CN113295665A - 一种加压装置及基于加压装置的蓝藻藻液预处理方法和蓝藻活细胞快速荧光染色计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种加压装置及基于加压装置的蓝藻藻液预处理方法和蓝藻活细胞快速荧光染色计数方法，属于水环境检测技术领域。本发明的加压装置能够用于对蓝藻样本进行加压处理，具有气囊结构的蓝藻经加压处理后，死亡但裂解不充分的蓝藻气囊被破坏，不影响活性藻体的细胞膜完整性，从而对活性蓝藻染色计数结果无干扰，气囊中的气体溶解到细胞液中，并向细胞壁外扩散，细胞外水分子和荧光染料更多的进入细胞内，导致藻细胞密度增大而下沉，藻体与荧光染料接触更充分，染色更快，染色效果更好，荧光显微镜观察时染色结果更典型，便于计数和判读，能够提高检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及水环境检测技术领域，尤其涉及一种加压装置及基于加压装置的蓝藻藻液预处理方法和蓝藻活细胞快速荧光染色计数方法。
背景技术
蓝藻水华爆发后会分泌大量藻毒素危害水环境和人类健康，准确监测活性蓝藻数量对预警水华现象的发生具有重要作用。
监测活性蓝藻数量的常用方法为荧光染色显微计数法，即利用荧光染料分别对蓝藻总细胞和蓝藻死亡细胞进行染色，再于荧光显微镜下使用血球计数板进行观察计数，计算出蓝藻活细胞的数量。但是蓝藻死亡细胞的细胞膜完整性较好和气囊完好性较多时，容易出现死亡细胞染色不均匀或染不上色的情况，进而会导致镜检时死亡细胞荧光强度较弱或无荧光，降低检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种加压装置及基于加压装置的蓝藻藻液预处理方法和蓝藻活细胞快速荧光染色计数方法，本发明的加压装置能够对具有气囊结构的蓝藻进行加压处理，加压处理后的蓝藻藻液进行蓝藻活细胞荧光染色计数，检测准确度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种加压装置，包括原水罐1、空气加压组件2和压力作用组件3；
所述原水罐1和空气加压组件2分别通过第一管道和第二管道与压力作用组件3的顶部连通；
所述第一管道上设置有进水阀1-1；所述第二管道上设置有进气阀2-1。
优选的，所述压力作用组件3的侧壁或底部开设有取液口。
优选的，所述压力作用组件3为压力套管，所述压力作用组件3的取液口设置于底部，所述加压装置还包括通过第三管道与所述取液口连通的收集罐4；所述第三管道上设置有排水阀3-1。
优选的，所述压力作用组件3为有机玻璃柱，所述压力作用组件3的取液口设置于侧壁，所述压力作用组件3的侧壁从下到上依次设置有第一取样口、第二取样口和第三取样口。
优选的，所述第一取样口和第二取样口的间距为80～120mm；所述第二取样口和第三取样口的间距为80～120mm。
本发明提供了一种基于上述方案所述加压装置的蓝藻藻液预处理方法，包括以下步骤：
1)在压力作用组件3中加入待测蓝藻水样至待测蓝藻水样的水位达到压力作用组件3总高度的2/5～4/5；
2)将空气加压组件2的运行压力设定为0.5～0.7MPa，向压力作用组件 3中通入压缩空气2～3min。
本发明还提供了一种蓝藻活细胞快速荧光染色计数方法，包括以下步骤：
S1.按照上述方案所述蓝藻藻液预处理方法对待测蓝藻藻液进行预处理；
取预处理后的样品进行离心，对所述离心得到的沉淀进行清洗后重悬，得到第一重悬液，将所述第一重悬液和碘化丙啶溶液混合进行第一染色，对第一染色后的反应物进行离心，清洗沉淀，再离心，重悬沉淀，得到第一染色液；
