CN1572320A - 利用药代动力学和药效模型进行红细胞生成素给药的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及为所希望的药效/药代动力学反应获得合适的EPO剂量方案的方法。本方法包括选择一种或几种EPO剂量方案，然后使用一种PK/PD模型来确定一种或几种EPO剂量方案的药效/药代动力学概况，最后选择使用其中一种EPO剂量方案，以获得基于EPO概况的所希望的药效/药代动力学反应。

Description

利用药代动力学和药效模型进行红细胞生成素给药的方法

本申请是国际申请日为2000年5月10日，国际申请号为PCT/US00/12629，名称为“红细胞生成素给药的药代动力学和药效模型”的中国专利申请No.00809989.8的分案申请。

技术领域

本发明涉及为所希望的药效/药代动力学反应获得的优化EPO剂量方案的方法。

背景技术

红细胞生成素(EPO)是负责在平稳状态条件下调节红细胞的生成和加速出血后红细胞凝块恢复的一个主要因子。EPO是一种糖蛋白激素，其分子量为30Kda，被大量地糖基化，以使EPO分子在体内不被迅速降解。人体内血清EPO浓度正常范围在6至32U/l之间，据报道EPO的半衰期(t_1/2)范围在2至13小时之间，其容积的分布与血浆容积密切相关。正如大的唾液酸糖蛋白那样，低于10％的EPO从尿中分泌。(见Lappin等，1996.Clin.Lab Haem.18：137-145)

成人体内EPO合成的主要器官是肾脏，虽然肝脏和骨髓也有可能，但数据尚不肯定。增加EPO合成的主要刺激是组织缺氧导致的组织氧供减少。大量失血、辐射引起的红细胞破坏或高海拔地区暴露都会导致缺氧。另外，各种形式的贫血都会导致缺氧，因为红细胞负责氧气在体内的运输。在正常状态下，增加EPO水平刺激新生红细胞产生，因此提高氧气水平，减少或消除了缺氧条件。

EPO的主要功能是与其他的生长因子协同作用刺激骨髓内的红血球祖细胞的增殖和分化，导致网织红细胞增多，增加血液中的红细胞数量，这一过程被称作红细胞生成(图1)。在红细胞生成过程中，人红细胞系的分化产生经历两个星期的周期。最早的祖细胞是BFU-E(Burst-Forming Unit-Erythroid)，较小且没有明显的组织学特征。BFU-E后是CFU-E(Colony Forming Unit-Erythroid)，比BFU-E大且马上到达血红蛋白产生开始期。开始产生血红蛋白的细胞是幼稚红细胞，它们不仅开始产生血红蛋白，而且开始缩合细胞核，最终成为成熟的红细胞。成熟的红细胞较幼稚红细胞小，有一个非常致密的核，当细胞变成网织红细胞时核消失。之所以叫网织红细胞是因为这些细胞含有多核糖体的网状结构，当网织红细胞失去其多核糖体后，变成成熟的红细胞(RBCs)。

直到最近，EPO的来源都很局限。虽然蛋白在人的尿中存在，但所分泌的水平太低而不能使这一实际的EPO来源用于治疗。编码EPO基因的识别，克隆，表达和EPO纯化技术，如在美国专利US4,703,008，US5,389,541，US5,441,868，US5,614,184，US5,688,679，US5,888,744，US5,888,772和US5,856,298中所述，已经使EPO很易获得并用作治疗应用。例如在美国专利第4,667,016中有从含有重组EPO质粒支持哺乳动物细胞生长的细胞介质中纯化重组EPO(rHuEPO)的描述。这种重组的EPO具有同人尿中红细胞生成素一样的氨基酸序列，这两种成分在化学，物理和免疫测试中不能区分。从含有EPO基因重组质粒的哺乳动物宿主细胞的具有生物学活性的重组EPO的表达和回收已经获得适量的EPO用作治疗应用。另外，基因序列的知识和大量纯化蛋白的获得使我们更好的理解这一蛋白的作用方式。

一种蛋白的生物学活性依赖于其结构。尤其是，一种蛋白的基本结构，如，它的氨基酸序列，为其合成过程和合成后通过多肽形成二维(如α-螺旋和β-片层)和三维结构(整体的三维折叠)提供依据。而且，不仅一种蛋白的生物学活性是由其结构决定，蛋白翻译产生后的修饰也由其结构决定。实际上，许多细胞的表面蛋白和分泌蛋白是通过一种或几种寡聚糖基团来修饰的。这种修饰叫糖基化，可以明显影响蛋白的物理特性，在蛋白的稳定，分泌，和细胞亚定位中也有重要作用。合适的糖基化对生物学活性是必须的。

人尿来源的和重组的EPO(哺乳动物细胞表达)二者都具有人EPO的1-165个氨基酸序列，包含3个N-连接的和一个O-连接的寡聚糖链，该N-连接和O-连接共同包括大约糖蛋白总分子量的40％。已经证明寡聚糖链可以被末端唾液酸残基修饰。处理糖基化EPO以移除所有唾液酸残基使其体内活性丧失，但并不影响它的体外活性(Lowy等，1960，Nature 185：102；Goldwasser等，1974，J.Biol.Chem.249：4202)。这一作用的解释是无唾液酸基红细胞生成素在循环中与肝脏中的无唾液酸基糖蛋白结合蛋白反应后被迅速清除(Morrell等，1968，J.Biol.Chem.243：155；Briggs等，1974，Am.J.Physiol.227：1385；和Ashwell等，1978Methods of Enzymol.50：287)。因此，EPO在体内仅在被唾液酸化而避免与肝脏结合蛋白结合时拥有生物学活性。

与血红蛋白水平相关的EPO产生不足(或无效)与某些贫血相关。这些贫血包括肾脏衰竭的贫血和晚期肾脏疾病，慢性紊乱的贫血(慢性感染和类风湿性关节炎)，自身免疫性疾病，获得性免疫缺陷性疾病(AIDS)和恶性肿瘤。这些条件中的许多与一种因子的产生有关，而这种因子被证明是EPO活性的抑制剂。另外一些贫血是明显不依赖EPO的，包括再生障碍性贫血，缺铁性贫血，地中海贫血，巨幼细胞性贫血，纯红细胞再生障碍和骨髓增生异常性综合征。

人血清中EPO水平的测量在临床上具有重要意义。在患者的血清中测定EPO水平在那些贫血和红细胞增多症的鉴别中是有用的，其是将与EPO水平增加或降低相关的疾病和与EPO没有关系的疾病区别开来。另外，证明不适宜的低血清EPO水平是推断一个贫血患者能从外源性应用EPO治疗中受益的前提。

在临床实验中，红细胞生成素α已经在正常患者与几种贫血患者中得到评价。红细胞生成素α诱导正常志愿者剧烈的血液学反应，提示恰当应用铁离子可以支持血红蛋白合成增加。大量实验研究了治疗肾功能衰竭相关贫血的安全性和有效性。另外，红细胞生成素α可以用来纠正另外一些贫血，包括与铂类为主癌症化疗相关的贫血，AIDS病人齐多夫定治疗引起的贫血和其他药物如顺铂引起的贫血。另外，红细胞生成素α的应用还有许多其他潜在作用：应用红细胞生成素α增加拟定手术患者自体供血的能力和减轻未治疗的自身供血者血细胞比积下降；应用红细胞生成素α可以增加同种异体-而不是自体-骨髓移植后血液红细胞恢复；应用红细胞生成素α已被证明可以改善类风湿性关节炎患者的生活质量。

EPO的另一种应用是通过增加运动员的血细胞比容提高运动员的成绩。血细胞比容的加强增加了氧气从肺到运动骨骼肌转运的能力。由于通过生物工程合成EPO，给运动员注射EPO，已知叫血掺，已经在体育运动中运用得非常普遍，尤其是在自行车运动中(Scheen，AJ.，1998.Rev.Med.Lieg 53(8)：499-502)。

目前，标准的施用于患者的EPO剂量方案有许多相关缺点。在特殊指征中，如癌症，患者每周用150IU/kg的EPO治疗三次。因此，将目前认可的用药时间表变为更方便的用药时间表和治疗方案仍然是一个重要的目标。预期的目标是更少的治疗次数使使用者更加容易接受和方便。进一步来说，标准的剂量方案可能不能最大化患者的生理反应；标准的剂量方案并不是最有效的。

而且，与使用EPO给药的方式相关的缺点有许多：对患者来说定期静脉注射不方便；对患有这样一些状况如限制血管入量的经常走动的腹膜透析和非透析患者，静脉使用也是不实际的。经静脉迅速给予rHuEPO会导致长时间rHuEPO较低的生物利用度，可能并不象希望的那样有效的刺激RBC的产生。

因此，基于上述理由，需要一个更佳的给药途径和方法来确定EPO给药的有效剂量和给药方案。

所以，本发明的一个方面是建立一种用于表征和预测对rHuEPO反应的药效/药物动力(PK/PD)模型，因此可以识别更有效的，更经济的，和/或对患者更方便的治疗方案。在本发明的一个特定实施方案中，考虑了每周使用一次或每两周使用一次EPO。本发明的另外一个方面是提供了一种方法，在使用了两种或多种剂量方案后评价EPO的药效/药代动力学概况，在几种EPO定量给药方案中比较临床效果及耐受性和安全性参数。相关的商业方法和计算机系统也有讨论。

发明概述

本发明的一个特定实施方案中包括一种为所希望的药效学反应获得最佳EPO剂量方案的方法，其中包括选择一种或多种剂量方案，然后使用一种PK/PD模型决定一种或多种EPO剂量方案的药效学关系图，最后选择一种EPO剂量方案给药，获得希望的基于EPO关系图的药效学(PD)反应。在另一个实施方案中，PD反应可以包括一组或几组，其由网织红细胞数目，RBC数目和血红蛋白水平组成。

本发明的另外一个实施方案还包括一种为了所希望的药效学反应获得最佳EPO剂量方案的方法，包括首先选择一种或多种希望的药效学反应，然后使用一种PK/PD模型确定获得希望反应的一种EPO给药方案，最后，选择其中一种EPO剂量方案使用，获得希望的药效学反应。在另一个实施方案中，PD反应可以包括一组或几组，其由网织红细胞数目，RBC数目和血红蛋白水平组成。

本发明另一个优选的实施方案包括一种计算机程序，可以用来为所希望的药效反应获得最佳的剂量方案。计算机程序包括一种计算机编码。在一个进一步的实施方案中，计算机编码描述了一个EPO的PK/PD模型，允许使用者选择一种或多种希望的药效学反应。然后计算机编码使用PK/PD模型确定EPO剂量方案，提供希望的药效学反应。EPO剂量方案可以每周使用一次或两周使用一次，基于体重的剂量。优选每周一次的EPO剂量包括给予40000IU/kg剂量EPO，两周一次的EPO剂量方案包括给予EPO大约80000至大约120,000IU/kg之间。在另外一个实施方案中，PD反应包括由网织红细胞数目，RBC数目和血红蛋白水平组成的一组或几组。

本发明的另外一种优选实施方案中包括一种为所希望的药效学反应获得最佳剂量方案的计算机程序。在另外一个实施方案中，计算机程序包括一种计算机编码。计算机编码允许使用者选择一种或多种EPO剂量方案。然后计算机编码使用PK/PD模型确定基于所选择的EPO剂量方案的药效学反应。

本发明的一个优选实例包括为所希望的药代动力学反应确定最佳EPO剂量方案的方法，包括依次选择一种或多种EPO剂量方案，使用PK/PD模型确定EPO剂量方案的药代动力学反应然后选择基于药代动力学曲线图的希望的EPO剂量方案，在一个特殊的实施方案中，基于一种或多种EPO或EPO样化合物。在另外一个实施方案中，药代动力学反应包括血清EPO水平，生物利用度和EPO极限水平。

本发明的进一步实施方案包括一种为所希望的药代动力学反应获得最佳EPO剂量方案的方法，包括首先选择一种或多种希望的药代动力学反应，然后使用一个PK/PD模型确定EPO剂量方案，提供一种或多种希望的药代动力学反应，最后选择EPO剂量方案，提供希望的药代动力学反应。

本发明的另外一个实施方案包括一种为所希望的药代动力学反应获得最佳剂量方案的计算机程序，包括描述EPO的PK/PD模型的一种计算机编码。在另外一个实施方案中，计算机编码允许使用者选择一种或多种药代动力学反应，然后使用PK/PD模型确定一种或多种EPO剂量方案，提供所希望的药代动力学反应。

本发明的另外一个实施方案包括一种为所希望的药代动力学反应获得最佳剂量方案的计算机程序。在另外一个实施方案中，计算机程序包括一种计算机编码。计算机编码允许使用者选择一种或多种EPO剂量方案。然后计算机编码使用PK/PD模型确定基于所选择的EPO剂量方案的药效学反应。可以考虑使用一种或多种EPO或EPO样化合物。

本发明的另外一种优选的实施方案包括许多方法，包括一种给消费者一个EPO剂量方案的商业方法，其中包括给患者第一剂量EPO，然后第二剂量EPO。第二剂量优选在第一剂量后的一个时间点进行，此时与第一剂量产生的PD关系图相符合。PD关系图包括与时间相关的祖细胞产生数目，与时间相关的网织红细胞浓度，与时间相关的血红蛋白浓度。更优选，PD概况将是这一剂量方案的网织红细胞概况。第二EPO剂量优选与网织红细胞关系图相符合，例如，当网织红细胞曲线图产生到达峰值时。第二EPO剂量促进了循环幼稚红细胞成熟变成成熟红细胞。

本发明的进一步的实施方案包括一种给患者一种EPO剂量方案的商业方法，包括给患者第一剂量EPO，然后第二剂量EPO。患者的第二剂量在第一剂量后的一个时间进行，此时应与患者第一剂量后产生的网织红细胞关系图相符合。第二EPO剂量应在第一EPO剂量后6至10天内给予。优选第二EPO剂量在第一EPO剂量后7天时给予。

本申请的商业方法涉及本发明方法学中的商业和其它用途。一方面，商业方法包括市场，销售，或本方法学的注册，提供给消费者如，患者，医师，医学服务者，和药品批发商和制造商，本发明的EPO剂量方案。这些方案包括每周一次和每两周一次剂量方案。

本发明的另外一个优选实施方案提供了一种给患者经皮下(SC)使用EPO的药代动力学模型的方法。这一方法包括从患者身上获得药代动力学数据，根据患者的PK数据选择一种方程式，并将PK数据代入方程中。另外，获得PK数据包括使收集的PK数据的血清EPO浓度值正常化，并建立基于正常化数据的血清EPO浓度时间关系图。在一个进一步的实施方案中，PK数据的正常化可以首先从PK数据中通过多时间点用药前平均血清EPO浓度值获得基线血清EPO浓度值；其次，在SC使用EPO后获得血清EPO浓度值；然后，通过从血清EPO浓度值中减去用药前EPO浓度值获得标准血清EPO浓度值；最后，计算每一时间点的平均正常血清EPO浓度。

在本发明的另外一个实例中，PK方程式包括选择Michaelis-Menten方程。PK数据采用如ADAPT II软件代入PK方程中，参数的评估可以通过利用通过最大似然方法和延展最低平方模型的最低平方获得。在本发明的一个进一步的实施方案中参数选自Vmax，Km，Vd，Fr，τ(低剂量)和τ(高剂量)组成的组中。

本发明的一个进一步实施方案提供了一种在SC应用EPO后计算EPO生物利用度的方法。方法包括获得PK数据，计算血清EPO浓度对剂量的曲线下面积(AUC)，使AUC对剂量正常化，最后，通过PK数据的线性回归获得一个方程。

本发明的另外一种优选实施方案提供了一种给患者皮下使用EPO后建立药效学模型(PD)的方法。这一方法包括使血清EPO浓度正常化，获得PD数据，选择一个PD模型，获得基于PD模型的方程式，并将PD数据代到PD方程中。在另外一个实施方案中，血清EPO浓度正常化包括通过每一剂量组多时间点用药前平均血清EPO浓度值获得每一剂量组的基线血清EPO浓度(C_bs)，然后，通过将C_bs加至由PK模型预测的血清EPO浓度中调节C_bs，调节后的C_bs在PD分析中可作为强制函数。

在一个进一步的实施方案中，PD数据可以通过测定平均用药前祖细胞，网织红细胞，RBC数目和血红蛋白浓度获得，然后根据EPO剂量获得平均网织红细胞，平均RBC和平均血红蛋白对时间关系图。

在另外一个实施方案中，PD模型包括一个细胞衰减和产生的模型。PD数据可以采用如ADAPT II软件代入模型方程中，然后，推算和固定的参数可以通过利用通过最大似然方法和延展最低平方模型的最低平方获得。另外，推算的参数包括Ks，SC₅₀和TP，固定的参数包括R_L，RBC_L，Hb和低限。

本发明一个进一步优选的实施方案提供了一种预测患者使用不同剂量SC EPO后PD反应的方法。而且，这个方法包括选择一个剂量和剂量方案，然后通过PK/PD模型测定基于特定剂量和剂量方案的PD反应。在另一个实施方案中，PD反应包括一个或多个由网织红细胞数目，RBC数目和血红蛋白水平组成的组。

本发明致力于患者的需要，这些患者可能有与血红蛋白水平相关的EPO产生缺乏或不足，可能与某些形式贫血相关。这些贫血包括，但并不局限于，与晚期肾功能或肾衰相关贫血，癌症铂化疗相关的贫血，AIDS药物治疗相关的贫血，药物包括顺铂和齐多夫定。另外，患者可能经历手术前的自体输血，同种异体骨髓移植后的恢复，关节炎疾患，或运动员或其他需要或希望增加RBC数目和/或血红蛋白的人。

本发明的PK/PD模型有许多潜在的治疗作用。例如，医师可以使用这种PK/PD模型系统确定使用最佳的EPO剂量方案，以便给需要增加RBC数目和/或血红蛋白的患者使用。尤其是，医师可以选择是确定基于希望的药效学结果的EPO剂量方案还是确定基于特定的EPO剂量方案的药效学反应。

附图的简要说明

图1：红细胞生成过程。

图2：静脉使用五种给定的剂量水平后的血清rHuEPO浓度对时间的关系图。150和300IU/kg剂量的数据是6个健康受试者的平均数据，其它剂量是单独的受试者数据。圆圈代表校正的基线EPO浓度数据，实线是从将数据代入方程式1，2，3中获得的，见下。

图3：静脉和皮下EPO用药后药代动力学参数。

图4：本发明用于分析血浆rHuEPO(C_EPO)对时间关系图的药代动力学模型的图解展示。使用的符号在本发明详细描述的定义章节中解释，见下。

图5A：皮下使用300，450，600和900IU/kg剂量后血清rHuEPO浓度对时间的关系图。每次用药数据是5个健康受试者的平均值。数据被基线EPO浓度校正，实线是将数据代入方程式1，2，3中获得的。

图5B：皮下使用1200，1350，1800和2400IU/kg剂量后血清rHuEPO浓度对时间的关系图。每次用药数据是5个健康受试者的平均值。数据被基线EPO浓度校正，实线是将数据代入方程式1，2，3中获得的。

图6：皮下使用8个剂量水平后血清rHuEPO浓度-时间曲线(AUC)对剂量，见图4A和4B。AUC通过Spline方法计算。

图7：皮下使用8种指定剂量水平后rHuEPO的生物利用度(F)对剂量的曲线。F值是将初始的药代动力学数据代入模型中获得的，在正文中有描述。线性回归系数r²为0.9713。斜率为0.00024952，截距为0.3884。

图8：皮下使用rHuEPO的生物利用度值。

图9：在150IU/kg一周3次(最高)和600IU/kg/周(最低)的多种剂量方案中的血清rHuEPO浓度对时间的关系图。实圈代表平均值，线代表模型预测值。

图10：用于分析网织红细胞，RBC，和血红蛋白浓度的药效学模型的图解展示。使用的符号在本发明详细描述的定义章节中解释，见下。

图11：8种指定的皮下使用rHuEPO剂量水平的平均网织红细胞计数对时间的关系图。

图12A：皮下使用300，450，600和900IU/kg剂量后网织红细胞数目对时间的关系图。每次用药数据是5个健康受试者的平均值。符号表示实验数据，实线是将数据代入方程式4，5，6和7中获得的，见下。图12B：皮下使用1200，1350，1800和2400IU/kg剂量后网织红细胞数目对时间的关系图。每次用药数据是5个健康受试者的平均值。符号表示实验数据，实线是将数据代入方程式4，5，6和7中获得的。

图13：皮下使用EPO效果的推算和固定的药效学参数。

图14：单独皮下使用8种指定剂量水平的rHuEPO的血红蛋白浓度对时间的关系图。封闭的圆圈表示平均数据，实线是模型预测数据。

图15：多次皮下使用150IU/kg一周3次rHuEPO后网织红细胞，RBC和血红蛋白反应。实圈表示测量数据，实线表示模型预测数据。

图16：多次皮下使用600IU/kg/周rHuEPO后网织红细胞，RBC和血红蛋白反应。实圈表示测量数据，实线表示模型预测数据。

图17：临床研究EPO-PHI-358，EPO-PHI-359，EPO-PHI-370和EPO-PHI-373中受试者药效和药代动力学数据相关的红细胞生成素α的临床药代动力学研究的概况。

