CN110487945B

CN110487945B - 一种针对药物多峰现象的犬药代动力学模型的创建方法

Info

Publication number: CN110487945B
Application number: CN201910768826.5A
Authority: CN
Inventors: 白杨; 苏薇薇; 姚宏亮; 吴灏; 彭维
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2039-08-20
Also published as: CN110487945A

Abstract

本发明涉及一种药物多峰现象的动物药代动力学模型的创建方法。包括以下步骤:选取犬至少6只，雌雄各半，按剂量给药，给药后采集血样，采血时间点保证在第一个峰前至少采集到2个采血点，在每个峰最高值附近至少采集到3个采血点，在最后一个峰后至少需采集3个采血点;采用液相质谱联用仪测定血药浓度；按每只犬5种类型计算其拟合常数（DM），最小值为该只犬的药代标准模型类。本模型可在犬体内建立标准模型，并正确求算该类药物的药代参数，得出合理给药剂量方案，也可用于计算和预测该类药物在犬体内的药物浓度，克服现有药代软件计算多峰现象药物的药代参数偏小引起犬给药剂量过大的缺陷。

Description

一种针对药物多峰现象的犬药代动力学模型的创建方法

技术领域

本发明涉及一种药物多峰现象的动物药代动力学模型的创建方法。

背景技术

新药研究是药物开发的必经阶段，药物经过实验室药理研究和临床前动物研究两个阶段才能进入药物临床研究阶段，最终成为新药。药代动力学参数对实验室药理研究和临床前动物研究中的用药剂量具有重要意义。药物学家根据药代动力学参数按照国家规定得出合理给药剂量方案，明确每次研究动物给药剂量和每给药次数，如给药剂量过高会对动物产生毒副作用，如给药剂量过低则无法产生药效，影响对药物治疗效果及安全性的评价。

现阶段，常采用DAS软件或WinNonlin软件药代动力学模型用于求算药代参数，得出合理给药剂量方案。但是对于某些类的药物（如黄酮类、蒽醌类、多酚类、非甾体类抗炎药）而言，这类药物血药浓度-时间曲线出现多个峰的现象。常用软件求算的药代参数偏小尤其是半衰期偏小，如按照其药代参数设计的用药剂量方案，服药剂量偏大，服药次数偏多，会产生毒副作用，影响在动物药理模型中药物治疗效果及安全性的评价，进而影响药物临床前药理研究及药代动力学研究的结果。

本发明构建了一种针对药物多峰现象的犬药代动力学模型，该模型适用于多峰现象的药物在犬的实验研究及临床前试验，本发明界定了该模型的标准模型，建立标准模型后可正确计算具有多峰现象的药物的犬药代动力学参数，得出合理给药剂量方案，对药物临床前药理研究及药代动力学研究具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种针对药物多峰现象的犬药代动力学模型构建方法及其标准模型。该方法包括以下步骤：

1.本发明设计的针对药物多峰现象的犬药代动力学模型是基于国家标准《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》的要求设计的，选取犬至少6只，雌雄各半，禁食不禁水12-16小时，称重，计算给药量；

2.对每只犬口服给药，给药期间，犬正常饮食饮水，并与给药后0.5小时，1小时，1.5小时，2小时，3小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，24小时，36小时采集血样，离心取血浆，处理后进液相质谱联用仪进行测定血药浓度数值。

3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B；梯度洗脱：0分钟-2分钟-20分钟-25分钟-27分钟-30分钟，流动相A：5%-5%-95%-95%-5%-5%；流速0.3mL/min；质谱检测条件根据常规方法确定。

4.药代标准模型的建立及评判指标：

本发明在犬中存在5种药代标准模型，由于生物体本身的特性，不同犬符合的药代标准模型不同。

类型1：

类型2：

类型3：

类型4：

类型5：

其中t为采血时间；C ₁ - C ₅为各类型中采血时间的对应血药浓度；e为自然常数；k _a，k，A，B，f，t ₁为生物常数。

由于生物体本身的特性，犬个体之间差异大，不同犬的生物常数k _a，k，A，B，f，t ₁需分别求算，求算方法如下：

把每只犬的血药浓度和采血时间分别输入Office Excel，第一列为采血时间，命名为t；第二列为对应的血药浓度，命名为C _p；第三列为第二列对应的自然对数值（excel函数为LN（C _p））。以第一列最后3-5个点为线性横坐标，第三列最后3-5个点为线性纵坐标，求斜率和截距，分别命名为k和A（excel函数为SLOPE和INTERCEPT）。第四列为根据公式e^(A ^{+k ∗t )}－C _p求算值的自然对数值,其中e为自然常数（excel函数为LN(EXP(A +k ∗t )- C _p)）。以第一列最前面3-5个点为线性横坐标，第四列最前面3-5个点为线性纵坐标，求斜率和截距，分别命名为k _a和B （excel函数为SLOPE和INTERCEPT）。t ₁求算如下（excel求算为（A－B）/(k－k _a)）。f由于生物体本身的特性，在0.2-3之间（不同犬个体中，为0.2，0.6，1，1.5，2，2.5，3）。