S2.取预处理后的样品和鲁哥试剂混合，于黑暗条件下放置40～60h，得到混合液；所述混合液进行离心、对离心得到的沉淀进行清洗和重悬后，得到第二重悬液，将所述第二重悬液和碘化丙啶溶液混合，进行第二染色，对第二染色后的反应物进行离心，清洗沉淀，再离心，重悬沉淀，得到第二染色液；
S3.使用荧光显微镜红色滤光片分别对第一染色液和第二染色液进行藻细胞观察计数；
对所述第一染色液中发出红色荧光的细胞进行计数，得到水样蓝藻死亡细胞数；
对所述第二染色液中发出红色荧光的细胞进行计数，得到水样蓝藻总细胞数；
水样蓝藻活细胞数为水样蓝藻总细胞数减去水样蓝藻死亡细胞数；
步骤S1和S2之间没有时间顺序限制；
步骤S1和S2中所述碘化丙啶溶液以磷酸盐缓冲液为溶剂；所述碘化丙啶溶液中碘化丙啶的质量浓度独立为300～500μg/mL。
优选的，步骤S2中所述荧光显微镜的物镜放大倍数为20x。
优选的，所述第一染色和第二染色的时间独立为1～2min。
优选的，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.0；所述磷酸盐缓冲液包括质量浓度为1.7～1.8g/100mL的Na2HPO4和质量浓度为0.9～1g/100mL的 NaH2PO4。
本发明提供了一种加压装置。本发明的加压装置能够用于对蓝藻样本进行加压处理，具有气囊结构的蓝藻经加压处理后，死亡但裂解不充分的蓝藻气囊被破坏，但不影响活性藻体的细胞膜完整性，从而对活性蓝藻染色计数结果无干扰，气囊中的气体溶解到细胞液中，并向细胞壁外扩散，细胞外水分子和荧光染料更多的进入细胞内，导致藻细胞密度增大而下沉，藻体与荧光染料接触更充分，染色更快；气囊在藻体中分布较多且均匀，气囊破裂，气体流出，在对蓝藻藻液进行荧光染色计数时，更多的荧光染料随水分子快速进入藻体细胞占据气囊破裂前所用空间，荧光染料颜色沉积加深，染色效果更好，解决了死亡藻体细胞膜裂解不充分、荧光染料进入有限、染色效果差的问题，荧光显微镜观察时染色结果更典型，便于计数和判读，能够提高检测结果的准确性。
附图说明
图1为实施例1中加压装置的结构示意图；其中，1为原水罐、2为空气加压组件、3为压力作用组件、4为收集罐、1-1为进水阀、2-1为进气阀、 3-1为排水阀、5为排气阀；
图2为实施例2中加压装置的结构示意图；其中，1为原水罐、2为空气加压组件、3为压力作用组件、1-1为进水阀、2-1为进气阀、31为第一取样口、32为第二取样口、33为第三取样口、5为排气阀。
具体实施方式
本发明提供了一种加压装置，包括原水罐1、空气加压组件2和压力作用组件3；
所述原水罐1和空气加压组件2分别通过第一管道和第二管道与压力作用组件3的顶部连通；
所述第一管道上设置有进水阀1-1；所述第二管道上设置有进气阀2-1。
在本发明中，所述压力作用组件3的侧壁或底部优选的开设有取液口。
在本发明中，所述第一管道和第二管道优选的通过同一主管道与压力作用组件3的顶部连接，原水罐1的原水进水管和空气加压组件2的进气管共用一条管道，通过进气阀和进水阀控制开闭，减少开口数量，增加气密性，降低开口多漏气引起的压力消耗。
在本发明中，所述空气加压组件2优选的包括空压机；在本发明中，所述压力作用组件中工作压力优选为0～1.0MPa。
在本发明中，所述压力作用组件3的高度为500～600nm。
在本发明中，所述压力作用组件3优选为压力套管，所述压力作用组件 3的取液口设置于底部，所述加压装置还包括通过第三管道与所述取液口连通的收集罐4；所述第三管道上设置有排水阀3-1。在本发明中，所述加压装置的结构示意图参见图1。其中，1为原水罐、2为空气加压组件、3为压力作用组件、4为收集罐、1-1为进水阀、2-1为进气阀、3-1为排水阀、5 为排气阀。在本发明中，所述压力作用组件3的形状包括圆柱状；所述压力作用组件3的直径为80～120mm，更优选为100mm。在本发明中，收集罐 4收集藻液使用的出水管道优选为1条。在本发明中，收集罐4中的藻体是加压处理后的总藻体，混合均匀后进行取样鉴定，代表性强，能够提高检测结果的准确性。在本发明中，所述压力作用组件3的上下封闭可调节，空气加压组件2的进气管、原水罐1的进水管与压力作用组件3顶部连接，通过进水阀1-1和进气阀2-1控制原水和空气进入，收集罐4的出水管与压力作用组件底部连接，通过排水阀3-1控制加压后藻体的收集。
