CN1944643A

CN1944643A - 紫外线诱变获得耐低温盐藻及其鉴定方法

Info

Publication number: CN1944643A
Application number: CN 200610143445
Authority: CN
Inventors: 刘广发; 周韬
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2006-10-26
Filing date: 2006-10-26
Publication date: 2007-04-11

Abstract

紫外线诱变获得耐低温盐藻及其鉴定方法，涉及一种盐藻。提供一种耐低温盐藻突变株，以及采用紫外线诱变、低温选育盐藻的技术路线及其鉴定方法。耐低温盐藻突变株的特征为在3～10℃下光照培养能生长，达(1.05～8.11)×10⁶个细胞/mL，藻液细胞密度为对照的2.1～21倍；与野生型原出发株之间的遗传相似系数为0.680～0.910；与野生型原出发株相比，电泳时将出现一至若干条新蛋白带，如在大约36和158kDa处各多出一条新蛋白带，同时也可能丧失一至若干条蛋白带；或在某一位置的蛋白带前者比后者表达量高，如在大约27和29kDa处耐低温突变株表达的蛋白量比野生型原出发株高，或者反过来的情况也有出现。

Description

紫外线诱变获得耐低温盐藻及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种盐藻，尤其是涉及一种采用紫外线诱变盐藻(盐藻，Dunaliellabardawil)，通过选育获得能耐低温(3～10℃)的突变株及其鉴定的方法。

背景技术

盐藻(Dunaliellasp.)是一类单细胞真核绿藻，天然没有细胞壁，容易被消化。盐藻细胞中灰分含量较低，富含甘油、蛋白质、β-胡萝卜素、碳水化合物以及一定量的不饱和脂肪酸和维生素，是较为理想的保健食品之一，也可以作为动物的优质饵料和饲料，因此成为人类主要的养殖微藻之一，在商业开发中具有很高的利用价值。盐藻的最适生长温度为25～30℃，当温度低于10℃时，盐藻生长缓慢，甚至不生长，形成胞囊细胞。冬季气温低，盐藻难以露天或无温室养殖。因此世界几个主要的盐藻养殖国家，如澳大利亚、美国和以色列都只能在热带或亚热带的气温较高的地区进行养殖。在气温较低的冬季整个养殖场只能闲置，导致养殖场的经济效益不够高。如果能获得一种在较低温度(3～10℃)下还能比对照生长快得多的盐藻，则既能明显提高现有盐藻养殖场的经济效益，又能使盐藻的养殖区北移(北半球)和/或南移(南半球)，具有十分显著的作用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的盐藻只能在热带或亚热带的气温较高的地区进行养殖的问题，提供一种耐低温盐藻突变株，以及采用紫外线诱变、低温选育盐藻的技术路线及其鉴定方法。

本发明的技术方案是以紫外线诱变的方法获得在低温(3～10℃)条件下比对照生长快2.1～21倍的盐藻突变藻株。

本发明所述的耐低温盐藻突变株的特征为：

1)在3～10℃下光照培养还能生长，达到(1.05～8.11)×10⁶个细胞/mL，藻液的细胞密度为对照的2.1～21倍；

2)盐藻耐低温突变株与野生型原出发株之间的遗传相似系数I为0.680～0.910；

3)盐藻耐低温突变株与野生型原出发株相比，在进行SDS-PAGE电泳时将出现一至若干条新的蛋白带，如在大约36和158kDa处各多出一条新的蛋白带，同时也可能丧失一至若干条蛋白带；或在某一位置的蛋白带前者比后者的表达量高，如在大约27和29kDa处耐低温突变株表达的蛋白量比野生型原出发株高，或者反过来的情况也有出现。

本发明所述的耐低温盐藻的诱变、选育及其鉴定方法的具体步骤如下：

1)将人工海水培养基分装封口、灭菌；

2)取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，接种盐藻；

3)分别经光照和黑暗的光周期诱导，盐藻出现同步化生长；

4)以碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活盐藻，取样计算藻液中盐藻细胞的密度；

5)取处于指数生长期的盐藻藻液，倾注于培养皿中，置紫外灯下照射进行照射诱变，然后暗培养；

6)将暗培养后的藻液和新鲜培养液混匀，涂布到盐藻琼脂培养基上，低温光照培养；

7)挑取生长迅速的单藻落分别接种到少量培养液中，在低温光照下扩大培养；

8)取步骤7)培养所得的盐藻和野生型原出发株移接到含新鲜培养液的容器中扩大培养；

9)取样检测、比较盐藻耐低温突变株和野生型原出发株在低温光照下的生长曲线；

10)提取各盐藻耐低温突变株和野生型原出发株的总DNA，并以10聚核苷酸随机引物对总DNA进行随机多态性扩增DNA(RAPD)比较；

11)根据上述统计数字计算盐藻耐低温突变株和野生型原出发株之间的遗传相似系数；

12)提取盐藻耐低温突变株和野生型原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后用考马斯亮蓝R₂₅₀染色，扫描记录结果；

