CN1375058A - 由物质混合物中检测和分离药物活性化合物的方法及其设备 - Google Patents

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Abstract

一种自活性及非活性化学物质的混合物中分离和/或鉴别至少一种活性化学物质的方法,其特征在于下列步骤:a)向该混合物中添加标的物形成标的物与该混合物中至少一种活性化学物质的复合物,b)自所述混合物的非活性化学物质中分离该复合物,及任选一种下列的步骤,c)自该经分离的复合物中游离及分离和/或鉴别至少一种活性化学物质,或d)自活性和非活性化学物质的混合物的色谱图扣除非活性化学物质的混合物的色谱图以鉴别该混合物中至少一种活性化学物质,该非活性化学物质的混合物是在分离复合物、及自该经分离的复合物中任选地游离及分离至少一种活性物质后而获得。

Description

由物质混合物中检测和分离 药物活性化合物的方法及其设备
药理研究经历了从使用独特的天然来源，经化学合成活性物质和对其进行动物实验测试到利用实验和理论方法对活性物质进行寻标、计算机辅助结构设计的发展。
随着对疾病的各种病因(例如缺乏或遗传引起蛋白的变性)的认识加深，药剂的药学研究和治疗变得更加复杂。因此，过去十年，利用分子生物学(人体基因工程)阐明了一些原发性神经变性疾病，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧向硬化、朊病毒病(prionic diseases)和各种共济失调综合征的遗传因素。对于疾病内在的生物转变的认识为从症状缓和到病因治疗法的转变提供了基础。
医学中约30000种疾病中100-150种疾病适于药学工业的研究项目。现有的药剂目的在于在治疗上影响约400受体、酶和其它生物分子。然而，设想约有高达10000基因及其产品适于活性剂研究的对象。证明它们的病理上的相关性特别需要具有信息价值的分子和细胞体系。
除了合理设计(这涉及到根据经验值或已知的分子结构对物质的性质进行优化)，当前组合化学和组合生物合成在药物研究中起着重要作用；而后者仍处于发展阶段。
与植物和微生物二级代谢结构的复杂性相比，这些方法的重要的缺点是合成物质多样性是有限的。
为了利用天然的多样性，必不可少的是在传统的天然产物研究、分子医学和有机化学之间建立紧密的联系。在探索新的主题结构的研究中，植物和动物有机体以及真菌和微生物的选择是根据生态学观察和以前的人类治疗学知识，按化学分类随机进行的。
然而，测定物质混合物如通过组合化学所产生的物质库或天然产物萃取物中的一种或多种活性组份相当费时。
例如，天然物质萃取物在整个极性范围通常由大量(高达2000种)非常不同的物质组成。上述的极性是由于不同的基本结构和功能团所致。通常，只有相当少数的化合物的量就达到萃取物重量的约80％，而其它化合物的主要部分的存在量低到ppm级浓度范围，即非等摩尔。然而，常常是只有几个或甚至单一种物质具有生物活性，而这种活性可能是在萃取物中微量物质所产生的。
至今，天然萃取物的大部分色谱分离组分或由组合化学产生的广泛的物质库的处理和分析通常是使用处理量极高(high-throughput screening，高处理量筛选法；HTS)的自动化测试系统进行的。然而，这种方法费力、费钱。例如必须先用高极性溶剂由天然产物源(如，植物、动物、真菌、微生物)制备选择性萃取物，然后进行生物测试。从各有效的选择性萃取物得到细馏分，然后进行其它测试。
最后，有效组分分离之后，最终测试来表明那些纯物质具有生物活性和因此表示成功(hit)。色谱分离和测试这些次资料库(sublibraries)每次要几周。为了回收足量的纯物质，必需由大量的萃取物开始。这也导致制备HPLC柱(高效液相色谱柱)的成本增高，对溶剂的要求(购买和处理)也高。
经分离细馏分(但更多的是通过分离纯的天然物质)，萃取物的某些组分可能具有的协同或拮抗效应在高处理的筛选中就丧失了。因此，在第一次测试中有效的萃取物可能失去了其生物活性，这是因为分离成单一的物质防止了标的物接合(target-binding)，而标的物接合只有通过各种组分的相互作用实现。