在本发明中，所述压力作用组件3优选为有机玻璃柱，所述压力作用组件3的取液口设置于侧壁，所述压力作用组件3的侧壁从下到上依次设置有第一取样口、第二取样口和第三取样口。在本发明中，所述第一取样口和第二取样口的间距优选为80～120mm，更优选为100mm；所述第二取样口和第三取样口的间距优选为80～120mm，更优选为100mm。在本发明中，所述加压装置的结构示意图参见图2。其中，1为原水罐、2为空气加压组件、 3为压力作用组件、1-1为进水阀、2-1为进气阀、31为第一取样口、32为第二取样口、33为第三取样口、5为排气阀；所述第一取样口距离所述压力作用组件3底部的高度优选为150mm；所述第三取样口距离所述压力作用组件3顶部的高度优选为150mm。压力作用组件3开孔少，密封性增强，加压效果更好。
在本发明中，所述压力作用组件3的顶部优选的设置有排气管道，通过排气阀5控制排气。压力作用组件3内加压后，先通过排气阀5排气降压，再进行取样，避免压力过大造成加压后的藻体从取样口喷出，由于撞击力过大，造成藻体破裂，影响藻体活性，导致染色计数结果不准确。
本发明所述加压装置使用过程中，所述原水罐1的垂直高度优选的高于所述压力作用组件3，所述压力作用组件3的垂直高度优选的高于所述收集罐4；利用重力的作用将原水罐1中的原水流入压力作用组件3内，将加压后的藻液从压力作用组件3流入收集罐4中，能够避免使用动力泵泵入和泵出所需的能量消耗，更节能。
本发明还提供了一种基于上述方案所述加压装置的蓝藻藻液预处理方法，包括以下步骤：
1)在压力作用组件3中加入待测蓝藻水样至待测蓝藻水样的水位达到压力作用组件3总高度的2/5～4/5；
2)将空气加压组件2的运行压力设定为0.5～0.7MPa，向压力作用组件 3中通入压缩空气2～3min。
本发明首先在压力作用组件3中加入待测蓝藻水样至待测蓝藻水样的水位达到压力作用组件3总高度的2/5～4/5。
在本发明具体实施过程中，将待测蓝藻水样加入原水罐1，打开进水阀1-1，待压力作用组件3中的水位达到压力作用组件3总高度的2/5～4/5范围内关闭进水阀1-1。在本发明具体实施过程中，所述压力作用组件3中的水位达到200～400mm时关闭进水阀1-1。
在压力作用组件3中加入待测蓝藻水样后，将空气加压组件2的运行压力设定为0.5～0.7MPa，向压力作用组件3中通入压缩空气2～3min，保障细胞内气囊充分破裂并且气体渗透出细胞壁，但对细胞膜的完整性无影响，然后关闭进气阀2-1和空气加压组件2。
预处理后，关闭进气阀2-1和空气加压组件2后，打开排气阀5，待压力套管压力与外界压力一致时，关闭排气阀5，通过压力作用组件3的取样口获取预处理后的蓝藻藻液。
本发明还提供了一种蓝藻活细胞快速荧光染色计数方法，包括以下步骤：
S1.按照上述方案所述蓝藻藻液预处理方法对待测蓝藻藻液进行预处理；
取预处理后的样品进行离心，对所述离心得到的沉淀进行清洗后重悬，得到第一重悬液，将所述第一重悬液和碘化丙啶溶液混合进行第一染色，对第一染色后的反应物进行离心，清洗沉淀，再离心，重悬沉淀，得到第一染色液；
S2.取预处理后的样品和鲁哥试剂混合，于黑暗条件下放置40～60h，得到混合液；所述混合液进行离心、对离心得到的沉淀进行清洗和重悬后，得到第二重悬液，将所述第二重悬液和碘化丙啶溶液混合，进行第二染色，对第二染色后的反应物进行离心，清洗沉淀，再离心，重悬沉淀，得到第二染色液；