13)比较盐藻耐低温突变株和野生型原出发株两者的蛋白电泳图谱，找出盐藻耐低温突变株和野生型原出发株之间蛋白条带的共同点与不同之处；

14)根据在低温环境下比对照生长快2.1～21倍的新特征和RAPD研究及蛋白质分析结果，确认获得耐低温盐藻突变株。

在步骤1)中，所述的将人工海水培养基分装封口、灭菌是指将人工海水培养基分装在100～250mL的锥形瓶中，每瓶装量20～50mL，棉花塞塞紧或用8层纱布封口，包上牛皮纸，把上述培养基放置在高压蒸汽灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15～20min，所述的人工海水培养基的组成如表1所示。

在步骤2)中，所述的接种盐藻是指在超净工作台中取1～5mL盐藻藻液接种在无菌培养基中摇匀，重新塞上棉花塞或封好纱布。

在步骤3)中，所述的光周期诱导是在25～30℃的培养箱中每天以2000～4000烛光(lx)光照12h，黑暗12h，连续培养2～5d；可以是静止培养，每天手摇数次，每次10～20s，或在可控光照的摇床上以30～150rpm的速度摇动。获得同步化生长的盐藻。

表1 盐藻培养基组成

成分	浓度	成分	浓度
成分	浓度	成分	浓度	KNO₃NaNO₃K₂HPO₄·3H₂OTris·HCl pH7.4CaCl₂·2H₂OMgSO₄·7H₂OMgCl₂·6H₂OH₃BO₃	1mmol/L4mmol/L0.1mmol/L10mmol/L10mmol/L24mmol/L20mmol/L0.185mmol/L	FeCl₃·6H₂OMnCl₂·4H₂OZnCl₂CoCl₂CuCl₂·2H₂OEDTA·Na₂NaClpH	1.5μmol/L7.0μmol/L0.8μmol/L0.02μmol/L0.2μmol/L30μmol/L1.5mol/L7.4

在步骤4)中，所述的以碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活盐藻，取样计算藻液中盐藻细胞的密度是指每天或隔天取出0.3～0.5mL藻液，以等量的碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活盐藻，立即取样在血球计数板上计算藻液中盐藻细胞的密度。所述的计算藻液中盐藻细胞的密度可重复计数3次，取平均值，绘制盐藻的生长曲线。所用的碘液为碘1g，碘化钾2g，蒸馏水100mL。先用少量蒸馏水溶解碘和碘化钾，待完全溶解后再定容到100mL。所用的溴酚蓝溶液为0.25％的溴酚蓝溶解在40％的蔗糖溶液中。盐藻细胞密度的计算也可以用光密度法，即取出藻液注入比色杯中，在OD₆₃₀处读取数值，依据公式“细胞密度＝899.08OD₆₃₀-12.544”换算成藻液细胞密度。以盐藻培养时间为横轴，以培养基中的藻细胞密度为纵轴，绘制盐藻的生长曲线。

在步骤5)中，所述的处于指数生长期的盐藻藻液置于超净工作台中紫外灯下照射进行诱变，所用超净工作台事先擦净并以紫外线杀菌15～20min；每个无菌培养皿中盛5～30mL藻液；超净工作台中的紫外灯为20～30w，紫外灯与培养皿的距离为12～18cm，紫外线照射时间为50～100s；照射后关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸或布包好培养皿进行暗培养；暗培养的温度为20～30℃，时间为48～72h。

在步骤6)中，所述的藻液和新鲜培养基按质量比为1∶(1～10)，混匀后吸取50～500μL均匀地涂布到盐藻琼脂培养基上，盖好培养皿，以封口膜密封上下皿盖间的缝隙，防止培养基水分逃逸，培养皿要倒扣培养防止水珠产生。所述的盐藻琼脂培养基指的是在盐藻人工海水培养液中添加1.0％～2.0％的琼脂；在低温3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照培养。

在步骤7)中，所述的单藻落是指由单个盐藻细胞长成的细胞集落；所述的生长迅速的单藻落是指在同等条件下长得比较大的藻落；以无菌接种环挑取较大藻落的藻细胞分别接种到含3～8mL盐藻培养液的试管中，在低温3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照的光照培养箱中扩大培养。所述的盐藻培养液的试管应斜放成15～45°，每天手工摇动数次，每次10～20s，或在光照摇床上以30～150rpm的速度摇动。