图18A：临床研究EPO-PHI-373的生物制药学研究概况。

图18B：临床研究EPO-PHI-370的生物制药学研究概况。

图18C：临床研究EPO-PHI-358的生物制药学研究概况。

图18D：临床研究EPO-PHI-359的生物制药学研究概况。

图19：临床研究EPO-PHI-358，EPO-PHI-359，EPO-PHI-370和EPO-PHI-373的药代动力学概况。

图20：临床研究EPO-PHI-358，EPO-PHI-359，EPO-PHI-370和EPO-PHI-373的分析方法概况。

图21：临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359中登记的受试者人口统计和基线参数的平均值±标准差。

图22：临床研究EPO-PHI-358中受试者血清红细胞生成素α平均浓度-时间关系图(未被基线EPO水平校正)。

图23：临床研究EPO-PHI-359中受试者血清红细胞生成素α平均浓度-时间关系图(未被基线EPO水平校正)。

图24：药代动力学参数平均值±标准差(％CV)(临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359)。

图25：临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359中接受单次或多次SC剂量方案的受试者的C_max的平均值±标准差和剂量的关系。

图26：临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359中接受单次或多次SC剂量方案的受试者的CL/F的平均值±标准差和剂量的关系。

图27：四周研究期间网织红细胞-时间平均百分比关系图(临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359)。

图28：150 IU/kg一周3次(N＝5)和600 IU/kg每周一次(N＝5)红细胞生成素α治疗4周后基线水平以上血红蛋白平均值±标准差变化关系图(临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359)。

图29：临床研究EPO-PHI-370中受试者人口统计数据。

图30：接受150IU/kg一周3次(N＝24)或40,000 IU每周一次(N＝22)后第4个用药周的健康受试者的红细胞生成素α平均血清浓度-时间关系图(临床研究EPO-PHI-370)(未用基线EPO校正)。

图31：药代动力学参数平均值±标准差(％CV)(临床研究EPO-PHI-370)。

图32：基线以上的网织红细胞百分数平均变化的关系图。

图33：基线以上的血红蛋白(g/dl)平均变化的关系图。

图34：基线值校正后药效学参数平均值±标准差(％CV)(临床研究EPO-PHI-370)。

图35：临床研究EPO-PHI-373中受试者人口统计数据平均值±标准差。

图36：接受150IU/kg一周3次(N＝17)或40,000IU每周一次(N＝17)后第4个用药周的健康受试者的红细胞生成素α平均血清浓度-时间关系图(临床研究EPO-PHI-373)(未用基线EPO校正)。

图37：基线值校正后药代动力学参数平均值±标准差(％CV)(临床研究EPO-PHI-373)。

图38：临床研究EPO-PHI-373受试者基线以上的网织红细胞百分数平均变化的关系图。

图39：临床研究EPO-PHI-373受试者基线以上的血红蛋白(g/dl)平均变化的关系图。

图40：临床研究EPO-PHI-373受试者基线以上的总血红细胞(×10¹²/l)平均变化的关系图。

图41：临床研究EPO-PHI-373中基线值校正后受试者药效学参数平均值±标准差(％CV)。

图42：临床研究EPO-PHI-358，EPO-PHI-359，EPO-PHI-370和EPO-PHI-373中基线值校正后受试者药代动力学平均值±标准差(％CV)。

图43：作为红细胞生成素α的AUC函数(0-29天)网织红细胞百分比的平均AUC变化(临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359)。

图44：作为红细胞生成素α的AUC函数(0-29天)网织红细胞百分比的平均AUC变化(临床研究EPO-PHI-370和EPO-PHI-373)。

图45：临床研究EPO-PHI-373中受试者基线以上的血红蛋白(g/dl)平均变化的关系图。

图46：临床研究EPO-PHI-370中受试者基线以上的血红蛋白(g/dl)平均变化的关系图。

图47：完成EPO实验(EPO-PHI-373)的34例受试者的人口统计和基本特征。18例受试者为第1组，接受150IU/kg一周3次的EPO剂量方案，18例为第2组，接受40,000每周一次EPO剂量方案。人口统计特征包括性别，年龄(岁数)，体重(kg)，身高(cm)和种族。图48：受试者未用预剂量内源性红细胞生成素校正的血清红细胞生成素α浓度，第1组(150IU/kg一周3次)用三角表示，第2组(40,000IU每周一次)用圆圈表示。

图49：受试者用预剂量内源性红细胞生成素校正的血清红细胞生成素α浓度，第1组(150IU/kg一周3次)用三角表示，第2组(40,000IU每周一次)用圆圈表示。

图50：组1(150IU/kg一周3次)和组2(40,000IU每周一次.)受试个体的平均(SD)(％CV)药代动力学参数值。

图51：临床研究EPO-PHI-373中用药组1(150IU/kg一周3次)和组2(40,000IU每周一次)的所有受试个体的有效人群的平均网织红细胞百分比基线以上根据研究天数变化的概况(SD)。

图52：所有受试个体的有效人群的平均网织红细胞百分比基线以上根据研究天数变化(SD)的关系图。开放圆圈代表组1(150IU/kg一周3次)，封闭圆圈代表组2(40,000IU每周一次)。获得的参数列于图51。

图53：临床研究EPO-PHI-373中组1(150IU/kg一周3次)和组2(40,000IU每周一次)的所有受试个体的有效人群的平均血红蛋白(g/dL)基线以上根据研究天数变化的概况(SD)。

图54：所有受试个体的有效人群的平均血红蛋白(g/dL)基线以上根据研究天数变化(SD)的关系图。开放圆圈代表组1(150IU/kg一周3次)，封闭圆圈代表组2(40,000IU每周一次)。获得的参数列于图53。

图55：临床研究EPO-PHI-373中所有受试个体的有效人群的平均血红细胞(×10¹²/L)基线以上根据研究天数变化的概况(SD)。

图56：所有受试个体的有效人群的平均血红细胞(×10¹²/L)基线以上根据研究天数变化(SD)的关系图。开放圆圈代表组1(150IU/kg一周3次)，封闭圆圈代表组2(40,000IU每周一次)。获得的参数列于图55。

图57：基线值校正后平均药效学参数值。％CV是变异系数百分率。注释如下：^a在一月研究期内网织红细胞百分率的AUC和用用药前基线值校正；^b在一月研究期内血红蛋白AUC和用用药前基线值校正；^c在一月研究期内血红细胞AUC和用用药前基线值校正；^d所有受试者40,000IU每周一次对150IU/kg一周3次平均参数值的比率；^e包括两个治疗组所有女性受试者；^f包括两个治疗组所有男性受试者；^g男性和女性受试者的统计学差异(p＜0.05)。

图58：用最适合的专有名词描述临床研究EPO-PHI-373中个别受试者的治疗突发副作用。

图59：两个治疗组和研究时间内铁，铁蛋白，转铁蛋白饱和和其它血清化学参数的基线以上平均变化。临床研究EPO-PHI-373中组1使用150IU/kg一周3次EPO，组2使用40,000IU每周一次EPO。

图60：临床研究EPO-PHI-373中两个治疗组和研究时间内铁，铁蛋白(ng/mL)基线以上的平均变化关系图。开放圆圈代表组1(150IU/kg一周3次)，封闭圆圈代表组2(40,000IU每周一次)。获得的铁蛋白参数列于图59。

图61：临床研究EPO-PHI-373中组1(150IU/kg一周3次)个体生命体征测量值基线以上平均变化概况。

图62：rHuEPO的刺激红细胞生成作用模型的图解展示。

图63：使用EPREX^R和PROLEASE^R的rHuEPO后药代动力学参数。

图64：使用rHuEPO后药效学参数。男性和女性的网织红细胞数据分别分析。这些参数反映在性别上有一些轻微的药效学差异。

图65：使用600IU/kg/一周3次EPREX^R 4周后药效学参数关系图。显示平均rHuEPO浓度-时间，网织红细胞浓度-时间和RBC浓度-时间关系图。男性受试者用封闭的圆圈表示，女性受试者用开放的圆圈表示。

图66：使用150IU/kg/一周3次EPREX^R一月后药效学参数关系图。显示平均rHuEPO浓度-时间，网织红细胞浓度-时间和RBC浓度-时间关系图。男性受试者用封闭的圆圈表示，女性受试者用开放的圆圈表示。

图67：2400IU/kg/mth单次给药PROLEASE^R后药效学参数关系图。显示平均rHuEPO浓度-时间，网织红细胞浓度-时间和RBC浓度-时间关系图。男性受试者用封闭的圆圈表示，女性受试者用开放的圆圈表示。

图68：使用不同剂量/治疗方案的rHuEPO后刺激的血红蛋白水平。

图69：体重为50，70和90kg受试者EPO剂量方案为600IU/kg/wk，使用24周与给予总剂量为40,000IU/wk的rHuEPO比较的刺激血红蛋白与RBC反应对时间关系图。

图70A：癌症患者使用150IU/kg/一周3次EPO剂量方案12周后刺激网织红细胞，RBC和血红蛋白反应对时间关系图。

图70B：癌症患者使用300IU/kg/一周3次EPO剂量方案12周后刺激网织红细胞，RBC和血红蛋白反应对时间关系图。

图70C：癌症患者使用450IU/kg/一周3次EPO剂量方案12周后刺激网织红细胞，RBC和血红蛋白反应对时间关系图。

图70D：癌症患者使用600IU/kg/一周3次EPO剂量方案12周后刺激网织红细胞，RBC和血红蛋白反应对时间关系图。

图70E：癌症患者使用900IU/kg/一周3次EPO剂量方案12周后刺激网织红细胞，RBC和血红蛋白反应对时间关系图。

图71：免疫抑制(IS)和非免疫抑制狗平均血红蛋白时间浓度对天数关系图。封闭圆圈代表使用50IU/kg/d EPO的IS狗，封闭方框代表使用50IU/kg/一周3次EPO的非IS狗，开放三角代表使用600IU/kg/wkEPO的IS狗，封闭三角代表使用600IU/kg/wk EPO的非IS狗，封闭菱形代表IS狗的生理盐水对照，阴影十字代表非IS狗的生理盐水对照。

图72：免疫抑制(IS)和非免疫抑制狗平均血红细胞时间浓度对天数关系图。封闭圆圈代表使用50IU/kg/d EPO的IS狗，封闭方框代表使用50IU/kg/一周3次EPO的非IS狗，开放三角代表使用600IU/kg/wkEPO的IS狗，封闭三角代表使用600IU/kg/wk EPO的非IS狗，封闭菱形代表IS狗的生理盐水对照，阴影十字代表非IS狗的生理盐水对照。

图73：猴的rHuEPO PK/PD模型。

图74：使用三种单次静脉注射给药和六种单独皮下给药EPREX^R后rHuEPO浓度时间关系图的拟合。所获得的参数列于图75。

图75：猴的PK参数。

图76A：400IU/kg，1000IU/kg和2400IU/kg剂量方案的平均网织红细胞浓度-时间关系图。

图76B：5000IU/kg，20,000IU/kg和40,000IU/kg剂量方案的平均网织红细胞浓度-时间关系图。

图77：猴的PD参数。

图78A：400IU/kg，1000IU/kg和2400IU/kg剂量方案的平均RBC浓度-时间关系图。

图78B：5000IU/kg，20,000IU/kg和40,000IU/kg剂量方案的平均RBC浓度-时间关系图。

图79A：400IU/kg，1000IU/kg和2400IU/kg剂量方案的平均血红蛋白浓度-时间关系图。

图79B：5000IU/kg，20,000IU/kg和40,000IU/kg剂量方案的平均血红蛋白浓度-时间关系图。

图80：人PD参数。

图81：人rHuEPO的PK/PD模型。

发明的详细描述

可以理解的是本发明并不局限于特定的方法学，方案和试剂等等，正如这里描述的，它们可以变化。同样可以理解的是，这里所用的术语仅仅是用来描述特定实施方案的目的，并不打算限制本发明的范围。必须注明的是在此和所附的权利要求中所用的单数形式”a”，”an”和“the”包括复数参考，除非上下文有明显的其他提示。

除非其他限定，在此所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的具有相同的含义。优选的方法，设备和材料也有描述，虽然任何同这里描述的相似或相同的方法和材料可以用于实践或检验本发明。这里所引用的所有参考文献在此整体作为参考。定义

a.m         上午，早晨

AUC              浓度对时间曲线下面积

AUC_(0-168)        0至168小时血清红细胞生成素α浓度的AUC

AUC(RETI)        基线以上网织红细胞百分率AUC变化

AUC(HEMO)        基线以上血红蛋白AUC变化

AUC(RBC)         基线以上总血红细胞AUC变化

BUN              血尿素氮

℃               摄氏度

C_max            最大浓度

C_min            从0至168小时用药前最低浓度AUC

CL/F             清除率/生物利用度

cm               厘米

CRF              个例报告单

CV％             变异系数，相对标准差

d                天

D                剂量(数量)

dL               十分之一升

g                克

h                小时

Hb               血红蛋白

Hct              血细胞计数

HIV              人免疫缺陷病毒

IRB              协会检查委员会

I                负反馈机制

IV               静脉注射

Kg               千克

L                升

LDH              乳酸脱氢酶

LOQ              定量限制

Ug               微克(也叫μg)

Mg               毫克

Min              分钟

ML          毫升

N/A         不使用的/能用的

Ng          纳克

Nm          纳米

NMR         核磁共振

No.         数目

NS          无统计差异

OTC         非处方药

q.w.        每周一次

QC          质量控制

r           相关系数

r²         确定系数

RBC         血红细胞

REF         参考文献

RETI        网织红细胞

RIA         放射免疫测定

rHuEPO      重组人红细胞生成素

RWJPRI      Robert Wood Johnson药理学研究机构

SC          皮下注射

SD          标准差

SE          标准误

SEM         平均标准误

SGOT        血清谷氨酸-草酰乙酸转移酶(AST)

SGPT        血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶

t_max       最大浓度时间

t.i.w.      每周三次

TIBC        总铁结合能力

t_1/2       半衰期衰减

WBC         血白细胞

WHOART      世界卫生组织副作用命名法

这里定义的EPO，指特异刺激造血干细胞来源的血红细胞最终分化和刺激血红蛋白生成的任何分子。例如，但不限制本发明的范围，EPO分子包括小的有机或无机分子，合成的或天然氨基酸肽，从重组或天然表达系统来源的纯化蛋白，或合成或天然的核酸序列，或前面提到的任何化学衍生物。红细胞生成素的具体实例包括红细胞生成素α(EPREX^R和PROLEASE^R)、新生红细胞形成刺激蛋白(NESP)(一种高糖基化的重组人红细胞生成素(Epoetin)类似物，见欧洲专利申请EP640619中描述)、人红细胞生成素类似物-人血清白蛋白融合蛋白(见国际专利申请WO9966054中描述)、红细胞生成素突变体(见国际专利申请WO9938890中描述)、从人红细胞生成素基因的一个ApaI限制片段产生的红细胞生成素Ω(见美国专利号5,688,679中描述)、改变糖基化的人红细胞生成素(见国际专利申请WO9911781中描述)、PEG结合红细胞生成素类似物(见WO9805363或美国专利5,643,575)。表达人内源性红细胞生成素的修饰的细胞系具体实例见国际专利申请WO9905268和WO9412650。一种优选形式的EPO是纯化，重组的EPO。例如，纯化、重组的EPO根据EPREX^R，PROLEASE^R或ERYPO^R的商标进行分发。尤其是，红细胞生成素α(EPREX^R，ERYPO^R)是一种无菌透明，无色，液体注射液，提供的包装是预装的，包含4,000或10,000IU红细胞生成素α(一种人重组红细胞生成素)和2.5mg/ml人血清白蛋白置于0.4ml(4,000IU注射器)或1.0ml(10,000IU注射器)的磷酸缓冲液的一次性注射器。

EPO也包括另外一些蛋白，这些蛋白是有生物学活性的人红细胞生成素，还有红细胞生成素类似物，红细胞生成素异构体，红细胞生成素仿制物，红细胞生成素片段，杂交红细胞生成素蛋白，红细胞生成素受体激动剂，肾脏红细胞生成素，上述的寡聚体和多聚体，上述的同源物，上述的突变体，不管相同的生物学活性，也不管它们的方法或合成或制造包括但不局限于自然产生的，重组的，合成的，转基因的和基因激活的方法，如EPO样蛋白。这些EPO和产生的方法学描述于美国专利US5,716,644，US5,674,534，US5,916,597，US6,048,524，US5,994,127，US5,955,422，US5,856,298，US5,756,349，US5,621,080，US5,547,933和US5,441,868。

这里定义的SC EPO施用，指通过一个药物输送装置输送期望剂量的EPO。药物输送装置可以穿透受治疗个体的表皮，将期望剂量的EPO导入个体的组织。本发明的输送装置包括但不局限于任何传统的皮下针形注射器，低空气压力针注射器，喷射式注射器或低气压针注射器(见，如美国专利第US5,730,723，US5,891,086，US5,957,886和US5,851,198)。

这里定义的极限水平指血清EPO浓度，血清EPO浓度持续超过这一水平将促进幼稚RBCs分化成成熟的RBCs。相反，血清EPO浓度保持在低限水平之下并不导致网织红细胞成熟成RBCs。

这里描述的一个患者包括由于一个疾病状态而需要治疗方案，或期望，增加血细胞计数，RBC数目或容氧能力的个体。

这里描述的下部结构包括系统的操作方面，这一系统将对系统的使用者更加透明。下部结构区项目的实例包括执行同步，处理事物的支持，数据结构支持和设备安全性等的设备。

这里描述的商业区包括所有关系到系统实际功能的操作和逻辑，因为它认为系统履行了实际的商业模型和方法。例如，如果商业模型提供了一种EPO剂量方案，销售定好剂量的EPO，商业区逻辑将包括商业运作的所有方面。这将包括制造，购买和销售EPO，对顾客检查和建立信用，等等。重要指出的是交易区并不包括下部结构相关活动的支持。

本发明的一个优选实例描述了一种剂量方案，其中EPO的用药是大约40000IU/kg，每周使用一次，连续使用两个星期。EPO第一次用药促进祖RBC细胞产生网织红细胞。第2次EPO给药与患者的网织红细胞药效学曲线图相一致。第2次EPO给药在初次给药后使用6-10天，优选在第1次EPO给药后网织红细胞浓度到达高峰时。

本发明的一个方面涉及用EPO刺激红细胞祖细胞增殖，在循环血中释放网织红细胞。在单次给药后，网织红细胞在6-10天的时间范围内到达高峰，到15天恢复至用药前水平。循环血中网织红细胞期的细胞寿命大约是1至2天。因此，本领域的专业技术人员可以预测到幼稚红细胞在给药后大约7至14天在血循环中出现。可以假设在最初使用EPO治疗后7至14天，幼稚红细胞转变成成熟红细胞EPO是必须的。在健康受试者中，成熟红细胞的的平均寿命为120天。在慢性贫血或其他疾病状态的患者中成熟红细胞的寿命可能短些。

本发明的另外一个优选实例包括一个剂量方案，其中EPO在一个包括两个或多个周期的用药周期中使用，其中EPO每周使用一次，连续使用两周。用药周期之间的时间长度优选与RBC的寿命相一致。RBC的寿命一般为120天，然而这一时间由于一种疾病状态或治疗方案可能会改变。因此，优选的是，EPO的第2个周期应优选在前一次使用后60-120天使用。

本发明的一个优选实施方案描述了在健康志愿者中静脉或皮下注射用药后血清EPO浓度的药代动力学模型，以及SC EPO的药效学模型，引起血中网织红细胞，RBC数目和血红蛋白浓度改变。另外，特殊的实例将继续利用本发明的PK/PD模型。这些包括：确定不通rHuEPO剂量方案血红蛋白反应的预期差异；评价受试者体重对持续rHuEPO治疗预期反应的作用；研究癌症患者与健康志愿者对rHuEPO是否具有相同程度的反应。

药代动力学模型和分析

数据描述模型和SC rHuEPO药代动力学数据是从The RobertWood Johnson药物研究院(RWJPRI)的临床研究中获得的。这个研究是由两个在健康志愿者中进行的可对比的，开放-标记，随机，平行，安慰剂对照的研究组成，其中rHuEPO使用8种单次SC的EPREX^R给药：300，450，600，900，1200，1350，1800，2400 IU/kg和多次剂量方案：150IU/kg一周三次，用4个星期，600IU/kg每周一次，4个星期。每一治疗组有5个受试者。

使用rHuEPO后测定rHuEPO浓度用基线值校正，因为使用的放免法不能辨别内源性EPO和rHuEPO。每一受试者的基线EPO浓度是用药前测定值的平均值(10，20和30分钟)。用药后每一时间点测定值减去前述值获得了校正后的血清rHuEPO浓度。所有受试者的校正后浓度的平均值用于数据分析。在测定检测值(7.8IU/l)低限以下的测定值不用作数据值。静脉应用的数据也用基线EPO水平校正。