S3.使用荧光显微镜红色滤光片分别对第一染色液和第二染色液进行藻细胞观察计数；
对所述第一染色液中发出红色荧光的细胞进行计数，得到水样蓝藻死亡细胞数；
对所述第二染色液中发出红色荧光的细胞进行计数，得到水样蓝藻总细胞数；
水样蓝藻活细胞数为水样蓝藻总细胞数减去水样蓝藻死亡细胞数；
步骤S1和S2之间没有时间顺序限制；
步骤S1和S2中所述碘化丙啶溶液以磷酸盐缓冲液为溶剂；所述碘化丙啶溶液中碘化丙啶的质量浓度独立为300～500μg/mL，优选为400μg/mL。
本发明首先按照上述方案所述蓝藻藻液预处理方法对待测蓝藻藻液进行预处理；取预处理后的样品进行离心，对所述离心得到的沉淀进行清洗后重悬，得到第一重悬液，将所述第一重悬液和碘化丙啶溶液混合进行第一染色，对第一染色后的反应物进行离心，清洗沉淀，再离心，重悬沉淀，得到第一染色液。
在本发明中，所述离心的转速优选为3000～4000rpm；所述离心的时间优选为2～3min；所述清洗采用的试剂优选为磷酸盐缓冲液；在本发明中，所述清洗的次数优选为1～2次。在本发明中，所述重悬采用的试剂优选为磷酸盐缓冲液；
在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.0；所述磷酸盐缓冲液优选的包括质量浓度为1.7～1.8g/100mL的Na2HPO4和质量浓度为0.9～1 g/100mL的NaH2PO4。在本发明具体实施过程中，所述磷酸盐缓冲液(pH 7.0， 0.2M)配制的步骤为：甲液：Na2HPO429.3 g，乙液：NaH2PO424.35 g，各加水至1L；取甲液61mL，乙液39mL，配制得到100mL磷酸盐缓冲液。
在本发明中，未经加压的蓝藻(压力0MPa)，染色时间是7～10min，加压后的蓝藻染色1～2min即可，未经加压的蓝藻染色时间长，背景深干扰多，需用磷酸盐缓冲液多次清洗(3～4次)，操作繁琐，加压后的蓝藻染色时间短(1～2min)，背景浅干扰少，染色效率提升的同时无需多次清洗(1～2 次)，简化操作过程，方便结果的观察和判读。
本发明对所述第一重悬液和碘化丙啶溶液的比例没有特殊限制，采用本领域常规设置的比例即可。
在本发明中，所述第一染色的时间为1～2min；所述第一染色的温度优选为20～30℃，进一步优选为25℃。
在本发明中，所述清洗沉淀采用的试剂优选为磷酸盐缓冲液；所述清洗沉淀的次数优选为1～2次。
本发明取预处理后的样品和鲁哥试剂混合，于黑暗条件下放置40～60h，得到混合液；所述混合液进行离心、对离心得到的沉淀进行清洗和重悬后，得到第二重悬液，将所述第二重悬液和碘化丙啶溶液混合，进行第二染色，对第二染色后的反应物进行离心，清洗沉淀，再离心，重悬沉淀，得到第二染色液。
在本发明中，所述蓝藻藻液和鲁哥试剂的体积比优选为(8～12)：1，进一步优选为10：1；在本发明中，所述放置的时间优选为48h，使细胞固定并且细胞壁破裂，但细胞个体没有破碎分解；在本发明中，所述离心的转速优选为3000～4000rpm；所述离心的时间优选为2～3min；所述清洗采用的试剂优选为磷酸盐缓冲液；所述清洗的次数优选为2～3次，所述清洗的作用是去除鲁哥试剂；所述重悬采用的试剂优选为磷酸盐缓冲液。
本发明对所述第二重悬液和碘化丙啶溶液的比例没有特殊限制，采用本领域常规设置的比例即可。
在本发明中，所述第二染色的时间为1～2min；所述第二染色的温度优选为20～30℃，进一步优选为25℃。
在本发明中，所述清洗沉淀采用的试剂优选为磷酸盐缓冲液；所述清洗沉淀的次数优选为1～2次。
在本发明中，单一的荧光染料比双荧光法节约成本，操作简便。