在步骤8)中，所述的扩大培养可在无菌超净工作台中取各诱变藻液和对照藻液0.5～2.0mL，加入到装有50～200mL盐藻培养液的锥形瓶中，塞上棉花塞或封好纱布，其标准就是使各藻液的起始细胞密度(OD值)尽可能一致或十分接近；放在3～10℃、1000～4000lx、24h光照的光照培养箱中，每天手工摇动数次，每次10～20s；或在光照摇床上以30～150rpm的速度摇动。

在步骤9)中，所述的取样检测是每1～3d取出0.5～4.0mL藻液，按步骤4)所述方法测定各藻液的细胞密度。

在步骤10)中，所述的提取各盐藻耐低温突变株和野生型原出发株的总DNA是按常规方法提取植物总DNA，在紫外分光光度计上检测该DNA的OD₂₆₀与OD₂₈₀的比值。若该比值小于1.8，则说明DNA的纯度不够，应进一步提纯；若该比值大于或等于1.8，则可以进行后述实验。所述的10聚核苷酸随机引物是计算机随机设计的、由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA(可从上海生工生物工程有限公司等处购买)；所述的随机引物对总DNA进行随机多态性扩增是以各藻的总DNA为模板，分别以单链10聚核苷酸为引物进行的PCR扩增反应。反应产物经琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖含量0.8％～1.2％)，在凝胶成像系统扫描和记录。所选取的引物至少要达到25～30个，每个引物至少重复进行两次PCR反应，两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。从这些扩增结果中遴选条带清晰、重复性良好的引物进行正式扩增。

在步骤11)中，所述的计算盐藻耐低温突变株和野生型原出发株之间的遗传相似系数，其公式为I＝2Nij/(Ni+Nj)，式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。

在步骤12)中，所述的提取盐藻耐低温突变株和野生型原出发株的总蛋白质可采用对细胞反复冻融裂解的方法分别提取盐藻耐低温突变株和野生型原出发株的总蛋白质，保持两者蛋白浓度的一致性；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的分离胶浓度为10～12，浓缩胶浓度为4～5。

在步骤13)中，所述的比较盐藻耐低温突变株和野生型原出发株两者的蛋白电泳图谱是检测它们之间的蛋白泳带是否有增加或/和减少，或者在两者蛋白浓度基本一致的条件下，其中一条或几条的蛋白泳带比对方相对位置上的蛋白更浓些(含量更高)或更淡些(含量更低)。

由于突变株具有稳定的可在较低温度(3～10℃)下比对照生长快2.1～21倍的新特点，同时RAPD和SDS-PAGE检测都证明突变株与原出发株在DNA和蛋白质水平基本相同，但也都各自出现一些不同的突变，因此可以确定已经获得耐低温盐藻突变株。

盐藻养殖一般都是在露天或室外的浅池中进行，气候因素对其生长具有决定性的影响。具备耐低温特征的盐藻将能显著延长盐藻的露天或室外的养殖时间，大大提高养殖场的生产效益；此外耐低温盐藻还能使盐藻的养殖区域北移，有利于开辟我国北方养殖盐藻的新局面。可见，本发明获得在低温(3～10℃)下比对照生长快2.1～21倍的突变藻株，必将对延长一年中盐藻的养殖周期、提高养殖场的经济效益具有重要意义。

附图说明

图1为耐低温盐藻突变株L-5和野生型原出发株在5℃的生长曲线。在图1中，横坐标为培养天数/d，纵坐标为细胞数量(×10⁶个/mL)，Ba代表野生型原出发株。

图2为耐低温盐藻突变株L-5和野生型原出发株的RAPD扩增图谱。在图2中，M代表DNA分子量标志物，单位为bp，即碱基对；图上方的英文字母和数字的组合(S260、S264、S265)代表各种10聚核苷酸随机引物；5148、2027、1375和831分别代表DNA分子量为5148、2027、1375和831个碱基对。

图3为耐低温盐藻突变株L-5和野生型原出发株用另三种10聚核苷酸随机引物的RAPD扩增图谱。在图3中，M代表DNA分子量标志物，其单位为bp，即碱基对；图上方的英文字母和数字的组合(S282、S283、S284)代表各种10聚寡核苷酸随机引物；5148、2027、1375和947代表分别代表DNA分子量为5148、2027、1375和947个碱基对。

