CN101586080B - 杜氏藻耐高温高光突变株及其诱变选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)UTEX LB 999的耐高温高光的突变株，以及所述突变株的诱变选育方法。具体而言，本发明提供两种杜氏藻耐高温高光突变株，一种是耐受42℃高温和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-2CGMCC No.2982，另一种是耐受45℃高温和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-4CGMCC No.2983。

Description

杜氏藻耐高温高光突变株及其诱变选育方法
技术领域
本发明涉及杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)UTEX LB 999的耐高温高光的突变株，以及所述突变株的诱变选育方法。具体而言，本发明涉及两种杜氏藻耐高温高光突变株，一种是耐受42℃高温和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-2(CGMCC No.2982)，另一种是耐受45℃高温和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-4(CGMCC No.2983)。
背景技术
杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)隶属于绿藻门(Chlorophyta)、真绿藻纲(Chlorophyceae)、衣藻目(Chlamydomonadales)、杜氏藻科(Dunaliellaceae)，具有单细胞、无细胞壁、基因组小等特点。杜氏藻天然没有细胞壁，是迄今为止发现的少数极端耐盐的真核生物之一。杜氏藻富含β-胡萝卜素、维生素C、维生素E，油脂含量高，并且杜氏藻具有罕见的耐受极端高盐(可在饱和盐水中生存)、高温和高光强等极端生长环境的能力，生长条件相当粗放，因此成为人类主要的养殖藻类之一。据测算，杜氏藻室外全年养殖的平均生产率是平均20g干藻粉·m-2·d-1或0.25g胡萝卜素·m-2·d-1。因此美、澳、以、日等国已兴起大规模养殖杜氏藻提取胡萝卜素的产业，同时还可收获大量的蛋白质和甘油等副产物。
杜氏藻的最适生长温度为25～30℃，当温度超过35℃时，生长完全被抑制，藻细胞会逐渐死亡。而我国大部分地区夏季炎热高温，光照强度较高，常规的杜氏藻种难以耐受夏季高温和强光照，因此，杜氏藻难以在夏季实现大规模养殖。如果能通过诱变获得耐受高温及高光的藻株，将扩大该藻株的应用范围，对我国杜氏藻的养殖具有重要意义。
对于藻类的育种，目前普遍采用诱变育种法。诱变育种是指通过物理(射线照射等)和化学(诱变剂等)方法使藻类发生变异，从中选育出具有优良性状的藻种，是微藻育种中使用最多也是最有效的一种方法。诱变育种既能诱发基因突变，又能促进遗传基因重新组合，在短时间内获得大量  优良突变体作为新品种直接利用或作为种质资源间接利用，具有选择育种难以替代的优点。
常用的物理诱变辐射源有紫外线、倍频Nd:YAG激光、He-Ne激光、半导体激光、60Co-γ射线、超声波等。紫外线是一种非电离辐射，可引起DNA链的断裂、DNA分子内和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联，以及胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等，从而导致基因突变。现有的研究已经通过紫外诱变的方法筛选获得了很多有应用价值的藻株。
然而，目前用于藻类育种的一些现有的诱变育种技术存在一些缺点：现有技术筛选时间较短，通常只经过一次筛选，得到的突变藻株遗传稳定性相对较差，容易出现回复突变；而且，现有技术一般只在室外进行高温高光暴晒，很容易受到天气因素的影响，实验的重复性较差。
发明内容
为了杜氏藻类的大规模培养，扩大其应用的目的，本发明人在寻找高效的、可操作的和重复性好的诱变育种筛选方法的同时，筛选得到稳定的耐高温高光的杜氏藻UTEX LB 999诱变株系，完成了本发明。本发明所用的野生株是UTEX LB 999，来源于UTEX The Culture of Alage(TheUniversity of Texas)。