得到第一染色液和第二染色液后，本发明使用荧光显微镜红色滤光片分别对第一染色液和第二染色液进行藻细胞观察计数；活细胞在荧光显微镜下不发出红色荧光；死细胞在荧光显微镜红色滤光片下发出红色荧光。
对第一染色液中发出红色荧光的细胞进行计数，得到水样蓝藻死亡细胞数，单位为cells/mL；
对所述第二染色液中发出红色荧光的细胞进行计数，得到水样蓝藻总细胞数B，单位为cells/mL；
水样蓝藻活细胞数C＝B-A。
本发明具体实施过程中，从血球计数板25个中格中选取5个区域进行计数，水样A中的藻细胞计数结果记为A1、A2、A3、A4、A5，水样蓝藻死亡细胞数A(cells/mL)＝(A1+A2+A3+A4+A5)/5*400*104*稀释倍数，水样B中的藻细胞计数结果记为B1、B2、B3、B4、B5，水样蓝藻总细胞数 B(cells/mL)＝(B1+B2+B3+B4+B5)/5*400*104*稀释倍数，水样蓝藻活细胞数 C(cells/mL)＝B-A。
在本发明中，所述荧光显微镜的物镜放大倍数优选为20x。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.蓝藻细胞的加压与收集
1.1加压装置如图1所示。
压力套管3的直径为100mm、高度为500mm，上下封闭可调节，空压机进气管、原水罐进水管与压力套管3的顶部连接，通过进水阀和进气阀控制原水和空气进入，水样收集罐出水管与压力套管3底部连接，通过排水阀控制加压后藻体的收集。设计压力套管3中工作压力为0～1.0MPa，压力套管3 中的水柱高度为300mm。
1.2蓝藻细胞加压处理与收集
将待测蓝藻水样1000mL加入原水罐，充分搅拌均匀，打开进水阀，待压力套管3中的水位在300mm范围内关闭进水阀；将空压机运行压力设定为 (0、0.2、0.7、1.0)MPa，打开进气阀和空压机，向压力套管3中通入压缩空气2min，保障细胞内气囊充分破裂并且气体渗透出细胞壁，但对细胞膜的完整性无影响，然后关闭空压机和进气阀；打开排气阀，待压力套管压力与外界压力一致时，关闭排气阀，打开排水阀，待空气套管中的藻液全部流入收集罐后关闭排水阀；摇晃均匀藻液，取20mL藻液用于荧光染色计数。
2.蓝藻的染色与计数
2.1蓝藻死细胞和总细胞染色
2.1.1取1.2中10mL水样，记为水样A，经3000rpm离心2min，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2M)清洗2次，用5mL磷酸盐缓冲液清洗重悬藻细胞，取重悬后的藻液1.7mL加入0.3mL碘化丙啶(400μg/mL)溶液，在室温下染色1～2min(未经加压处理染色需7～10min)，用磷酸盐缓冲液清洗1～2次(未经加压处理清洗需3～4次)。
2.1.2取1.2中10mL藻液，记为水样B，加入1mL鲁哥试剂，在黑暗中放置48h，使细胞固定并且细胞壁破裂，但细胞个体没有破碎分解。3000rpm 离心2min，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2M)清洗2～3次去除鲁哥试剂，用 5mL磷酸盐缓冲液清洗重悬藻细胞，取重悬后的藻液1.7mL加入0.3mL碘化丙啶(400μg/mL)溶液，在室温下染色1～2min(压力0MPa染色7～10min)，用磷酸盐缓冲液清洗1～2次(压力0MPa清洗3～4次)。
2.2蓝藻死细胞和总细胞计数