从由组合化学制得的由多达19条化学上非常相似的多肽组成的合成多肽库测定其有效组份的方法表述在Zuckermann等人，Proc.Acad.Sci.USA 89，4505-4509(1992)，其中多肽来自氨基酸替换且以等摩尔量存在。为此，在多肽物质库中加入不足量的抗体，由快速凝胶过滤分离标的物(＝抗体)-多肽-复合物。用1％的三氟乙酸由复合物中游离出多肽，用质谱和氨基酸分析来说明其结构。然而这种方法不适于小分子的标的物-分子复合物(分子量低于或等于1500)，因为凝胶过滤技术只在分子量差异巨大时起作用。而且，根据这些作者，该方法要求等摩尔的混合物。此外，不可能测定试剂的协同活性，或有很大的偶然性。
Wieboldt等在Anal.Chem.，69，1683-1691(1997)中描述的实验同样是用于20-30分子极相关的的等摩尔混合物(具有通式1，4-苯并二杂吖庚因结构的合成衍生物)。合成物质的有限的多样性有助于实验进行。但同时也是这一应用的局限性。
同样，R.B.van Breemen等在Anal.Chem.，69，2159-2164(1997)中描述的脉冲超过滤质谱要求具有20种物质的等摩尔的混合物库。由于仅能用有机溶剂完成游离，不可检测到共价接合的物质。
因此，本发明的目的是开发一种快速、有效地从非等摩尔混合物如天然萃取物(如，植物、动物、真菌、微生物)中检测和分离生物上，如药理学上活性物质和物质混合物。
本发明的目的可由下列方法实现，该方法的特征是以下的步骤：
a)向化学物质混合物如天然产物萃取物中加入标的物；
b)由标的物和至少一种活性化学物质形成至少一种复合物，所述的化学活性物质接合到标的物上；
c)将未接合的化学物质混合物与至少一种复合物分开，以及分析(色谱)检测(＝主实验)该复合物。
在无标的物的实验(空白实验)中测定的另外存在的或高浓度的物质代表标的物接合的所有物质的和。对其进行分离，测定其结构。
但下列步骤可适于作为进一步处理复合物的步骤：
d)通过破坏复合物中化学活性物质与标的物之间的接合，游离复合物中接合到标的物上的至少一种化学活性物质，
e)将至少一种经游离的化学活性物质分离，和
f)鉴定该至少一种经分离的化学活性物质，以及任选地与步骤c中的物质比较。
术语“生物标的物”指蛋白质(如受体、酶、抗体)，生物膜或整个(健康或癌化)细胞。一旦接触，特别是当匹配的化学活性物质接合到标的物上时，可引发反应，这种反应是标的物的特性，并与生物化学方法密切相关。换句话，活性化学物质对特定的标的物具有强的亲合性。这种标的物的实例为蛋白质凝血酶，胰蛋白酶、β2肾上腺素能受体。
作为“化学物质”，有机和天然产物化学中已知的那些物质实际上都是合适的。其中包括低分子或高分子的化学物质，但不包括单体单元数未知的聚合物。这些有机化学的化学均一物质对于现有技术中是已知，包括脂族、芳香族或环族烃和具有以下功能团的化合物：羧酸、醇、酯、醛、内酮、酰胺、杂环、类异戊二烯、萜烯、烃和类固醇等。苷、多肽、蛋白质和酶可考虑作为合适的物质。
合适的化学均一物质的分子量通常是大于Mr＝150。已知的神经递质乙酰胆碱[H3CCO-O-CH2-CH2-N(CH3)3]OH和尼古丁分子量Mr分别为163和162，实际中作为合适的化学物质的分子量的下限。分子量的上限原则上讲无限制。因此，高分子蛋白(Mr高达约300,000)明确是适用的活性化学均一物质，可用本发明的方法从不同的化学混合物中分离出来。
非均一性的生物聚合物如糖原、纤维素等不适于本发明的方法。由于其单体单元数目的不确定性，它们不能代表本发明目的的化学均一物质。
而且，活性和非活性化学物质间应有区别。活性化学物质理解为一旦接合到特定的标的物就能引发其特性反应的物质。活性物质的特征在于对标的物具有亲合性。而非活性化学物质无需对标的物具有亲合性。
因此，合适化学物质的相对分子量的真实上限可能无法指出。更确切地说，这仅仅是处理过程的简化，其实质上是由活性化学物质与标的物的相对分子量的比值确定的。标的物的相对分子量通常很大，例如1百万以上。如上所述，标的物也可以是整个细胞。由于分子量的巨大差别，用常规方法如超离心法，易于将相对分子量较小(约150-30000)的化学物质与这些标的物分离出来。但当活性化学物质与标的物的相对分子量的大小为可比较的数量级范围内，超离心法只能提供不能令人满意的分离结果，必须利用更复杂或另外的分离方法。
术语“化学物质混合物”指不同化学物质的混合物，其含有至少一种满足上述标准活性化学物质，即一旦与特定的标的物接触就能引发反应。混合物可能含有一种活性化学物质以上。此外，混合物可含有不能在特定的生物标的物上引发反应的化学物质。通常，非活性化学物质占不同化学物质混合物的大部分。特别是，化学物质混合物中所含的非活性化学物质仅相对于某特定选择的标的物是非活性的，但却可以在另一标的物上引发这样的反应。