图4为耐低温盐藻突变株L-5与野生型原出发株的蛋白质SDS-PAGE电泳图谱。在图4中，M为蛋白质分子量标志物，单位为kDa(千道尔顿)；Ba代表野生型原出发株。在大约36和158kDa处L-5比野生型原出发株各多出一条新的蛋白带，同时在大约27和29kDa处L-5表达的蛋白量比对照高得多。图右侧的数字158、116、66、56、43、36和27分别代表蛋白质分子量为158、116、66、56、43、36和27kDa(千道尔顿)。

具体实施方式：

以下实施例将对本发明作进一步说明。

实施例1

紫外线诱变和培育耐低温盐藻，需先配制培养盐藻(Dunaliella bardawil)的人工海水培养液，将各成分事先分组配成50～1000倍的母液，使用时再按需稀释配制成培养液。配制培养盐藻的人工海水培养液的组成如表1所示。将人工海水培养液分装在100mL的锥形瓶中，每瓶装量20mL，棉花塞塞紧，包上牛皮纸。把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15min。取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，取1mL盐藻藻液接种在无菌培养液中，轻轻摇匀，塞上棉花塞。在20℃的培养箱中每天以4000lx光照12h，黑暗12h。连续培养2d，获得同步化生长的盐藻，即出现大量细胞分裂现象。每天定时取出藻液0.3mL，以等量的碘液灭活盐藻，取样用血球计数板计算藻液中盐藻细胞的密度。超净工作台事先打开紫外灯杀菌15min。取处于指数生长期(即从暗培养6h后到光照培养开始2h内)的盐藻藻液，倾注于无菌培养皿中，每皿5mL。置超净工作台中20w紫外灯下，距离12cm照射100s进行诱变，20℃暗培养72h。

将暗培养后的藻液和新鲜培养液以1∶1的比例混匀，吸取混匀藻液50μL涂布到含琼脂1.0％的盐藻固体培养基上，低温5℃光照1000lx，不间断光照培养。挑取生长迅速的单藻落分别接种到含3mL盐藻培养液的试管中，15°斜放，在5℃以1000lx的光照强度不间断培养，每天手摇数次至藻液呈深绿色。取0.5mL上述长成的盐藻藻液移接到含50mL新鲜培养液的锥形瓶中，在5℃以1000lx的光照强度不间断培养，每天手摇数次，每次10～20s。每3天取样0.5mL在血球计数板计数藻液中耐低温盐藻突变株和野生型原出发株在低温培养时的细胞密度，描绘出各自的生长曲线(参见图1)。由图1可见，L-5在低温5℃的情况下仍能基本正常生长，而野生型原出发株在第48d就已进入生长平衡期，且藻液的细胞密度低得多。实验观察到，在5℃光照培养箱中培养，耐低温盐藻突变株L-5藻液的细胞密度逐渐增大，经过57d培养，其藻液细胞密度达到8.11×10⁶个细胞/mL，是原始细胞密度的33.8倍，是野生型原出发株的2.59倍；野生型原出发株一直到第24d都没有明显增长，从第27d才缓慢进入指数生长期，而到第48d就已经达到生长平衡期，其最终藻液密度仅为3.13×10⁶个细胞/mL。提取各盐藻总DNA，经检测纯度合格后，以25个10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较研究；每个引物至少重复进行两次PCR反应，并将反应产物在含琼脂糖0.8％的凝胶上进行电泳。两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。实验发现，其中1个引物不产生任何条带，7个引物产生不清晰和无法检测的产物，17个能产生多态性条带。从中遴选条带清晰、重复性良好的12个引物(参见表2)进行正式扩增。实验共检测到125个位点，其中12个引物扩增出差异条带(参见图2)。

根据上述统计数字计算耐低温盐藻突变株与野生型原出发株间的遗传相似系数I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。根据表2计算耐低温盐藻突变株L-5和野生型原出发株间的遗传相似系数I为0.768，符合变异株的特征。提取耐低温盐藻突变株和野生型原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为4％。电泳结束后用考马斯亮蓝R₂₅₀染色，扫描记录结果(参见图3)。比较两者的蛋白电泳图谱(参见图3)，可以看到，在大约36kDa和158kDa处耐低温盐藻突变株L-5比野生型原出发株各多出一条新的蛋白带，同时在大约27kDa和29kDa处耐低温盐藻突变株L-5表达的蛋白量比原出发株高得多(箭头指处)。根据在低温环境(5℃)下基本能正常生长的新特征和RAPD研究及蛋白质分析结果，确认已经获得耐低温盐藻突变株。