把每只犬的生物常数k _a，k，A，B，f，t ₁代入药代标准模型的类型1-类型5，得到每只犬的5种药代标准模型。

求算每只犬的拟合常数（DM）作为标准模型建立的评判指标

其中n为该只犬中可检测到血药浓度的样品个数。把每只犬所有采血时间作为自变量代入各自的5种标准模型，可算出所有采血时间对应的所有血药浓度的计算值命名为C _j ^’。每一个计算出的C _j ^’ 对应一个测得真实血药浓度，命名为C _j， j为第j个采血时间点。

每只犬的5种类型可以求算共5个拟合常数，分别命名为DM ₁-DM ₅，选择DM ₁-DM ₅中的最小值，为该只犬符合的药代标准模型类型。

本发明建立的犬药代标准模型的DM值规定为0-50范围内，每个剂量组的犬应60%以上符合DM值要求（如6只犬中应有4只犬的DM值在0-50范围内），说明标准模型建立合理。

标准模型建立后可求算药代参数C _max, T _max, t _1/2,AUC, V _D, Cl。

本发明提供了一种针对药物多峰现象的犬药代动力学模型构建方法及其标准模型。相对于现在常用的药代软件（如：DAS软件,WinNonlin软件）计算多峰现象药物的药代参数偏小引起犬给药剂量过大，应用本模型可在犬体内建立标准模型，并正确求算该类药物的药代参数，得出合理给药剂量方案，也可用于计算和预测该类药物在犬体内的药物浓度，适合广泛应用于多峰现象的药物在犬体内的临床前药理研究及药代动力学研究方面。

附图说明

图1是多峰现象药物的犬药代动力学模型的标准模型图（类型1-类型5）；

图2是柚皮苷口服给药后，多峰现象的犬药代模型建立后，柚皮苷(G)及其活性代谢物柚皮素(S)在犬体内药物浓度结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本说明做进一步说明。

实施例：

柚皮苷为黄酮类化合物，在体内的主要存在形式为柚皮苷及活性代谢物柚皮素，在犬体内均出现多峰现象，采用本发明可以建立针对多峰现象的犬药代动力学模型，并求算药代参数。

1.仪器：十万分之一电子分析天平（MS205DU，瑞士Mettler toledo公司）；超纯水器（Simplicity，美国密理博Millipore公司）；数控超声波清洗器（KQ250DE，昆山市超声仪器有限公司）；1200SL HPLC-6410A Triple Quad 液相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；Centrifuge 5430R 台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Vortex-Genie 2 涡旋振荡器，美国Scientific Industries公司；系列精密移液器，美国Rainin公司；色谱柱：Agilent RRHT ZORBAX Eclipse C18 column (2.1×100 mm, 1.8 μm)。

2.标准品：柚皮苷标准品（Lot: 110722-201714，含量：94.3%）购自中国药品和生物制品检定研究所。柚皮素标准品（Lot: BCBT8724，含量：97.0%）,异槲皮苷标准品（Lot:131697，含量：90.5%）和β-葡萄糖醛酸酶（G0751-100KU，Lot: SLBT2889，活度≥300,000units/g）购自Sigma-Aldrich公司。

3.试药：在化橘红（芸香科植物化州柚Citrus grandis ‘Tomentosa’ 或Citrus grandis (L.) Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮）中提取柚皮苷（HPLC检测纯度大于98.8%）。

4.一种针对多峰现象的犬药代动力学模型构建

4.1 动物试验：实验比格犬30只(12±2.4 kg，雌雄各半)，购自广东肇庆高要市康达实验动物科技有限公司。在禁食过夜后，18只犬随机分为3组(口服，3.1、12.4、49.6 mg/kg)。犬的采血时间分别为0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36小时。所有血样转移到肝素处理的离心管中，在4℃下4000 rpm离心10分钟。血浆保存于-80℃。

4.2 样品处理：血浆样品（200μL）加入β-葡萄糖醛酸酶20μL孵育（10 U/μL，37°C）2小时。酶孵化后,加入内标溶液10μL（2μg/mL异槲皮苷）。然后加入乙酸乙酯，涡旋提取样品至少3分钟后，离心（4℃，3900 rpm）10分钟，上清液转入离心管，氮气吹干。加入50%乙腈水溶液超声溶解，进样。