实际上，化学物质混合物优选是合成或使用组合化学得到的物质库或天然产物萃取物。术语“天然产物萃取物”是指源自生物来源，优选由植物、植物的部分如叶、花、木材(wood)、根、树皮等，真菌、动物、腺、蛋和动物分泌物、微生物等回收得到的化学均一物质。这可由已知的方法得到，例如汽馏、干馏、用水、有机无机或超临界溶剂萃取；常常同时或随后进一步加工处理，如酯化、皂化、成盐、氢化、脱水、异构化、烷基化、发酵、酶降解等。关于其组分，由此得到的天然产物萃取物物有时不再对应于天然来源中的成分。然而，通常存在大量如至少50种非常不同的化学物质；如上所述，其中大量的物质仅以微量存在，如几个ppm。但，在这样的萃取物中，常常仅有几种或甚至单一种物质具有生物活性，而这种活性正是萃取物中微量存在的物质所致。化学物质的混合物也可以是不同的天然产物萃取物的混合物。特定的例子是选择蒲公英的萃取物(taraxacum officinate)。特别重要的生物来源当然是药用植物，其萃取物具有生理学和/或药理学效应，其部分描述在德国药典和顺式疗法药典中。
在化学物质混合物中“加入”标的物优选以溶液、悬浮液或分散液进行。许多情况下，“加入”发生在水溶液中，特别是其pH值用合适的缓冲剂稳定化的溶液中。这种方法的特别好处是加入标的物之前并未将化学物质混合物事先分离成许多不同的馏分直至纯化学物质。
术语“复合物”是指可被分离的、由标的物和其上接合的至少一种活性化学物质组成的颗粒。标的物还可接合两种或两种以上活性化学物质。复合物中接合到标的物上的两种或多种活性化学物质相互可以一定的特性比例存在，相对于特定标的物的特定反应，该比例对应于协同作用。选择蛋白的构象作为标的物是通常的方法，因此本领域的普通技术人员也称之为蛋白-配体复合物。
在复合物中，至少一种活性化学物质“接合”至标的物上。这里，标的物与活性化学物质同的接合类型基本上并不重要。常为共价键或非共价键。后者例如包括氢桥、静电作用(如反电荷间的作用)、金属络合、活性化学物质的亲油基团与标的物的疏水区域(即袋，pocket)的相互作用、偶极子间作用和阳离子-π作用。常常是各种作用的组合引起活性化学物质对标的物的亲合性。
至少一种复合物与混合物未接合(即，游离)的非活性化学物质的“分离”基本上利用通常的方法进行。特别的好处是可以选择这些方法而不会涉及到复合物的热负荷。这些方法例如复合物的过滤、超过滤、离心、超离心、平衡分析、凝胶过滤或沉淀。对于接合到标的物上的至少一种活性化学物质的鉴别有时可以在将这种化学物质从复合物中游离来之前进行，例如快速扫描质谱议(MALDI-TOF)。
过滤表示一种特别快速、简单和有效的分离方法。可用超过滤(如，Amicon公司的Microcon过滤单元)和特殊的过滤设备(如，Brandel细胞收集器)。
然而，至少一种活性化学物质从复合物中“游离”出来有助于检测、分离，特别是其化学定性。在两次或多次清洗步骤除去未特定吸收的物质之后，进行分离步骤。由此，将至少一种活性化学物质从复合物中“游离”出来。在该方法中，复合物中标的物和至少一种活性化学物质的接合再次断裂。为此，根据接合的类型，可使用机械或化学方法。例如可使用酸、水性低碱溶液，优选体积比为1/49.5/49.5(体积％)的三氟乙酸/甲醇/水的混合物。
如果无需对活性化学物质进行鉴别，即对复合物进行测定，可省去游离步骤。如果活性化学物质会因游离条件而改变或不可用游离液而分离，就必须省去游离步骤。这主要是在一些共价键的情况。此时，可利用标的物存在下(试验)和无标的物存在下(空白样品)滤出液的差别鉴定活性化学物质。这种方法可让所有接合到标的物的化学物质同时鉴定，而游离通常只得到几种(如1-3种)活性化学物质。另外，在游离的情况下，不能确定物质未改变。
在盲样(blind sample)中另外地或以高浓度发生的物质表示潜在的活性化学物质。它们可用任何分离方法如色谱由化学物质混合物(如天然产物萃取物)中甚至大量地分离。
在破坏复合物中存在的接合后，可用上述的相同、基本上已知的方法完成将至少一种活性化学物质与标的物“分离”。此处，使用最简单实用的方法，优选过滤和离心。活性化学物质的分离可用制备高效液相色谱(HPLC)进行。
在空白样品中另外的或高浓度的物质，以及至少一种活性化学物质的鉴定可用常规的方法进行，如HPLC，如常规分析HPLC、微-HPLC、毛细管HPLC或纳-HPLC，或电子色谱，电泳或LC-MS或MS-MS偶合技术。然而，可在活性化学物质从复合物中游离出来之前，用上述的方法对其进行鉴定。