从文献中获得的IV数据的前瞻性分析中，一种一室模型比较适合。据报道rHuEPO分布主要不是线性的，因为清除呈剂量依赖性的下降(见Macdougall等，1991.Clin.Pharmacokinet.20：99-113)。因此，Michaelis-Menten函数用来描述rHuEPO分布。rHuEPO浓度(C_EPO＝Ap/Vd)的IV数据对时间符合以下公式：

$\frac{\mathrm{dAp}}{\mathrm{dt}}=-\left[\frac{V\max }{K{m}^{*}\mathrm{Vd}+\mathrm{Ap}}\right]*\mathrm{Ap}----\left(1\right)$

其中Ap是体内rHuEPO的量，Vmax是该过程的容量，Km是亲和力常数或血浆rHuEPO浓度，其清除率到达Vmax的一半，Vd是分布体积。

不同剂量的IV浓度时间概况见表2。非线性分布的单室模型用来描述rHuEPO的动力学。值得注意的是，一种两室模型可能更好的适合早期的IV数据；不过，它将会使总体数据的拟合产生更大的复杂性。所以，我们选择了单室模型，因为它能进行合适的拟合并为本研究的目的服务。另外，由于rHuEPO是一个30Kda蛋白，可以预测它可以被限制在血管腔内，因此验证了单室模型的选择。

通过拟合获得的参数列于图3。获得的Vd(0.0558L/Kg)和Vmax/Km(例如，低剂量CL：0.0066L/hr/kg)在文献报道推算的范围内(见，Macdougall等，见上和Lappin等，1996.Clin.Lab Haem.18：137-1458.)。最大的Km值表明EPO分布仅仅是轻微的非线性，剂量依赖的清除只有在高剂量时才重要。大鼠研究表明rHuEPO在骨髓与脾中与受体的结合有助于rHuEPO的饱和性清除(见，Kato等，1997，J.Pharmacol.Exp.Ther.283：520-27)。

SC EPO的药代动力学被发现其最佳特征是双向吸收模型，其中大多数药物有一个快速的0级快速吸收(87％被吸收)，然后是小部分药物的缓慢1级吸收(13％被吸收)。其生物学利用度发现根据剂量而增加(范围是46-100％)可以解释动力学的非线性。模型(图4)的的微分方程显示如下：

$\frac{\mathrm{dAp}}{\mathrm{dt}}=\mathrm{ko}(0-\mathrm{\τ})+k_1(t>\mathrm{\τ})-\left[\frac{V\max }{K{m}^{*}\mathrm{Vd}+\mathrm{Ap}}\right]*\mathrm{Ap}----\left(2\right)$

其中

ko＝0                         当t＞τ时

当0＜t≤τ时

k₁＝0                         当t≤τ时

和

k₁＝ka^*F^*剂量^*e^{-(ka·(t-τ))}  当t＞τ时

静脉应用rHuEPO设定为100％的生物学活性。SC用药后后的生物学利用度表示为参数F。相应地，与1级过程相关的rHuEPO数量用F^*Fr^*剂量计算，0级过程的吸收用F^*(1-Fr)^*剂量。

所有的拟合采用ADAPT II软件(见，如Argenio等，1998.ADAPTII使用说明书，生物医学模拟资源，南加里福尼亚大学，洛杉矶)，尽管也可以应用任何合适的软件。参数的推算使用最大似然方法的最小平方拟合，扩展的最小平方方差模型如下计算：

V(1)＝Inter^2*Y(1)^σ+0.0001    其中Y(1)＝Ap/Vd

8个单次SC给药和5种IV剂量水平同时进行拟合。在最初的拟合中，Vmax，Km，Vd，ka，Fr和方差参数不随剂量变化而变化，而τ和F跟随剂量变化。结果表明，τ固定为一个单一值直至1350IU/kg，而对最后两种剂量，最好取较高的τ值。生物利用度F发现在检测的一定剂量范围内与剂量成比例增加，用线性方程描述(r²＝0.9713)，见下：

F＝0.3884+0.00024952^*剂量                             (3)

线性回归后，450IU/kg剂量的F值被排除，因为它似乎是一个无关项。最后的拟合采用这种函数根据剂量设定F值，对于所有剂量τ固定为44小时，除了最后两个的τ设定为60小时。这使采用Vmax，Km，Vd，ka，Fr和方差参数的单一设定值来描述所有的参数成为可能。600IU/kg/周多次给药的数据使用相同的参数模拟，参数的F值设定为60％，因为它可进行最佳的拟合。对150IU/kg一周3次治疗方案，F固定为25％。另外，对这一低剂量，有必要增加Vd(0.11931/kg)，设置τ为18小时。

图5A和5B显示了不同的单次SC给药的平均rHuEPO浓度-时间关系图。目测的SC数据清晰的表明了触发性动力学，由于最后斜率与IV单指数斜线相比较为平坦。因此，1级吸收率常数指定用于捕获终末期。数据也表明rHuEPO浓度在一天内迅速到达Cmax峰值，提示一定也有一个更快的吸收过程。这一迅速的上升曲线可解释为一个0级吸收过程。所有剂量的最后斜率是平行的，表明单一的1级吸收率ka可解释所有剂量的这一期。与缓慢的1级吸收过程相关的剂量部分仅为13.1％。因此，大部分生物活性的药物通过0级成分在2-3天内迅速吸收。1级吸收率ka可解释rHuEPO从皮下区的缓慢持续释放。相似的双重吸收率模型用于在SC用药后作为另一种大分子，IL-10吸收动力学的特征(见，Radwanski等，1998.Pharm.Res.15：1895-1902)。

图6提供了不同的单次SC给药AUC对剂量的图表。随剂量的增加，更高的AUC增加比例表明不管CL或生物利用度或二者皆有均是随剂量变化的。rHuEPO的清除发现仅有非常轻微的非线性。另一方面，F可以增加与剂量相关的线性(图7)，并且证明是引起与SC给药不成比例的AUC增加的主要因子。在最后两个高剂量中，CL降低也证明是非线性的。图8列了所有剂量的F值，这些值是通过重折叠和将数据从个别用药中代入拟定的模型中获得的。使用两种方法获得的推算值非常相似，因此表明本发明的药代动力学模型可以正确的解释由于F值变化引起的非线性。

SC rHuEPO生物利用度的不完全性和非线性的原因并不知道。例如，IL-10蛋白在SC给药中仅显示了42％的生物利用度，丧失的可能是由于蛋白水解酶的作用(见，Id.)。依次，这些酶在高浓度的肽或蛋白底物下可能是饱和的。双重吸收过程可能是由于淋巴细胞在控制SC给药后大分子进入中的地位有关。迅速的早期吸收期可能是由于大部分药物漏入局部血管的原因，而后期可能与通过淋巴系统缓慢进入有关。

150IU/kg一周3次和600IU/kg/周多次剂量方案的rHuEPO浓度对时间的模拟显示在图9中。本发明的药代动力学模型，大部分参数固定为单次给药拟合获得的值，准确地描述了多次给药的数据。对较低的150IU/kg多次剂量方案，必须增加Vd值。这可能是由于当生物利用量如此低时，分布中的非线性的原因。Vd相同的变化也便于拟合10IU/kg IV的用药，其中最大浓度也在相同的范围内。

药效学模型和分析

描述血中网织红细胞，红细胞数目和血红蛋白水平的药效学数据是从RWJPRI临床研究中获得的。这是由两组健康受试者进行的可比较的，开放标记的，随机的，平行的，安慰剂对照的研究组成的，rHuEPO的使用有8个EPREX^的单次SC剂量：300，450，600，900，1200，1350，1800，2400IU/kg和多次剂量方案：150IU/kg一周三次共用4周和600IU/kg每周一次用4周。每一治疗组有5个受试者。测定的药效学终末值是网织红细胞数目，血RBC和血红蛋白计数。

药效学数据使用细胞产生和衰减模型描述，它描述了使用rHuEPO后细胞数目随时间的变化。根据这一模型，参与红细胞生成过程的所有细胞被认为以0级方式(k0)产生的：它们生存一段固定的时间期，最后死亡或转变成其它细胞。结果，这些细胞的衰减率正好与它们的出生率相同，除了它们衰减间期与细胞的寿命相同以外。现在认为任何单独一种细胞的寿命长短是固定的，一种类型的每一个细胞都是相同的。

图10提供了本发明的一个PD模型的图解示意图。每一个祖细胞(TP)，网织红细胞(R_L)，和血红细胞(RBC_L)的寿命都有指示。小室反映了血中的红细胞祖细胞(P)，网织红细胞(R)，血红细胞(RBC)和血红蛋白(Hb)池。使用rHuEPO刺激红细胞生成(Cp(t))是通过Hill函数(S(t))作用于骨髓中的祖细胞实现的。

模型的微分公式如下：

dp/dt＝k0[S(t)-S(t-TP)]                              (4)

dR/dt＝k0[S(t-TP)-S(t-TP-R_L)]                      (5)

dRBC/dt＝k0[S(t-TP-R_L)-S(t-TP-R_L-RBC_L)]             (6)

其中

$S\left(t\right)=\frac{S_{\max }*(\mathrm{Cp}\left(t\right)+C_{\mathrm{bs}})}{{\mathrm{SC}}_{50}+\mathrm{Cp}\left(t\right)+C_{\mathrm{bs}}}----\left(7\right)$

$S(t-\mathrm{TP})=\frac{S_{\max }*(\mathrm{Cp}(t-\mathrm{TP})+C_{\mathrm{bs}})}{{\mathrm{SC}}_{50}+\mathrm{Cp}(t-\mathrm{TP})+C_{\mathrm{bs}}}----\left(8\right)$

$S(t-\mathrm{TP}-R_L)=\frac{S_{\max }*(\mathrm{Cp}(t-\mathrm{Tp}-R_L)+C_{\mathrm{bs}})}{{\mathrm{SC}}_{50}+\mathrm{Cp}(t-\mathrm{TP}-R_L)+C_{\mathrm{bs}}}----\left(9\right)$

$S(t-\mathrm{TP}-R_L-{\mathrm{RBC}}_L)=\frac{S_{\max }*(\mathrm{Cp}(t-\mathrm{TP}-R_L-{\mathrm{RBC}}_L)+C_{\mathrm{bs}})}{{\mathrm{SC}}_{50}+\mathrm{Cp}(t-\mathrm{TP}-R_L-{\mathrm{RBC}}_L)+C_{\mathrm{bs}}}----\left(10\right)$

S_max是rHuEPO对网织红细胞产生的最大可能刺激作用，SC₅₀是产生最大刺激作用的一半的血浆rHuEPO浓度。参数Ks定义为Ks＝k0*Smax，它表示了rHuEPO刺激后细胞最大可能生成率。

SC₅₀也可作网织红细胞转变成RBC的最低rHuEPO浓度限度。可以假设当rHuEPO浓度低于这一限度时，网织红细胞不能转化为红细胞。这一过程中模型方程的模拟函数如下：

如果Cp(t)≤SC₅₀，那么Cp(t-TP-R_L＝0)                 (11)

且Cp(t-RBC_L)≤SC₅₀，那么Cp(t-TP-R_L-RBC_L)＝0         (12)

基线条件(稳定状态水平)定义如下：

$\frac{\mathrm{dPss}}{\mathrm{dt}}=0,$ $\frac{\mathrm{dPss}}{\mathrm{dt}}=0$ 和 $\frac{\mathrm{dRBCss}}{\mathrm{dt}}=0----\left(13\right)$

结果，初始条件本身限定了平稳状态本身。

Pss＝P(0)，Rss＝R(0)和RBCss＝RBC(0)                   (14)

前体的稳定状态条件可以明显形式的方式定义如下：

Pss＝kin*TP                                           (15)

由于前体腔室的基线条件仍不了解，14*10¹⁰细胞/L/hr的值可用上述方程和Kin的文献估计值来赋值(19)。

血红蛋白水平变化可简单使用了一个成比例因子Hb_cell来模型化，Hb_cell代表每个细胞中的血红蛋白含量(网织红细胞或RBC)。

Hb(t)＝Hb_cell*细胞数(t)                               (16)

如图1中所描述的，红细胞生成涉及一系列的级联反应。模型中的前体腔室代表骨髓中参与到这一过程中的所有细胞，它们最终转化成网织红细胞。因此时间TP作为rHuEPO刺激早期祖细胞经历一系列级联的分化过程，最后转变成网织红细胞的平均时间长度。换一句话说，它说明了初始使用rHuEPO后见到网织红细胞生成的时间间隔。一旦一个网织红细胞形成了，它会存在与R_L相等的时间，在那一点转变成RBC。现在认为网织红细胞的主要去路是转变成红细胞，除非是在亚阈值条件下。本模型并不能解释细胞的随机破坏，如出血。因此，所有这些细胞的产生和衰减率可以用一个单独的0级率常数k0来表示。一旦一个红细胞产生了，在从血中消失后，它依次存活的时期为RBC_L的天数。

网织红细胞转化成RBC部分发生在骨髓，部分在血中，需要72小时的间期(见，如Jusko，1994.Clin.Pharmacol.Ther.56：406-19)。网织红细胞在骨髓中形成，通过渗出进入循环，在循环中这些不成熟细胞在转化为红细胞前经过24-48小时转化成红细胞(见，如Guyton，1996.医学生理手册，W.B.saunders，Philadelphia.)。由于已知rHuEPO刺激网织红细胞的未成熟体从骨髓中的释放，可以认为这些新生的细胞在rHuEPO刺激下在血中的整个寿命为72小时。因此，网织红细胞的寿命，RL被确定为72小时。基于文献值，RBC的寿命，RBC_L被确定为120天，每一细胞的Hb含量确定是29.5pg/细胞(见，如Jusko，见上和Guyton，见上)。网织红细胞和红细胞二者都被认为与血中的总Hb含量有关。

而且，新细胞的产生(Ks率)和衰减模型用来获得SC50和Ks估计值。网织红细胞和血红细胞寿命分别是3天(72小时)和120天(2880小时)。网织红细胞在血中出现的迟滞期是通过介入一种代表祖细胞的前体腔室来估计的。0.3709×10¹⁰细胞/L/hr的Ks值的获得产生一个粗略的S_max为2，反应了红细胞生成的适度的最大刺激作用。获得的SC₅₀是23IU/L，表明低血清浓度的rHuEPO足以维持刺激作用。与rHuEPOSC₅₀相等的阈值浓度对血中网织红细胞转化成红细胞是必要的。单次给药rHuEPO最高至900IU/kg在红细胞产生过程中不能维持rHuEPO水平于阈值之上。这解释了尽管在使用4种较低剂量的单次SC给药后刺激网织红细胞的产生，但RBC数目仍未增加的原因，结果在短时间内Hb仅发生了非常小的变化。另外，阈值概念解释了Hb水平对rHuEPO多次剂量方案的更好反应，这一方案引起Hb水平的明显改善。研究的平行特性在对不同rHuEPO剂量的反应上产生变化，但单组参数为剂量范围和治疗方案反应特征提供了合理的解释。

图11描述了所有单次SC用药的平均网织红细胞数目对时间曲线图。网织红细胞计数与第一样品点的用药前水平相比只有轻度增加。这一水平持续3-4天，其后稳定的增加大约200-300小时到达峰值。然后，网织红细胞计数开始迅速下降，半衰期为25小时，在22天(528小时)到达基线水平。

拟合的数据和模型见图12A和12B。通过将数据代入药效学数据方程中获得的参数估计见图13。获得的Ks是0.3709×10¹⁰细胞/L/hr，假定血液体积为5L，转换过来即4.451×10¹⁰细胞/天。已知健康人所有RBC每天破坏1％通过网织红细胞代替，红细胞产生率(K0)为2-3×10¹¹细胞/天。因此，估计的S_max是1.5-2.2，表明rHuEPO可以使网织红细胞0级产生率最大增加2.5至3.2倍，刺激作用相对缓和可以解释血中缓慢有限的增加。

获得的SC₅₀为22.58IU/L反映了引起最大刺激作用的一半所需的血清rHuEPO浓度。只要血清rHuEPO浓度保持在这一值以上，细胞计数应保持在基线值以上。正常的红细胞祖细胞，不管来源，表面的EPO受体低于1000个。EPO与受体的结合引起的信号转导活动最终导致刺激骨髓中红细胞祖细胞的分化和增殖(见，如Lappin，见上)。另外，EPO加速网织红细胞从骨髓中的释放致使血清中网织红细胞和红细胞数目(Id)增加。0时间点后看到的网织红细胞水平的轻微增加可能是由于不成熟网织红细胞从骨髓中的早期释放引起的，而并不是由于这些早期时间的模型。

获得的低SC₅₀值22.58IU/L反映了一个事实，即红细胞表面受体区域数目较少，这些受体可能容易饱和，因此，高剂量迅速释放可能导致了相当大的rHuEPO生物利用度的丧失。剂量增加或缓慢释放促进rHuEPO水平较长时间保持在SC₅₀以上，因此刺激网织红细胞产生的程度和间期增加。这一概念解释了最近两个临床实验的结果，实验表明SC rHuEPO在刺激红细胞产生上较IV用药更有效。尽管生物学利用度更低，延长吸收的SC用药可以更有效的刺激RBC的产生。(见Kaufmann等，1998.N.Engl.J.Med.339：578-83和Besarab等，1992.Am.Soc.Nephrol.2：1405-12.)。

图12A和12B显示一些剂量水平的药效学数据是可以改变的，这表明在增加剂量的刺激程度方面的不一致性。例如，600和1200IU/kg剂量较900和1350IU/kg细胞产生数目有轻微的增加。然而，回到基线的方式在剂量间似乎相似。总之，本发明的模型捕获了反应的趋势，考虑数据的可变属性和一组参数可以正确描述所有剂量的药效学数据。通过允许每组Ks和SC₅₀可以改变获得每一剂量水平更佳的数据拟合。这可能是有道理的，因为这些是平行的用药组，但因此为了概括的目的，参数必须平均。

图14显示8种单次SC用药剂量和刺激血红蛋白反应对时间曲线图。血红蛋白水平的变化，如果有的话，也非常微小，这可以解释成rHuEPO浓度在7天时降至阈值极限，因此阻止了新生网织红细胞向红细胞的转化。因此网织红细胞数量在剂量至900IU/kg时增加仅引起了血红蛋白水平的轻微增高，在那以后RBC的轻微增加也归因于持续的高Hb水平。如Flaharty等，见上报道的这一阈值概念可以解释在健康受试者中单独静脉注射至1000IU/kg剂量时，网织红细胞反应的剂量依赖增加，而血细胞计数或血红蛋白反应并不明显增加。

图15和图16显示网织红细胞，RBC和血红蛋白计数在多次rHuEPO SC剂量的模型产量。包括了两种剂量方案的药效学反应。大部分时间rHuEPO浓度保持在这一域值之上，使网织红细胞有机会转变成RBC，反映了多剂量与单剂量给药相比具有稳定的血红蛋白水平增加。不同的单次SC给药的拟合和多次SC给药的模拟表明通过使用几次小剂量使rHuEPO浓度保持在SC₅₀以上有助于Tib水平的持续增加，与单次应用相同总剂量相反。在稍后的实例中，低于SC₅₀浓度很快引起网织红细胞反应消失，更重要的是无效的血红蛋白反应。

总之，本发明的PK/PD模型阐明在控制rHuEPO反应中剂量，剂量方案和给药途径的重要性，可以用来作为有价值的工具设计不同条件下最佳的rHuEPO剂量和再应用时间。另外，本发明提供了应用计算机系统定做EPO治疗的剂量和日程，患者因此接受最合适的方案，例如，增加的血红蛋白和网织红细胞的产生，或提供适合患者需要的剂量方案，例如，每星期一次或两星期一次。

商业方法

在本发明的一个特殊的实施方案中，可以使用一种与提供EPO剂量方案和销售规定剂量EPO相关的商业方法。在一个特殊的实施方案中，方法通过本发明的计算机系统进行工作。例如，一个使用者(如一个健康的实习生如医师或药师)可以通过计算机终端和通过互联网或其它方法进入本发明的计算机系统。在使用者和计算机系统之间的联系是非常安全的。

在实践中，使用者可以输入，例如，与患者相关的概况如患者的疾病状态，红细胞比积，血红蛋白浓度，和其它与患者网织红细胞和/或RBC计数相关的因子，如希望的或合适的网织红细胞或RBC数量。然后计算机系统可以通过使用所属计算机项目为患者提供一种或更多种合适的EPO剂量方案。计算机项目，通过使用者界面，也可以提供不同EPO或类EPO药品的价格和花费比较，还有，或分别，合适EPO或类EPO剂量方案。

本发明的与优选实例相适应的计算机系统可以是，例如，一种增加IBM AS/400中范围计算机系统。然而，本领域的专业人员将正确评价本发明应用的方法，本发明的设备可同等应用于任何计算机系统，不管这一计算机系统是一个复杂的多用户计算设备或一个单独的用户设备如一个个人计算机或工作平台。计算机系统组成一个处理器，主存，内存控制器，一个辅助储存界面和一个终端界面，所有这些通过一个系统总线总线相互连接。注意可以在本发明的范围之内对计算机系统进行不同的修饰，添加或删除，如添加缓存或其它外周设备。