表2.12个10聚核苷酸随机引物序列及其扩增结果

引物序列	总扩增带数	共有带数
引物序列	总扩增带数	共有带数	S₂₆₀ACAGCCCCCAS₂₆₄CAGAAGCGGAS₂₆₅GGCGGATAAGS₂₆₆AGGCCCGATGS₂₆₇CTGGACGATGS₂₆₈GACTGCCTCTS₂₇₄CTGCTGAGCAS₂₇₅ACACCGGAACS₂₇₇GTCCTGGGTTS₂₈₂CATCGCCGCAS₂₈₇ACAGCCTGCAS₂₈₄GGCTGCAATG	1738117101067191215	603534333747
总计12	125	48		1738117101067191215	603534333747

实施例2

与实施例1类似，其区别在于配制培养盐藻(Dunaliella salina)的人工海水培养液，将人工海水培养液分装在250mL的锥形瓶中，每瓶装量50mL，8层纱布封口，包上牛皮纸。把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌20min。取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，取5mL盐藻藻液接种在无菌培养液中，轻轻摇匀，8层纱布封口。在30℃的培养箱中每天光照12h，2000lx，黑暗12h。连续培养5d，获得同步化生长的盐藻，即从暗培养6h后到光照培养开始2h内，盐藻出现大量细胞分裂。隔天定时取出藻液0.5mL，以等量的溴酚蓝液混匀藻液，灭活盐藻，取样用血球计数板计算藻液中盐藻细胞的密度。

超净工作台事先打开紫外灯杀菌20min。取处于指数生长期的盐藻(即从暗培养6h后到光照培养开始2h内)，倾注于无菌培养皿中，每皿30mL。置超净工作台中30w紫外灯下距离18cm照射50s进行诱变，30℃暗培养48h。将暗培养后的藻液和新鲜培养液以1∶10的比例混匀，吸取混匀藻液500μL涂布到含琼脂2.0％的盐藻固体培养基上，低温3℃光照强度4000lx，不间断光照培养。挑取生长迅速的单藻落分别接种到含8mL盐藻培养液的试管中，45°斜放，在3℃以4000lx的光照强度，10rpm摇床培养至藻液呈深绿色。取2.0mL上述长成的盐藻藻液移接到装有200mL新鲜培养液的锥形瓶中，在3℃以3000lx的光照强度，150rpm摇床培养。每天取样4.0mL在分光光度计检测耐低温盐藻突变株和野生型原出发株在低温培养时的藻液细胞密度，描绘出各自的生长曲线。实验观察到，在本培养条件下，耐低温盐藻突变株藻液的细胞密度逐渐增大，经过60d培养，其藻液密度达到1.05×10⁶个细胞/mL，是原始细胞密度的29.2倍。野生型原出发株一直没有明显增长，实验结束时其最终藻液细胞密度仅为0.051×10⁶个细胞/mL，与实验开始时基本无异。

提取耐低温盐藻突变株和野生型原出发株总DNA，经检测纯度合格后，以30个10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较研究。每个引物至少重复进行两次PCR反应，并将反应产物在含琼脂糖1.2％的凝胶上进行电泳。两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。实验发现，其中2个引物不产生任何条带，9个引物产生不清晰和无法检测的产物，19个引物能产生多态性条带。从中遴选条带清晰、重复性良好的16个引物进行正式扩增。实验共检测到136个位点，其中14个引物扩增出差异条带。

根据上述统计数字计算耐低温盐藻突变株与野生型原出发株间的遗传相似系数I，I＝0.680，符合变异株的特征。提取耐低温盐藻突变株和野生型原出发株的总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。电泳结束后用考马斯亮蓝R₂₅₀染色，扫描记录结果。比较两者的蛋白电泳图谱可以看到，在大约37kDa和150kDa处耐低温盐藻突变株比野生型原出发株各多出一条新的蛋白带。根据在低温环境(3℃)下基本能生长的新特征和RAPD研究及蛋白分析结果，确认已经获得耐低温盐藻突变株。

实施例3

与实施例1类似，其区别在于配制培养盐藻(Dunaliella bardawil)的人工海水培养液，将人工海水培养液分装在150mL的锥形瓶中，每瓶装量30mL，棉花塞塞紧，包上牛皮纸。把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15min。取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，取3mL盐藻藻液接种在无菌培养液中，轻轻摇匀，塞上棉花塞。在25℃的培养箱中每天光照12h，3000lx，黑暗12h。连续培养3d，获得同步化生长的盐藻，即从暗培养6h后到光照培养开始2h内，盐藻出现大量的细胞分裂。每天定时取出藻液5mL，在分光光度计检测藻液的OD₆₃₀数值，换算成藻液中盐藻细胞的密度。超净工作台事先打开紫外灯杀菌15min。取处于指数生长期的盐藻藻液，倾注于无菌培养皿中，每皿20mL。置超净工作台中25w紫外灯下距离15cm照射70s进行诱变，25℃暗培养60h。将暗培养后的藻液和新鲜培养液以1∶5的比例混匀，吸取200μL涂布到含琼脂1.5％的盐藻固体培养基上，低温10℃，光强3000lx，不间断光照培养。