本发明的方法从根本上讲不同于已知的高处理量筛选法。这主要在于，通过寻标生成标的物和至少一种活性化学物质的复合物，随后分离未接合的非活性化学物质(主实验)，以及与空白试验的差别，可以用合适的特定的标的物从物质库或复合的天然产物混合物中分离和鉴别一种或几种接合到相应蛋白质上的活性化学物质。
代替将潜在的所关注化学物质逐一分离，和将其提供给标的物，后者出现在物质混合物中。根据Emil Fischer的锁-钥匙原理(Lock-and-Keyprinciple)检测出之后，可通过如超过滤从未接合的低分子量化学物质中分离出复合物，再用比较色谱法测定(无标的物(空白)样品相对于含标的物(主试验)样品)。为了确认这一结果，从复合物将配体(活性化学物质)再游离(只要其稳定和可游离的)，由普通方法鉴定、分离并用常规分析方法对结构进行解释。
本发明的方法既不要求大量的蛋白质，又不要求大量的萃取物。只需要少体积的溶剂，规模可小到微量法分析；而无需费时的次分馏，并可发现具有协同效应的活性物质的组合物。省去了放射活化标记和荧光标记。本发明的方法本质上还可加工大量的萃取物，可“找出”(fish-out)活性化学物质，其性能不是萃取物进一步应用所要求的。
当只要求由大量的萃取物中“找出”与相应的标的物具有反应的那些活性化学物质时，本发明的方法是特别有利的。然后，至少一种分离的活性化学物质可进一步用作药剂的活性成分，而代替天然产物混合物。当天然产物混合物中至少一种活性化学物质与标的物形成复合物，并且至少一种活性化学物质的相对比例对天然产物萃取物的生物效用(协同效应)起主要作用时，这种方法也是重要的。
因此，本发明的好处在于可以测定活性(协同)物质组合物，而这在对单个物质进行高处理量筛选中不能检测得到的。
最后，还可以借助该方法将活性化学物质的检测限(detection limit)出人意料地转变为微摩尔ki值区域。即可检测到ki值为1.7μM的标的物与活性化学物质的复合物。
下面的实施例用于说明本发明的方法。
实施例1：从随机选取的物质库中分离4-脒基苯基丙氨酸型凝血酶抑制剂。
选取丝氨酸蛋白酶凝血酶(serine protease thrombin)为标的物。考虑到其水溶性、最大吸收和色谱分离的分离性，下列5种药物作为物质混合物(上述定义的“非”活性化学物质的混合物)：
1.中枢进攻的α2肾上腺素能受体激动剂克氯尼定(clonidin)-HCL
2.粘液溶解剂必消痰(bromhexine)-HCL
3.三环的抗抑郁剂阿米替林(amitryptiline)-HCL
4.吩噻嗪型安定剂氯丙嗪(chlorpromazine)-HCL
5.吩噻嗪型安定剂氯普噻吨(chlorprothixene)-HCL
凝血酶抑制剂(活性化学物质)使用具有下述结构式的Behinbgwerke(Marburg；Ki＝2.5nM)化合物CRC220。
检测分析下列的组合物：
                              表1
           样品     无凝血酶的盲样   有凝血酶的主试验
凝血酶2000E/mg     0     1nmol5μmol/l
Clonidin-HCl     2nmol10μmol/l     2nmol10μmol/l
必消痰-HCl     2nmol10μmol/l     2nmol10μmol/l
阿米替林HCl     2nmol10μmol/l     2nmol10μmol/l
氯丙嗪-HCl     2nmol10μmol/l     2nmol10μmol/l
氯普噻吨-HCl     2nmol10μmol/l     2nmol10μmol/l
CRC 220     2nmol10μmol/l
0.9％NaCl水溶液(最纯)     200μl     200μl
在室温下，物质库和具有凝血酶的抑制剂培养1小时；溶剂为0.9％的NaCl的水溶液。用超过滤(离心)分离所形成的蛋白质-配体复合物。进行所有的过滤步骤和洗涤直到滤器干燥。
滤器：Microcon 10(Amicon)
离心条件：9981×g，室温
清洗步骤：2x；每次在4℃下用150μl的0.9％NaCl水溶液。
滤出液的超过滤和分析之后，进行清洗步骤，然后于室温用200μl水/甲醇/TFA(49.5/49.5/1)处理，从滤器上所保留的蛋白质-配体复合物中游离出配体(活性化学物质)。
