(代号H-42)能持续进行细胞分裂，藻细胞的密度逐渐增大，到第7d藻细胞的密度达到最高值为3.68×106个/mL，是起始密度的4.5倍，以后细胞密度基本维持在动态平衡状态；而原出发株(对照)从第2d开始细胞密度急剧下降，到第5d细胞密度几乎接近于零。
将突变株(H-42)和原出发株藻液分别制成简易装片，在OLYMPUS显微镜下观察、测量各50个细胞的长径和短径。根据以下公式计算其体积：细胞体积＝4/3π·[a/2]2·[b/2]，式中，a为细胞短径，b为细胞长径。检测发现，H-42的短径为10.2～12.2μm，长径为12.8～15.1μm，原出发株的短径为7.3～8.1μm；长径为8.1～10.2μm。根据上述公式换算，H-42的体积达到(0.697～1.184)×10-15m3，而原出发株仅为(0.228～0.350)×10-15m3，前者的细胞体积相当于后者的3.1～3.4倍，增大的效果非常显著。
为了进一步从分子水平对H-42是否为原出发株的突变株进行判别，提取杜氏藻总DNA，并以30个10聚寡核苷酸随机引物进行随机扩增多态DNA(RAPD)研究，每个引物至少重复进行两次PGR反应。RAPD实验发现，9个引物产生不清晰和无法检测的产物，21个能产生多态性条带。从这21个引物中遴选条带清晰、重复性良好的15个引物进行正式扩增。实验共检测到152个位点，其中13条引物扩增出差异条带，其大小在250～2000bp之间。
根据公式I＝2Nij/(Ni+Nj)计算相关株系间的遗传相似系数。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。据计算H-42和原出发株的遗传相似系数I为0.714，符合变异株的特征。
采用冻融裂解法进一步提取H-42和原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％，电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果。观察两者的蛋白电泳图谱可以看到，H-42在大约24kD和30kD处分别比原出发株多出一条新的蛋白带，同时在大约26kD处缺失一条蛋白带。
实施例3：
与实施例1类似，其区别在于将人工海水培养基分装在200mL的锥形瓶中，每瓶装量40mL，用棉花塞封口，包上牛皮纸。把包装好的上述培养基放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15min。取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，取3mL巴氏杜氏藻藻液接种在无菌培养基中，轻轻摇匀，塞好棉花塞。将培养液置于光照培养箱中，光照强度3000lux，培养温度25℃，每日光照24h，静止培养，每天轻摇1～3次，每次10～20s。
每天取出0.2mL藻液，以等量的碘液混匀，灭活巴氏杜氏藻。立即取样在血球计数板上进行读数，计算藻液中巴氏杜氏藻的密度。重复计数3次，取平均值，绘制巴氏杜氏藻的生长曲线。
取12mL处于对数生长期的巴氏杜氏藻(约培养6d)，倾注于直径9cm的无菌培养皿中，置超净工作台中30W紫外灯下13cm处，分别照射65s进行诱变。关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好，在26℃无光培养54h。将暗培养后的藻液和新鲜培养基按1∶1的比例在锥形瓶中混匀，依方法5培养13d。
各取诱变藻液和对照藻液100mL，分装250mL锥形瓶中，塞上棉花塞。选择8月晴天，每天从10时至17时将上述藻液置于室外花岗岩石板上，在夏季强光下照射进行高温筛选；每隔1h用温度计测藻液温度，连续7d；期间测得午后最高培养液温度达52℃，每天48.0℃以上高温可维持至少2.5h，到17:00放回室内时藻液的温度仍在38℃以上。每天17时后取回藻液，置室内光照培养箱中以2500lux在25℃静止培养。在高温筛选时，前2d原出发株藻液由绿色逐渐变为淡绿色，第3～4d藻液褪色到几乎无色，并出现大量白色絮状沉淀，显微镜下未能发现完整的藻细胞，说明原出发株经受不了高温考验大量死亡。突变株藻液第2d绿色才变浅，第3d藻液变为黄绿色，以后逐渐成为浅黄色。镜检表明，突变株藻液中尚有少量耐高温的藻细胞存活。
将高温筛选后存活的藻细胞依方法5扩大培养10d，使其恢复生长；吸取0.2mL藻液涂布到杜氏藻固体培养基上，24h光照培养14d，光强2500lux。挑取若干生长迅速的黄色单藻落分别接种到液体培养基中，扩大培养。从以下各方面检测其诱变效果。
将突变株与原出发株一同置于24h光照培养箱中，每天42℃处理6h。取样，以血球记数板在OLYMPUS显微镜下直接计数藻细胞，每株藻计三次，取平均值，测定杜氏藻突变株在高温下的生长曲线。实验发现突变株(代号H-42)能持续进行细胞分裂，藻细胞的密度逐渐增大，到第7d藻细胞的密度达到最高值为3.58×106个/mL，是起始密度的4.4倍，以后细胞密度基本维持在动态平衡状态；而原出发株(对照)从第2d开始细胞密度急剧下降，到第5d细胞密度几乎接近于零。
将突变株(H-42)和原出发株藻液分别制成简易装片，在OLYMPUS显微镜下观察、测量各50个细胞的长径和短径。根据以下公式计算其体积：细胞体积＝4/3π·[a/2]2·[b/2]，式中，a为细胞短径，b为细胞长径。检测发现，H-42的短径为9.9～12.4μm，长径为12.5～15.0μm；原出发株的短径为7.1～8.0μm，长径为8.0～10.5μm。根据上述公式换算，H-42的体积达到(0.641～1.207)×10-15m3，而原出发株仅为(0.211～0.352)×10-15m3，前者的细胞体积相当于后者的3.0～3.4倍，增大的效果非常显著。