挑取生长迅速的单藻落分别接种到含5mL盐藻培养液的试管中，30°斜放，在10℃以3000lx的光照强度不间断培养，每天手摇数次，每次10～20s，培养至藻液呈深绿色。取1.0mL上述长成的盐藻藻液移接到含100mL新鲜培养液的锥形瓶中，在10℃以2000lx的光照强度不间断培养，每天手摇数次，每次10～20s。每3天取样1.5mL在分光光度计测OD₆₃₀数值，换算成它们的细胞密度，描绘出各自的生长曲线。实验观察到，在10℃光照培养下，耐低温盐藻突变株藻液的细胞密度逐渐增大，经过60d培养，其藻液细胞密度可达7.88×10⁶个细胞/mL，是原始细胞密度的31.2倍，是野生型原出发株的2.32倍；野生型原出发株一直到第21d都没有明显增长，从第24d开始才缓慢进入指数生长期，而到第45d就已经达到生长平衡期，其最终藻液细胞密度仅为3.40×10⁶个细胞/mL。

分别提取耐低温盐藻突变株和野生型原出发株的总DNA，经检测纯度合格后，以28个10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较研究。每个引物至少重复进行两次PCR反应，并将反应产物在含琼脂糖1.0％的凝胶上进行电泳。两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。实验发现，其中3个引物不产生任何条带，5个引物产生不清晰和无法检测的产物，20个能产生多态性条带。从中遴选条带清晰、重复性良好的15个引物进行正式扩增。实验共检测到135个位点，其中13个引物扩增出差异条带。

根据上述统计数字计算耐低温盐藻突变株与野生型原出发株间的遗传相似系数I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。经计算，耐低温盐藻突变株和野生型原出发株间的遗传相似系数I为0.910，符合变异株的特征。分别提取耐低温盐藻突变株和野生型原出发株的总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分离胶浓度为11％，浓缩胶浓度为4％。电泳结束后用考马斯亮蓝R₂₅₀染色，扫描记录结果。比较两者的蛋白电泳图谱。可以看到，耐低温盐藻突变株比野生型原出发株多出两条新的蛋白带，同时在大约67kDa处，前者表达的蛋白量比后者高得多。根据在低温环境(10℃)下基本能正常生长的新特征和RAPD研究及蛋白质分析结果，确认已经获得耐低温盐藻突变株。

实施例4

与实施例1类似，其区别在于配制培养盐藻(Dunaliella salina)的人工海水培养液，将人工海水培养液分装在200mL的锥形瓶中，每瓶装量40mL，8层纱布封口，包上牛皮纸。把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15min。取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，取4mL盐藻藻液接种在无菌培养液中，轻轻摇匀，8层纱布封口。在28℃的培养箱中每天光照12h，2500lx，黑暗12h。连续培养4d，获得同步化生长的盐藻，即从暗培养6h后到光照培养开始2h内，盐藻出现大量的细胞分裂。隔天定时取出藻液4mL。在分光光度计测藻液的OD₆₃₀数值，换算成藻液中盐藻细胞的密度，并进行记录。

超净工作台事先打开紫外灯杀菌20min。取处于指数生长期的盐藻藻液，倾注于无菌培养皿中，每皿10mL。置超净工作台中25w紫外灯下，距离17cm照射60s进行诱变，28℃暗培养52h。将暗培养后的藻液和新鲜培养液以1∶3的比例混匀，吸取300μL涂布到含琼脂1.5％的盐藻固体培养基上，低温7℃，光强2000lx，不间断光照培养。挑取生长迅速的单藻落分别接种到装有4mL盐藻培养基的试管中，20°斜放，在7℃以2000lx的光照强度不间断培养，以150rpm的速度摇床培养至藻液呈深绿色。取1.5mL上述长成的盐藻藻液移接到含200mL新鲜培养液的锥形瓶中，在7℃以4000lx的光照强度，150rpm的速度摇床培养。每3天取样3.0mL在分光光度计测OD₆₃₀数值，换算成藻液中耐低温盐藻突变株和野生型原出发株在低温培养时的细胞密度，描绘出各自的生长曲线。实验观察到，在7℃光照培养下，耐低温盐藻突变株藻液的细胞密度逐渐增大，经过60d培养，其藻液细胞密度可达6.01×10⁶个细胞/mL，是原始细胞密度的31.9倍，是野生型原出发株的2.11倍；野生型原出发株一直到第18d都没有明显增长，从第21d开始才缓慢进入指数生长期，而到第48d就已经达到生长平衡期，其最终藻液密度仅为2.84×10⁶个细胞/mL。分别提取耐低温盐藻和野生型原出发株的总DNA，经检测纯度合格后，以27个10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较研究。每个引物至少重复进行两次PCR反应，并将反应产物在含琼脂糖0.9％的凝胶上进行电泳。两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。实验发现，其中3个引物不产生任何条带，6个引物产生不清晰和无法检测的产物，18个能产生多态性条带。从中遴选条带清晰、重复性良好的14个引物进行正式扩增。实验共检测到121个位点，其中12个引物扩增出差异条带。