对盲样(无凝血酶)在所有步骤中进行类似处理以对滤出液进行比较。所有步骤中得到的滤出液用快速-VAC浓缩器进行干燥，然后应用超声和搅拌溶解在所定义量的相对应的HPLC流动试剂中。
用分析式HPLC进行配体的鉴定。固定相：Hypersil C 18 BDS，3μm，150*0.3 mm，Fusica(LC填充)。流动相：乙腈/水/TFA(35/65/0.01)，恒溶剂，5μl/min，λ＝230 mm。结果如图2所示。
主试验和盲样的区别是CRC 220作为活性化学化合物。
因为clonidin-HCL(4.6分钟)既未出现在主试验中也未在盲样中，借由标的物无法发现到，但由滤器也无法发现到。其不是抑制剂。
实施例2：具有不同接合强度的脒基苯基丙氨酸与胰蛋白酶的非等摩尔混合物的接合
下式表示的胰蛋白酶抑制剂3-脒基苯基丙氨酸作为化学物质，丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶作为标的物。
                                表3
Figure A0081311000131
                                表4：组分分析
  样品     胰蛋白酶10.600 E/mg        6(Ki＝67nM)        7(Ki＝330nM)          10(Ki＝20nM)     0.9NaCl水溶液(最纯)
261；300     0   1.68nmol8.4μmol/l   8.25nmol41.25μmol/l     0.5nmol2.5μmol/l     ad 200μl
262；301；302     10nmol50μmol/l   1.68nmol8.4μmol/l   8.25nmol41.25μmol/l     0.5nmol2.5μmol/l     ad 200μl
按实施例1进行实验。
                                 表5：结果
 样品   物质     滤出物[μmol/l]   第一次清洗[μmol/l]   第二次清洗[μmol/l]     游离[μmol/l]
  261     6     7.44     0.71     0.05     0.01
    7     31.57     3.13     0.26     0.13
    10     0.05     0.02     0.0013     0.0011
  262     6     0.67     0.23     0.15     6.09
    7     22.22     3.68     1.29     8.49
    10     0.02     0.0058     0.0012     0.53
实施例3：蒲公英天然产物萃取物的分离和测定
分析所用物质：
a)extr.taraxaci spir.sicc(Caelo公司的天然产物干燥萃取物)
水溶液的制备：
-干燥萃取物悬浮于水中(0.2g溶解于20ml中)
-在超声浴中处理5分钟，并持续30分钟，伴有偶尔的搅拌
-先经膜过滤(0.7μm)，再用Anotop 25滤器(0.02μm)过滤
用FeCl3，Pb(CH3COO)4和明胶进行单宁试验：阴性
b)β2肾上腺素能受体(＝标的物)
-从Sf9昆虫细胞制备薄膜，Sf9昆虫细胞已用重组β2肾上腺素能受体-杆状病毒感染(细胞和病毒，质粒构造，重组杆状的分离和薄膜的制备：MPI生物物理，分子膜生物部，Frankfurt/Main，Dr.Helmut Reilander)[H.Reilander，Febs Letter，282，441-444(1991)]
分析中，将蒲公英萃取物和薄膜制剂按不同的化学计量比混合，然后溶解在200μl接合缓冲液(150mM NaCl，50mM三羟甲基氨基甲烷(tris)，在水中的pH为8.2)。
在30-34℃对混合物进行30分钟的培养，得到受体-配体接合。然后将溶液放在Microcon 10离心过滤器上于9981×g离心15分钟或直至滤器干燥。对含有受体(主试验)和不含有受体(盲样)的样品的色谱图的比较可鉴定接合的化学物质。用接合的缓冲液清洗两次后，用200μl TFA(1/49.5/49.5)处理，从滤器上分离出复合物。
                                   表6：组分分析