为了进一步从分子水平对H-42是否为原出发株的突变株进行判别，提取杜氏藻总DNA，并以27个10聚寡核苷酸随机引物进行随机扩增多态DNA(RAPD)研究，每个引物至少重复进行两次PCR反应。RAPD实验发现，8个引物产生不清晰和无法检测的产物，19个能产生多态性条带。从这19个引物中遴选条带清晰、重复性良好的14个引物进行正式扩增。实验共检测到150个位点，其中12条引物扩增出差异条带，其大小在250～2000bp之间。
根据公式I＝2Nij/(Ni+Nj)计算相关株系间的遗传相似系数。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。据计算H-42和原出发株的遗传相似系数I为0.710，符合变异株的特征。
采用冻融裂解法进一步提取H-42和原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离胶浓度为11％，浓缩胶浓度为4％，电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果。观察两者的蛋白电泳图谱可以看到，H-42在大约24kD和30kD处分别比原出发株多出一条新的蛋白带，同时在大约26kD处缺失一条蛋白带。
Claims (10)
1、耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42，其特征在于：
(1)在每天42℃处理6h情况下正常生长，达到3.68×106个/mL；
(2)细胞长径为12.5～15.5μm，短径为10.0～12.5μm，体积为(0.654～1.267)×10-15m3，相当于原出发株细胞体积的3.0～3.4倍；
(3)巴氏杜氏藻突变株H-42与原出发株之间的遗传相似系数I为0.726；
(4)巴氏杜氏藻突变株H-42比原出发株在24kD和30kD处分别多出一条新的蛋白带，同时在26kD处缺失一条蛋白带。
2、如权利要求1所述的耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42的诱变培育方法，其特征在于其步骤为：
(1)配制巴氏杜氏藻的人工海水培养基；
(2)将上述人工海水培养基分装封口；
(3)把封装好的上述培养基灭菌；
(4)取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，取巴氏杜氏藻藻液接种在无菌培养基中；
(5)将培养液置于光照培养箱中培养；
(6)每天或隔天取出藻液，以等量的碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活巴氏杜氏藻，取样在血球计数板上计算藻液中巴氏杜氏藻的密度；
(7)取处于对数生长期的巴氏杜氏藻，倾注于无菌培养皿中，置超净工作台中紫外灯下照射进行诱变后，无光暗培养；
(8)将暗培养后的藻液和新鲜培养基按1∶1的比例混匀，依步骤5培养；
(9)取诱变藻液和原出发藻液，在夏季强光下照射进行高温筛选；
(10)待藻液变为浅黄色；
(11)将高温筛选后存活的藻细胞依步骤(5)扩大培养，使其恢复生长；吸取藻液涂布到杜氏藻固体培养基上，光照培养；
(12)取黄色单藻落分别接种到液体培养基中，扩大培养，检测其诱变效果；
(13)将突变株H-42和原出发株藻液分别制成简易装片，在显微镜下观察、测量细胞的长径和短径；
(14)提取杜氏藻总DNA，并以25～30个10聚寡核苷酸随机引物进行随机扩增多态DNA，每个引物至少重复进行两次PCR反应；
(15)计算相关株系间的遗传相似系数；
(16)采用冻融裂解法进一步提取H-42和原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果；
(17)观察突变株H-42和原出发株的蛋白电泳图谱获得结果。
3、如权利要求1所述的耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42的诱变培育方法，其特征在于其步骤为：
(1)配制培养巴氏杜氏藻的人工海水培养基；
(2)将人工海水培养基分装在100～250mL的锥形瓶中，每瓶装量20～50mL，棉花塞塞紧或用8层纱布封口，包上牛皮纸；
(3)把包装好的培养基放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15～20min；
(4)取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，取1～5mL巴氏杜氏藻藻液接种在无菌培养基中，轻轻摇匀，塞上棉花塞或封好纱布；
(5)将培养液置于光照培养箱中，光照强度1000～4000lux，培养温度20～30℃，每日光照时间12～24h，旋转摇动，90～120rpm或静止培养，每天轻摇1～3次，每次10～20s；
(6)每天或隔天取出0.3～0.5mL藻液，以等量的碘液或溴酚蓝液混匀，灭活巴氏杜氏藻，立即取样在血球计数板上进行读数，计算藻液中巴氏杜氏藻的密度，重复计数3次，取平均值，绘制巴氏杜氏藻的生长曲线；
(7)取10～15mL处于对数生长期的巴氏杜氏藻，培养4～8d，倾注于直径9cm的无菌培养皿中，置超净工作台中30W紫外灯下12～14cm处，分别照射60～70s进行诱变，关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好，在22～30℃无光暗培养48～60h；