根据上述统计数字计算耐低温盐藻突变株与野生型原出发株间的遗传相似系数I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。经计算，耐低温盐藻突变株和野生型原出发株间的遗传相似系数I为0.831，符合变异株的特征。提取耐低温盐藻突变株和野生型原出发株的总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分离胶浓度为11％，浓缩胶浓度为5％。电泳结束后用考马斯亮蓝R₂₅₀染色，扫描记录结果。比较两者的蛋白电泳图谱可以看到，前者比后者多出3条新的蛋白带，同时发现在大约56kDa处前者表达的蛋白量比后者低得多。根据在低温环境(7℃)下基本能正常生长的新特征和RAPD研究及蛋白质分析结果，确认已经获得耐低温盐藻突变株。

Claims

1、耐低温盐藻突变株，其特征在于

1)在3～10℃不间断1000～4000lx光照培养下生长速度是对照的2.1～21倍，达到(1.05～8.11)×10⁶个细胞/mL；

2)盐藻耐低温突变株L-5与野生型原出发株之间的遗传相似系数I为0.680～0.910；

3)盐藻耐低温突变株L-5比野生型原出发株在36kDa和158kDa处分别多出一条新的蛋白带，同时在大约27kDa和29kDa处L-5表达的蛋白量比对照高得多。

2、如权利要求1所述的耐低温盐藻突变株的诱变、选育和鉴定方法，其特征在于其步骤为：

1)将盐藻的人工海水培养基分装封口、灭菌；

2)取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，接种盐藻；

3)分别经光照和黑暗的光周期诱导，盐藻出现同步化生长；

4)取出藻液，以碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活盐藻，取样计算藻液中盐藻细胞密度；

5)取处于指数生长期的盐藻藻液，倾注于培养皿中，置紫外灯下照射进行诱变，然后暗培养；

6)将暗培养后的藻液和新鲜培养液混匀，涂布到盐藻固体培养基上，低温光照培养；

8)取步骤7培养所得的盐藻和野生型原出发株移接到含新鲜培养液的容器中扩大培养；

10)提取各盐藻耐低温突变株和野生型原出发株的总DNA，并以10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA研究比较；

11)按比较后的统计数字计算盐藻耐低温突变株和野生型原出发株间的遗传相似系数；

12)提取盐藻耐低温突变株和野生型原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后用考马斯亮蓝R₂₅₀染色，扫描记录结果；

13)比较盐藻耐低温突变株和野生型原出发株两者的蛋白电泳图谱，找出盐藻耐低温突变株和野生型原出发株之间的共同点与不同之处；

14)根据在低温环境下生长速度比对照快2.1倍以上的新特征和随机扩增多态DNA研究及蛋白质分析结果，确认获得耐低温盐藻突变株。

3、如权利要求2所述的耐低温盐藻突变株的诱变、选育和鉴定方法，其特征在于在步骤1)中，配制培养盐藻的人工海水培养液的组成如表1：

表1 盐藻培养液组成成分浓度成分浓度 KNO₃NaNO₃K₂HPO₄·3H₂OTris·HClpH7.4CaCl₂·2H₂OMgSO₄·7H₂OMgCl₂·6H₂OH₃BO₃ 1mmol/L4mmol/L0.1mmol/L10mmol/L10mmol/L24mmol/L20mmol/L0.185mmol/L FeCl₃·6H₂OMnCl₂·4H₂OZnCl₂CoCl₂CuCl₂·2H₂OEDTA·Na₂NaClpH 1.5μmol/L7.0μmol/L0.8μmol/L0.02μmol/L0.2μmol/L30μmol/L1.5mol/L7.4

将人工海水培养液分装在100～250mL的锥形瓶中，每瓶装量20～50mL，棉花塞塞紧或用8层纱布封口，包上牛皮纸，把包装好的培养液放置在高压蒸汽灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15～20min。