处理器执行计算机系统的计算和控制功能，并且包括一个合适的中央处理器(CPU)。处理器可以包括一个单独的整合回路，如微处理器，或包括任何合适数量的整合回路设备和/或共同完成处理器功能的电路板。处理器在它的主存内恰当的执行了PK/PD模型计算机程序。

在一个优选的实施方案内，辅助储存界面允许计算机系统储存和获得来自辅助储存设备的信息，如磁盘(硬盘或软盘)或光储存设备(如CD-ROM)。一种合适的储存设备是直接访问的储存设备(DASD)。DASD可以是一个软盘驱动器，可以从软盘上读取程序和数据。重要指出的是虽然本发明已经(并且将继续)在上下文中描述了全部功能的计算机系统，但是本领域的专业技术人员仍然认可本发明的机制能以不同的形式作为一个程序产品进行分配，而且不管特异类型的信号存储媒介实际进行的分布的特殊类型，本发明同样可以应用。信号存储媒介的实例包括可记录类媒介包括软盘和CD ROMS，和和传递类媒介如数字和类似通讯连接，包括无线传递连接。

本发明的计算机系统也包括一个内存控制器，通过使用单独的处理器，负责将来自主内存的请求和/或通过辅助储存界面移动至主处理器。虽然为了解释的目的，内存控制器仍描述为单独的主体，本领域的专业技术人员可以理解，实际上，内存控制器提供的功能部分实际上驻留在与主处理器，主内存和/或辅助存储界面相关的电路上。

而且，本发明的计算机系统可能包括一个终端界面，允许系统管理者和计算机使用者与计算机系统交流，通常通过可操作的工作平台。可以理解本发明同样可以应用于具有多处理器和多个系统总线的计算机系统中。相似的是，虽然优选实施方案的系统总线是典型的硬布线，多支路总线，任何连接意味着在计算机相关的环境中可以使用支持性双向交流。

本发明计算机系统的主存合适的包含了一个或多个与EPO使用PK/PD模型相关的计算机程序和操作系统。内存中的计算机程序的含义很宽，包括任何和所有形式的计算机程序，包括源代码，中间代码，机器编码，和其他任何一个计算机程序的代表形式。这里使用的术语“内存”指在系统虚拟内存空间内的任何存储地址。应该理解的是计算机程序和操作系统部分可能装入指令高速缓存中让主处理器来执行，同时其他文件可以更好储存至磁盘或光盘储存设备。另外，可以理解的是主内存可能包括根本不相同的内存地址。

本发明的其它目的，特性和优点在以下特殊实例中会变得更明显。特殊的实例，虽然指本发明的特殊实施方案，仅仅通过例证的方法提供。因此，本发明也包括那些在本发明的精神和范围内的不同的变化和修饰，从这些详细的描述中本领域的专业技术人员也会明白。

实例1：人EPO的药代动力学和生物学利用度

本发明的下述实例提供了PK/PD数据摘要，支持40000Iu每周一次剂量方案。数据来自于文献和4个RWJPRI，Raritan，NJ进行的临床研究。三个研究由Investigational New Drug BB-IND-2318执行，一个研究在UK执行。研究的主要情况见图17。

包括在这个技术概述中的临床药代动力学研究见图18A-18D，这些药代动力学数据概述见图19。确定血清EPO浓度所用的分析方法总结如下和图20。

临床研究EPO-PHI-373(图17)提供了支持40,000IU每周一次用药方案的数据。临床研究EPO-PHI-370(图17)与临床研究EPO-PHI-373设计相似。

在临床研究EPO-PHI-370中，存在随机化问题，在开始时血红蛋白水平波动，且许多受试者均有铁离子缺乏。研究地点的随机化偏差导致了每个治疗组中男性和女性不均衡分布，并造成了血红蛋白值平均基线水平的不平衡。对血液学数据的回顾显示，一些受试者的血红蛋白在筛选和基线评价值之间实际上有波动。进一步调查表明有与设备校准相关的实验室不一致性。为了证实本研究的阳性结果，确定应当进行一次重复研究。临床研究EPO-PHI-373是临床研究EPO-PHI-370的重复研究。

临床研究EPO-PHI-358(图17)和EPO-PHI-359(图17)是两个调查剂量成比性的试验性研究，以获得不同的单次和多次给药后初步的药代动力学和药效学资料。

体内研究的一般分析方法

概述

建立并确认了生物分析方法以支持由RWJPRI，Raritan，NJ进行的EPO临床实验。最初用于确定人血清中EPO浓度的方法是放射免疫测定(RIA)(RWJPRI研究Nos DM92001和DM96023)。这种方法成功地转让给PPD Development(PPD)，Richmond VA，后者是进行辅助性临床研究(EPO-PHI-370)分析的合同研究机构。这种RIA方法为在PPD进行关键研究(EPO-PHI-370)的分析，而与酶联免疫吸收实验(ELISA)完全交叉确认。为了检验RIA和ELISA之间的可比性，由RWJPRI准备了一组16个储存的人受试者样品，在PPD公司同时进行ELISA和RIA分析。ELISA改善了试剂的可得性、分析时间并在不损失敏感性情况下扩展了标准曲线的范围。

检测类型

放射免疫测定在临床研究EPO-PHI-358、EPO-PHI-359(在RWJPRI进行)和EPO-PHI-370(在PPD进行)中被用于进行EPO的定量测定。ELISA在临床研究EPO-PHI-373(在PPD进行)中用来进行EPO的定量测定。

RIA方法最初由诊断系统试验室(Diagnostic Systems Laboratories.DSL)，Webster，TX开发，用于进行EPO的定量测定，其结果与RWJPRI方法获得的结果进行比较。市售的RIA是一个双抗体的竞争性方法，采用人尿EPO的兔多克隆抗血清作为一抗，¹²⁵I标记的人尿EPO为示踪剂。该方法遵循放射免疫测定的基本原理，即放射活性和非放射活性的抗原竞争固定数量的抗体结合位点。结合到抗体上的¹²⁵I标记EPO的数量与血清中存在的EPO浓度呈反比。采用加速的双抗体聚乙二醇系统可以很容易和迅速地分离游离的和结合的抗原。DSL试剂盒的主要内部改变是在标准的和形成尖峰的质量控制样品中用重组的人EPO代替尿EPO。在测定中使用的标准浓度是7.8、15.6、31.3、50、62.5、100和125mU/mL。这种准确的方法被PPD转接并由其验证。

PPD的免疫化学部证实了ELISA测定人血清中EPO浓度的有效性。ELISA是由R&D Systems公司，Minneapolis，MN开发的一种直接双重抗体夹心测定法，以定量测定血浆或血清中的EPO浓度。用r-HuEPO特异单克隆(鼠)抗体预包被的微量滴定孔被用于捕获EPO。结合的EPO用抗EPO多克隆(兔)抗体和辣根过氧化物酶(交联)进行标记。通过添加四甲基联苯胺/缓冲的过氧化氢(底物)产生了最佳的信号。产生颜色的量与样品或标准品中的EPO浓度成正比。R&D试剂盒主要的内部改变是在标准的和形成尖峰的质量控制样品中采用内部重组人EPO。在测定中使用的标准浓度是7.8、15.6、31.3、50、62.5、100、125和250mU/mL。

标准曲线的范围

临床研究EPO-PHI-358、EPO-PHI-359和EPO-PHI-370中使用的RIA，其标准曲线范围是用0.1mL样品试样的7.8至125mU/mL。RWJPRI标准曲线的精度为≤5.8％，PPD为≤10.8％。在临床研究EPO-PHI-373中用于检测临床样品的ELISA显示在0.1mL样品试样中的浓度范围是7.8至250mU/mL，精度≤5.3％。

定量的低限

定量低限(LLOQ)，即可以准确和精密量化的最低可测量标准浓度，在RIA和ELISA中均为7.8mU/mL。

质量控制

两种方法的质量控制样品(QCs)均是以空白血清制备的，以反映研究中期望的浓度。在RWJPRI的RIA确认过程中检测的QC浓度是35、60、100、300、1000和2000mU/mL。在PPD的RIA确认过程中检测的QC浓度是100、500、2000和5000mU/mL。用于ELISA的QC浓度是7.8、20、100、500、2000和5000mU/mL。在每天的样品分析中，至少3个水平的人血清QCs与研究样品一起被检测。

RWJPRI从以前的临床研究中制备了一组16个合并的人血清样品，PPD运来了盲态的样品，均进行RIA和ELISA检测。从两种方法获得的值之间计算的相对百分比差异被确定为15.8％(对于最低水平QC)或更好。

因为一些样品的期望浓度超过了最高的标准曲线浓度，也显示了稀释性线性度。在RWJPRI确认RIA的过程中，采用一系列1∶30至1∶256倍稀释的QC样品建立了稀释的线性度。在PPD，稀释性线性度在RIA确认过程中用QC样品的1∶20至1∶200倍稀释液证实，并从一个具有高浓度EPO的受试者体内样品的1∶20至1∶100倍稀释液中证明。在确认ELISA的过程中，稀释性线性关系是采用5000mU/mL QC的1∶50-、1∶100-和1∶200倍稀释液建立的。

回收

检测的进行没有样品提取，因此不需要回收率的评价。

准确度和精度

在RIA中，检测内的准确度范围(在测定浓度和目标浓度之间的百分比差异)在RWJPRI为102.7至127％，在PPD为95.5至100.3％。检测间的准确度范围在RWJPRI为81.7至109.8％，在PPD为100至105.6％。在ELISA中，检测内准确度为87.9至109.9％，检测间的准确度为83.6至116％。

在RIA中，检测内精度(百分比变异系数)在RWJPRI为≤8.2％，在PPD为≤5.3％。检测间精度在RWJPRI为≤15.1％，在PPD为≤7.2％。在ELISA中，检测内精度为≤10％，检测间精度为≤12.9％。

稳定性

人血清中EPO的稳定性在-20℃20个月、室温下2小时、以及4次冷冻/融解循环中得到证明。

数据分析和可接受标准

在两种检测中，经确认的4参数对数曲线被用来从标准曲线中确定未知的血清样品EPO浓度。来自RWJPRI进行的RIA数据被采用Micromedic软件(ICN Biomedicals公司，Costa Mesa，CA)换算。来自PPD进行的RIA和ELISA数据采用PPD Development Oracle 7.3专有RICORA数据库进行换算。当QCs在标定值的20％之内、且重复试验的每分钟计数之间的差异≤6％时，RIA测定是可接受的。当QCs的准确度和精度均在20％之内时ELISA测定是可以接受的。

单个研究的总结

初步探索性研究，EPO-PHI-358和EPO-PHI-359

临床研究EPO-PHI-358和临床研究EPO-PHI-359是两个初步的探索性研究，它们是设计用来调查皮下给药后EPO的剂量成比性。由于研究设计上相似，来自两个研究的数据被合并以使药代动力学和药效学分析的剂量范围最大化。

临床研究EPO-PHI-358的目的是确定单次皮下给予EPO 450-、900-、1350-或1800-IU/kg后的药代动力学和药效学关系，并将这些资料与典型的150-IU/kg一周3次连续4周的用药方案相比较。临床研究EPO-PHI-359的目的是确定单次皮下给予EPO 300-、600-、1200-或2400-IU/kg的药代动力学和药效学概况，并将这些资料与典型的600-IU/kg每周1次连续4周的用药方案相比较。每个研究中均设有一个安慰剂组。

在两个研究中使用的EPO剂型为40,000IU/mL，无防腐剂的磷酸盐缓冲液中含有2.5mg/ml人血清白蛋白、5.84mg/mL氯化钠、1.164mg/mL磷酸钠单碱二水化物和2.225mg/mL磷酸钠双碱二水化物(剂型号FD-22512-000-J-45；产品批号5C903J；生产日期，1995年3月)。两个研究中使用的安慰剂剂型是含有2.5mg/mL人血清白蛋白、5.84mg/mL氯化钠、1.164mg/mL磷酸钠单碱二水化物和2.225mg/mL磷酸钠双碱二水化物(剂型号FD-22512-000-ABX-45；产品批号5C902J；生产日期，1995年3月)的无防腐剂磷酸盐缓冲液。

两个研究都是开放标记、随机化、安慰剂对照、平行分组、单中心研究。32个健康受试者入组临床研究EPO-PHI-358，30个受试者完成了研究并包括在PK/PD分析中。30个受试者入组并完成了临床研究EPO-PHI-359。这两个研究中受试者的人口统计学数据列在图21中。

在600-IU/kg每周1次用药方案中的第1至4周之间，和150-IU/kg一周3次用药方案的第4周期间，多次收集系列血样以进行血清EPO测定。用于测定血清EPO的给药前一周血样也被收集。对于单次用药组，用于血清EPO测定的系列血样在4周研究期间内采集。在4周研究期间内同时收集测定血中网织红细胞百分比(％RETI)、总红血细胞(RBC)和血红蛋白(HEMO)的血样。

RWJPRI，Raritan，NJ进行了血清EPO的样品分析。DSL生产、RWJPRI改良的RIA试剂盒方法被用来测定血清EPO浓度。这种方法及其确认在第4节中描述。药代动力学和药效学参数通过描述统计学数字总结。临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359中受试者的平均血清EPO浓度-时间曲线分别在图22和23中显示。

单次用药后血清EPO浓度在第15天下降至内源性EPO水平，而150-IU/kg一周3次用药方案可以在整个治疗过程中保持血清EPO浓度在给药前的内源性EPO水平之上(图22)。本组受试者的平均给药前内源性EPO的浓度为14±4mIU/mL，在第四个用药周中的第一次、第二次和第三次给药前的平均谷浓度(用基础EPO校正的)分别为19±9、48±18和52±25mIU/mL。在给药期间血清EPO有累积，因为在最后给药周的第一次、第二次和第三次给药后，Cmax分别为128至163、141至214、和152至334mIU/mL。每周一次600-IU/kg的用药方案可以在一个用药周中将血清EPO水平维持在给药前内源性EPO水平之上，直至5到6天(图23)。这些受试者的平均给药前内源性EPO水平为13±3mIU/mL，平均稳态EPO谷浓度(用基础EPO校正的)为11±5mIU/mL。

这个剂量方案获得了较150-IU/kg一周3次剂量方案更高的Cmax，尽管给药前谷浓度接近内源性EPO水平。在600-IU/kg每周1次方案的第1周和第4周期间，Cmax值的范围分别是1203至2148、920至1489mIU/mL。药代动力学和药效学参数值的均数±标准差列于图24。

在平均Cmax和剂量之间存在线性关系，其相关系数为0.982(图25)，表明EPO从注射部位的吸收率不依赖剂量。另一方面，在AUC和剂量之间的关系是曲线性的，清除率(CL/F)随剂量增加而下降(图26)。

在4周研究期间内网织红细胞平均百分比-时间曲线在图27中显示。单次和多次用药，血中网织红细胞百分比均在给药后大约第10天达到其最大值。单次用药后血中网织红细胞百分比在第15天降至给药前基础值，而两个多次剂量方案(150IU/kg一周3次和600IU/kg每周1次)使用后的血中网织红细胞百分比则直到第30天仍很好地维持在给药前的基础值之上。这种观察结果并不意外，因为网织红细胞期中细胞的正常寿命在骨髓中大约为3.5天，在血循环中为1到2天(Hillman，见前)。EPO通过与其在骨髓中的靶红系祖细胞，集落形成单位红系(CFU-E)和爆发性形成单位红系(BFU-E)(Dessypris等，1984，Br.J.Haematol.，56：295-306和Wu等，1995，Cell，83：59-67)，上的特异性细胞表面受体结合而发挥其生物学效应。这些红系祖细胞最后成熟成为网织红细胞，然后释放进血循环。从这两个研究中的数据表明通过单次使用EPO刺激产生的网织红细胞在血循环中出现大约在7到10天。因网织红细胞在血循环中的寿命为1到2天，可以期望通过单次给药刺激产生的网织红细胞在第15天从血循环中消失。因此，网织红细胞的持续产生需要血清中EPO持续地(如在150-IU/kg一周3次剂量方案后)或间断地(如在600-IU/kg每周1次剂量方案后)维持在内源性EPO浓度之上。

对于单次给药的数据，随着EPO平均AUC(AUC(第0-29天))的增加(血清EPO浓度用给药前EPO水平校正，AUC值按4周时间计算)，网织红细胞百分比的平均AUC(AUC[未校正的网织红细胞])有增加的趋势。与单次给药的相似AUC值(第0-29天)数据相比，多次给药数据具有较高的平均AUC值(未校正的网织红细胞)。因此，数据提示EPO多次给药较单次给药更有效地刺激网织红细胞的产生。

尽管有EPO AUC相关的网织红细胞产生增加，但在单次剂量给药后血红蛋白水平没有明显的增加。在单次剂量给药后没有产生血红蛋白水平增加的原因目前尚不明确。另一方面，两个多剂量方案均能使血红蛋白水平稳定的增加，而且两个多剂量方案中血红蛋白从基线上改变的方式是相似的(图28)。

总之，从这个研究中的结果显示，对EPO的药物学反应是剂量和剂量方案的函数。皮下给药后EPO的吸收率不依赖于剂量。EPO的清除率是剂量依赖性的，随剂量的增加而降低。对于单次给药，随AUC(第0-29天)有反应(AUC[未校正的网织红细胞])增加的趋势。持续的药物学反应需要EPO血清浓度持续地(如150-IU/kg一周3次剂量方案后)或间断地(如600-IU/kg每周1次剂量方案后)维持在内源性EPO水平之上。

临床研究EPO-PHI-370

本研究的主要目的是评价150IU/kg一周3次或40,000IU每周1次给药后，EPO的药代动力学概况，并用血红蛋白作为临床效果的指标证明两种剂量方案产生相似的临床效果。第二个目的是评价150IU/kg一周3次或40,000IU每周1次给药后EPO的药效学概况，并比较两个EPO剂量方案间的耐受性和安全性参数。

在本研究中使用的EPO被制成装于一次性瓶中的无菌、无色、无防腐剂，柠檬酸盐缓冲的溶液。EPO 10,000IU/mL(制剂号FD-22512-000C-45，产品批号D000123)用于150-IU/kg一周3次上臂注射，EPO40,000IU/mL(制剂号FD-22512-000 AC-45，产品批号D000175)用于40,000-IU每周一次上臂注射。

这是一个在49个健康受试者(49个入组并进行安全性分析；46个完成研究并进行PK/PD分析)中进行的单中心、开放标记、平行设计、随机化的研究。受试者被随机分入两个治疗组，按照标准的癌症方案(150IU/kg皮下一周3次)或每周固定剂量方案(40,000IU皮下每周一次)使用EPO 4周。在第1、8、15天给药前和第4周期间抽取血样以测定血清EPO浓度。在基准日(第1天)和4周研究期间的特定时间点也抽取血样以测定网织红细胞百分比、血红蛋白和总红血细胞计数。

在46个作PK/PD分析的受试者中，24个受试者(9个男性和15个女性)入组150-IU/kg一周3次上臂注射，22个受试者(14个男性和9个女性)入组40,000IU每周一次，上臂注射。这些受试者的人口统计学数据和及基础血红蛋白列于图29。

血清EPO的样品分析在PPD Development，Richmond，VA进行。一个由DSL生产、RWJPRI改良的RIA试剂盒方法被用来确定血清中的EPO浓度。

本研究的样本大小不是出于统计学的考虑。药效学参数的主要统计指标由处理组和天提供；计算均数、标准差、中位数、变动范围和标准误。为了比较150IU/kg一周3次和40,000IU每周一次用药后EPO的药效学概况，数据接受适合二元配置的方差模型分析，目的PD参数(网织红细胞百分比、血红蛋白和总红血细胞计数的对数变换AUC)之一作为因变量，处理、性别和按处理的性别作为固定效应。由于发现按处理的性别的交互作用对所有三个参数都不显著，数据应用无交互作用项的简化模型，处理和性别效应采用残差项在5％水平进行检验。每周40,000IU与150IU/kg一周3次的均数比和女性与男性的均数比采用来自ANOVA模型的几何最小平方法进行估算。

在4周研究期间150-IU/kg一周3次和40,000-IU每周一次组的平均血清EPO浓度-时间曲线(未用给药前内源性EPO水平校正)在图30中显示。

在4周的150-IU/kg一周3次剂量方案中，EPO血清峰浓度(用基础EPO校正的)的范围从78到447mIU/mL(平均C_max＝191±100mIU/mL)至谷浓度7.9到88mIU/mL(平均谷浓度(C_min)＝39±18mIU/mL)。在4周的40,000-IU每周1次剂量方案中，EPO血清峰浓度(用基础EPO校正的)的范围从197到1992mIU/mL(平均C_max＝785±427mIU/mL)，且在9至24小时之间的时间内达到(平均t_max＝18±5小时)，然后呈多指数地降至谷水平，在用药周结束时的第29天，谷水平范围从低于分析方法的定量限(7.8mIU/mL)至44IU/mL(在第29天的平均谷浓度＝19±10mIU/mL)。在4周研究过程中平均C_min为13±9mIU/mL。两个剂量方案的终末相似乎是平行的，150-IU/kg一周3次和40,000IU每周一次剂量方案的平均半衰期值分别为31.8±13.4(N＝13)和39.3±7.1(N＝3)小时。