因此，在第一方面中，本发明的一个目的在于针对常规的杜氏藻无法耐受高温的缺陷以及常规选育方法的缺陷，提供一种采用紫外线诱变选育杜氏藻的耐受高温高光突变株的方法。
所述方法包括下列步骤：
(1)将处于对数生长期的杜氏藻进行紫外诱变后，无光暗培养；
(2)取步骤(1)的诱变藻株培养液，在室外高温高光条件下进行预备高温高光处理，筛选存活的单个藻株；
(3)将步骤(2)的单个藻株进行高温高光的初步筛选；和
(4)将步骤(3)筛选得到的单个藻株进行高温高光复筛。
在本发明的一个实施方案中，所述诱变筛选方法步骤(1)的紫外诱变用2个20W紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离藻液30cm，照射75s。但是，本领域技术人员应该理解，可以根据本领域公知常识适当选择紫外诱变所用的紫外线波长/频率、紫外光源距离藻液的距离、紫外照射的时间、紫外线照射量等参数。
在本发明的另一个实施方案中，所述诱变筛选方法步骤(2)所述的在室外高温高光条件下进行预备高温高光处理是在夏季每天将所述藻液置于室外，高温高光照强度暴晒4至8小时，然后取回藻液置室内人工气候箱(例如，型号MGC-350HP，购自上海一恒科学仪器有限公司)中在室温和正常光照条件下继续静置或摇动培养，期间间断补充适量新鲜培养基，18天筛选结束。该预备高温高光处理是利用炎热夏季(例如，5月晴天)的高温和高光照在室外进行的，温度和光照强度波动较大，但基本保持为温度在35-45℃和光照强度在10000lux以上。选择在室外进行预备高温高光处理的主要原因是因为：(1)微藻的培养条件本身比较粗放；并且，(2)本发明的最终目的是获得能够在夏季高温高光照条件下，即在炎热夏季室外条件下生长的突变藻株。此外，在室外利用夏季自然条件进行预备高温高光处理也可以节约筛选成本。
在一个优选实施方案中，所述诱变筛选方法步骤(2)所述的在室外高温高光条件下进行高温高光处理是在夏季每天将所述藻液置于室外，高温高光照强度暴晒6小时，然后取回藻液置室内人工气候箱中在正常培养温度和正常光照条件下继续静置或摇动培养，每6天补充适量新鲜Erdschreiber’s Medium(简称EM)培养基，18天筛选结束，其中所述室外高温高光条件基本保持在温度在35-45℃和光照强度在10000lux以上。
在本发明的一个实施方案中，其中步骤(3)的高温高光初步筛选和步骤(4)的高温高光复筛在室内进行，优选在人工气候箱中进行。可以利用人工气候箱严格控制温度和光照强度，避免室外筛选的温度和光照强度不稳定的缺点。
在本发明的另一个实施方案中，所述诱变筛选方法步骤(3)的高温高光初步筛选是将步骤(2)得到的单个藻株每天在人工气候箱中在38℃和10000lux以上光照强度下培养6小时，持续7天。
在本发明的另一个实施方案中，所述诱变筛选方法步骤(4)的高温高光复筛是将步骤(3)得到的单个藻株每天在人工气候箱中在42℃和10000lux以上光照强度下培养6小时，持续7天。
在本发明的另一个实施方案中，所述诱变筛选方法步骤(4)的高温高光复筛是将步骤(3)得到的单个藻株每天在人工气候箱中在42℃和10000lux以上光照强度下培养6小时，持续2天后，每天在人工气候箱中在45℃和10000lux以上光照强度下培养6小时，持续5天。
综上所述，本发明所述的高温高光条件是指温度在35-45℃和光照强度在10000lux以上的条件，所述高温高光条件是与微藻正常光培养所需要的温度和光照强度相对的，其中微藻正常光培养条件一般为温度在25～30℃，光照强度为4000～5000lux。所述高温高光条件可以包括炎热夏季的粗放的自然高温高光照条件，或在人工气候箱中严格控制的高温高光条件，温度优选为38℃，更优选为42℃或45℃。
在本发明的优选实施方案中，本发明所述的用紫外线诱变选育杜氏藻耐高温高光诱变株的具体步骤如下：
(1)紫外诱变：取在EM培养基中在25℃，湿度60％，光照4000-5000lux，光周期12hL/12hD的正常生长条件下生长至对数生长期的杜氏藻UTEX LB 999，置超净工作台中以2个20W紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离30cm，照射75s，进行诱变后，在25℃无光暗培养3天；