4、如权利要求2所述的耐低温盐藻突变株的诱变、选育和鉴定方法，其特征在于在步骤3)中，所述的光周期诱导是在25～30℃的培养箱中每天以2000～4000烛光，光照12h，黑暗12h，连续培养2～5d；可以是静止培养，每天手摇数次，每次10～20s，或在可控光照的摇床上以30～150rpm的速度摇动，获得同步化生长的盐藻。

5、如权利要求2所述的耐低温盐藻突变株的诱变、选育和鉴定方法，其特征在于在步骤4)中，所述的以碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活盐藻，取样计算藻液中盐藻细胞的密度是指每天或隔天取出0.3～0.5mL藻液，以等量的碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活盐藻，立即取样在血球计数板上计算藻液中盐藻细胞的密度；所述的计算藻液中盐藻细胞的密度可重复计数3次，取平均值，绘制盐藻的生长曲线；所述的碘液为碘1g，碘化钾2g，蒸馏水100mL。先用少量蒸馏水溶解碘和碘化钾，待完全溶解后再定容到100mL；所述的溴酚蓝溶液为0.25％的溴酚蓝溶解在40％的蔗糖溶液中；盐藻细胞密度的计算也可以用光密度法，即取出藻液注入比色杯中，在OD₆₃₀处读取数值，依据公式“细胞密度＝899.08OD₆₃₀-12.544”换算成藻液细胞密度；以盐藻培养时间为横轴，以培养基中的藻细胞密度为纵轴，绘制盐藻的生长曲线。

6、如权利要求2所述的耐低温盐藻突变株的诱变、选育和鉴定方法，其特征在于在步骤5)中，取处于指数生长期的盐藻藻液倾注于无菌培养皿中，置超净工作台中紫外灯下照射进行诱变，所用超净工作台事先擦净并以紫外线杀菌15～20min；每个无菌培养皿中盛5～30mL藻液；超净工作台中的紫外灯为20～30w，紫外灯与培养皿的距离为12～18cm，紫外线照射时间为50～100s；照射后关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸或布包好培养皿进行暗培养；暗培养的温度为20～30℃，时间为48～72h。

7、如权利要求2所述的耐低温盐藻突变株的诱变、选育和鉴定方法，其特征在于在在步骤6)中，所述的藻液和新鲜培养基按质量比为1∶1～10，混匀后吸取50～500μL均匀地涂布到盐藻琼脂培养基上，盖好培养皿，以封口膜密封上下皿盖间的缝隙，防止培养基水分逃逸，培养皿要倒扣培养防止水珠产生；所述的盐藻琼脂培养基指的是在盐藻人工海水培养液中添加1.0％～2.0％的琼脂；在低温3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照培养。

8、如权利要求2所述的耐低温盐藻突变株的诱变、选育和鉴定方法，其特征在于在步骤7)中，所述的单藻落是指由单个盐藻细胞长成的细胞集落；所述的生长迅速的单藻落是指在同等条件下长得比较大的藻落；以无菌接种环挑取较大藻落的藻细胞分别接种到含3～8mL盐藻培养液的试管中，在低温3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照的光照培养箱中扩大培养；所述的盐藻培养液的试管应斜放成15～45°，每天手工摇动数次，每次10～20s，或在光照摇床上以30～150rpm的速度摇动。

9、如权利要求2所述的耐低温盐藻突变株的诱变、选育和鉴定方法，其特征在于在在步骤8)中，所述的扩大培养可在无菌超净工作台中取各诱变藻液和对照藻液0.5～2.0mL，加入到装有50～200mL盐藻培养液的锥形瓶中，塞上棉花塞或封好纱布，其标准就是使各藻液的起始细胞密度尽可能一致或十分接近；放在3～10℃、1000～4000lx、24h光照的光照培养箱中，每天手工摇动数次，每次10～20s；或在光照摇床上以30～150rpm的速度摇动。

10、如权利要求2所述的耐低温盐藻突变株的诱变、选育和鉴定方法，其特征在于在步骤10)中，所述的提取各盐藻耐低温突变株和野生型原出发株的总DNA是按常规方法提取植物总DNA，在紫外分光光度计上检测该DNA的OD₂₆₀与OD₂₈₀的比值；若该比值小于1.8，则说明DNA的纯度不够，应进一步提纯；若该比值大于或等于1.8，则可以进行后述实验，所述的10聚核苷酸随机引物是计算机随机设计的、由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA；所述的随机引物对总DNA进行随机多态性扩增是以各藻的总DNA为模板，分别以单链10聚核苷酸为引物进行的PCR扩增反应；反应产物经琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖含量0.8％～1.2％，在凝胶成像系统扫描和记录，所选取的引物至少要达到25～30个，每个引物至少重复进行两次PCR反应，两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果；从这些扩增结果中遴选条带清晰、重复性良好的引物进行正式扩增。