均数(标准差)(％CV)药代动力学参数值列于图31。

40,000-IU每周1次剂量方案相对于150-IU/kg一周3次剂量方案获得的生物利用度用下面的公式计算：

平均体重采用完成研究的受试者的数据进行计算。

40,000IU每周1次剂量方案相对150-IU/kg一周3次剂量方案的EPO生物利用度为176％。

网织红细胞百分比和血红蛋白浓度从基线的平均变化对应研究日的线图分别见图32和图33。平均药效学参数值(用基础值校正的)见图34。尽管40,000IU每周1次剂量方案的血清EPO AUC大于150-IU/kg一周3次剂量方案，但两个剂量方案的药效学反应是相似的。虽然40,000IU每周1次剂量方案的网织红细胞百分比AUC有统计学意义地高于150-IU/kg一周3次剂量方案(P＜0.05)，但两个剂量方案间在血红蛋白AUC和红血细胞AUC上没有显著的统计学差异。男性和女性受试者之间网织红细胞百分比AUC、血红蛋白AUC和红血细胞AUC没有显著的统计学差异。

在1个月研究过程中，血红蛋白和总红血细胞改变的时间情况在两个剂量方案间是相似的，尽管血清中EPO暴露(即AUC[0-168])有差异且40,000-IU每周1次剂量方案产生更高的网织红细胞(如通过曲线下面积进行测量的)。在1个月的研究过程中，两个剂量方案的血红蛋白和总红血细胞的AUC是相似的。在本研究中男性和女性的药效学反应没有差异。

虽然本研究的数据表明150-IU/kg一周3次和40,000-IU每周一次剂量方案后的血红蛋白反应是相似的，两种剂量方案可以互换使用，但存在着随机化问题，在进入研究时血红蛋白水平波动，且许多受试者在开始时存在铁缺乏(如转铁蛋白饱和值所示)。在研究地点随机化上的失误导致每个处理组间男性和女性分布的不均衡，引起平均基础血红蛋白值的不平衡。为了恰当的证明本研究的阳性结果，确定将进行一次重复的研究(临床研究EPO-373)。

临床研究EPO-PHI-373

本研究的第一目的是评价150IU/kg一周3次或40,000-IU每周一次用药后EPO的药代动力学概况，并证明两种剂量方案产生相似的临床效果。第二个目的是检测150-IU/kg一周3次或40,000-IU每周一次用药后EPO的药效学概况，并比较两个EPO剂量方案之间的耐受性和安全性参数。

在本研究中使用的EPO被制成装于一次性瓶中的无菌、无色、无防腐剂、磷酸盐缓冲的溶液。EPO 10,000IU/mL(制剂号FD-22512-000-T-45，产品批号99KS077)用于150-IU/kg一周3次上臂注射，EPO 40,000IU/mL(制剂号FD-22512-000-AA-45，产品批号99KS091)用于40,000-IU每周一次上臂注射。

这是一个在36个健康受试者(36个入组并进行安全性分析；34个完成研究并进行PK/PD分析)中进行的单中心、开放标记、平行设计、随机化的研究。受试者被随机分为两个处理组，按照标准的癌症方案(150IU/kg皮下一周3次)或每周固定剂量方案(40,000IU皮下每周一次)使用EPO4周。在第1、8、15天给药前和第4周期间抽取血样以测定血清EPO浓度。在基准日(第1天)和4周研究期间的特定时间点也抽取血样以测定网织红细胞百分比、血红蛋白和总红血细胞计数。

在34个作PK/PD分析的受试者中，17个受试者(9个男性和8个女性)入组150-IU/kg一周3次上臂注射，17个受试者(9个男性和8个女性)入组40,000-IU每周一次上臂注射。这些受试者的人口统计学数据及其基础血红蛋白列于图35。

由R&D Systems公司(R&D)，明尼阿波利斯，MN生产的，PWJPRI改良的，并在PPD Department，Richmond，VA与最初的RIA试剂盒交叉验证的一个ELISA试剂盒被用来测定血清中EPO的浓度。

本研究的样本大小不是出于统计学的考虑。药效学参数的主要统计指标由处理组和天提供；计算均数、标准差、中位数、变动范围和标准误。为了比较150IU/kg一周3次和40,000IU每周一次用药后EPO的药效学概况，数据接受适合二元配置的方差模型分析，目的PD参数(网织红细胞百分比、血红蛋白和总红血细胞计数的对数变换AUC)之一作为因变量，处理、性别和按处理的性别作为固定效应。由于发现按处理的性别的交互作用对所有三个参数都不显著，数据应用无交互作用项的简化模型，处理和性别效应采用残差项在5％水平进行检验。每周40,000IU与150IU/kg一周3次的均数比和女性与男性的均数比采用来自ANOVA模型的几何最小平方法进行估算。

在4周研究期间150-IU/kg一周3次和40,000-IU每周一次组的平均血清EPO浓度-时间曲线(未用给药前内源性EPO水平校正)在图36中显示。

在4周的150-IU/kg一周3次剂量方案中，EPO血清峰浓度(用基础EPO校正的)的范围从75到284mIU/mL(平均C_max＝143±54mIU/mL)至谷浓度范围从低于分析方法的定量限(7.8mIU/mL)至40IU/mL(平均谷浓度(C_min)＝18±9mIU/mL)。在4周的40,000-IU每周1次剂量方案中，EPO血清浓度(用基础EPO校正的)在1至24小时之间(平均t_max＝16±8小时)的时间内达到峰浓度(平均C_max＝861±445mIU/mL)，然后呈多指数地降至谷水平，在用药周结束时的第29天，谷水平范围从低于分析方法的定量限(7.8mIU/mL)至5.9IU/mL(在第29天的平均谷浓度＝2.0±1.5mIU/mL)。在4周研究过程中平均C_min为3.8±4.3mIU/mL。两个剂量方案的终末相似乎是平行的，150-IU/kg一周3次和40,000IU每周一次剂量方案的平均半衰期值分别为19.4±8.1(N＝9)和15.0±6.1(N＝9)小时。

平均(标准差)(％CV)药代动力学参数值列于图37。

40,000-IU每周1次剂量方案相对于150-IU/kg一周3次剂量方案获得的生物利用度用下面的公式计算：

平均体重采用完成研究的受试者的数据进行计算。

40,000IU每周1次剂量方案相对150-IU/kg一周3次剂量方案的EPO生物利用度为239％。

网织红细胞百分比、血红蛋白浓度和总红血细胞从基线的平均变化对应研究日的线图分别见图38、39和40。

平均药效学参数值(用基础值校正的)见图41。尽管40,000IU每周1次剂量方案的血清EPO AUC大于150-IU/kg一周3次剂量方案，但两个剂量方案的药效学反应是相似的。两种剂量方案之间在网织红细胞百分比的AUC、血红蛋白AUC和红血细胞的AUC上没有显著的统计学差异。男性和女性受试者之间网织红细胞百分比AUC上没有显著的统计学差异(P＞0.05)。但是，在统计学上女性的血红蛋白AUC和红血细胞AUC较男性高(分别是p＝0.038和0.042)。这些差异在临床上不明显。

在1个月研究的过程中，网织红细胞百分比、血红蛋白和总红血细胞改变的时间情况在两个剂量方案间是相似的，尽管血清中EPO暴露(就AUC[0-168]而言)有差异。另外，在1个月研究过程中两个剂量方案之间在网织红细胞百分比AUC、血红蛋白AUC和总红血细胞AUC上没有统计学的显著差异(P＞0.05)。在本研究中男性和女性受试者之间药效学反应没有差异。本研究的数据表明150-IU/kg一周3次和40,000-IU每周一次剂量方案后的血红蛋白反应是相似的，因此证实两种剂量方案可被互换使用。

总之，使用150-IU/kg一周3次和40,000-IU每周一次剂量方案后在血清中EPO的总暴露量有所期望的不同。血红蛋白反应是相似的，因而证实了两种剂量方案可被互换使用。因此，本研究显示可以使用一周一次的EPO剂量方案。这个方案克服了常用剂量方案有关的缺点。在一个优选的实施方案中，40,000IU的剂量是根据这些临床研究来考虑的。本发明也考虑了两周一次的剂量方案，如，以80,000至120,000IU的EPO剂量。在特殊的实施方案中，使用了两周一次的EPO剂量方案。

结果

静脉给药后药代动力学

健康志愿者或肾功能不全的患者静脉给药后，r-HuEPO以与血浆容积相当的容积分布，血浆浓度以平均4至11.2小时的半衰期范围衰减，曾有报道重复给药后半衰期将缩短(Macdougall等，1991，Clin.Pharmacokinet.，20：99-113)。在健康受试者静脉单次给予50至1000IU/kg剂量后，Cmax和AUC值与剂量成比例的增加(Flaharty等，1990，Clin，Pharmacol.Ther.，47：557-64)，有报道在健康受试者单次静脉弹丸样给予10-、100-和500-IU/kg剂量后清除率(CL)与剂量无关，其平均值分别为5.89±1.53、7.02±1.14和6.88±1.19mL/h/kg(Veng-Pendersen等，1995，J.Pharma.Sci.84(6)：760-767)。但是，也有报道在健康受试者单次静脉给予10-IU/kg(13.1mL/h/kg)剂量后的清除率较单次静脉内给予100和500IU/kg剂量高(各自的CL＝7.9和6.2mL/h/kg)(Widness等，1996，J.Appl.Physiol.，80(1)：140-148)。

皮下给药后的药代动力学

来自临床研究EPO-PHI-358、EPO-PHI-359、EPO-PHI-370和EPO-PHI-373的皮下给药后药代动力学参数的总结见图42。

在单次或每周一次皮下给药后，血清EPO浓度在9至36小时时间(tmax)范围内达到峰值。不同的单剂量给药的平均t_max是相似的，范围是15.6±5.8至28.8±7.8小时。在平均C_max和剂量之间存在线性关系(相关系数＝0.982)，表明EPO从注射部位的吸收率与剂量无关。另一方面，AUC与剂量之间的关系是一个曲线关系，清除率(CL/F)随着剂量的增加而降低(Cheung等，1998，Clin.Pharmacol.Ther，64：412-423)。临床研究EPO-PHI-373和EPO-PHI-370的数据表明150-IU/kg一周3次剂量方案的CL/F较40,000-IU每周一次剂量方案高，来自临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359的数据表明150-IU/kg一周3次剂量方案的CL/F较600-IU/kg每周一次剂量方案高。

如图42所示，皮下给药后EPO以较静脉给药后更慢的速率衰减。单次皮下给予300至2400IU/kg剂量后的半衰期值范围为15.9至221小时，在150-IU/kg一周3次和40,000-IU每周一次剂量方案后平均半衰期值分别为19.4±8.1和15.0±6.1。在研究的剂量范围内半衰期值与剂量无关。与静脉给药相比，皮下给药后观察到的较长的半衰期值可能反映了从皮下组织吸收的半衰期。

单剂量给药后血清EPO浓度在第15天降至内源性EPO水平(较低剂量更早)，而150-IU/kg一周3次剂量方案则可以在整个治疗期间维持血清EPO浓度在给药前内源性EPO水平之上(Cheung，见上)。每周一次600IU/kg/mL剂量方案和40,000IU每周一次方案可在一个用药周内将血清EPO浓度维持在给药前内源性EPO水平之上达5至6天(Cheung，见上)。这些每周一次的剂量方案较150-IU/kg一周3次剂量方案获得了更高的C_max，尽管给药前的谷浓度接近内源性EPO水平。

皮下给药后EPO的药效学

在单次(300至2400IU/kg)或多次(150IU/kg一周3次，600IU/kg每周一次，或40,000IU每周一次)皮下给予EPO后，网织红细胞百分比在第3至4天开始增加。单次给药后网织红细胞百分比在第6至12天(Cheung，见前)达到其最大值，而多次给药后网织红细胞百分比达到最大值的时间范围从第8天至最后血样采集点的第29天(Cheung，见前)。所有的多次剂量方案刺激中度的、但是持续的网织红细胞百分比增加(大约2至7％)，其值在第22至29天之间仍维持在给药前的基础值之上，而单次给药后网织红细胞百分比在第15至22天降至基础值(Cheung，见前)。

网织红细胞百分比改变(从基线开始)的平均AUC[AUC(RETI)]和EPO平均AUC(用给药前内源性EPO水平校正的)[AUC(第0-29天)]之间的关系显示于：临床研究EPO-PHI-358、EPO-PHI-359的数据在图43中，临床研究EPO-PHI-370和EPO-PHI-373的数据在图44中。从基线开始的网织红细胞百分比的改变和EPO的AUC值在4周期间均进行计算。由于网织红细胞样品的采集时间不同，临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359的AUC(RETI)值不能与临床研究EPO-PHI-370和EPO-PHI-373相比较。临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359的采样程序次数较少，AUC(RETI)值可能被低估了。来自l临床研究EPO-PHI-358和EPO-PHI-359的数据表明，对于单次给药数据，随着EPO平均AUC(第0-29天)的增加，平均AUC(RETI)有增加的趋势。基于临床研究EPO-PHI-370和EPO-PHI-373数据的多次剂量方案，随着EPO平均AUC(第0-29天)的增加，平均AUC(RETI)也有增加的趋势。

在1个月中，150-IU/kg一周3次方案给予的总EPO量为1800IU/kg，600-IU/kg每周1次方案给予的大约为2400IU/kg。虽然 150-IU/kg一周3次方案较1800-IU/kg的单次剂量方案有较小的EPO AUC(第0-29天)，但它们具有相似的平均AUC(RETI)值。相似地，600-IU/kg每周1次方案较2400-IU/kg单次剂量方案有较小的EPO AUC(第0-29天)值，但他们也有相似的平均AUC(RETI)值。因此多次给药后的EPO(每单位AUC暴露)较单次给药后更有效地产生网织红细胞。

尽管有EPO AUC相关的网织红细胞产生增加，但在单次给药后血红蛋白没有明显的增加。另一方面，多次剂量方案可以引起血红蛋白的稳定增加，血红蛋白增加的模式在150-IU/kg一周3次和40,000IU每周1次剂量方案之间是相似的，正如在关键的临床研究EPO-PHI-373(图45)和支持性的临床研究EPO-PHI-370(图46)中证明的，在150-IU/kg一周3次和600-IU/kg每周1次方案之间是相似的，如在试验性的临床研究EPO-PHI-359和EPO-PHI-359中所示的。在单次给药后血红蛋白反应的缺乏目前还不了解。对此有两种可能的解释：单次给药后网织红细胞的增加(在2400-IU/kg单次给药后网织红细胞百分比的最大增加＝6.6％)可能维持时间不够长以导致任何实质上的血红蛋白增加；曾有假设幼稚红细胞的生存依赖于血循环中EPO的持续存在(Alfrey等，1997，The Lancet，349：1389-1390)。单次给药后网织红细胞在6至12天的时间范围内达到峰值，直到第15天时回到给药前水平。在血循环中网织红细胞期的细胞寿命大约为1至2天(Hillman等，1967，Sem Haematol.，4(4)：327-336)。

因此，可以预测在用药后大约7至14天幼稚红细胞出现在血循环中。在那时，单次给药后的EPO浓度处于内源性水平，就可能由于血循环中缺乏足够的EPO以维持它们的存活而导致幼稚红细胞的死亡。另一方面，EPO浓度在一周3次剂量方案后持续地或每周一次剂量方案后间断地保持在内源性水平之上，因此幼稚红细胞的生存得以维持，导致研究过程中血红蛋白的持续升高。

所以，为了维持大量由于药物产生的幼稚红细胞的生存，血清EPO浓度必须在内源性水平之上。

结论

总之，来自这4个在健康受试者中的I期研究数据表明，在人体皮下给药后EPO的药代动力学和药效学是非线性的。来自这些研究的数据也清楚地显示，150-IU/kg一周3次剂量方案产生了与40,000-IU每周一次剂量方案相似的血红蛋白反应，因此证实两个剂量方案可被互换使用。据此，EPO以大约40,000IU/kg每周一次，连续使用两周。EPO的首次给药加速了从红细胞祖细胞产生网织红细胞。EPO的第二次给药与患者网织红细胞药效学概况相一致。第二剂量EPO可在初次给药后6-10天给予，优选在首次EPO给药后网织红细胞浓度达峰值时给予。

实例2：给予150IU/kg一周3次和40,000IU每周一次后EPO PK/PD

概况的评价

在特定的适应征中，如癌症，受试者接受α型红细胞生成素150IU/kg一周3次。因此，改变目前公认的用药时间表为一个更方便的(即，每周一次或每2周一次)用药时间表和方案仍是一个重要的目标。较少次数的用药将改善使用者的接受度和易用性。

α型红细胞生成素多次剂量方案的药代动力学和药效学特性已经在前面的实例中(EPO-PHI-358和EPO-PHI-359)详细说明。数据提示150IU/kg一周3次和600IU/kg每周1次的剂量方案具有相似的药效学反应(如，血红蛋白升高)。因此，α型红细胞生成素可能地以每周每公斤的剂量给药。由于对于一个70公斤的人来说，600IU/kg等于42,000IU，进行了本研究以证明固定的40,000IU每周一次的剂量方案与公认的150IU/kg一周3次剂量方案产生了相当的药效学反应。

本研究的第一目的是评价150IU/kg一周3次或40,000IU每周一次给药后α型红细胞生成素的药代动力学概况，并证明两种剂量方案产生相似的临床效果。

第二个目的是评价150IU/kg一周3次或40,000IU每周一次给药后α型红细胞生成素的药效学概况，并比较α型红细胞生成素两个剂量方案之间的耐受性和安全性参数。

36个健康成人志愿者(18个男性和18个女性)入组此开放标记、平行设计、随机化、单中心研究。受试者在18至45岁之间，血红蛋白水平对女性包含在12.0至14.0g/dl之间，对男性包含在13.0至14.0g/dl之间。受试者根据包含和排除的标准进行研究资格的筛选，并随机分进两个处理组中的一组。第一组接受150IU/kg一周3次皮下注射EPO的标准癌症方案4周。第二组接受固定剂量方案，40,000IUα型红细胞生成素皮下注射每周一次4周。

在研究过程中，受试者每天接受口服铁补充剂(两粒Ferro-Grad^胶囊，每粒含105mg元素铁)。

在研究过程中，在基准时间和特定时间点抽取血样以测定血清红细胞生成素浓度，全血细胞计数(CBC)，包括网织红细胞百分比，血红蛋白浓度和血球压积。安全性评价根据处理-出现不良事件的发生率和类型、临床实验室检查(血液学和化学)的改变、生命体征测量和物理检查的结果。另外，在研究中监测了血清铁、计算的转铁蛋白饱和度和铁蛋白浓度。

安全性根据处理-出现不良事件的发生率和严重性、以及物理检查、生命体征测量和实验室参数从研究前的改变。

在所有受试者开始研究后修改了草案。修改阐明了包含和排除标准、伴随的治疗、实验室参数、尿分析、生命体征测量和40,000IU每周一次组的剂量方案。

随机分到150IU/kg一周3次组的3个受试者和40,000IU每周一次组的一个受试者，其血红蛋白入组标准多少超过包含/排除标准特定的限制(14.0g/dL)，但仍被包含在研究中。150IU/kg一周3次组中的2012、2015和2016受试者的筛选血红蛋白为14.1g/dL；40,000IU每周一次组中的2018受试者的筛选血红蛋白为14.2g/dL。40,000IU每周一次组中的4个受试者的筛选铁蛋白值低于排除标准特定的45ng/mL限制：受试者1006的筛选值为40ng/mL，受试者1010的筛选值为43ng/mL，受试者1015和2011的筛选值为44ng/mL。每个处理组中一个受试者(150IU/kg组中的2015受试者和40,000IU组中的2014受试者)的筛选转铁蛋白饱和值为19％，略低于≥20％的包含标准。受试者2002(40,000IU)的体重超过草案包含标准中对其身高所允许的最大值0.1公斤。另外，受试者2016(150IU/kg一周3次)在开始α型红细胞生成素治疗前服用草药安眠药片4天。

研究药物的资料

α型红细胞生成素被制成装于一次性瓶中的无菌、无色、无防腐剂、磷酸盐缓冲的溶液。本研究使用市售产品，并有商业标记。α型红细胞生成素10,000IU/mL溶液的制剂号FD 22512-000-T-45，产品批号99KS077，α型红细胞生成素40,000IU/mL溶液的制剂号FD 22512-000-AA-45，产品批号99KS091。

剂量和给药

受试者至少在第一天给予研究药物前12小时进入研究者单位。受试者在第一天用药前至少禁食10小时；水随意饮用。受试者随机分配，并接受如下两个研究用药中的一个：

组别	治疗
		组1(N＝18)组2(N＝18)	标准的癌症方案α型红细胞生成素150IU/kg皮下注射一周3次4周每周一次固定剂量的方案α型红细胞生成素40,000IU皮下注射每周一次4周