4.3 色谱质谱条件及样本测定：采用安捷伦6410A QQQ液相色谱-质谱联用仪对犬的血浆样品进行分析。色谱柱采用Agilent RRHT ZORBAX Eclipse C18柱（2.1×100 mm,1.8μm），柱温：40°C。流动相为甲醇：水：甲酸 = 52：48：0.12（v/v），流速为0.2 mL/min。在负离子模式下，采用多反应监测模式检测样本。质谱条件为:毛细管电压4000 V，干燥气体9L/min，雾化器压力30 psi，气体温度350℃。柚皮苷: 579.2/271.0 (m/z)，fragmentor200 V，collision energy 35 V; 柚皮素, 271.2/151.1 (m/z)，fragmentor 90 V，collision energy 20 V;异槲皮苷, 463.0/299.8 (m/z), fragmentor 130 V，collisionenergy 25 V。采用方法学验证试验通过的方法对比格犬血浆中的柚皮苷及其活性代谢物柚皮素进行测定。

4.4 药代模型的建立及模型常数的求算结果见表1。

4.5 本发明药代模型对比格犬中柚皮苷和柚皮素的适用性：计算各组中所有比格犬的DM值，超过60%比格犬的DM值不大于50，说明本发明的药代模型适用于比格犬体内柚皮苷和柚皮素拟合药物浓度曲线。

5 运用本发明药代模型求算药代动力学参数结果：比格犬中各剂量组的药代参数计算结果见表2。

本发明药代模型与常用的DAS软件比较：对于柚皮苷，多峰现象的犬仅有4只，占犬总只数25%，药代参数没有统计学显著性差异；对于柚皮素，多峰现象的犬有13只，占犬总只数70%以上，在三个剂量组中，药代参数半衰期均有统计学显著性差异（见表3）。

以上结果说明，对于个体差异大的犬，本模型具有良好的适应性，既同一种药物在不同生物体之间，单峰现象时，和常用软件没有差异，多峰现象时，可正确计算药代参数，防止药物在犬体内过量给药引起的毒副反应，适用于多峰现象的药物在犬体内实验研究及临床前试验。

表1 比格犬中柚皮苷(G)及柚皮素(S)的药代标准模型及模型生物常数

表中，“—”表示不存在

表2比格犬中柚皮苷（G）和柚皮素（S）的药代参数的求算

表3 DAS软件和本模型计算柚皮苷（G）和柚皮素（S）的药代参数的比较

* 表示有统计学显著差异，P<0.05。

Claims

1.一种针对药物多峰现象的犬药代动力学模型的构建方法,包括以下步骤:

(1) 选取犬至少6只，雌雄各半，按剂量给药，给药后采集血样，采血时间点保证在第一个峰前至少采集到2个采血点，在每个峰最高值附近至少采集到3个采血点，在最后一个峰后至少需采集3个采血点;

（2）采用液相质谱联用仪测定血药浓度，其中液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B；梯度洗脱：0分钟-2分钟-20分钟-25分钟-27分钟-30分钟，流动相A：5%-5%-95%-95%-5%-5%；流速0.3mL/min;

(3)药代标准模型的建立：按下列方法计算每只犬5种类型的拟合常数（DM），其中，最小值为该只犬的药代标准模型类型；

类型1：

类型2：

类型3：

类型4：

类型5：

其中t为采血时间；C ₁ - C ₅为各类型中采血时间的对应血药浓度；e为自然常数；k _a，k，A，B，f，t ₁为生物常数;

每只犬的拟合常数（DM）作为标准模型建立的评判指标;

其中n为该只犬中可检测到血药浓度的样品个数；把每只犬所有采血时间作为自变量代入各自的5种标准模型，可算出所有采血时间对应的所有血药浓度的计算值命名为C _j ^’；每一个计算出的C _j ^’对应一个测得真实血药浓度，命名为C _j， j为第j个采血时间点;

其中, 生物常数k _a，k，A，B，f，t ₁求算方法如下：

把每只犬的血药浓度和采血时间分别输入Office Excel，第一列为采血时间，命名为t；第二列为对应的血药浓度，命名为C _p；第三列为第二列对应的自然对数值，excel函数为LN（C _p），以第一列最后3-5个点为线性横坐标，第三列最后3-5个点为线性纵坐标，求斜率和截距，分别命名为k和A；第四列为根据公式e^{(A+k∗t )}－C _p求算值的自然对数值,其中e为自然常数，excel函数为LN(EXP(A +k ∗t )- C _p)，以第一列最前面3-5个点为线性横坐标，第四列最前面3-5个点为线性纵坐标，求斜率和截距，分别命名为k _a和B ；t ₁求算方法为excel求算公式（A－B）/(k－k _a)；f在0.2-3之间。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述采血时间点为：给药后0.5小时，1小时，1.5小时，2小时，3小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，24小时，36小时采集血样。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于：所述DM值的范围为0-50。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于：每个剂量组60%以上的犬的DM值范围为0-50。