(2)将暗培养后的藻液置于人工气候箱中，在25℃、湿度60％、光照强度4000-5000lux、光周期12hL/12hD的正常生长条件下培养10-13天；
(3)预备高温高光筛选：取经过步骤(2)培养的诱变藻株藻液用新鲜EM培养基适当稀释，在夏季高温和强光照射下在室外进行预备高温高光处理6小时，其间每6天补充适量的新鲜EM培养基，18天筛选结束，其中所述室外高温高光条件基本保持在温度在35-45℃和光照强度在10000lux以上；
(4)将高温筛选后存活的藻细胞涂布在EM固体培养基平板上，在人工气候箱中，在25℃、湿度60％、光照强度4000-5000lux、光周期12hL/12hD的正常生长条件下培养14天后，挑取生长迅速的黄绿色单藻落，分离保存；
(5)耐受高温高光的藻株的初筛：从原始保存板上挑取上述步骤(4)筛选得到的藻落分别接种到EM液体培养基中，在人工气候箱中培养，正常培养条件下(即，温度25℃、湿度60％、光照4000-5000lux、光周期12hL/12hD，每天摇动三次)培养约3-4天至藻株的生长达到指数生长期，然后每天在38℃和10000lux以上光照强度下培养6小时，其余时间的培养条件为在25℃、光照4000-5000lux、湿度60％的光照培养和在25℃、湿度60％的暗培养，保持光周期12hL/12hD，持续7天，通过光密度的测定初步确定生长迅速的耐受高温高光的藻株；
(6)耐受高温高光的藻株的复筛(I)：将在步骤(5)中初步筛选确定的耐受高温高光的藻株作为复筛的样本。从原始保存板挑取筛选出的单个藻落，在人工气候箱中培养，在三角瓶中在25℃、湿度60％、光照强度4000-5000lux、光周期12hL/12hD的正常培养条件下扩大培养后，调整到同样的起始浓度，正常条件下(即，温度25℃、湿度60％、光照4000-5000lux、光周期12hL/12hD，每天摇动三次)培养约3-4天至藻株达到指数生长期，然后，然后在人工气候箱中，每天在42℃和10000lux以上光照强度下培养6小时，其余时间的培养条件为在25℃、光照4000-5000lux、湿度60％的光照培养和在25℃、湿度60％的暗培养，保持光周期12hL/12hD，持续7天，进行42℃高温高光筛选，通过光密度的测定最终确定生长迅速的耐受42℃高温高光的藻株；
(7)耐受高温高光的藻株的复筛(II)：将在步骤(5)中初步筛选确定的耐受高温高光的藻株作为复筛的样本。从原始保存板挑取筛选出的单个藻落，在人工气候箱中培养，在三角瓶中在25℃、湿度60％、光照强度4000-5000lux、光周期12hL/12hD的正常培养条件下扩大培养后，调整到同样的起始浓度，正常条件下(即，温度25℃、湿度60％、光照4000-5000lux、光周期12hL/12hD，每天摇动三次)培养至藻株达到指数生长期，然后在人工气候箱中，每天在42℃和10000lux以上光照强度下培养6小时，其余时间的培养条件为在25℃、光照4000-5000lux、湿度60％的光照培养和在25℃、湿度60％的暗培养，保持光周期12hL/12hD，持续2天后，每天在45℃和10000lux以上光照强度下培养6小时，其余时间的培养条件仍为在25℃、光照4000-5000lux、湿度60％的光照培养和在25℃、湿度60％的暗培养，保持光周期12hL/12hD，持续5天，进行45℃高温高光筛选，通过光密度的测定最终确定生长迅速的耐受45℃高温高光的藻株。
与常规的杜氏藻选育方法相比，本发明的诱变选育杜氏藻耐高温高光诱变株的方法具有下列优点：第一，本发明人先对出发藻种进行紫外诱变，在藻体基因组中引入基因突变，引发藻株的基因突变，且经过至少2～3轮高温高光筛选，筛选时间长，紫外诱变与高温高光筛选结合，得到的突变藻株的遗传性状和生长特性较稳定；第二，高温高光筛选在室外进行预备筛选后，又在室内高温和高光条件下进行初筛和复筛，可以利用人工气候箱严格控制高温和高光条件的稳定性，避免了单纯在室外筛选天气变化等因素的不利影响。与现有技术相比，本发明的紫外诱变选育方法高效、稳定、操作性好、重复性好。
另外，本领域的技术人员应该理解，本发明所述的用于杜氏藻的紫外诱变选育方法也可以适用于诱变选育其它藻类的耐高温高光突变株。