对于用药组1，对于一个70公斤受试者的注射容积大约为1.0毫升。

对于用药组2，注射容积准确地为1毫升。

如果在治疗期间的任何时候，任何受试者的血红蛋白等于或超过18.0g/dL，则采集第二份样品以证实首次结果。如果证实，进行放血术以降低血红蛋白水平；最初，要抽出1单位血。一旦受试者稳定，则再次测定血红蛋白。如果血红蛋白仍然为18.0g/dL或更高，就再抽出0.5至1单位血，并测量血红蛋白。任何进行放血的受试者将中止α型红细胞生成素的治疗，并进行所需的完整评价和程序。

10,000IU/mLα型红细胞生成素制剂用于组1(标准癌症方案)，40,000IU/mLα型红细胞生成素制剂用于组2(每周固定剂量方案)。

伴随的治疗

受试者被通知在研究药物首次用药前两周开始至此后的整个研究过程中，不要服药(处方药、非处方药(OTC)、草药或“天然药”)。在有头疼或感冒样症状时，可以使用对乙酰氨基酚。如果必须使用任何药物，要记录在适当的病例报告表(CRF)和原始资料文件上。

在研究过程中，受试者每天口服铁补充剂(两粒Ferro-Grad^胶囊，每粒含105mg元素铁)。

研究评价

时间和事件表

研究被分为三个阶段：筛选、处理和完成/早期撤出。在筛选阶段评价受试者的资格(在给予研究药物两周内进行的程序)。受试者被随机分配进两个治疗组中的一个，然后进入处理阶段。受试者在第1天给予研究药物前至少12小时收留进诊所，在用药后继续收留至少24小时，直至完成所有的检测。受试者在第一天用药之前至少禁食10小时，但随意地饮水。处理阶段由给予研究药物组成(150IU/kg一周3次组在第1、3、5、8、10、12、15、17、19、22、24和26天用药，40,000IU每周1次组在第1、8、15和22天用药)。在第22天，第二个监护期开始于给予α型红细胞生成素后，并持续至用药后至少144小时。在28天处理阶段，对所有受试者以定期的间隔进行药代动力学、药效学和安全性参数评价。研究完整评价和程序在第29天，或在从研究中早期撤出时进行。

药代动力学评价

样品收集和处理

每个2.5毫升的静脉血样通过直接静脉穿刺收集在真空管中用于测定血清红细胞生成素浓度，150IU/kgα型红细胞生成素一周3次组(组1)的采血时间点如下：

第1天：在研究药物开始给药前30、20和10分钟。

第8和15天：在用药前即刻。

第22和24天：用药前即刻，和用药后0.5、3、6、9、12、15、18、24、30和36小时。

第26天：用药前即刻，和用药后0.5、3、6、9、12、15、18、24、36、48和72小时。

测定40,000IU每周一次组(组2)血清红细胞生成素浓度的血样于如下时间点采集：

第1天：在研究药物开始给药前30、20和10分钟。

第8和15天：在用药前即刻。

第22-28天：用药前即刻，和在第22天α型红细胞生成素给药后0.5、3、6、9、12、15、18、24、30、36、48、48.5、51、54、57、60、63、66、72、78、84、96、96.5、99、102、105、108、111、114、120、126、132、144和168小时。

样品在室温下凝结大约20分钟，然后在冷冻离心机中以1200rpm离心10分钟。血清分装入一个预先作标记的聚丙烯小瓶中。样品在-20℃冷冻，并在此温度冷冻保存直至进行分析。

分析程序

血清α型红细胞生成素的样品分析在PPD Development，Richmond，VA进行。一个由R&D Systems公司(R&D)，明尼纳波利斯，MN生产的，RWJPRI改良的酶联免疫吸收检测(ELISA)试剂盒程序被用来测定血清中红细胞生成素的浓度。市售的ELISA是一个直接的、双抗体夹心检测。预包被鼠rHuEPO特异单克隆抗体的微量滴定孔用来捕捉EPO。结合的EPO用抗EPO多克隆(兔)抗体和辣根过氧化物酶标记。随着添加底物产生了最佳信号。R&D试剂盒的主要内部改良是在标准品和形成尖峰的质量控制样品中使用了重组人红细胞生成素。

在检测中使用的标准浓度为7.8、15.6、31.3、50、62.5、100、125和250mIU/mL。定义为给定可接受精度的最低标准的敏感度为7.8mIU/mL，经过质量控制稀释液，检测范围增加至5,000mIU/mL。

药代动力学参数

测定红细胞生成素的血清浓度。通过不依赖模型的方法测定药代动力学参数C_max、t_max、C_min、AUC_(0-168)、CL/F和t_1/2。

药效学分析

药效学参数包括测定网织红细胞百分比、红血细胞和血红蛋白浓度从基线水平的改变，以及它们与血清红细胞生成素浓度之间的关系。

安全性评价

不良事件

处理-出现的不良事件是指在临床观察期间观察到的任何有害或非预期的事件，它们是新发生的，或严重度或频率恶化的，包括需要医疗干预的病理学发现，包括需要额外的诊断过程或改变研究治疗。

每个受试者从第一次给药开始在整个研究过程中要观察其可能的不良事件。不良事件报告通过志愿者的汇报来确认。研究者在受试者CRF上记录任何处理-出现的不良事件，无论它们与研究药物的关系如何。不良事件根据发生的时间、程度(明显、中度或轻微)、与研究药物的关系(极可能、很可能、可能、怀疑或无关)、研究治疗所采取的措施(没有、降低剂量、暂时停药或永久停药)、以及反应是否是严重的等而定性。同时记录伴随的治疗和结果。

严重的不良事件是指致命的或立即威胁生命的，需要或延长住院患者的住院时间，引起持续的或明显的残疾或功能丧失，或是先天性异常、出生缺陷，或药物过量者。研究者被告知马上将所有的严重不良事件汇报给RWJPRI。研究者要在第29天最后一次评价后收集严重不良事件的资料直至第35天。还要为潜在的严重不良事件回顾安全性数据；这些是被认为十分严重或担忧以致需要医疗干预者。

临床实验室检查

临床实验室检查的样品分析在英国Berks的Havenfern实验室进行。血样包括检测血红蛋白、血球压积、网织红细胞百分比、红血细胞(RBC)、红细胞平均容积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)和血小板，在筛选期间和第1、3、5、8、10、12、15、17、19、22、24、26和29天抽取，如果可能在上午8至10点之间。筛选的CBC还包括总红细胞计数和总白细胞计数及分类。

在筛选和终止日(第29天)采集血清化学样品；参数包括葡萄糖、钙、钠、钾、氯、磷、血尿素氮(BUN)、总胆红素、肌酐、总蛋白、胆固醇、白蛋白、尿酸、碱性磷酸酶、血清谷草转氨酶(SGOT；天门冬氨酸氨基转移酶(AST))、血清谷丙转氨酶(SGPT；丙氨酸氨基转移酶(ALT))和乳酸脱氢酶(LDH)。

检测铁参数(血清铁、总铁结合力(TIBC)和铁蛋白水平)的血样在筛选过程和第8、15、22和29天采集。转铁蛋白饱和度用铁/总铁结合力来计算。

尿液检测用探测尺进行。如果血或白细胞酯酶阳性(1+或更高)和/或蛋白或硝酸盐为痕量或更高，尿液标本要送至中心实验室进行显微镜检查。

其他安全性观察

生命体征

在筛选调查及第1、8、15和22天使用研究药物前和第29天(终止日)时记录坐位血压、脉率和口腔温度的生命体征指标。呼吸频率和体重测量在筛选和终止日进行；身高指标仅在筛选调查时获得。

物理检查

物理检查在筛选调查和第29天时进行。

数据质量保证

在选择研究地点前，由临床RWJPRI职员评价研究者、研究地点的人员和机构。在研究开始之前，研究草案和知情同意书经过研究者的伦理委员会(EC)审评并批准。REJPRI职员在定期的现场监查访问过程中检查病例报告表的准确性和完整性。

数据的差异由研究者或设计者解决。数据被输入RWJPRI数据库，并运行适当的计算机编辑程序来核实数据库的准确性。

统计学方法

本研究的样本大小不是出于统计学的考虑。因此，分析是描述性的；对药代动力学参数没有进行统计学检验。概括统计量，包括均数、标准差、中位数和范围由处理组的血液学、血清化学和生命体征指标提供。

研究的第一目的(即，评价150IU/kg一周3次或40,000IU每周1次给药后α型红细胞生成素的药代动力学概况，并采用血红蛋白作为临床效果的指标证明两种剂量方案产生相似的临床结果)是通过给药后获得的药代动力学参数的描述性比较来完成的。

药代动力学

下面的药代动力学参数是采用WinNonlin软件，1.1版(科学顾问公司(Scientific Consulting，Incorporation)，Apex，NC)，以不依赖模型的方法计算的：

血清峰值浓度(C_max)：在150IU/kg一周3次和40,000IU每周1次剂量方案的第4周用药期间观察到的最大血清浓度。

达到C_max的时间(t_max)：出现C_max的时间。α型红细胞生成素一周3次处理组不报告T_max，因为在第4个用药周期间C_max随机地出现于三次给药中的任何一次。

平均给药前谷浓度(C_min)：150IU/kg一周3次方案的C_min通过将第22、24、26天的给药前谷浓度和第26天最后一次给药后72小时的浓度平均进行估算。40,000IU每周一次方案的C_min通过将第8、15、22天的给药前浓度和第22天最后一次给药后168小时的浓度平均进行估算。

α型红细胞生成素40,000IU每周一次和150IU/kg一周3次方案的最后用药周期间血清浓度-时间曲线下从零点至最后血样时间的面积AUC(0-168)：采用线性梯形规则进行计算。

皮下给药后的清除率(CL/F)：通过剂量(每公斤)除以AUC(0-168)来计算。

终末消除半衰期(t_1/2)：从0.693/消除速率常数来计算。消除速率常数通过在对数-线性浓度-时间图的终末线性区内对连续数据点的线性回归来估计。最少三个数据点用于回归。对那些相关系数(r)小于0.975(或r²＜0.95)的回归不给出t_1/2值。

对每个处理计算药代动力学参数的均数、标准差和变异系数。

采用经给药前内源性红细胞生成素水平校正的血清红细胞生成素浓度来计算药代动力学参数。给药后血清浓度值用给药前基础红细胞生成素浓度来校正，即从每个值中减去平均基础红细胞生成素浓度，后者是由用药前30、20和10分钟采集的样品确定的。如果给药前血清红细胞生成素浓度低于检测的定量限度，则不包括在平均值的计算中。如果所有三个受试者给药前样品的浓度值均低于检测的定量限度，则检测定量限度7.8mIU/mL作为该受试者的平均基础红细胞生成素浓度。实际采血时间(以相对首次给药时间的小时来表示)用于计算药代动力学参数。

40,000IU每周一次剂量方案相对于150IU/kg一周3次剂量方案的生物利用度采用下面的公式计算：

^*完成本研究的40,000IU每周一次组受试者的平均体重

药效学

概括统计量包括均数、标准差、中位数、范围和标准误，按处理组及网织红细胞百分比和血红蛋白浓度的时间来提供。根据完成研究的受试者进行进行计算。基准日、第1、3、5、8、10、12、15、17、19、22、24、26和29天被概述；如果一个受试者在特定的天(几天)没有收集数据，则进行“开窗操作”以在一览表中包含实验室检查结果。从基线开始的改变按处理组和日期来概述。对网织红细胞、血红蛋白和铁蛋白形成了从基础值的平均变化对研究日期的线性图。

药代动力学/药效学

在研究步骤中提到的指定时间(以相对第一天首次给药的天数表示)被用来计算药效学参数。下面的药效学参数采用WinNonlin软件，1.1版(科学顾问公司，Apex，NC)通过不依赖模型的方法进行计算：

从0时间至开始给药后672小时(第29天)网织红细胞百分比的血清浓度-时间曲线下面积[AUC(RETI)]采用线性梯形规则计算。AUC(RETI)用给药前网织红细胞百分比值校正的网织红细胞百分比来估算。用药前10分钟和30分钟测定值的平均值被用作给药前网织红细胞百分比值。对于那些负值的校正后网织红细胞百分比数据，用0来估算AUC(RETI)。

从0时间至开始给药后672小时(第29天)血红蛋白的血清浓度-时间曲线下面积[AUC(HEMO)]采用线性梯形规则进行计算。AUC(HEMO)用给药前血红蛋白值校正的血红蛋白值来估算。用药前10分钟和30分钟测定值的平均值被用作给药前血红蛋白值。对于那些负值的校正后血红蛋白数据，用0来估算AUC(HEMO)。

从0时间至开始给药后672小时(第29天)总红血细胞计数(RBC)的血清浓度-时间曲线下面积[AUC(RBC)]采用线性梯形规则进行计算。AUC(RBC)用给药前红血细胞值校正的红血细胞值来估算。用药前10分钟和30分钟测定值的平均值被用作给药前红血细胞值。对于那些负值的校正后红血细胞数据，用0来估算AUC(RBC)。

40,000IU每周一次与150IU/kg一周3次的AUC(RETI)、AUC(HEMO)和AUC(RBC)比值被确定。

安全性

安全性评价根据受试者报告的不良事件以及物理检查、临床实验室数据和生命体征改变的类型和发生率来确定。处理-出现的不良事件按体系、优选项和包含项被分类。不良事件按照世界卫生组织不良反应术语(WHOART)词典编码，其中包含项是与研究者术语最密切相关的描述，优选项是一组密切相关的包含项，体系是包括相关优选项的广泛范围。处理-出现的不良事件按体系和优选项来概述，并以单个受试者数据列表的方式表示。

临床实验室数据和生命体征被概述并以单体受试者数据列表的方式表示。

数据储存

本研究的实验方案、报告和原始数据储存在RWJPRI信息管理部的文件管理部。数据可以在为药物代谢研究DM00009保留的项目记事簿中找到。

研究时间

两组的用药和血样采集均在2000年2月21日至2000年3月29日期间进行。血清红细胞生成素检测的确认在2000年1月21日和2000年2月3日之间进行。血清样品在2000年3月24日至2000年4月4日期间进行分析。

结果

人口统计学和基本情况特性

36个健康成人(每组18个受试者)入组本研究，并随机分配进两个治疗组中的一个。总体来说，大多数受试者(89％)是白人，平均年龄为26.5岁(范围是18-41岁)。40,000IU每周1次组中受试者的平均体重(70.3kg)较150IU/kg一周3次组(66.8kg)稍高，两组之间其他基本情况和人口统计学特性十分相似。

完成研究的34个受试者的人口统计学和基本情况特性见图47。总体研究人群没有显著的区别。

研究完成/撤出资料

如果受试者参与了整个研究过程(29天)，则被认为完成了本研究。另外，受试者必须使用了研究药物所需的所有用药次数，他们必须依从血样采集步骤，并必须经历第29天的评价和程序。有效人群包括接受完成本研究所需剂量的受试者。有效人群被用来进行药代动力学和药效学数据分析。

两组中均有94％的受试者完成了本研究。α型红细胞生成素150IU/kg组中的一个受试者(1014)在研究的第15天因不良事件(持续头疼)而撤出，α型红细胞生成素40,000IU一周一次组中的一个受试者(1006)在第10天撤出(受试者的选择)。这些受试者没有包括在有效人群中。

分析结果

药代动力学结果

图48显示了150IU/kg一周3次组和40,000IU每周一次组在第4周研究期间的平均血清α型红细胞生成素浓度-时间曲线(未用给药前内源性红细胞生成素水平校正)。用给药前内源性红细胞生成素水平校正的平均血清红细胞生成素浓度-时间曲线见图49。

150IU/kg一周3次组和40,000IU每周一次方案组中受试者平均(SD)给药前内源性红细胞生成素α的浓度分别是8(0.4)和9(2)mIU/mL。150IU/kg一周3次剂量方案的第4周中，血清中红细胞生成素浓度(用基础红细胞生成素校正的)的范围是从75-284mIU/mL的峰浓度[平均(SD)C_max＝143(54)mIU/mL]至谷水平值，该值的范围从低于分析方法的定量限(7.8mIU/mL)至40IU/mL[平均(SD)谷浓度(C_min)＝18(9)mIU/mL]。在40,000IU每周一次剂量方案的第4周，血清红细胞生成素浓度(用基础红细胞生成素校正的)在1至24小时时间范围内[中位t_max＝15小时(范围，1-24)]达到峰值浓度[平均(SD)C_max＝861(445)mIU/mL]，然后在第29天用药周结束时呈多指数地降至谷水平值，其范围从低于分析方法定量限的值(7.8mIU/mL)至5.9mIU/mL[第29天的平均(SD)谷浓度＝2.0(1.5)mIU/mL]。在4周研究期间，40,000IU每周一次的平均(SD)C_min为3.8(4.3)mIU/mL。两个剂量方案的终末期似乎平行于平均(SD)半衰期值，150IU/kg一周3次和40,000IU每周一次剂量方案分别为19.4(8.1)小时(n＝9)和15.0(6.1)小时(n＝9)。

平均(SD)[％CV]药代动力学参数值见图50。40,000IU每周1次剂量方案相对150IU/kg一周3次剂量方案的α型红细胞生成素生物利用度为239％。

药效学结果

网织红细胞百分比、血红蛋白浓度和红血细胞值从基础值的平均变化按处理组和研究时间分别概述于图51、53和55。仅呈现了完成研究受试者药效学结果从基础值的平均变化。

网织红细胞百分比、血红蛋白浓度和红血细胞值的从基础值的平均变化对应研究天数的线性图分别见图52、54和56。

网织红细胞百分比

在两组中，网织红细胞百分比的平均变化增加至第10天，逐渐下降至第29天(图51和52)。

血红蛋白

两个用药组平均血红蛋白的基础值是相等的，150IU/kg一周3次组为13.4g/dL，40,000IU每周一次组为13.5g/dL。在两个治疗组中，血红蛋白值从基础值的平均变化增加至第26天(图53和54)。40,000IU每周一次组血红蛋白从基础值的平均变化反映了150IU/kg一周3次组α型红细胞生成素的变化。总体上，两组至第29天从基础值上增加了3.1g/dL。

红血细胞

红血细胞值从基础值的平均变化见图55和56。在两个治疗组中，红血细胞值从基础值的平均变化增加至第24天。40,000IU每周一次组血红蛋白从基础值的平均变化反映了150IU/kg一周3次组α型红细胞生成素的变化。总体上，两组至第29天从基础值增加了1.0×10¹²/L。

药代动力学/药效学结果

平均药效学参数值(用基础值校正的)见图57。两种剂量方案的药效学反应是相似的，尽管事实上40,000IU每周一次剂量方案的血清红细胞生成素AUC高于150IU/kg一周3次剂量方案。在两个剂量方案之间，网织红细胞％的AUC、血红蛋白的AUC和红血细胞的AUC没有显著的统计学差异(P＞0.05)。男性和女性受试者之间在网织红细胞百分比AUC上没有显著的统计学差异(P＞0.05)。但是，血红蛋白AUC和红血细胞AUC在统计学上女性大于男性(分别p＝0.038和0.042)。这些差异没有临床显著性。

安全性结果

暴露程度

参加研究的受试者中的34(94％)个接受了研究药物的所有给药剂量(α型红细胞生成素150IU/kg一周3次[12次用药]或α型红细胞生成素40,000IU每周一次[4次用药])。一个随机进入α型红细胞生成素150IU/kg一周3次组的受试者(1014)因不良事件(持续头疼)在接受6次研究药物后撤出了研究。在40,000IU每周一次组中，一个受试者(1006)在接受2次研究药物后选择撤出研究。

除1例外，所有受试者按照方案每天口服铁补充剂；受试者2008(40,000IU每周一次)在研究的第19天停止口服铁补充剂。除1例外，所有的女性继续使用研究前的避孕方法(按照方案)；受试者1010(α型红细胞生成素40,000IU每周一次)在研究开始前11天停止口服避孕药物。

不良事件

所有处理-出现的不良事件均概述于图58。总体上，18个使用α型红细胞生成素150IU/kg一周3次受试者中的13个(72％)有不良事件，而18个使用α型红细胞生成素40,000IU每周一次受试者中的12个(67％)有不良事件。大多数处理-出现的不良事件在严重程度上是轻微的，在两组之间的定性差异很小。

最经常报告的不良事件是疼痛(150IU/kg为22％，40,000IU每周一次为28％)、头疼(两组均为28％)和红斑疹。接受α型红细胞生成素150IU/kg一周3次的18个受试者中的5个(28％)在前臂套管部位出现红斑疹，而在接受α型红细胞生成素40,000IU每周一次的18个受试者中为两个(11％)。所有事件被研究者评价为与α型红细胞生成素治疗无关。