(8)将暗培养后的藻液和新鲜培养基按1∶1的比例在锥形瓶中混匀，依步骤(5)培养12～14d：
(9)各取诱变藻液和对照藻液100mL，分装250mL锥形瓶中，塞上棉花塞或封好纱布；选择8月晴天，每天从10时至17时将上述藻液置于室外花岗岩石板上，在夏季强光下照射进行高温筛选；每隔1h用温度计测藻液温度，连续7d；每天17时后取回藻液置室内光照培养箱中以2000～3000lux在22～30℃继续静止或摇动培养；
(10)高温筛选时，前2d对照藻液由绿色逐渐变为淡绿色，到第3～4d藻液几乎无色，并出现大量白色絮状沉淀，显微镜下未能发现完整的藻细胞，说明对照经受不了高温考验大量死亡，突变株藻液第2d绿色才变浅，第3d藻液变为黄绿色，以后逐渐成为浅黄色。镜检表明，突变株藻液中尚存少量耐高温的藻细胞存活；
(11)将高温筛选后存活的藻细胞依方法5扩大培养7～14d，使其恢复生长；吸取0.1～0.3mL藻液涂布到杜氏藻固体培养基上，24h光照培养12～16d，光强2000～3000lux；
(12)挑取黄色单藻落分别接种到液体培养基中，扩大培养，检测其诱变效果；
(13)将突变株与原出发株一同置于24h光照培养箱中，每天42℃处理6h，取样，以血球记数板在OLYMPUS显微镜下直接计数藻细胞，每株藻计三次，取平均值，测定杜氏藻突变株在高温下的生长曲线；
(14)将突变株H-42和原出发株藻液分别制成简易装片，在OLYMPUS显微镜下观察、测量各50个细胞的长径和短径，根据以下公式计算其体积：细胞体积＝4/3π·[a/2]2·[b/2]，式中，a为细胞短径，b为细胞长径，检测发现，H-42的短径为10.0～12.5μm，长径为12.5～15.5μm，原出发株的短径为7.0～8.5μm，长径为8.5～10.0μm；
(15)提取杜氏藻总DNA，并以25～30个10聚寡核苷酸随机引物进行随机扩增多态DNA，每个引物至少重复进行两次PCR反应，以25个10聚寡核苷酸随机引物进行的RAPD实验发现，7个引物产生不清晰和无法检测的产物，18个能产生多态性条带，从这18个引物中遴选条带清晰、重复性良好的12个引物进行正式扩增，实验共检测到146个位点，其中10条引物扩增出差异条带，其大小在250～2000bp之间；
(16)计算相关株系间的遗传相似系数I＝2Nij/(Ni+Nj)，式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数，计算H-42和原出发株的遗传相似系数I为0.726，符合变异株的特征；
(17)采用冻融裂解法进一步提取H-42和原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为10％～12％，浓缩胶浓度为4％～5％，电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果；
(18)观察两者的蛋白电泳图谱，H-42在24kD和30kD处分别比原出发株多出一条新的蛋白带，同时在26kD处缺失一条蛋白带。
4、如权利要求3所述的耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42的诱变培育方法，其特征在于在步骤(1)中，将各成份事先配成50～1000倍的母液。
5、如权利要求3所述的耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42的诱变培育方法，其特征在于在步骤(6)中，所用的碘液为：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水100mL，先用蒸馏水溶解碘和碘化钾，待完全溶解后再定容到100mL，所用的溴酚蓝溶液为：0.25％的溴酚蓝溶解在40％的蔗糖溶液中。
6、如权利要求3所述的耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42的诱变培育方法，其特征在于在步骤(8)中，将暗培养后的藻液和新鲜培养基的混合在超净工作台中进行。
7、如权利要求3所述的耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42的诱变培育方法，其特征在于在步骤(9)中，将藻液塞上棉花塞或封好纱布置于室外花岗岩石板上，在夏季强光下照射进行高温筛选时，若遇下雨应及时取回，并在以后适当补上所损失的日照时间。
8、如权利要求3所述的耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42的诱变培育方法，其特征在于在步骤(11)中，所说的杜氏藻固体培养基上，是在原有液体培养基中添加琼脂0.8～1.0％配制而成；杜氏藻涂抹到固体培养基上后，培养皿要倒扣培养以防止水珠产生。
9、如权利要求3所述的耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42的诱变培育方法，其特征在于在步骤(13)中，所说的取样并在血球记数板上计数藻液浓度，是指取出藻液后还需按1∶1比例滴加等量的碘液或溴酚蓝液混匀。
10、如权利要求3所述的耐高温巴氏杜氏藻突变株H-42的诱变培育方法，其特征在于在步骤(14)中，在OLYMPUS显微镜下测量杜氏藻的长径和短径以前，以台微尺校正目微尺每格的实际长度。
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