 样品     β-肾上腺素能受体(膜制备10/98；6.5pmol受体/mg蛋白)     Extr.Taraxaci(10mg/ml水性提取物，用Anotop 25滤器(Merck)过滤     结合缓冲液(150mM NaCl；50mMtris；pH8.2)
  351     0     1.5mg7.5g/l     ad 200μl
  355     1.04pmol5.2nmol/l     1.5pmol7.5nmol/l     ad 200μl
  356     1.04pmol5.2nmol/l     1.5pmol7.5nmol/l     ad 200μl
  360     0     0.3mg1.5g/l     ad 200μl
  361     1.04pmol5.2nmol/l     0.3mg1.5g/l     ad 200μl
  362     0     0.6mg3g/l     ad 200μl
  363     1.04pmol5.2nmol/l     0.6mg3g/l     ad 200μl
  364     0     1.0mg5.0g/l     ad 200μl
  365     1.04pmol5.2nmol/l     1.0mg5.0g/l     ad 200μl
  366     1.04pmol5.2nmol/l     1.5mg7.5g/l     ad 200μl
  367     1.04pmol5.2nmol/l     1.5mg7.5g/l     ad 200μl
  369     1.04pmol5.2nmol/l     1.5mg7.5g/l     ad 200μl
  373     1.04pmol5.2nmol/l     1.5mg7.5g/l     ad 200μl
  374     0.52pmol2.6nmol/l     1.5mg7.5g/l     ad 200μl
  375     0.26pmol1.3nmol/l     1.5mg7.5g/l     ad 200μl
对四个过滤步骤的洗脱液在真空下离心干燥，所得物质用超声溶于10μl的HPLC流动相中(与实施例1比较)，紧接着进行LC分析。
                                 表7：结果
  样品   物质   滤出液[nmol/l]   第一次清洗[nmol/l]   第二次清洗[nmol/l]     游离[nmol/l]
  351     L3     740.3     51.0     8.0     11.9
    L6     5970.7     15045     750.8     195.0
    L7     3802.1     748.2     145.5     22.7
  355     L3     353.5     88.8     12.9     15.8
    L6     1482.0     451.4     100.4     707.0
    L7     1539.6     909.9     180.4     214.5
  356     L3     961.9     79.0     9.9     26.3
    L6     1848.6     600.1     202.1     2199.1
    L7     2183.1     1117.4     295.9     510.7
  360     L3     411.5     22.7     0     8.1
    L6     2935.2     468.9     140.3     34.7
    L7     1268.8     129.6     6.6     8.6
  361     L3     537.0     16.5     29.6     11.2
    L6     1588.2     146.5     124.3     138.1
    L7     1268.8     129.6     6.6     8.6
  362     L3     650.1     20.5     5.6     3.0
    L6     3446.6     958.0     351.4     85.4
    L7     1423.2     176.5     33.7     7.5