所有不良事件的总结

死亡，其他严重不良事件和其他显著的不良事件

在研究过程中没有出现死亡或严重的不良事件。一个使用α型红细胞生成素150IU/kg一周3次的受试者(1014)在研究的第15天因不良事件(持续头疼)而中断了研究。头疼被研究者评价为与α型红细胞生成素用药极有关。

受试者2007(150IU/kg一周3次)，一个28岁的白人男性，其血红蛋白水平在第26天为18.0g/dL。当天晚些时重复的血红蛋白检测显示其水平为17.6g/dL。第29天，该受试者的血红蛋白水平为18.2g/dL；在第31天的重新评价显示血红蛋白水平为18.4g/dL。然后如研究方案规定的对受试者进行放血；抽去450毫升血。受试者在第29天完成研究，随后为安全性起见监测血红蛋白；在第32和39天的评价显示血红蛋白水平分别为17.7g/dL和16.9g/dL。

在研究中为治疗不良事件所使用的伴随药物包括：用对乙酰氨基酚治疗头疼(受试者1014、2004[150IU/kg]和1011、2008[40,000IU])、牙痛(受试者2004[150IU/kg])、颈部疼痛(受试者2010[150IU/kg])、经期痛(受试者1013[150IU/kg])、胃肠型感冒(受试者1011[40,000IU])、伤风(受试者1013[150IU/kg])和套管部位疼痛(受试者1008[150IU/kg])；用生理盐水和氯霉素治疗眼炎(受试者2004[150IU/kg])。

临床实验室评价

随时间的实验室值

铁离子、铁蛋白和转铁蛋白饱和度从基础值的平均变化概述于图59。在铁离子值或转铁蛋白饱和度上没有一致的模式可表明每一个处理引起了临床上明显的异常。

铁蛋白变化反映的模式在两个组之间是相似的，反映了期望的使用铁离子储备来产生血红蛋白(图60)。两个组中血清铁水平的波动不被认为具有临床意义。

如图60所述，铁蛋白值从基础值的平均变化降低至第8天，并保持低水平至第29天，表明在此期间有持续的红细胞生成。铁蛋白值从基础值的平均变化在两组间没有明显的差异。

单个受试者的改变

在研究过程中没有单个受试者的改变被记录为不良事件。

其他安全性观察

生命体征

按研究日期，单个受试者数据的生命体征检查从基础值的平均变化的概述见图61。每个处理组在平均生命体征检查方面均没有临床上显著的变化，在两组之间也没有显著差异。

使用α型红细胞生成素150IU/kg一周3次的两个受试者的收缩压等于或超过140mmHg的上限；这些事件均没有被研究者认为具有临床显著性，也没有被记录为不良事件。

物理检查发现

物理检查没有从基础值的临床显著改变。

安全性结论

在本研究中，使用α型红细胞生成素150IU/kg一周3次或40,000IU一周1次是安全的并被健康受试者很好地耐受。在任一治疗组都没有临床上重要的处理-出现不良事件。大多数处理-出现的不良事件在严重程度上是轻微的，在两组之间的定性差异很小。在研究中没有受试者死亡，也没有严重不良事件的报告。一个应用α型红细胞生成素150IU/kg一周3次的受试者在研究的第31天因较高的血红蛋白水平而被静脉放血。对此受试者随后的血红蛋白水平监测表明血红蛋白水平没有进一步升高。一个接受150IU/kg一周3次α型红细胞生成素的受试者因不良事件(持续头疼)而撤出研究。任一组在临床实验室检测值、平均生命指征检查或物理检查方面没有观察到明显的临床改变；在两组之间的结果上也没有明显的差异。

总结和讨论

在使用α型红细胞生成素40,000IU一周1次后，C_max值为150IU/kg一周3次剂量方案的6倍，AUC_(0-168)值为3倍。150IU/kg一周3次剂量方案后，清除率较40,000IU一周1次剂量方案高。网织红细胞百分比、血红蛋白和总红血细胞在1个月研究期间改变的时间概况在两个剂量方案间是相似的，尽管血清中α型红细胞生成素的暴露(按照AUC_(0-168))不同。此外，网织红细胞百分比的AUC、血红蛋白的AUC和总红血细胞的AUC在1个月研究期间内，两组间没有统计学上的显著差异(p＞0.05)。尽管男性和女性之间在血红蛋白AUC和总红血细胞AUC上的差异有统计学显著性，但这些差异被认为没有临床意义。本研究数据清楚地表明，150IU/kg一周3次和40,000IU一周1次剂量方案后血红蛋白的反应是相似的。

150IU/kg一周3次和40,000IU一周1次剂量方案后有所期望的血清中α型红细胞生成素总暴露的差异。血红蛋白反应相似提示两种剂量方案可以被互换使用。

实例3：给予EPREX^和PROLEASE^后PK/PD参数的比较

图62是rHuEpo对红细胞生成刺激作用模型的示意图。此模型用于评价给予8个单次剂量EPREX^后rHuEpo反应的动力学和药效学参数，以及给予单次剂量PROLEASE^后的动力学参数。

药代动力学

600IU/kg/周EPREX^用药4周的药代动力学用同时代入8个单次剂量获得的参数模拟。只有Tau和Fr值被估算。对于150IU/kg一周3次的癌症剂量方案，根据来自较早研究(EPO-358/359)的既往评估，F、Tau和Vd值如图63所示是固定的。PROLEASE^单次用药(2400IU/kg)的药代动力学被评估，并用这些参数模拟1800IU/kg/月的多次剂量方案。同一组动力学参数被用于确定男性和女性概况的特征，因为初步的运行显示根据性别估算的参数没有显著的差异。

药效学

动力学被固定并用作驱动药效学反应的强制函数。网织红细胞给药前的值被固定为基础水平，48和96小时RBC值的均值被固定为基础值。固定从EPREX^单次用药评价得到的生命周期参数以进一步代入多次用药。在600IU/kg/周多次用药手术方案后，估算了网织红细胞反应的Smax和SC₅₀。如图64所报告的，就反应的可变性而言，这些参数似乎改变得不是非常可观。这些差异可仅仅反映了这样一个事实，即这是一个与单次给药研究不同的在新的一组志愿者中进行的I期研究。而且，根据图65和66中显示的模拟，这些参数组似乎可以很好地描述了150IU/kg一周3次的癌症剂量方案的特征。男性和女性网织红细胞的数据单独进行分析，因为从男性受试者数据估算的Smax和SC50并不足以很好地描述女性的反应。如图68所示，当单独对女性估算时，这些参数是不同的，尽管很难判断这些差异是否是可观的。这些差异可反映了以性别为基础的一些轻微的药效学差异，因为所有数据是从一个预期可变性较低的单一研究中得到的。

估算的EPREX^参数用来模拟单次和两次PROLEASE^剂量方案的反应。根据来自EPREX^的性别分开的估计值参数，采用本发明的模型分别对男性和女性进行模拟。进一步，RBC反应根据用网织红细胞数据产生的参数进行模拟，且红细胞反应似乎在EPREX^和PROLEASE^的所有例子中都被很好地描述了特征。

根据图66和67中显示的模拟，可见同样一组药效学参数可以很好地描述对两种剂型的反应。因此，可以得出结论EPREX^和PROLEASE^在药效学上似乎是等价的。本发明的模型预测，在两种剂型之间反应的差异可能完全是由于动力学改变造成的。实际上，本发明的模型可被用于将EPO和EPO样化合物新形式和变型的PK/PD特性与那些目前可获得者进行比较，以给患者提供最有益的治疗方案。

实例4：rHuEPO不同剂量方案的比较

长期使用rHuEPO的标准剂量方案是150IU/kg一周3次和600IU/kg/周。如果患者治疗减少用药次数，就可能节约费用并增加便利。因此采用本发明的模型来检测不同rHuEPO剂量方案的血红蛋白反应的差异，以描述和预测对rHuEPO的反应，这样提供了最有效的治疗方案。

本发明的生成/衰减药效学模型及双重吸收药代动力学模型一起被使用。从健康志愿者rHuEPO药效学拟合获得的参数(图3和图13)被用来模拟不同的剂量方案。40IU/L的基础EPO浓度对于所有例子中的模拟是固定的。ADAPT II程序用于所有模拟。

图68显示了不同rHuEPO用药剂量和剂量方案模拟的血红蛋白反应对应时间的曲线。所有的方案均引起Hb浓度的持续增加，直至大约126天(3024小时)到达稳定状态。600IU/kg/周的剂量似乎导致Hb水平的最大增加。这个剂量和剂量方案可以在大多数时间内保持rHuEPO浓度在23IU/L的起点之上，引起细胞计数的持续增加，最终产生较高的稳定状态的Hb水平。每2周给予1200IU/kg的相同的总剂量产生很低的反应，因为rHuEPO浓度在大多数网织红细胞转变为红细胞之前降至起点以下。此外，rHuEPO的随后给药也不够及时以像每周给药所发生的那样增加浓度至起点之上

在比较450IU/kg/周方案和900IU/kg每2周一次方案时可产生相似的争论。就给予的总剂量而言，150IU/kg一周3次剂量方案与450IU/kg/周的方案是相等的，但一周3次用药的药效学概况产生了稍好的Hb反应。如所预测的一样，900IU/kg/10天的剂量方案产生好于1200IU/kg/2周(增加48％)的稳定状态反应情况(增加56％)，但低于600IUkg/周方案(增加71％)。

当治疗持续一定长的时间，获得的实际稳定状态反应看起来依不同的剂量和剂量方案而不同。但这些稳定状态反应的差异在短期治疗方案中不明显，后者仅引起Hb水平的轻微升高(如，增加1单位)，600IU/kg/周的治疗除外，它与其他方案相比可以产生持续的较高的Hb反应。采用本发明模型进行的模拟显示，随着再次给药的时间缩短，在相同总剂量下可以达到较高和较稳定的Hb增加。多次给药有助于保持rHuEPO浓度在起点之上，加速了网织红细胞转变为红细胞。红细胞的寿命较网织红细胞长40倍，在血中保持更长的时间，引起Hb水平的稳定增加。而且，可以发现频繁给药所见到的反应改变也依赖于选择的剂量。隔周方案转换为每周一次方案对600IU/kg剂量的影响较450IU/kg剂量大。虽然就达到的稳定状态反应而言可能好一些，但一周3次用药并不优于总剂量相同的每周一次剂量方案，因为同频繁给药的不便相比，反应改善的程度不够突出。因此，对于所检测的剂量方案，600IU/kg一周一次的EPO用药显示了获得所期望的PK/PD反应。

实际上，本发明的模型可以提供任何所需的剂量方案，如根据所使用的EPO和所期望的PK/PD反应，提供少于每天一次、少于每周一次、少于每2周、每3周或每4周一次的方案。因此本发明的模型并不限于用于任何特殊类型EPO和任何特殊类型的剂量方案，并且可被修改和与任何类型的EPO使用。

实例5：rHuEPO 40,000IU/周剂量方案的效果与患者体重的关系

重复使用rHuEPO的需求使以体重为依据的用药十分不便和浪费时间。将这种做法转变为不考虑受试者体重而使用一定的剂量，可以促进rHuEPO的临床应用。因此用本发明的模型进行模拟，尝试揭示期望的RBC和血红蛋白反应随体重改变而改变的程度。想要用这些模拟来提供关于用药方式的这种变化是否可从理论观点进行判断的了解。

本发明的生成/衰减药效学模型与双相吸收药代动力学模型被一起使用。从健康志愿者rHuEPO药效学拟合获得的参数(图3和图13)被用来模拟不同的剂量方案。40IU/L的基础EPO浓度对于所有例子中的模拟都是固定的。ADAPT II程序被用于所有的模拟。

受试者体重对预期的rHuEPO维持治疗反应的影响描述于图69。图69显示了体重50、70和90kg受试者模拟的RBC和Hb对时间的反应曲线，剂量方案为600IU/kg/wk共24周(4032hr)与一个总剂量40000IU/wk比较。在rHuEPO给药期间RBC和Hb都显示了持续的升高。假定大多数受试者体重为70kg，40000IU/wk剂量与600IU/kg/wk剂量方案相似。

体重改变影响分布容积(Vd)。rHuEPO的Vd为0.0558L/kg，与血浆容积很接近。随着体重增加，Vd(L)增加，引起得到的最大rHuEPO浓度更低。体重改变也影响清除参数Vmax(IU/hr/kg)。伴随体重增加Vmax(IU/hr)增加，导致rHuEPO清除(Vmax/(Km+C_epo)增多。由于Vmax和Vd受到同等程度的影响，因此清除率常数(即低浓度时的k值)保持不变。在任何情况下，体重不同看起来对动力学没有显著程度的影响，因为在SC注射后的末端斜率实际上由吸收动力学控制，由于SC₅₀非常低，所以末端斜率主要地控制着反应程度。

模拟显示，RBC计数和Hb计数的稳态水平依体重略有不同。而达到稳态的时间一样长，因此，Hb反应在早期如4周没有很大变化(50、70和90kg受试者分别为16.46、16.33和16.19g/dl，相比600IU/kg/wk剂量方案为16.35g/dl)。

因此，来自本发明模型的数据显示，体重在50至90kg范围内的变化对rHuEPO的药效和动力学没有很大的作用。因此，根据体重确定剂量方案是不合适的，也无必要，将根据体重确定剂量方案改为不管体重采用40,000IU/wk的标准方案是合理的和方便的。40,000和650IU剂量并不意味着是绝对的，是预期可以给予患者并提供同样或相似作用的剂量值范围。事实上，“大约”40,000或650IU预测了给患者提供同样或相似作用的剂量范围，并在特殊的实施方案中，预测有+/-1至20％IU值的范围。

实例6：在癌症患者中评价rHuEPO的药效

进行化疗的癌症患者经常贫血。内源性EPO产生不足被认为是造成这些患者贫血状态的因素之一，以150IU/kg每周三次(t.i.w.)的剂量给予rHuEPO已显示证实对矫正贫血有益。虽然这一方案产生了合适的反应并被最常使用，但需要频繁给药使其不方便，它可能不是最好的方案。因此，考虑了rHuEPO的最优剂量，该剂量可以用每周一次的方案给药以产生与通常的一周三次方案相当的血红蛋白水平升高。采用正常受试者数据的本发明PK/PD模型被用以定量比较癌症患者的反应，如果需要，并解释在药效上不同的可能原因。此研究也提供了证实本发明模型的机会，使他们能可靠地在将来用于预测。

癌症患者的数据从RWJPRI获得。这是一个在150例具有实体肿瘤并接受含铂(顺铂或卡铂)化疗的贫血癌症患者中进行的开放标记、随机、对照、平行组、多中心的研究。不同剂量水平的PROCRIT^(α型红细胞生成素，Amgen)，包括每周一次300、450、600、900IU/kg皮下给药和150IU/kg t.i.w.皮下给药，被给予5组受试者(每组25例患者)12周。对照组不接受治疗。患者需18岁以上，研究前Hb 10g/dl，校正的网织红细胞计数3％，血小板25,000细胞/mm³，肌酐2.0mg/ml，大便隐血阴性，无溶血迹象，血清叶酸和维生素B₁₂水平正常。此外，只有那些在随机化前1月内无必需的输血并没有铁缺乏者被纳入研究中。血红蛋白计数被作为主要药效学终点而测定。

获取自正常志愿者的药代动力学和药效数据拟合的参数被用以模拟给予癌症患者不同剂量和方案rHuEPO后的反应。本发明的生成/衰减药效学模型以及双向吸收动力学模型被采用。获取自健康志愿者rHuEPO药效学拟合的参数(图3和图13)以及40IU/L的EPO浓度基础值被用作起点，以模拟不同的剂量方案，并探讨了改变各种参数对反应的影响。ADAPT II程序被用于所有模拟过程。

图70A-70E显示了给予不同剂量和方案rHuEPO的贫血癌症患者的血红蛋白数据以及模拟的网织红细胞、红细胞和Hb反应。如图中所见，患者看起来通常对治疗顺利地反应为Hb浓度的持续增加。300IU/kg剂量方案仅有很轻微的反应。随着每周剂量的增加，反应程度看起来也提高。然而，900IU/kg/周的最高剂量并不比600IU/kg/wk剂量产生更高的Hb水平增加。数据显示，600IU/kg每周一次方案产生的反应略好于150IU/kg t.i.w.方案。从图中也可看到，用健康受试者参数模拟的预测反应比癌症患者中观察到的实际反应要高。癌症患者与健康受试者在rHuEPO药动学和/或药效学上的不同可以解释这些反应状态改变的原因。因此，进行了在药效学模型中改变选定参数的模拟以解释这些不同。

有报道骨髓红细胞系发育不足、RBC存活下降和网织红细胞减少(见，如，Abels，1992.Semin.Oncol.19：29-35)为慢性疾病中贫血的一些可能原因。抗癌药物治疗也被认为是这些患者贫血的主要原因之一(见，如，Matsumoto等，1990.Br.J.Pharmacol.75：463-68.)。Ks值减少1/3，提示内在细胞产生率较低和/或S_max较低，可能解释模拟中所见的反应减小。癌症患者有高于正常的基础EPO浓度，但对于贫血的程度是不适当地减小的(见，如，Case等，1993.J.Natl.CancerInst.85：801-806和Miller等，1990.N.Engl.J.Med.322：1689-99.)。依据随癌症和化疗的贫血严重度和类型，被报道的基础EPO浓度范围从低于40到高于500U/L(见，如，Ludwig等，1994.Blood 84：1056-63，Case等，见上，Abels，见上，和Miller等，见上)。据报道，基础EPO水平高于500IU/l预示着对rHuEPO治疗无反应(见，如，Ludwig等，见上)。

随着模型中基础EPO浓度升高到70U/L，意味着对EPO的全身敏感性下降，下移了反应-时间曲线并较好地与数据吻合。由于用药每周进行，所以浓度很好地保持在阈值以上，使大多数网织红细胞得以转变为红细胞。因此，阈值的改变并不显著地有助于曲线移位，提示网织红细胞-RBC转变过程在这些患者中可能受影响不明显。在正常情况下，红细胞存活2880小时，根据生成/衰减模型，真正的稳定状态是在新红细胞生成开始后达到一个寿命周期。RBC寿命的任何缩短将在这些患者中引起此稳定状态较早达到和水平较低。这一可能性未能证明，因为在研究中没有用药到正常情况下获得真正稳定状态所需的足够长的时间。如前面提到的，另一个在癌症患者中减少反应的可能原因可以是rHuEPO药代动力学的不同。在健康志愿者中，rHuEPO皮下注射后经历触发式动力学，导致浓度在延迟的时间内保留在基线以上而得以持续地刺激新细胞的生成。经过淋巴管的缓慢1级输入被假定与此现象有关，任何因疾病状态和化疗引起的淋巴管生理功能改变可减弱此缓慢释放而导致反应降低。

尽管每周一次600IU/kg方案较150IU/kg t.i.w.需要更高的总剂量，但它在癌症患者中产生了较好的Hb反应且是rHuEPO维持治疗的更方便的给药方法。因此，根据本发明的模型将目前的方案改变为600IU/kg/wk可能是优选的。形成的PK/PD模型能解释由于疾病状态如癌症的反应性的不同，模拟法预测较低的Ks值和/或较高的基础EPO水平，无论有无rHuEPO药代动力学的改变，可能是这些患者中所见到的反应迟钝的原因。

关于上述详细的描述和特殊实例，本领域的技术人员会知道本发明的PK/PD模型系统可被用于各种情况。例如，一个专业人员可能想要调整EPO的剂量方案以在一个患者中获得所需要的药代动力学反应，如血清EPO浓度。专业人员可以应用本发明的系统完成此结果。可选择地，专业人员可能想在一个患者中获得特殊的药代动力学反应，如特殊的血红蛋白水平升高。专业人员可以应用本发明的系统确定哪种EPO剂量方案将能够获得所需要的结果。另一方面，专业人员可能想确定一个特殊的EPO剂量方案将得到什么类型的药代动力学和药效学结果。再一次地，专业人员将能够应用本发明的PK/PD模型作出确定。

实例7：在狗一个月剂量方案期间EPO的免疫原性

本研究是为评价EPO制剂在免疫抑制和非免疫抑制的beagle狗中的免疫原性而设计。检测了EPO制剂的药效学和药代动力学曲线。

管理依从性

实验室工作规范(GLP)：本研究不是严格遵照美国食品和药品管理局的非临床实验室研究的GLP规程进行的，而是按照议定书和可适用的Oread标准操作步骤进行的。

动物管理和使用：动物研究是按照NRC的“实验动物管理和应用指南”(1996年修订)和USDA的“实验动物安全法案，1996年8月24日，Pub.L.89-544及随后的修正案”进行的。Oread Met/PK是一个AAALAC公认的机构。

药品确认及来源

制剂：

EPREX^，一个2000IU/mL，一个10,000IU/mL，盐水作对照。

贮存：

EPO制剂未在研究中使用时冷冻(～4℃)避光保存。在给药或损坏后没有用的制剂退还给RWJPRI。

实验动物

种属：                      狗

品系：                      Beagle

性别：                      雄性

来源：                      Harlan Sprague Dawley，Inc.