在第二方面中，本发明的另一个目的是通过利用本发明第一方面的紫外线诱变筛选方法得到耐受42℃高温和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-2，和耐受45℃高温和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-4。上述耐受高温高光的杜氏藻株已于2009年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏登记号分别为：CGMCCNo.2982(ENN0001-2)和CGMCC No.2983(ENN0001-4)。
在第三方面中，本发明人鉴定了耐受42℃高温和10000lux以上高光的杜氏藻突变株ENN0001-2，以及耐受45℃高温和10000lux以上高光的杜氏藻突变株ENN0001-4的生长性状。简述如下：
1.形态特征：
在25℃，在EM、F/2等自养培养基中均能生长，藻体在液体中分散均匀。藻细胞呈梨形，长度约6-10μM，具有2根等长的鞭毛，无细胞壁，仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜包裹，为天然原生质体。
2.在固体培养基上的生长特征：
在25℃，在EM固体培养基上生长良好，5-7天即可形成明显的单藻落。藻落呈规则的圆形，藻体呈黄绿色。
在第四方面中，提供本发明的杜氏藻耐高温高光的突变株ENN0001-2和ENN0001-4的应用。我国大部分地区夏季炎热高温，光照强度较大，常规的杜氏藻种难以耐受夏季高温高光，因此，常规杜氏藻难以实现夏季的大规模养殖。然而，本发明的突变株ENN0001-2和ENN0001-4可以在炎热高温高光照条件下应用于小规模的培养，还可应用于大规模的封闭式(如平板式反应器)和开放式(如跑道池)的反应器中的杜氏藻的培养，并进一步用于提取胡萝卜素、维生素C、维生素E和油脂等，并且用于生产生物柴油等。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1显示两种杜氏藻突变株分别在42℃和45℃高温和10000lux以上高光条件下与野生株比较的生长状况。A.在42℃高温和10000lux以上高光条件下，耐受42℃高温和高光的杜氏藻突变株ENN0001-2与野生株的叶绿素含量(OD680)和生物量(OD750)的变化；B.在45℃高温和10000lux以上高光条件下，耐受45℃高温和高光的杜氏藻突变株ENN0001-4与野生株的叶绿素含量(OD680)和生物量(OD750)的变化。横坐标为藻株株系，W(6)为野生株，纵坐标为OD值的变化。
图2显示在45℃高温和10000lux以上高光培养条件下两种杜氏藻突变株与野生株的生长状况。从图中可见，在45℃高温和10000lux以上高光的条件下，两种突变株的生长状况均比野生株W(6)好，并且ENN0001-2的生长状况虽然比野生株好，但是比ENN0001-4差，这说明本发明筛选得到ENN0001-2和ENN0001-4是独立的突变株。
具体实施方式
以杜氏藻UTEX LB 999的野生株(来源于UTEX The Culture of Alage，The University of Texas)为出发藻株，首先进行紫外诱变，随后于室外高温高光照强度暴晒，选择存活的藻落，分离并传代培养后保存，然后将此次处理后的藻株经活化后于人工气候箱(型号MGC-350HP，购自上海一恒科学仪器有限公司)中进行至少2～3轮高温高光筛选，选出在高温和高光条件下生长良好的藻株，分离并传代培养后保存，即获得杜氏藻耐受高温高光的突变藻株。
本发明用于培养杜氏藻UTEX LB 999的Erdschreiber’s Medium培养基(简称EM)的组成及其含量如表1所示，在配制培养液时，将其中一些成分以固体形式加入蒸馏水中，一些成分事先配成50-1000倍的母液，使用时再按需稀释配置成培养液，详情参见下表2-5。
表1.EM培养基的组成及其含量
  #   成分   量   储液浓度   使用时终浓度
  1   人工海水   3L
  2   P-IV金属储液   36mL/3L
  3   NaNO3   10mL/3L   0.7M   2.3mM
  4   Na2HPO4·7H2O   10mL/3L   0.02M   6.7mM
  5   土壤水：GR+培养基   150mL/3L
  6   维生素B 12   3mL/3L
注：下划线表示需要事先配制成母液，所述母液的配制参见下表2-5。
表2.人工海水的组成及其含量