用20μL移液枪分别吸取2.1.1和2.1.2中处理后的藻液加入血球计数板中央，盖玻片沿液滴边缘缓慢盖上，防止气泡产生；将血球计数板置于载物台中间，先在低倍镜下找到计数室位置，再使用荧光显微镜红色滤光片于20x 物镜下进行观察计数。活细胞细胞膜完好，碘化丙啶不能进入细胞，在荧光显微镜下不发出红色荧光；死细胞细胞膜缺损、气囊破裂，碘化丙啶与细胞内的DNA和RNA相互作用生成红色荧光物质，在荧光显微镜红色滤光片下发出红色荧光。从血球计数板25个中格中选取5个区域进行计数，水样A中的藻细胞计数结果记为A1、A2、A3、A4、A5，水样蓝藻死亡细胞数A(cells/mL) ＝(A1+A2+A3+A4+A5)/5*400*104*稀释倍数，水样B中的藻细胞计数结果记为B1、B2、B3、B4、B5，水样蓝藻总细胞数 B(cells/mL)＝(B1+B2+B3+B4+B5)/5*400*104*稀释倍数，水样蓝藻活细胞数 C(cells/mL)＝B-A。
计数结果
表1不加压(0MPa)染色计数结果
表2加压0.2MPa染色计数结果
表3加压0.7MPa染色计数结果
表4加压1.0MPa染色计数结果
表1是不加压(0MPa)染色计数结果，表2是加压0.2MPa染色计数结果，表3是加压0.7MPa染色计数结果，表4是加压1.0MPa染色计数结果。未加压直接进行染色是目前大多数文献中报道的藻类死亡鉴定染色方法，表1中未经加压直接进行染色，蓝藻活细胞数6.29*107cells/mL；表2中加压0.2MPa，蓝藻活细胞数6.27*107cells/mL；表3中加压0.7MPa，蓝藻活细胞数5.79*107 cells/mL；表4中加压1.0MPa，蓝藻活细胞数1.49*107cells/mL；蓝藻气囊能够承受的压力范围是0.5～0.7MPa，在该压力下气囊破裂，气体流出，水分子和荧光染料进入，藻体密度增大而下沉，为荧光染料与DNA和RNA提供更为充分的接触面积，气囊消失气体流出，荧光染料染色分布更均匀，染色效率更高；超过0.7MPa的压力，气囊破裂的同时对细胞壁的完整性有影响，原先的活细胞会失去活性变成死细胞，细胞壁破裂，荧光染料进入，导致检测结果错误；因此，适当的加压可保证死亡细胞气囊完全破裂碘化丙啶充分进入细胞但不会破坏存活的细胞，从而使荧光染料染色更均匀充分，方便镜检，提高检测结果的准确性。与未经加压的方法相比，加压0.2MPa达不到气囊破裂的压力范围(0.5～0.7MPa)，蓝藻活细胞数6.27*107cells/mL(表2)与未经加压蓝藻活细胞数6.29*107cells/mL(表1)结果相近。0.7MPa的压力，蓝藻活细胞数5.79*107cells/mL(表3)低于未经加压的蓝藻活细胞数6.29*107 cells/mL(表1)，说明加压0.7MPa有助于死亡细胞的染色，死细胞计数量升高0.5*107cells/mL，结果更为准确。1.0MPa的压力，蓝藻活细胞数1.49*107 cells/mL(表4)远低于未经加压的蓝藻活细胞数6.29*107cells/mL(表1)和 0.7MPa的蓝藻活细胞数5.79*107cells/mL(表3)，1.0MPa的压力超过气囊破裂的压力范围(0.5～0.7MPa)，气囊破裂的同时活性细胞的细胞壁也被破坏而死亡，压力过大，结果不准确。以上说明，在0.5～0.7MPa范围内对具有气囊结构的蓝藻进行加压，可以使死亡但气囊破裂不完整的蓝藻气囊破裂，荧光染料进入更快、更充分，染色效率更高，镜检结果更准确。
实施例2
1.蓝藻细胞的加压与收集
1.1加压装置如图2所示。
有机玻璃柱的直径为100mm、高度为500mm，上端封闭可调节，空压机进气管、原水罐进水管与有机玻璃柱的顶部连接，通过进水阀和进气阀控制原水和空气进入，在柱高150mm、250mm、350mm处设有三个取样口(第一取样口、第二取样口和第三取样口)，收集加压后的藻体。设计有机玻璃柱中工作压力为0～1.0MPa，有机玻璃柱中的水柱高度为400mm。
1.2蓝藻细胞加压处理与收集