  363     L3     736.9     54.4     0     8.7
    L6     1180.6     248.3     142.0     257.0
    L7     1740.7     76.4     104.2     16.9
  364     L3     1034.4     36.9     3.0     5.3
    L6     3752.4     1377.0     627.8     151.3
    L7     1829.6     92.7     30.1     89.6
  365     L3     1221.4     51.7     8.6     9.8
    L6     2291.6     626.7     141.6     439.6
    L7     2746.8     74.0     11.2     111.9
    366     L3     2088.5     102.8     2.3     7.6
    L6     5581.8     620.0     181.5     504.8
    L7     4261.6     1425.3     213.1     168.2
    367     L3     2310.8     46.2     15.6     6.3
    L6     5159.0     832.5     274.6     616.8
    L7     6243.7     1509.0     199.2     232.9
    369     L3     2381.4     90.8     41.8     7.0
    L6     7449.7     478.1     341.9     674.0
    L7     3505.8     986.8     221.7     378.7
    373     L3     2450.0     91.7     26.6     36.2
    L6     5562.6     182.7     277.1     2096.1
    L7     4900.2     1176.5     285.4     847.8
    374     L3     2593.2     44.0     7.4     25.3
    L6     8589.0     1062.4     476.6     1015.4
    L7     5661.6     627.7     200.9     538.8
    375     L3     2252.1     39.7     19.6     19.0
    L6     10838.5     921.1     433.9     279.9
    L7     4921.4     631.3     112.3     154.4
经复合，然后从复合物上进行游离，“找到”三种配体(L3＝反式caftarinic酸，L6＝反式-chicorini酸和L7＝反式-diferoyl-tartaric酸酯)，用UV，1H-NMR和MS可以测定。
Figure A0081311000171
Figure A0081311000181
                        附图说明
图1示意地说明至少一种复合物的生成。向1000不同的非等摩尔化学均一物质的混合物(其中四种具有活性)中加入标的物。得到四种不同的复合物，各含有一种活性化学物质。用超过滤将复合物与996种非活性物质分离。数字表示如下：
1＝标的物
2＝各种活性化学物质
3＝各种非活性化学物质(点)
4＝具有至少一种活性化学物质的复合物
图2表示：
A)含有抑制剂CRC 220的化学物质混合物
clonidin-HCl(4.6分钟)，CRC(6.9分钟)，必消痰(12.3分钟)，阿米替林(17.6分钟)，氯丙嗪-HCL(23.9分钟)，氯普噻吨-HCL(26.9分钟)
B)无标的物的滤出液(盲样)
C)含有标的物凝血酶的滤出液(主试验)
图3的色谱图表示如下：
A)蒲公英(盲样)
B)蒲公英(主试验)
C)蒲公英游离
盲样和主试验的差别表明有约12种物质接合，而由游离方法只检测到3种物质。