  #   成分   量(g/L)   使用时终浓度
  1   NaCl   49.726   850mM
  2   MgCl2   7.26   76mM
  3   MgSO4   3.248   27mM
  4   CaCl2   1.153   10mM
  5   NaHCO3   0.198   2.4mM
  6   KCl   0.721   10mM
  7   NaBr   0.058   0.56mM
  8   H3BO3   0.058   9.4mM
  9   Na2SiO3   0.0024   0.02mM
  10   H3PO4   0.002   0.02mM
  11   Al2Cl6   0.013   0.0075mM
  12   NH3   0002   0.12mM
  13   LiNO3   0.0013   0.019mM
  14   Na2SO4   4   28mM
表3.P-IV金属溶液储液的组成及其含量
  #   成分   量   使用时终浓度
  1   Na2EDTA·2H2O   0.75g/L   2mM
  2   FeCl3·6H2O   0.097g/L   0.36mM
  3   MnCl2·4H2O   0.041g/L   0.21mM
  4   ZnCl2   0.005g/L   0.037mM
  5   CoCl2·6H2O   0.002g/L   0.0084mM
  6   Na2MoO4·2H2O   0.004g/L   0.017mM
表4.土壤水：GR+培养基的组成及其含量
  #   成分   量   使用时终浓度
  1   Green House Soil   5ml/200mL dH2O
  2   CaCO3(任选)   1mg/200mL dH2O   0.05mM
表5.其它成分的配制
 #   成分   量
 1   HEPES缓冲液pH 7.8(Sigma H-3375)   2.4g/200mL dH2O
 2   维生素B12(cyanocobalamin，Sigma V-6629)   0.027g/200mL dH2O
其中，Green House Soil的处理方法：将园艺用土置于铺好铝箔的耐热平板上，厚度不超过0.64cm，150℃烘干2小时。室内放置降温后，用铝箔盖在平板上，放置在黑暗通风干燥处，以备随时取用。
本领域的技术人员应该理解，除非另外指明，本发明所用的试剂均可从普通的生物试剂公司或化学试剂公司购买，其配制方法也是本领域的技术人员公知的。
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1：杜氏藻UTEX LB 999藻株的紫外诱变和预备高温高光筛选
将杜氏藻UTEX LB 999藻株的单个菌落从平板上接种至含有20mlEM培养基的100ml三角瓶中，置于人工气候箱(型号MGC-350HP，购自上海一恒科学仪器有限公司)中在25℃，光照4000-5000lux、湿度60％、光周期12hL/12hD的条件下培养至指数生长期。取3mL藻液置于直径3.5cm的无菌培养皿中，加搅拌子搅拌(搅拌速度约为60-90rpm)，以2个20W紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离30cm，照射75s，关闭紫外灯，加入17ml EM培养液，盖上培养皿盖，用锡纸包好，在25℃无光培养3天。
暗培养后的藻液和新鲜EM液体培养基按1∶1的体积比例在250ml三角瓶中混匀，在人工气候箱中在25℃、光照4000-5000lux、湿度60％、光周期12hL/12hD的正常培养条件下静置培养10-13天。然后，将由经紫外诱变后的藻株经过这样培养10-13天得到的藻液和新鲜EM液体培养基按1∶50的体积比例重新接种于250ml三角瓶中，称为藻液1，另外将由经紫外诱变后的藻株经过这样培养10-13天得到的藻液和新鲜EM液体培养基按1∶3的体积比例重新接种于500ml三角瓶中，称为藻液2，将藻液1和藻液2分别同时独立地在室外进行预备高温高光筛选：选择5月晴天，每天从10时至16时将上述藻液置于室外花岗岩石板上，高温高光照强度暴晒进行筛选，其中所述室外高温高光条件基本保持在温度在35-45℃和光照强度在10000lux以上；每天16时后取回藻液置室内人工气候箱中在25℃和正常光照4000-5000lux条件下继续静置或摇动培养。每6天补充50ml新鲜EM培养基，18天筛选结束，取少量液体铺平板培养14天并挑取较大的单藻落保存，得到150株突变株，概率约为40％。