将待测蓝藻水样1500mL加入原水罐，充分搅拌均匀，打开进水阀，待有机玻璃柱中的水位在400mm时关闭进水阀；将空压机运行压力设定为0.7 MPa，打开进气阀和空压机，向有机玻璃柱中通入压缩空气2min，保障细胞内气囊充分破裂并且气体渗透出细胞壁，但对细胞膜的完整性无影响，然后关闭空压机和进气阀，打开排气阀，待压力套管压力与外界压力一致时，关闭排气阀；将有机玻璃柱中藻液摇晃均匀，从第一取样口、第二取样口和第三取样口三个取样口各取10mL藻液混合均匀后用于荧光染色计数。
2.蓝藻的染色与计数
2.1蓝藻死细胞和总细胞染色
2.1.1取1.2中10mL水样，记为水样A，经3000rpm离心2min，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2M)清洗2次，用5mL磷酸盐缓冲液清洗重悬藻细胞，取重悬后的藻液1.7mL加入0.3mL碘化丙啶(400μg/mL)溶液，在室温下染色1～2min，用磷酸盐缓冲液清洗1～2次。
2.1.2取1.2中10mL藻液，记为水样B，加入1mL鲁哥试剂，在黑暗中放置48h，使细胞固定并且细胞壁破裂，但细胞个体没有破碎分解。3000rpm 离心2min，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2M)清洗2～3次去除鲁哥试剂，用 5mL磷酸盐缓冲液清洗重悬藻细胞，取重悬后的藻液1.7mL加入0.3mL碘化丙啶(400μg/mL)溶液，在室温下染色1～2min，用磷酸盐缓冲液清洗1～2 次。
磷酸盐缓冲液(pH 7.0，0.2M)配制：1)甲液：Na2HPO4:29.3g，乙液： NaH2PO4:24.35g，各加水至1L；2)取甲液61mL，乙液39mL配制100mL 磷酸盐缓冲液。
碘化丙啶溶液配制：称取1.2mg碘化丙啶加入3mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0，0.2M)，配制成400μg/mL的碘化丙啶溶液。
2.2蓝藻死细胞和总细胞计数
用20μL移液枪分别吸取2.1.1和2.1.2中处理后的藻液加入血球计数板中央，盖玻片沿液滴边缘缓慢盖上，防止气泡产生；将血球计数板置于载物台中间，先在低倍镜下找到计数室位置，再使用荧光显微镜红色滤光片于20x 物镜下进行观察计数。活细胞细胞膜完好，碘化丙啶不能进入细胞，在荧光显微镜下不发出红色荧光；死细胞细胞膜缺损、气囊破裂，碘化丙啶与细胞内的DNA和RNA相互作用生成红色荧光物质，在荧光显微镜红色滤光片下发出红色荧光。从血球计数板25个中格中选取5个区域进行计数，水样A中的藻细胞计数结果记为A1、A2、A3、A4、A5，水样蓝藻死亡细胞数A(cells/mL) ＝(A1+A2+A3+A4+A5)/5*400*104*稀释倍数，水样B中的藻细胞计数结果记为B1、B2、B3、B4、B5，水样蓝藻总细胞数 B(cells/mL)＝(B1+B2+B3+B4+B5)/5*400*104*稀释倍数，水样蓝藻活细胞数 C(cells/mL)＝B-A。
2.3计数结果
表5加压0.7MPa染色计数结果
表5是改变了加压装置后0.7MPa的压力下蓝藻染色计数结果。图2的加压装置与图1的加压装置相比，图2使用的是有机玻璃柱，使用高度间隔 100mm的三个取样口进行藻类加压后的收集，三个取样口收集的藻液混合均匀后进行染色计数，结果见表5；图1使用的是压力套管，压力套管底部与收集罐连接，收集后的藻类摇晃均匀后进行染色计数，0.7MPa压力下的结果见表3；表5中的蓝藻活细胞数5.84*107cells/mL与表3中的蓝藻活细胞数5.79*107cells/mL近似，说明加压装置的取样方式和压力装置的材质构造对染色计数结果没有影响，压力装置的加压大小与染色计数结果的准确性密切相关，因此，本发明对具有气囊结构的蓝藻进行加压处理再进行染色计数，可通过提高染色效率，改善染色结果，提升检测结果的准确性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种加压装置，包括原水罐(1)、空气加压组件(2)和压力作用组件(3)；