                            Indianapolis，Indiana 46299

用药时年龄：                8-9个月

第一次给药时的对象体重：    9-12kg

识别方法：                  由动物供应商应用的刺身纹

研究数量：                  18(N＝3只狗/组)

畜舍

狗依处理组分组居住于存狗房的狗舍内，并在给药前驯化以操作和采集血样。在给药至少5天前进行检疫。在检疫阶段结束时，由研究人员确定所有动物均健康。在研究/采样期间，狗依然保持分组居住，除非因健康状况必须改变。狗舍被标以动物和实验方案号。

环境条件

动物房保持在23±3℃，相对湿度50±15％，且12小时白天/黑夜循环。每小时至少10次更换室内空气。

食物和水

狗在进行研究时使用Purina认证的狗饲料(Purina Certified CanineDiet^)#5007和随意饮水。食物分析(分析证明书由卖主提供)和水分析(溶解的固体、微生物含量、选择的元素、重金属和氯代烃类)的结果保留在原始数据文件内。很期望在食物或水中没有污染物以足以干扰本研究结果的水平。

剂量和种属的鉴定

剂量根据以前研究的从制剂评价中获得的已有数据选择。本研究在免疫抑制和非免疫抑制的beagle狗中进行，以评价EPO制剂的免疫原性及两种剂量方案的PK/PD状态。所用的狗的数目是科学地提供有效结果所必须的最小数。没有可接受的体外模型可以利用。目的性繁殖的beagle狗常规地用于进行药代动力学、药效学和毒理学研究以满足规章需要。

研究设计

概述

Beagle狗(N＝3只狗/组，6组)被随机地分配进处理组。在第2天，给予3组狗单次口服剂量的环孢素(25mg/kg)。此后，3组狗每天接受维持剂量的环孢素(10mg/kg)。在免疫抑制和非免疫抑制的狗中检测两个剂量方案的EPREX^和赋形剂。所有制剂和赋形剂每日一次或每周一次皮下注射(sc)。在4周期间的设计时间点采集血液样本。注射部位每日观察一次，体重每周量一次。在末次采血后，狗被无痛处死或捐赠给其他的研究结构。

准备和实验制剂的注射给药

第1天

实验制剂在第1天首次注射给狗(见下表)。所有制剂以下表中特定的容积注射。

一次用药量被吸进安装了合适规格针头的注射器内。将SC剂量注射进背部区域。用药部位在给药前被修剪并用擦不掉的墨水标记。

组别	处理	免疫抑制	EPO剂量(IU/kg)	容积(mL/kg)	频度	用药途径
							1	EPREX	是	50	251	每日一次	SC

2	EPREX	否	50	251	每日一次	SC
							3	EPREX	是	600	602	每周一次	SC
4	EPREX	否	600	602	每周一次	SC
							5	盐水	是	NA	60	每周一次	SC
6	盐水	否	NA	60	每周一次	SC

¹基于含2000IU EPO/mL的EPREX^制剂。

²基于含10,000IU EPO/mL的EPREX^制剂。

NA指无效。

观察、样本采集和处理

每日观察狗及其注射部位。记录并评价任何异常表现或行为。每周记录体重一次。

在指定的最初时间点(见下)，经过颈静脉采集大约2mL血液进入肝素化的真空容器(Vacutainers^)内(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。在颈静脉损坏的情况下，经头静脉采集血液并注明。在应用环孢素前获得的最初的血样被用作收获血浆。血液置于冰上，离心(1500×g，10分钟，～4℃)并收集血浆。血浆在-20℃冰冻以装运。

在第2次采血时，用含EDTA的Vacutainer^在早晨采集大约2mL血液并置于冰上。第2次血样以全血形式在～4℃保存，用于网织红细胞、血红蛋白和总红血细胞测定。

最初血液采集时间点：

1和2组(每日一次EPREX^)：在第1和28天的给药前、1、3、8、12、16和24小时，及第3、7、14、21和24天的给药前。

3-6组(每周一次EPREX^或盐水)：在第1和22天的预剂量、1、3、8、12、24、48、72和96小时，及第7和14天的预剂量。

第2次血液采集时间点：

所有组：在第1、3、7、10、14、17、21、24和28天的预剂量。

在研究期间，如必要，额外采集血清样本以评定肾和肝功能。在末次采样的24小时内，将狗用静脉内过量巴比妥安乐死溶液无痛处死，或捐赠给其他研究机构。

样本分析

采集的全血(在EDTA中)进行网织红细胞、血红蛋白和总红血细胞分析。

结果：

本研究的结果呈现在图71和72中。本研究结果表明，在4周的研究期内，50IU/kg/天和600IU/kg/周的剂量方案在免疫抑制或非免疫抑制的狗中的药效学反应(血红蛋白和红细胞升高的方式)是相似的。实例8：雄性猕猴3个IV剂量和6个SC剂量注射给药后重组人EPO的PK/PD模型

目的：

本研究的目的是应用本发明的PK/PD模型，确定雄性猕猴在3个单次给药IV注射和6个单次给药SC注射rHuEpo(EPREX^)后，rHuEpo在增加血中网织红细胞、红血细胞和血红蛋白数量方面的药代动力学(PK)和药效学(PD)概况。

方法：

数据来自由RWJPRI进行的两个研究(Sbi研究号0876-49和0875-49及RWJPRI研究号DM99146和DM99124，1999年12月)。一个研究是在12只雄性猕猴中进行的平行区组研究(Sbi研究号0876-49和RWJPRI研究号DM99146，1999年12月)。猴子被分为4组，一组为对照，而其他3组被静脉注射500、2000和4000IU/kg的EPREX^。在用药前及用药后48小时内抽取血液样本以测定rHuEpo浓度。另一个研究是在21只雄性猕猴中进行的平行区组研究，该21只猕猴被分为7组，每组3只猴子(Sbi研究号0875-49和RWJPRI研究号DM99124，1999年12月)。对照组皮下接受消毒的盐水，而其他6组被皮下注射400、1000、2400、5000、20000和40000IU/kg的EPREX^。动物的分配使得在组间具有一致的体重分布。在预剂量和注射后的不同时间点抽取血液样本直至第28天，以测定rHuEpo浓度和网织红细胞、红细胞及血红蛋白。平均值数据被用于本分析。

模型：一个PK/PD模型示意图被画于图73。

药代动力学：一个二室模型被用以说明在IV给药情况下动力学曲线的多指数性。非室性分析显示了非线性的动力学，它是用Michaelis-Menten分布函数建立模型的。在SC给药情况下，用双向吸收动力学模型来描述rHuEpo的吸收特征，即部分剂量快速0级输入，随后其余剂量缓慢的1级输入。6个单次SC给药和3个单次IV给药同时应用于此模型，以获得一组通常的参数来描述所有数据的特征。

用于建立静脉内药代动力学模型的微分方程是：

$\frac{\mathrm{dAp}}{\mathrm{dt}}=-V\max \·\mathrm{Ap}/(\mathrm{Km}\·\mathrm{Vd}+\mathrm{Ap})-k12\·\mathrm{Ap}+k21\·\mathrm{At}$

$\frac{\mathrm{dAt}}{\mathrm{dt}}=k12\·\mathrm{Ap}-k21\·\mathrm{At}$

SC数据用下面的方程建立模型：

$\frac{\mathrm{dAp}}{\mathrm{dt}}=\mathrm{ko}(0-{\mathrm{\τ}}_1)+k_1(t>{\mathrm{\τ}}_1)-V\max \·\mathrm{Ap}/(\mathrm{Km}\·\mathrm{Vd}+\mathrm{Ap})-k12\·\mathrm{Ap}+k21\·\mathrm{At}$

$\frac{\mathrm{dAt}}{\mathrm{dt}}=k12\·\mathrm{Ap}-k21\·\mathrm{At}$

其中

ko＝0                                            当t＞τ₁时

                   当0＜t≤τ₁时

k₁＝0                                          当t≤τ₁时

和

当t＞τ₁时

Ap代表血浆中药物的量，而At代表外周室(即，组织)内的药物。微常数k12和k21是中央(血浆)和外周室间的一级传输速率。Vmax和Km为Michaelis-Menten常数，代表着处理的能力和达到一半Vmax时的浓度。Fr是与1级吸收通道k1相关的部分剂量。根据数据和最初的运转，0级输入(k₀)的时间(taul)被定于10小时。单一的1级吸收速率ka可描述所有的剂量，除最低剂量(400IU/kg)需要单独估计ka以外。生物利用度F看起来随剂量而改变，对最低的两个剂量进行了推算，其余的剂量固定在100％。

具有不同寿命周期的两个前体细胞部分的链式成熟药效学模型(图73)被用于建立EPREX^的药效学模型。假定在两个前体部分的成熟阶段都发生生成刺激。k0代表细胞的0级生成速率，而T_R和T_RBC表示网织红细胞和红血细胞的寿命周期。

基础rHuEpo浓度假定为0，因此基础网织红细胞水平给定为k0T_R。用于推算的微分方程如下：

$\frac{\mathrm{dR}}{\mathrm{dt}}=k0\·((1+S(T-\mathrm{TP}2))\·(1+S(t-\mathrm{TP}1-\mathrm{TP}2))-(1+S(t-\mathrm{TP}2-T_R))\·(1+S(t-\mathrm{TP}1-\mathrm{TP}2-T_R)))$

其中刺激函数由Hill方程给出，γ固定为1。

$S\left(t\right)=\frac{S\max \·{\left(C_{\mathrm{EPO}}\right)}^{\mathrm{\γ}}}{{{\mathrm{SC}}_{50}}^{\mathrm{\γ}}+{\left(C_{\mathrm{EPO}}\right)}^{\mathrm{\γ}}}$

给予6个剂量水平EPREX^后的网织红细胞数被应用于上述方程以得到单一的一组药效学参数，具有代表所有剂量数据的特征。动力学模型的参数被固定并用作药效学的强制函数。用药前网织红细胞计数被固定为稳定状态基础值。

从网织红细胞拟合得到的药效学参数被用于模拟所有剂量的RBC数和血红蛋白水平。48小时RBC计数被用作基础值，同时由给药前血红蛋白数与该组给药前总细胞(RBC+网织红细胞)数的比值固定各组每个细胞的血红蛋白含量。

用于模拟的微分方程如下：

$\frac{\mathrm{dRBC}}{\mathrm{dt}}=k0\·((1+S(t-\mathrm{TP}2-T_R))\·(1+S(t-\mathrm{TP}1-\mathrm{TP}2-T_R))-(1+S(t-\mathrm{TP}2-T_R-T_{\mathrm{RBC}}))\·(1+S(t-\mathrm{TP}1-\mathrm{TP}2-T_R-T_{\mathrm{RBC}})))$

Hb_t＝Hb_call·(RBC_t+R_t)

结果：

图74显示了给予3个单次静脉内给药和6个单次SC给药EPREX^后，rHuEpo的浓度-时间拟合曲线。得到的参数列于图75。尽管最低剂量的终末相看起来略为高估，但非线性分布的二室动力学模型可充分地记录多相的IV动力学概况。推算的Km值高，提示非线性分布是轻度的，且可能只在高剂量时突出。中央分布容积Vd推算为57ml/kg，接近血液容积。对于SC用药，生物利用度随剂量有相当大的增加，最低剂量显示生物利用度为26.8％，下一个较高剂量为73％。最低剂量同其他剂量相比，ka值略有不同。从参数推算值可以推断，可生物利用剂量的主要部分跟随在缓慢的1级通道之后。0级路径看起来是迅速的，并占可生物利用剂量的一小部分(35.5％)。

网织红细胞拟合线示于图76a、76b，图77列出了推算的药效学参数。由第2个前体部分TP2引起的滞后时间小(～15hr)。推算的网织红细胞寿命周期接近6天。表示生成速率的最大增加可能的Smax为3.133，但推算的SC₅₀值高，为842.5IU/L。图78a和78b显示了RBC数量的模拟，图79a和79b为血红蛋白反应的模拟。

图80显示了在健康人给予EPREX^后获得的药效学参数。根据IV浓度-时间曲线，将药代动力学模型从2室简化为1室模型。通过应用内源性EPO水平引起的细胞生成作对照扩展了药效学模型，并包括一个解释说明人体天然反馈机制的额外部分(图81)。这一内容是通过假定网织红细胞引起其自身生成的反馈抑制，减少由P1室代表的最早细胞的产生率来完成的。还假设其抑制作用起效需要TP0小时。抑制作用用Hill函数建立模型。对猴和人药效学参数推算值的比较显示，该室的寿命参数在两种属间非常相似。Smax和SC50值看起来在种属间不同，但这可能是由于附加的反向调节的复杂性，以及在人rHuEpo对网织红细胞作用模型中Epo的基础浓度造成的。

讨论：

药代动力学：在IV给药情况下，动力学遵循用非线性分布二室模型俘获的双指数衰减。rHuEpo的主要作用部位是骨髓，后者是高度灌注的组织，因此模型中的外周室可能仅代表一些非特异结合的rHuEpo。最低剂量的终末相被高估，可能是由于难以得到在后面时间点的浓度测定值，或在此剂量范围内可能有不同的动力学行为。与人相似，猴的Vd推算值非常接近血液容积，且高Km值表明动力学是轻度非线性的。

在SC给药后，rHuEpo峰浓度在1天内达到，由于发生ka控制终末相的触发现象，rHuEpo残留在循环中的时间较IV给药长。这些数据样本被用多相吸收模型可接受性地收集。最高SC剂量的最初浓度被略微高估。然而，考虑到是用单一的一组参数描述所有的剂量水平，这应当是可以接受的。我们的双向吸收动力学模型可以用于解释药物从SC部位吸收的不同途径。快速0级输入的部分剂量可解释为经皮下部位的血管直接进入血液。另一方面，另一部分剂量可假定进入淋巴管并经过缓慢的1级吸收过程从淋巴进入血液。这也可解释1级吸收开始后的10小时时间滞后。生物利用度随剂量而增加，对于2400IU/kg以上剂量为100％。这个相同的双向吸收模型很好地描述了人SC动力学的特征，并显示了随剂量增加生物利用度的相似趋势。然而，与猴不同，此模型预测人的主要剂量部分是经过0级通道吸收的。

药效学：网织红细胞计数在48小时内开始上升，在大约10天时达峰，随后开始下降，至20天时回到基础水平。我们的链式成熟模型看起来很好地代表了数据的特征。图78a、78b、79a和79b的模拟曲线显示，网织红细胞药效学可容易地用于预测RBC数目和血红蛋白数量的改变。

红细胞生成素的真正作用方式仍未完全了解。rHuEpo的主要作用被认为是刺激早期祖细胞的增殖。然而，来自实验动物研究的证据表明，红细胞生成素也作用于分化的成红细胞上(Krantz等，红细胞生成素和红细胞生成的调节，1970，The University of Chicago Press)。这一观点派别认为rHuEpo作用在成熟的成红细胞上以产生早期的24小时网织红细胞反应，随后由于对幼红细胞的附加效应而出现巨红细胞症。基于此理论，我们形成了机械的链式成熟模型，即rHuEpo刺激发生在2个前体细胞群，他们可代表成红细胞和较早的祖细胞。

已知成红细胞经历2至5个细胞阶段，依种属不同其平均成熟或更新时间为11到48小时(同前，Aplen等，1959，Ann.N.Y.Acad.Sci.，77：753，Osgood，E.，1954，Blood，9：1141，和Fliedner等，1959，Acta.Haematol.，22：65)。我们的模型预测，在新生成的网织红细胞真正释放入循环之前有15小时的时间滞后，这反映了成红细胞的成熟时间。

推算的网织红细胞寿命周期是6天。在人，网织红细胞阶段的正常细胞寿命周期大约是3.5天在骨髓，1至2天在血液(Hillman等，1967，Sem.Haematol.，4(4)：327)。然而，在严重贫血的动物模型中显示，骨髓网织红细胞库是迁移到循环中的(同前，和Bessis等，1973，活血细胞及其超微结构，Verlag New York-Heidelberg-Berlin)。这些移位的骨髓网织红细胞生成红细胞的时间需要3天，比正常网织红细胞。因此，我们可认为由我们的模型推算的网织红细胞平均寿命周期反映了骨髓和血液中成熟时间的总和。

在文献中已有报道，在人，骨髓中红系祖细胞形成网织红细胞平均需要5天(Krantz等，见上)。此时间事实上反映了细胞在P1和P2室中所用时间的总和，经推算为85小时。

总之，rHuEpo的动力学和药效学看起来在种属间(猴和人)非常相似，本发明的模型能够很好地接近rHuEpo作用的动力学和药效学，并给出细胞衰老时间参数的逼真的推算值。

对本领域的专业技术人员而言，所描述的实例和本发明系统的各种修改和变动是显而易见的，并不背离本发明的范围和精神。尽管本发明在特殊优选实施例方面进行了描述，但应当理解，如权利要求书所声明的，本发明不应不适当地限制于这些特殊实施方案。实际上，为实现本发明而对所描述模式的各种修改对相关领域的技术人员而言是显而易见的，应当包含在下述权利要求的范围内。

Claims (37)

1.一种方法，其包括以下步骤：

(a)选择一个或多个EPO剂量方案；

(b)用药代动力学/药效学模型来确定所述一个或多个EPO剂量方案的药效学曲线；和

(c)根据所述的药效学曲线选择在患者中产生需要的药效学反应的所述一个或多个EPO剂量方案。

2.一种方法，其包括以下步骤：

(a)选择一个或多个所需的药效学反应；

(b)用药代动力学/药效学模型来确定产生需要的一个或多个药效学反应的EPO剂量方案；和

(c)选择在患者中产生所述需要的药效学反应的一个或多个EPO剂量方案。

3.一种方法，其包括以下步骤：

a)选择EPO剂量和剂量方案；和

b)根据所述剂量和剂量方案确定药效学反应。

4.一种方法，其包括以下步骤：

(a)选择一个或多个EPO剂量方案；

(b)用药代动力学/药效学模型来确定所述一个或多个EPO剂量方案的药代动力学曲线；和

(c)根据所述的药代动力学曲线选择在患者中产生需要的药代动力学反应的所述一个或多个EPO剂量方案。

5.一种方法，其括以下步骤：

(a)选择一个或多个药代动力学反应；

(b)用药代动力学/药效学模型确定产生需要的一个或多个药代动力学反应的EPO剂量方案；和

(c)选择在患者中产生所述需要的药代动力学反应的所述一个或多个EPO剂量方案。

6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述选择的EPO剂量方案在EPO剂量之间至少将血清EPO浓度在高于服药前的水平维持约5到约30天。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述血清EPO浓度足以增加血液红细胞的生产。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述血清EPO浓度足以将增加的血液红细胞生产维持至少一周。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述血清EPO浓度足以将增加的血液红细胞生产维持至少两周。

10.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述选择的EPO剂量方案包括一周给药EPO一次。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述每周一次的EPO剂量方案包括给药范围为约300IU/kg到约2400IU/kg的EPO剂量。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述每周一次的EPO剂量方案包括给药范围为约30,000IU到约54,000IU的EPO剂量。

13.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述选择的EPO剂量方案包括两周给药EPO剂量一次。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述两周一次的EPO剂量方案包括给药范围为约900IU/kg到约1200IU/kg的EPO剂量。

15.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述选择的EPO剂量方案包括十天给药EPO一次。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述十天一次的EPO剂量方案包括给药约900IU/kg的EPO剂量。

17.根据权利要求6、8、9、10、13或15所述的方法，其中所述选择的EPO剂量方案包括给药选自epoietinα和darbepoietinα的EPO。

18.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述选择的EPO剂量方案包括给药选自新生红细胞形成刺激蛋白、人红细胞生成素类似物、和红细胞生成素Ω的EPO。

19.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述选择的EPO剂量方案包括给药具有EPO生物学活性的蛋白。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述具有EPO生物学活性的蛋白选自红细胞生成素类似物，红细胞生成素异构体，和肾脏红细胞生成素。

21.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述选择的EPO剂量方案包括给药衍生自自然产生的EPO，重组的EPO，和合成的EPO的EPO。

22.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述病人有贫血。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述贫血包括与EPO浓度相关的贫血。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述贫血选自与末期肾衰、肾衰相关的贫血，和透析相关的贫血。

25.根据权利要求22所述的方法，其中所述贫血包括与癌症化疗相关的贫血。

26.根据权利要求22所述的方法，其中所述贫血包括与AIDS药物治疗相关的贫血。

27.根据权利要求22所述的方法，其中所述贫血包括与药物相关的贫血。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述药物选自顺铂和卡铂。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述药物是叠氮胸苷。

30.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述病人经历献血。

31.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述病人接受过骨髓移植。

32.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述病人具有风湿性关节炎。

33.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述选择的EPO剂量方案包括通过选自以下的途径进行EPO给药：静脉给药、皮下给药、和肠胃外给药。

34.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述选择的EPO剂量方案包括给药具有修饰的糖基化模式的EPO。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述具有修饰的糖基化模式的EPO包括darbepoietinα。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述修饰的糖基化模式包括高糖基化。

37.根据权利要求34所述的方法，其中所述修饰的糖基化模式包括去糖基化。

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