实施例2：杜氏藻耐受高温高光的突变藻株的初步筛选
将上述实施例1中经分离后平板保存的150株单个藻株分别活化，以相同浓度接种于4ml液体EM培养基中，在人工气候箱中在12孔细胞培养板中在25℃，湿度60％，光照4000-5000lux、光周期12hL/12hD的正常条件下培养5天后，每天从10时至16时将人工气候箱温度升至38℃，光照强度调整为10000lux以上，曝露于高温高光下进行筛选；每天16时后温度降至25℃，光照强度重新调整为4000-5000lux，20时后进入无光照培养阶段，第二日8时-10时又进入正常光照培养(即，25℃、光照4000-5000lux、湿度60％)，整个过程中保持光周期12hL/12hD。如此循环进行高温高光筛选，持续7天，通过光密度的测定初步确定生长迅速的耐受高温高光的藻株，分离培养并保存，初步得到12株耐受高温高光的藻株，概率约为8％。
实施例3：杜氏藻耐受42℃高温高光的突变藻株的筛选
将实施例2中经室内高温和高光初步筛选后得到的12株藻株分别活化，以相同起始浓度接种于20ml EM液体培养基，置于100ml三角瓶中，每个样品做三个平行样。藻液在人工气候箱中在温度25℃、光照4000-5000lux、湿度60％，光周期12hL/12hD的正常培养条件下培养3天后，每天从10时至16时将人工气候箱温度升至42℃，光照强度调整为10000lux以上，曝露于高温高光下进行筛选；每天16时后温度降至25℃，光照强度重新调整为4000-5000lux，20时后进入无光照培养阶段，第二日8时-10时又进入正常光照培养(即，25℃、光照4000-5000lux、湿度60％)，整个过程中保持光周期12hL/12hD。如此循环进行42℃高温高光筛选，持续7天，通过光密度的测定确定生长迅速的耐受42℃高温高光的藻株，分离培养并保存，得到1株耐受42℃高温和高光的杜氏藻突变株，命名为ENN0001-2(CGMCC No.2982，于2009年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，100101)。
实施例4：杜氏藻耐受45℃高温高光的突变藻株的筛选
将实施例2中经室内高温和高光初步筛选后得到的12株藻株活化，以相同起始浓度接种于20ml EM液体培养基，置于100ml三角瓶中，每个样品做三个平行样。藻液在人工气候箱中在温度25℃、光照4000-5000lux、湿度60％，光周期12hL/12hD的正常培养条件下培养3天后，每天从10时至16时将人工气候箱温度升至42℃，光照强度调整为10000lux以上，曝露于高温高光下进行筛选；每天16时后温度降至25℃，光照强度重新调整为4000-5000lux，20时后进入无光照培养阶段，第二日8时-10时又进入正常光照培养(即，25℃，光照强度4000-5000lux，湿度60％)，整个过程中保持光周期12hL/12hD。如此循环进行42℃筛选，持续2天后，把每天10时至16时的光培养箱温度升至45℃，光照仍调整为10000lux以上，其余条件不变，如此循环进行45℃高温高光筛选，持续5天，通过光密度的测定确定生长迅速的耐受45℃高温高光的藻株，分离培养并保存，得到1株耐受45℃高温和高光的杜氏藻突变株，命名为ENN0001-4(CGMCC No.2983，于2009年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，100101)。
实施例5：杜氏藻耐受高温高光的突变株的生长性状鉴定
杜氏藻耐受42℃和45℃高温高光的突变藻株的生长性状鉴定如下：
1.形态特征：
在25℃，两种突变藻株在EM、F/2等自养培养基中均能生长，藻体在液体中分散均匀。藻细胞呈梨形，长度约6-10μM，具有2根等长的鞭毛，无细胞壁，仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜包裹，为天然原生质体。
2.在固体培养基上的生长特征：
在25℃，两种突变藻株在EM固体培养基上生长良好，5-7天即可形成明显的单藻落。藻落呈规则的圆形，藻体呈黄绿色。