所述原水罐(1)和空气加压组件(2)分别通过第一管道和第二管道与压力作用组件(3)的顶部连通；
所述第一管道上设置有进水阀(1-1)；所述第二管道上设置有进气阀(2-1)。
2.根据权利要求1所述的加压装置，其特征在于，所述压力作用组件(3)的侧壁或底部开设有取液口。
3.根据权利要求2所述的加压装置，其特征在于，所述压力作用组件(3)为压力套管，所述压力作用组件(3)的取液口设置于底部，所述加压装置还包括通过第三管道与所述取液口连通的收集罐(4)；所述第三管道上设置有排水阀(3-1)。
4.根据权利要求3所述的加压装置，其特征在于，所述压力作用组件(3)为有机玻璃柱，所述压力作用组件(3)的取液口设置于侧壁，所述压力作用组件(3)的侧壁从下到上依次设置有第一取样口、第二取样口和第三取样口。
5.根据权利要求4所述的加压装置，其特征在于，所述第一取样口和第二取样口的间距为80～120mm；所述第二取样口和第三取样口的间距为80～120mm。
6.一种基于权利要求1～5任意一项所述加压装置的蓝藻藻液预处理方法，包括以下步骤：
1)在压力作用组件(3)中加入待测蓝藻水样至待测蓝藻水样的水位达到压力作用组件(3)总高度的2/5～4/5；
2)将空气加压组件(2)的运行压力设定为0.5～0.7MPa，向压力作用组件(3)中通入压缩空气2～3min。
7.一种蓝藻活细胞快速荧光染色计数方法，包括以下步骤：
S1.按照权利要求6所述蓝藻藻液预处理方法对待测蓝藻藻液进行预处理；
取预处理后的样品进行离心，对所述离心得到的沉淀进行清洗后重悬，得到第一重悬液，将所述第一重悬液和碘化丙啶溶液混合进行第一染色，对第一染色后的反应物进行离心，清洗沉淀，再离心，重悬沉淀，得到第一染色液；
S2.取预处理后的样品和鲁哥试剂混合，于黑暗条件下放置40～60h，得到混合液；所述混合液进行离心、对离心得到的沉淀进行清洗和重悬后，得到第二重悬液，将所述第二重悬液和碘化丙啶溶液混合，进行第二染色，对第二染色后的反应物进行离心，清洗沉淀，再离心，重悬沉淀，得到第二染色液；
S3.使用荧光显微镜红色滤光片分别对第一染色液和第二染色液进行藻细胞观察计数；
对所述第一染色液中发出红色荧光的细胞进行计数，得到水样蓝藻死亡细胞数；
对所述第二染色液中发出红色荧光的细胞进行计数，得到水样蓝藻总细胞数；
水样蓝藻活细胞数为水样蓝藻总细胞数减去水样蓝藻死亡细胞数；
步骤S1和S2之间没有时间顺序限制；
步骤S1和S2中所述碘化丙啶溶液以磷酸盐缓冲液为溶剂；所述碘化丙啶溶液中碘化丙啶的质量浓度独立为300～500μg/mL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述荧光显微镜的物镜放大倍数为20x。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一染色和第二染色的时间独立为1～2min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.0；所述磷酸盐缓冲液包括质量浓度为1.7～1.8g/100mL的Na2HPO4和质量浓度为0.9～1g/100mL的NaH2PO4。
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