Claims (21)

1、一种自活性及非活性化学物质的混合物中分离和/或鉴别至少一种活性化学物质的方法，其特征在于下列步骤：
a)向该混合物中添加标的物形成标的物与该混合物中至少一种活性化学物质的复合物，
b)自所述混合物的非活性化学物质中分离该复合物，及
任选一种下列的步骤，
c)自该经分离的复合物中游离及分离和/或鉴别至少一种活性化学物质，
或
d)自活性和非活性化学物质的混合物的色谱图扣除非活性化学物质的混合物的色谱图以鉴别该混合物中至少一种活性化学物质，该非活性化学物质的混合物是在分离复合物、及自该经分离的复合物中任选地游离及分离至少一种活性物质后而获得。
2、如权利要求1的方法，其特征在于向该化学物质的混合物添加标的物是于溶液、悬浮液或分散液中进行。
3、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该添加是于水性溶液中进行。
4、如上述权利要求之一的方法，其特征在于水性溶液的pH值是以适当的缓冲溶液帮助其稳定。
5、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该复合物是由在至少一种活性化学物质和标的物间的接合所产生。
6、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该接合是共价键或是非共价键。
7、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该非共价键是由氢桥、静电相互作用、金属复合作用、活性化学物质的亲油性基团与标的物的相互作用、偶极-偶极相互作用、或阳离子π相互作用所形成。
8、如上述权利要求之一的方法，其特征在于自非活性化学物质分离复合物是由超过滤、超离心或其他适当的方法进行。
9、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该经分离的复合物的至少一种活性化学物质的分离及/或鉴别是由方法例如，HPLC、电子色谱分析、电泳，偶合技术如LC-MS或MS-MS完成，最适合的是由微毛细管(micro-capillary)或纳-HPLC(nano-HPLC)完成。
10、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该混合物的至少一种活性化学物质的鉴别是由方法，例如，HPLC、电子色谱分析、电泳，偶合技术如LC-MS或MS-MS完成，最适合的是由微毛细管(micro-capillary)或纳-HPLC(nano-HPLC)完成。
11、如上述权利要求之一的方法，其特征在于自该混合物分离至少一种活性化学物质是由制备HPLC，电子色谱分析或电泳进行。
12、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该活性和非活性化学物质的混合物为获自合成或组合化学的物质库，或天然产物萃取物。
13、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该化学物质混合物为化学改性的天然产物萃取物。
14、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该化学物质混合物为各种天然产物萃取物的混合物。
15、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该活性和非活性化学物质的混合物包含至少50种不同的化学物质。
16、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该标的物是一种蛋白质。
17、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该标的物是酶、受体、抗体、生物膜或细胞。
18、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该标的物是酶凝血酶。
19、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该标的物是受体胰蛋白酶。
20、如上述权利要求之一的方法，其特征在于该标的物是β2-肾上腺素能受体。
21、一种组合实行如权利要求1的方法的装置。
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