实施例6：杜氏藻耐受高温高光的突变株与野生株的比较鉴定
1.在42℃高温和10000lux以上高光培养条件下，耐受42℃高温和高光的杜氏藻突变株ENN0001-2比野生株生长状况好。
杜氏藻突变株ENN0001-2藻落和藻体培养液均呈黄绿色，而野生株则呈绿色。将杜氏藻突变株ENN0001-2和野生株W(6)同时按照实施例3的培养条件进行培养：挑取单个藻落经活化后，以相同起始浓度接种于20ml EM培养基中，先在25℃、光强4000-5000lux、湿度60％、光周期12hL/12hD条件下培养3-4天，然后每天在42℃高温和10000lux以上光照处理6小时，其余时间在25℃、光强4000-5000lux、湿度60％光照培养和在25℃、湿度60％暗培养，保持光周期12hL/12hD，处理7天。测定叶绿素含量OD680和生物量OD750。参考图1A，在42℃高温和高光培养条件下，突变株ENN0001-2的生长状况比野生株W(6)好，ENN0001-2的叶绿素含量达到野生株的109.08％，生物量达到野生株的107.71％。
2.在45℃高温和10000lux以上高光培养条件下，耐受45℃高温和高光的杜氏藻突变株ENN0001-4比野生株生长状况好。
杜氏藻突变株ENN0001-4藻落和藻体培养液均呈黄绿色，而野生株则呈绿色。将杜氏藻突变株ENN0001-2和野生株W(6)同时按照实施例4的培养条件进行培养：挑取单个藻落经活化后，以相同起始浓度接种于20ml EM培养基中，先在25℃、光强4000-5000lux、湿度60％、光周期12hL/12hD条件下培养3-4天，然后每天在42℃高温和10000lux以上光照处理6小时，处理2天，随后每天在45℃高温和10000lux以上光照处理6小时，处理5天。测定叶绿素含量OD680和生物量OD750。参考图1B，在45℃高温和高光培养条件下，突变株ENN0001-4的生长状况比野生株W(6)好，ENN0001-4的叶绿素含量达到野生株的149.43％，生物量达到野生株的135.55％。
3.耐受42℃高温和高光的杜氏藻突变株ENN0001-2与耐受45℃高温和高光的杜氏藻突变株ENN0001-4及野生株W(6)在45℃高温和10000lux以上高光培养条件下的生长差异。
将突变株ENN0001-2和ENN0001-4与野生株W(6)同时按实施例4的培养条件进行培养：挑取单个藻落经活化后，以相同起始浓度接种于20mlEM培养基中，先在25℃、光强4000-5000lux、湿度60％、光周期12hL/12hD条件下培养3-4天，然后每天在42℃高温和10000lux以上光照处理6小时，处理2天，随后每天在45℃高温和10000lux以上光照处理6小时，处理5天。测定叶绿素含量OD680和生物量OD750。参考图2，ENN0001-2的叶绿素含量达到野生株的126.57％，生物量达到野生株的113.75％，而ENN0001-4的叶绿素含量达到野生株的145.85％，生物量达到野生株的136.14％。在45℃高温和10000lux以上高光的条件下，两种突变株的生长状况均比野生株W(6)好，并且ENN0001-2的生长状况虽然比野生株好，但是比ENN0001-4差，二者存在差异，这可以说明本发明筛选得到ENN0001-2和ENN0001-4是独立的突变株。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，可以在其中进行各种形式和细节的变化，而不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围。

Claims (2)

1.杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)UTEX LB 999的耐高温高光突变株ENN0001-2，其于2009年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2982。
2.杜氏藻UTEX LB 999的耐高温高光突变株ENN0001-4，其于2009年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2983。
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